pobierz

P R A C A
O R Y G I N A L N A
Acta Haematologica Polonica
Original Article
2006, 37, Nr 1 str. 61–65
JADWIGA SAWECKA1 , JOANNA SKULIMOWSKA 1 , JERZY WINDYGA 2 ,
JERZY KOŚCIELAK 1
Inwersja intronu 1 genu czynnika VIII u pacjentów chorych
na ciężką hemofilię A
Inversion of intron 1 of Factor VIII gene in patients with severe hemophilia A
1
Z Zakładu Biochemii Instytutu Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie
Kierownik: doc. dr hab. Ewa Zdebska
2
Z Zakładu Hemostazy i Zakrzepie Instytutu Hematologii i Transfuzjologii w Warszawie
Kierownik: dr n. med. Jerzy W. Indyga
SŁOWA KLUCZOWE: Hemofilia A - Czynnik VIII - Inwersja intronu 1 - Inwersja intronu 22
KEY WORDS:
Hemophilia A — Factor VIII — Intron 1 inversion — Intron 22 inversion
STRESZCZENIE: Zbadano 56 pacjentów z ciężką postacią hemofilii A na obecność inwersji
intronu 1 genu czynnika VIII przy użyciu metody multipleks PCR. Poprzednio wykazano, że
pacjenci ci nie mieli inwersji intronu 22. Inwersję intronu 1 wykryto tylko u jednego pacjenta.
Uwzględniając wszystkich pacjentów zbadanych na obecność inwersji w intronie 1 i 22 genu
czynnika VIII częstość występowania inwersji intronu 1 wynosi 0,9%.
SUMMARY: 56 patients with severe hemophilia A were screened for inversion of intron 1 of
Factor VIII gene, employing multiplex PCR. Previously, all of these patients were found
negative for inversions of intron 22. Only one patient with inversion of intron 1 was found.
Taking into account all patients with severe hemophilia A who were examined for inversions of
intron 1 and 22, the prevalence of inversion of intron 1 of Factor VIII gene in our sample of
hemophiliacs amounts to 0,9%.
WSTĘP
Czynnik VIII czyli globulina antyhemofilowa, jest kodowana przez duży gen
o długości 186 kb składający się z 26 eksonów poprzedzielanych intronami.
W intronach 1 i 22 znajdują się dodatkowe sekwencje nukleotydowe, których kopie
znajdują się również poza genem czynnika VIII od strony telomeru. W przypadku
intronu 22 jest to dodatkowy gen oznaczony jako F8A, a w intronie 1 jest to
sekwencja o długości ok. 1041 nukleotydów oznaczana jako intl h-1. Na zewnątrz
[61]
62
J. SAWECKA, J. SKULIMOWSKA, J. WINDYGA, J. KOŚCIELAK
genu znajdują się na ogół dwie kopie genu F8A (proksymalna i dystalna) w odległości
ok. 400 i 500 kb oraz jedna kopia sekwencji homologicznej do sekwencji intl h-1 w
odległości ok. 140 kb od 5' końca genu. Zewnątrzgenowa kopia sekwencji intl h-1
różni się od wewnątrzgenowej jednym nukleotydem i jest oznaczana jako intl h-2.
Przeciwna orientacja kopii wewnątrz i zewnątrzgenowych umożliwia zajście pomiędzy nimi homologicznej rekombinacji, co prowadzi do przerwania ciągłości genu
czynnika VIII i jest przyczyną ciężkiej hemofilii A.
W reakcji tej powstają dwa różne chimeryczne mRNA (1). Inwersje intronu 22 po
raz pierwszy opisane w 1993 r. stanowią najczęściej występującą przyczynę zachorowań na ciężką hemofilię A (2). Stąd też inwersje te są badane w diagnostyce
hemofilii w pierwszej kolejności. W Polsce wdrożyliśmy metodę oznaczania inwersji
intronu 22 w roku 2000 (3). Określiliśmy też częstość występowania tej mutacji
w populacji polskiej na materiale 113 chorych. U 57 z nich choroba była
spowodowana inwersją intronu 22, w tym u 47 chorych zidentyfikowano inwersję
typu 1 [dystalna], u 10 typu 2 [proksymalna] (4). W roku 1996 Brinke i wsp. wykryli
drugą dużą rearanżację zachodzącą w obrębie genu czynnika VIII, tym razem
w intronie 1. Mutacja ta również powoduje ciężką postać hemofilii A (1).
Celem prezentowanej pracy było wdrożenie metody oznaczania inwersji intronu
1 genu czynnika VIII i otrzymanie wstępnych danych na temat występowania tej
mutacji u pacjentów z hemofilią A w Polsce.
