korelacja z ekspresja IL-10 oraz cechami kliniczno

28
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
Ekspresja transkrypcyjnego czynnika jądrowego NFκB
w komórkach raka krtani – korelacja z ekspresją IL-10
oraz cechami kliniczno-morfologicznymi guza*
Expression of transcription nuclear factor NFκB in laryngeal carcinoma tumor cells
– correlation with IL-10 expression by blood mononuclear cells and clinicomorphological features*
Katarzyna Starska1, Olga Stasikowska 2, Iwona Lewy-Trenda 3, Ewa Głowacka4, Marek Łukomski1
Otolaryngol Pol 2009;
63 (7 ): 28-34
SUMMARY
Purpose: Transcription nuclear factor NFκB (p65-p50/RelA) is an activator
of transcription process and regulates the apoptosis, cell cycle, proliferation,
secretion of cytokines, angiogenic and growth factors by initiation gene
transcription. NFκB can be activated by signaling pathway following IL-10
stimulation. The aim of this study was to estimate NFκB cytoplasmic and
nuclear immunoexpression and to analyze the connection with clinicopathological features and IL-10 concentration produced by blood mononuclear cells
in patients with laryngeal carcinoma.
Materials and methods: Analysis of NFκB expression by immunmohistochemistry and IL-10 production by PBMCs and measured by Elisa in 45 patients with
squamous cell carcinoma of the larynx were performed. Connections NFκB
immunoexpression with clinicomorphological features (pT, pN, Anneroth,
Batsakis i Lunas’ classification) and IL-10 secretion were analyzed.
Results: Authors reported statistical correlation between NFκB cytoplasmic
level and clinicomorphological parameters such as neoplasm advance according to Anneroth, Batsakis i Lunas’ classification and depth of invasion as well
as IL-10 secretion by PBMCs.
Conclusion: Our studied indicated the important influence of NFκB activity
on advance in laryngeal carcinoma as well as connection of anti-inflammatory and regulatory cytokine IL-10 produced by immunocompetent cells for
course of neoplasm disease.
Hasła indeksowe: Rak krtani, transkrypcyjny czynnik jądrowy NFκB, IL-10
©by Polskie Towarzystwo Otorynolaryngologów
– Chirurgów Głowy i Szyi
Otrzymano/Received:
05.05.2009
Zaakceptowano do druku/Accepted:
26.05.2009
1
Klinika Laryngologii Onkologicznej UM w Łodzi
Kierownik Kliniki: Prof. dr hab. med.
M. Łukomski
2
Katedra Patromorfologii, Zakład Nefropatologii
UM w Łodzi
Kierownik Zakładu: Prof. dr hab.
M. Wągrowska-Danilewicz
3
Katedra Patomorfologii, Zakład Patomorfologii
UM w Łodzi
Kierownik Katedry: Prof. dr hab. W. Papierz
4
Zakład Immunologii Klinicznej ICZMP w Łodzi
Kierownik Zakładu: Prof. dr hab. H. Tchórzewski
Wkład pracy autorów/Authors contribution:
Katarzyna Starska pierwszy autor, dalej według
kolejności
Konflikt interesu/Conflicts of interest:
Autorzy pracy nie zgłaszają konfliktu interesów.
Adres do korespondencji/
Address for correspondence:
imię i nazwisko: Katarzyna Starska
adres pocztowy:
Katedra Otolaryngologii UM
ul. Kopcińskiego 22
90-153 Łódź
tel. 42 678 57 85
fax 42 678 57 85
e-mail [email protected]
Key words: Laryngeal carcinoma, transcription nuclear factor NFκB, IL-10
Wstęp
W najnowszym piśmiennictwie, znaleźć można wiele
prac dotyczących analizy wartości klinicznego zastosowania różnych markerów komórkowych m.in. p53,
EGFR, PCNA, MT1-MMP, c-erbB-2, Bcl-xL, VEGFR2
i Flk-1/KDR, jako wskaźników przebiegu klinicznego w raku płaskonabłonkowym krtani oraz części
krtaniowej gardła [1-5]. Pomimo szeroko zakrojonej
współpracy klinicystów, biologów i patomorfologów,
nie wyodrębniono jednak jednoznacznych prognostycznie markerów, na podstawie których można by
przewidywać przebieg choroby nowotworowej oraz
ustalić jednolite wskazania do stosowanych metod
leczniczych [1-5]. Jednym ze wskaźników aktywności
komórek utkania nowotworowego jest ekspresja transkrypcyjnego czynnika jądrowego NF-κB/Rel, który
może ulegać regulacji w mechanizmach komórkowych
z udziałem cytokin i czynników wzrostu m.in IL-6
i IL-10 [6, 7]. NF-κB/Rel to rodzina białek będących
aktywatorami transkrypcji wpływającymi na zjawisko apoptozy, cykl komórkowy, proliferację komórek,
wydzielanie czynników angiogennych, cytokin oraz
cząsteczek adhezyjnych za pośrednictwem regulacji
transkrypcji określonych genów, które determinują
przebieg procesu nowotworowego [8, 9, 10]. Najlepiej
scharakteryzowanym heterodimerem, określanym jako
NF-κB jest p65/p50. Zbudowany jest on z dwóch podjednostek: białka p50, będącego produktem genu NFκB1 i białka p65, stanowiącego produkt genu RelA [11,
12]. Aktywacja NF-κB następuje po translokacji NF-κB
z cytoplazmy do jądra komórkowego. Regulatorami
aktywności NFκB są białka rodziny inhibitorów IκB,
które ulegając fosforylacji przez IKKα/β (IκB-kinaza),
* Praca finansowana z funduszy Komitetu Badań Naukowych Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego (Projekt KBN nr N403
04332/2326).
O t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
hamują aktywność heterodimeru p65-p50/ NF-κB1RelA, utrzymując go w cytoplazmie i uniemożliwiając
jego wiązanie z DNA [9-14]. W odpowiedzi na sygnał
pozakomórkowy np. TNFα (p55) dochodzi do fosforylacji
reszt serynowych IκB, ubiquitinizacji i jego degradacji
[15, 16]. Odłączenie IκB i uwolnienie NF-κB pozwala na
translokację NF-κB z cytoplazmy do jądra komórkowego, wiązanie z DNA i aktywację odpowiednich genów
m.in. genów dla mediatorów zapalenia, karcynogenezy,
pro- i antyapoptotycznych regulatorów oraz genów
dla IκB [8–10, 15–19]. W dostępnym piśmiennictwie
można znaleźć publikacje, w których wskazuje się na
znaczenie pobudzenia receptorów dla IL-10 w kaskadzie
zjawisk regulujących aktywność NF-κB, choć dokładny
mechanizm tych zjawisk nie jest znany [6, 7, 20]. Powszechnie wiadomo jednak, że IL-10, wydzielana przez
makrofagi, komórki dendrytyczne i komórki T, jest
przykładem antyzapalnej, immunohamującej cytokiny,
która powoduje supresję odpowiedzi immunologicznej,
w tym funkcję prozapalną transkrypcyjnego czynnika
jądrowego [21–25]. W aktywacji szlaków prowadzących
do stymulacji NF-κB może brać udział szereg białek
błonowych i wewnątrzkomórkowych m.in. TNFR (TNFα
receptor), IRAK (IL-1 receptor associated kinase), TRAF6
(TNF receptor-associated factor 6), NIK (NF-κB – inducing
kinase) oraz MEKK1 (mitogen-activated protein kinase/
ERK kinase 1) [6, 26].
Celem przeprowadzonych badań była:
1. Ocena immunoekspresji transkrypcyjnego czynnika jądrowego NFκB (podjednostki p65) w cytoplazmie
i jądrze komórek utkania guza nowotworowego,
2. Analiza związku z wybranymi cechami kliniczno-morfologicznymi guza (pT, pN, G, klasyfikacja
Annerotha, Batsakisa i Luny) oraz ekspresją IL-10,
oznaczonej we krwi obwodowej u chorych z rakiem
płaskonabłonkowym krtani.
Materiał i metody
Badaniami zostało objętych 45 chorych na raka płaskonabłonkowego krtani (43 mężczyzn i 2 kobiety,
w wieku 48-83 lat, śr. 58±5 lat), którzy zostali poddani całkowitemu usunięciu krtani lub laryngektomii
częściowej oraz w wybranych przypadkach operacji
usunięcia węzłów chłonnych szyi lub leczeniu skojarzonemu tj. chirurgicznemu i radioterapii. Rozległość
zmian nowotworowych określono wg kryteriów klasyfikacji TNM – International Union Against Cancer
(UICC-TNM 2002) [27].