MATERIAŁ I METODY
Materiał od chorych (krew) pochodził z Zakładu Hemostazy i Zakrzepie
Instytutu Hematologii i Transfuzjologii.
Genomowy DNA izolowano standardowymi metodami z zastosowaniem 6M
NaCL do odbiałczania preparatów DNA. Reakcję PCR wykonywano metodą
Bagnalla i wsp. (5). Jako starterow do powielania fragmentów DNA użyto
syntetycznych nukleotydów umożliwiających namnożenie fragmentów obejmujących
wewnątrz i zewnątrzgenowa sekwencję DNA występującą w intronie 1 (odpowiednio
intl h-1 i intl h-2). Przeprowadzano dwie reakcje amplifikacji DNA stosując po trzy
startery w każdej z nich. Do detekcji inwersji intronu 1 używano czterech starterow
o następującej sekwencji nukleotydowej: dla int. lh-1: (9F) 5'- GTTGTTGGGAATGGTTACGG, (9cR) 5'- CTAGCTTGAGCTCCCTGTGG, int lh-2(F) 5'- GGCAGGGATCTTGTTGGTAAA; dla int.lh-2: int lh-2(R) 5'- TGGGTGATATAAGCTGCTGAGCTA oraz (9F) i int lh-2(F).
Namnożone w reakcji PCR DNA analizowano elektroforetycznie. Rozdział
elektroforetyczny prowadzono w temperaturze pokojowej w 6% żelu poliakryloamidowym przy stałym natężeniu 25 mA przez ok. 60 min. Żele barwiono metodą
srebrową. Z wielkości uzyskanych fragmentów DNA wnioskowano o wystąpieniu
inwersji intronu 1 u chorych.
Inwersja intronu 1 genu czynnika VIII u pacjentów chorych na ciężką hemofilię A
63
WYNIKI
Ogółem zbadano 56 pacjentów. U jednego pacjenta stwierdzono obecność
mutacji inwersyjnej w intronie 1 (Ryc. 1, ścieżka 2,4). U pozostałych pacjentów (Ryc.
1, ścieżka 1, 3) choroba była spowodowana innym rodzajem mutacji.
Ryc. 1. Elektroferogram produktów PCR pacjentów z inwersją i bez inwersji intronu 1 genu czynnika
VIII. 0 drabina DNA; 1 i 3 pacjent bez inwersji intronu 1; 2 i 4 pacjent z inwersją intronu 1; 1 i 2 intl h-1;
3 i 4 intl h-2
Fig. 1. Electrophoretogram of PCR products of inverted and non inverted intron 1 of Factor VIII gene.
0 DNA ladder; 1 and 3 patient with non inverted intron 1; 2 and 4 with inverted intron 1; 1 and 2 intl h-1;
3 and 4 intl h-2
DYSKUSJA
Do wykrywania mutacji w hemofilii A wdrożono metodę oznaczania inwersji
intronu 1 genu czynnika VIII. Jest to druga co do częstości mutacja powodująca
ciężką postać hemofilii A po inwersji intronu 22. Według literatury inwersje intronu
22 występują w około połowie przypadków ciężkiej postaci hemofilii A (2). Inwersja
intronu pierwszego występuje znacznie rzadziej od inwersji intronu 22. Pierwsze
badania z Wielkiej Brytanii prowadzone przez Bagnalla i wsp. wskazywały, że
inwersja intronu 1 stanowi przyczynę choroby u ok. 5% pacjentów z ciężką postacią
64
J. SAWECKA, J. SKULIMOWSKA, J. WINDYGA, J. KOŚCIELAK
hemofilii A (5). Podobne rezultaty uzyskano w badaniach populacji hiszpańskiej (6),
włoskiej (7), nieco niższe w czeskiej – 4,3% (8) i hinduskiej – 3,75% (9). Jednak
późniejsze badania przeprowadzone na większej liczbie pacjentów wskazywały, że
w Wielkiej Brytanii i we Włoszech częstość występowania inwersji intronu 1 jest
niższa i wynosi ok. 1,8–1,7% (10, 11), a w Indiach jeszcze niższa 1,24% (12).
Częstość występowania inwersji intronu 1 w Iranie wynosiła 2% (13).
W niniejszej pracy zbadaliśmy inwersję intronu 1 u 56 pacjentów z ciężką
hemofilią A, u których nie stwierdziliśmy obecności inwersji intronu 22 (4). Obecność
mutacji inwersyjnej intronu 1 wykazano tylko u jednego pacjenta. Uwzględniając
wszystkich przebadanych chorych, w tym również pacjentów z inwersją intronu 22
(4) prewalencja inwersji intronu 1 wynosi więc 0,9%. Podobne wyniki uzyskano
w Argentynie. Na 64 przebadanych pacjentów jeden miał inwersję intronu 1 (14).
U 43 pacjentów na Węgrzech nie stwierdzono obecności mutacji inwersyjnej
intronu 1 (15).
Wprowadzenie oznaczania inwersji intronu 1 będzie miało znaczenie praktyczne
w diagnostyce hemofilii A (w tym w diagnostyce prenatalnej), gdyż pozwoli uniknąć
długotrwałych badań rodzinnych opartych na analizie sprzężeń genetycznych oraz
konieczności sekwencjonowania całego genu czynnika VIII. Większe znaczenie
praktyczne ma oznaczenie inwersji w intronie 22, która w Polsce występuje u 50%
pacjentów z ciężką postacią hemofilii A (4).
PIŚMIENNICTWO
1. Brinke A, Tagliavacca L, Naylor J, Green P, Giangrandę P, Gianelli F. Two chimaeric transcription
units result from an inversion breaking intron 1 of the factor VIII gene and a region reportedly affected by
reciprocal translocations in T-cell leukaemia. Hum Mol Genet 1996; 5: 1945–1951.
2. Naylor JA, Brinke A, Hassock S, Green PM, Gianelli F. Characteristic mRNA abnormality found
in the half the patients with severe hemophilia A is due to large DNA inversions. Hum Molec Genet 1993;
2: 1773–1778.
3. Sawecka J, Skulimowska J, Kościelak J. Mutacje inwersyjne u pacjentów chorych na ciężką
hemofilię A. Acta Haematol Poi 2000; 31: 47–50.
4. Sawecka J, Skulimowska J, Windyga J, Łopaciuk S, Kościelak J. Prevalence of the intron 22
inversion of the factor VIII gene and inhibitor development in Polish patients with severe hemophilia A.
Arch Immunol Ther Exp 2005; 53: 352–356.
5. Bagnall RD, Waseem N, Green PM, Gianelli F. Recurrent inversion breaking intron 1 of the factor
VIII gene is a freąuent cause of severe hemophilia A. Blood 2002; 99: 168 –174.
6. Tizzano EF, Cornet M, Baiget M. Inversion of intron 1 of the factor VIII gene for direct molecular
diagnosis of hemophilia A. Haematologica 2003; 88: 118 –120.
7. Riccardi F, Tagliaferri A, Manotti C, Pattacini C, Neri TM. Intron 1 Factor VIII gene inversion in
a population of Italian hemophilia A patients. Blood 2002; 100: 3432.
8. Habart D, Kalabova D, Hrachovinova I, Vorlova Z. Significant prevalence of the intron 1 factor
VIII gene inversion among patients with severe hemophilia A in the Czech Republic. J Thromb Haemost
2003; 1: 1323–1324.
9. Ahmed R, Kannan M, Choudry VP, Saxena R. Mutation reports: intron 1 and 22 inversions in
Indian haemophilics. Ann Hematol 2003; 82: 546–547.
10. Cumming AM. The factor VIII gene intron 1 inversion mutation: prevalence in severe hemophilia
A patients in the UK. J Thromb Haemost 2004; 2: 205–206.
Inwersja intronu 1 genu czynnika VIII u pacjentów chorych na ciężką hemofilię A
65
11. Salviato R, Belvini D, Radossi P, Tagariello G. Factor VIII gene intron 1 inversion: lover than
expected prevalence in Italian haemophiliac severe patients. Haemophilia 2004; 10: 194–196.
12. Shetty S, Ghosh K, Mohanty D. Major disorganization of factor VIII gene as a cause of severe
haemophilia A in Indian patients. Am J Hematol 2004; 76: 96.
13. Lari GR, Enayat MS, Arjang Z, Lavergne JM, Ala F. Identification of intron 1 and 22 inversion
mutations in the factor VIII gene of 124 Iranian families with severe haemophilia A. Haemophilia 2004;
10: 410–411.
14. Rossetti LC, Candela M, Bianco RP, de Tezanos Pinto M, Western A, Goodeve A, Larripa IB, De
Brasi CD. Analysis of factor VIII gene intron 1 inversion in Argentinian families with severe haemophilia
A and a review of the literaturę. Blood Coagulation Fibrynolysis 2004; 15: 569–572.
15. Andrikovics H, Klein I, Bors A, Nemes L, Marosi A, Varadi A. Tordai A. Analysis of large
structural changes of factor VIII gene, involving intron 1 and 22, in severe hemophilia A. Haematologica
2003; 88: 778–784.
Praca wpłynęła do Redakcji 31.01.2006 r. i została zakwalifikowana do druku 8.03.2006 r.
Adres Autorów:
Dr Jadwiga Sawecka
Zakład Biochemii Instytut Hematologii i Transfuzjologii
ul. Chocimska 5
00-957 Warszawa