Materiał tkankowy bezpośrednio po wykonanym
zabiegu operacyjnym był utrwalany w roztworze 10%
zbuforowanej formaliny. Wycinki z guza pierwotnego
do badania mikroskopowego były pobierane standardowo. Jako miejsce reprezentatywne dla określenia
głębokości nacieku nowotworowego wybierano punkt
najgłębszego naciekania do ściany krtani i tkanek
O t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9
otaczających. Z każdego węzła pobierano jeden lub
dwa wycinki, po uprzednim przecięciu węzła w jego
największym wymiarze. Wycinki pobrane do badania
zatopione były w bloczki parafinowe i rutynowo krojone
na skrawki grubości 4–5 μm (co najmniej 3-4 z guza
pierwotnego i każdego węzła chłonnego), przyklejane na szkiełka podstawowe i dalej poddane zwykłej
procedurze barwienia H&E. Oceny histopatologicznej
preparatów guza pierwotnego dokonano w oparciu
o kryteria zmodyfikowanej wg własnego pomysłu klasyfikacji Annerotha, Batsakisa i Luny [28]. Oceniano
10 wykładników opisujących cechy histopatologiczne
nowotworu (stopień rogowacenia, pleomorfizm jąder,
figury podziału) oraz rodzaj reakcji guz - tkanki otaczające (głębokość i typ naciekania, obecność nacieku
limfoidalnego i eozynofilowego, komórek wrzecionowatych, inwazję naczyń, obecność mikroprzerzutów).
Preparaty oceniano w mikroskopie świetlnym (pow.
200X, liczbę mitoz pow. 400X). Wynik przedstawiano jako sumę punktów w zastosowanej klasyfikacji,
z maksymalną liczbą punktów 28. W analizie wyników,
uwzględniono podział na pięć podgrup, w zależności od
otrzymanej sumy punktów: 6÷10, 11÷15, 16÷20, 21÷25,
>25 punktów. Wyższa wartość punktowa wskazuje na
bardziej zaawansowany proces nowotworowy.
Następnie dla celów tej pracy wykonano odczyny immunohistochemiczne dla określenia ekspresji
NFκB(p65) w utkaniu guza (w cytoplazmie i jądrze
komórek nowotworowych), wybierając jako miejsce
reprezentatywne skrawki z najgłębszym naciekaniem
raka do ściany krtani i tkanek otaczających. Odczyny
immunohistochemiczne z przeciwciałami pierwotnymi monoklonalnymi (rabbit anti-human NF-kappa B
(p65) antibody [IBL Co., LTD, Japan]) wykonano na
2-3 różnych skrawkach wg instrukcji dołączonej do
przeciwciała przez producenta. Oceniając ekspresję
NFκB(p65) w cytoplazmie (NFκB-c) zastosowano skalę:
(0) – brak ekspresji, (1+) – słaba lub średnia ekspresja
(<50% komórek z dodatnią ekspresją badanego przeciwciała), (2+) – duża ekspresja (≥50%) oraz drugą skalę
dwustopniową: (0) – brak ekspresji; (1+) – pozytywna
ekspresja badanego przeciwciała. Dla oceny nasilenia
ekspresji NFκB w jądrze komórkowym (NFκB-n) zastosowano skalę dwustopniową: (0) – brak ekspresji; (1+)
– pozytywna ekspresja badanego przeciwciała. Odczyny
IHC były oceniane w 10 polach widzenia (pow. 40X),
przez dwóch niezależnych patomorfologów.
Celem oceny wydzielania IL-10 przez jednojądrzaste
komórki krwi obwodowej (PBMC), krew pełna była pobierana od pacjentów w trakcie rutynowych badań kontrolnych w ilości 10 ml jednorazowo na antykoagulant
– heparynę litową (10U/mL). Zgodę na wykonanie badań
wyraziła Komisja Bioetyczna Uniwersytetu Medycznego
w Łodzi (Nr RNN/15/03/KN). Limfocyty krwi obwodowej były izolowane przez wirowanie na gradiencie
gęstości – Ficoll-Paque (ciężar właściwy 1,077 g/cm3).
29
30
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
Tabela I. Kliniczno-patomorfologiczna charakterystyka badanej grupy
60
Cechy
50
Liczba pacjentów (%)
Płeć
mężczyźni
kobiety
43 (95,6)
2 (4,4)
całkowita laryngektomia
częściowa laryngektomia
operacja węzłowa (+)
operacja węzłowa (-)
24 (53,3)
21 (46,7)
19 (42,2)
26 (57,8)
Leczenie chirurgiczne
40
20
pN0
pN(1-3)
31 (68,9)
14 (31,1)
70
pN
Klasyfikacja Annerotha, Batsakisa i Luny
6÷10 pkt.
11÷15 pkt.
16÷20 pkt.
21÷25 pkt.
>25 pkt.
15,6%
10
0
14 (31,1)
17 (37,8)
14 (31,1)
31,1%
30
pT
pT2
pT3
pT4
53,3%
0 (brak odczynu
NFkB-c)
mniej niż 50%
(słaby/średni
odczyn NFkB-c
więcej niż 50%
(silny odczyn
NFkB-c)
68,9%
60
50
0
12 (21,8)
25 (45,5)
16 (29,1)
2 (3,6)
31,1%
40
30
20
10
Zróżnicowanie histopatologiczne (G)
G1
G2
G3
3 (6,7)
23 (51,1)
19 (42,2)
0
brak odczynu NFkB-n
odczyn pozytywny NFkB-n
Ryc. 1. Wyniki badania IHC odczynu cytoplazmatycznego
(NFκB-c) i jądrowego (NFkB-n), wg przyjętej skali, w utkaniu
guza nowotworowego.
W nadsączach komórkowych (1 x 106 komórek PBMCs)
oceniono wydzielanie IL-10, w układach bez stymulacji
i ze stymulacją mitogenem – fitohemaglutyniną (PHA),
po inkubacji przez 21h w temp. 37°C, w atmosferze 5%
CO2. Stężenie cytokin określone zostało metodą Elisa
(Enzyme Linked Immuno Absorbent Assay) – stosując
zestawy BD optEIA firmy Pharmingen, postępując
zgodnie z procedurą podaną przez producenta. Absorbancję próbek odczytywano przy użyciu czytnika
Elx808, Bio-Tek Instruments, USA). Charakterystykę
kliniczno-morfologiczną badanej grupy chorych przedstawia tabela I.
W analizie statystycznej uzyskanych wyników
(zmienne w skali rangowej) zastosowano nieparametryczny test korelacji rang Spearmana. Dla porównań
badanych cech kliniczno-morfologiczno-immunologicznych w dwóch grupach o różnym nasileniu ekspresji
NFκB(p65) zastosowano test U Mann-Whitney’a. Dla
wszystkich stosowanych testów przyjęto poziom istotności p ≤ 0,05.
Wyniki
Wykonane odczyny immunohistochemiczne, na skrawkach z preparatów raków płaskonabłonkowych krtani,
z użyciem przeciwciał monoklonalnych anty-NFκB(p65),
wykazały dodatnią immunoekspresję NFκB(p65)
w cytoplazmie komórek utkania nowotworowego w 38
(84,4%) przypadkach oraz pozytywną reakcję z białkiem NFκB(p65) w jądrach komórkowych u 14 (31,1%)
pacjentów. W badanej grupie chorych, w ocenie nasilenia odczynu cytoplazmatycznego, zanotowano u 7
(15,6%) pacjentów brak ekspresji, u 24 (53,3%) słabą lub
średnią ekspresję NFκB(p65) (<50% komórek z dodatnią
ekspresją badanego przeciwciała) oraz u pozostałych
14 (31,1%) dużą ekspresję (≥50% komórek z dodatnią
ekspresją badanego przeciwciała) NFκB(p65). W analizie odczynu jądrowego u 31 (68,9%) nie potwierdzono
pozytywnej ekspresji cząsteczki NFκB(p65). Rozkład
odczynów immunohistochemicznych cytoplazmatycznego (NFkB-c) i jądrowego (NFκB-n) w badanej grupie
przedstawia rycina 1.
Średnie wartości stężeń IL-10 wydzielanej przez jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC), w układzie bez i ze stymulacją fitohemaglutyniną (PHA),
w badanej grupie chorych wynosiły odpowiednio:
590,1 ± 119,4 pg/mL oraz 1012,2 ± 126,66 pg/mL.
W przeprowadzonej analizie statystycznej, z zastosowaniem skali dwustopniowej dla oceny odczynu
cytoplazmatycznego (NKκB-c), zanotowano istotną statystycznie dodatnią korelację ekspresji NFκB(p65) w cytoplazmie komórek nacieku z głębokością inwazji nowoO t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
Tabela II. Stężenia IL-1- wydzielanej przez PBMCs w grupach guzów z różnym odczynem cytoplazmatycznego NFkB
Cytoplazmatyczny
odczyn NFkB
brak odczynu
0
1 (<50%)
2 (≥50%)
1507,4 ± 898,9
891,2 ± 502,2
488,7 ± 600,3
Stężenie [pg/mL] ± SEM
IL – 10 w układzie bez PHA *,**
odczyn pozytywny
521,5 ± 518,4
IL – 10 w układzie z PHA
1947,0 ± 1535,9
478,6 ± 384,1
798,0 ± 511,7
861,8 ± 416,0
*w teście U Mann-Whitney’a zanotowano istotne statystycznie różnice w wydzielaniu IL-10, w układzie bez stymulacji PHA, w grupie
guzów nowotworowych bez i z obecnym pozytywnym odczynem cytoplazmatycznym NFkB
** W teście U Mann-Whitney’a zanotowano istotne statystyczne róznice w wydzielaniu IL-10, w układzie bez stymulacji PHA, w grupie
guzów nowotworowych bez i z obecną słabą lub średnią ekspresją NFkB (<50% kom. O dodatniej ekspresji przeciwciała)
tworowej (r=0,33, p=0,02). Wraz ze wzrostem głębokości
nacieku wzrastał stopień ekspresji NFκB-c. Stwierdzono także dodatnią korelację ekspresji NFκB(p65) w cytoplazmie komórek guza nowotworowego ze stopniem
zaawansowania zmian nowotworowych określonych
wg klasyfikacji Annerotha, Batsakisa i Luny (r=0,29,
p=0,05). Wraz ze wzrostem liczby punktów w klasyfikacji wzrastał stopień ekspresji NFκB-c. W analizie
statystycznej potwierdzono także ujemną korelację
ekspresji NFκB(p65) w cytoplazmie utkania guza i stężeniem IL-10 wydzielanej przez jednojądrzaste komórki
krwi (PBMC) w układzie badawczym bez stymulacji PHA
(r= - 0,46, p=0,02). Wraz ze wzrostem stężenia IL-10
wydzielanej przez PBMCs zmniejszał się stopień ekspresji NFκB(p65) w cytoplazmie komórek nowotworowych.
W przeprowadzonej ocenie statystycznej nie wykazano
występowania istotnych statystycznie korelacji ekspresji NFκB(p65), ocenianego w cytoplazmie komórek, wg
skali trzystopniowej nasilenia odczynu z badanymi
wykładnikami kliniczno-morfologicznymi i poziomem
IL-10. Zanotowano jedynie bliski przyjętej granicy
statystycznej istotności, związek NFκB(p65) z sumą
punktów wg zastosowanej klasyfikacji morfologicznej
(r=0,27, p=0,06). Wraz ze wzrostem zaawansowania
histopatologicznego zmian występowała tendencja do
bardziej nasilonych odczynów w cytoplazmie komórek
guza. Analiza statystyczna nie wykazała występowania
istotnych statystycznie korelacji ekspresji jądrowego
NFκB(p65) z badanymi wykładnikami kliniczno-morfologicznymi oraz poziomem IL-10, jedynie związek
z cechą G był bliski przyjętej granicy statystycznej
istotności (r=0,2; p=0.06) – wraz ze zmniejszeniem
zróżnicowania histopatologicznego nacieku nowotworowego występowała tendencja do bardziej nasilonych
odczynów w jądrach komórek guza.
Stosując analizę porównawczą otrzymanych wyników punktacji wg kryteriów klasyfikacji Annerotha,
Batsakisa i Luny w badanej grupie raków krtani, zaznaczyły się różnice istotne statystycznie między grupą
guzów bez obecności odczynu NFκB-c(p65) cytoplazmaO t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9
tycznego w komórkach a grupą nowotworów z dodatnią
immunoekspresją NFκB(p65) (p=0,05). Raki krtani
z pozytywną ekspresją NFκB(p65) charakteryzowały się
większym stopniem zaawansowania zmian nowotworowych, określonych według proponowanej klasyfikacji.
Wykazano również istotne różnice między tymi dwoma
grupami raków, uwzględniając w analizie, sposób naciekania nowotworu (p=0,02). Raki krtani z dodatnimi
odczynami IHC charakteryzowały się częściej naciekiem
wieloogniskowym, pojedynczymi grupami komórek. Przy
uwzględnieniu trzystopniowego podziału cytoplazmatycznego odczynu NFκB(p65), zanotowano występowanie
różnic istotnych statystycznie w stężeniu wydzielanej
IL-10, między grupą raków z negatywnym odczynem
NFκB(p65) a grupą ze słabą lub średnią ekspresją
NFκB (<50% komórek z dodatnią ekspresją badanego
przeciwciała), w układzie bez stymulacji PHA (p=0,04).
W analizie porównawczej stężeń wydzielanej IL-10,
z zastosowaniem skali dwustopniowej tj. oznaczonych
w grupach raków krtani bez i z pozytywnym odczynem
NFκB(p65) w cytoplazmie komórek nowotworowych,
wykazano występowanie różnic istotnych statystycznie
w układzie bez stymulacji PHA (p=0,03). Wartości stężeń
IL-10 w badanych układach w zależności od obecności
ekspresji NFκB(p65) przedstawia tabela II.
Omówienie
Jądrowy czynnik transkrypcyjny NFκB(p65/p50) odgrywa kluczową rolę w prawidłowym funkcjonowaniu
układu immunologicznego (29,30). Do genów, których
ekspresja regulowana jest przez NFκB(p65/p50), należą geny kodujące białka, kontrolujące odpowiedź
immunologiczną organizmu (także reakcję zapalną
związaną z obecnością antygenów nowotworowych),
geny antyapoptotyczne (TRAF-1,TRAF-2, kodujące kaspazy) i kodujące białka regulujące proliferację komórki,
a także białka hamujące aktywność NFκB (IκB) [3134]. Czynnik transkrypcyjny NFκB(p65/p50), obecny
niemal w każdej prawidłowo funkcjonującej komórce,
31
32
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
ulega aktywacji w odpowiedzi na sygnały zewnątrzkomórkowe m.in. interleukiny i czynniki wzrostu. Konstytutywna aktywacja NFκB(p65/p50) spowodowana m.in.
mutacjami w genach kodujących NFκB lub w genach
regulujących aktywność NFκB (geny dla IkB), może
być przyczyną rozwoju nowotworów, m.in. poprzez
zwiększanie proliferacji komórek, hamowanie zjawiska
apoptozy i nasilenie angiogenezy [35]. Wiele badań
wskazuje na znaczącą rolę nieprawidłowej regulacji
transkrypcji NFκB(p65/p50) w karcynogenezie, oraz
w determinowaniu agresywności guza a tym samym
w prognozowaniu przebiegu choroby nowotworowej
m.in. raku płaskonabłonkowym jamy ustnej, jelita
grubego, pęcherzyka żółciowego, wątroby, sutka, płuca
i chłoniakach [35-43]. W naszych badaniach wykazaliśmy pozytywną ekspresję NFκB-c w 84,4% przypadków
badanych raków krtani i pozytywną ekspresję NFκB-n
w 31,1% guzów nowotworowych, jak też istotny związek
ekspresji NFκB(p65) z głębokością inwazji nacieku oraz
ze stopniem zaawansowania zmian nowotworowych wg
kryteriów klasyfikacji Annerotha, Batsakisa i Luny.
W dostępnym piśmiennictwie liczni autorzy potwierdzili
nadmierną aktywność transkrypcyjną NFκB(p65/p50)
w komórkach nowotworowych i wysoki (57,9%) odsetek komórek guza z pozytywnym odczynem [35, 36,
38, 39]. Badacze podkreślają również występowanie
związku aktywności NFκB(p65/p50) z cechami klinicznymi i morfologicznymi guza oraz wskaźnikami
rokowniczymi [35, 36, 38, 39]. Xiao i wsp. [40] wykazali istotny związek rozległości miejscowej raka
części nosowej gardła z poziomem ekspresji genów dla
NFκB(p65/p50). Guzy o wyższej ekspresji częściej były
klasyfikowane jako pT3-pT4. Podobnie Wu i wsp. [39]
potwierdzili korelację ekspresji p65 z wielkością guza
w raku pęcherzyka żółciowego. Lerebours i wsp. [38]
potwierdzili rolę NFκB(p65/p50) jako wskaźnika złej
prognozy u chorych z rakiem sutka. Wysoka ekspresja
genów NFκB wiązała się ze wzrostem agresywności
guza nowotworowego. Również Korkolopoulou i wsp.
[41] zanotowali istotną zależność ekspresji NFκB(p65/
p50) ze stopniem zaawansowania zmian miejscowych
i prognozą u chorych z astrocytoma. Według wielu
badaczy, nowotwory o większej ekspresji transkrypcyjnego czynnika jądrowego charakteryzują się również
wyższym prawdopodobieństwem występowania przerzutów węzłowych [42]. Jin i wsp. [43] wskazują na
istotne znaczenie oceny ekspresji RelA jako czynnika
rokowniczego, związanego ze złą prognozą w raku
płuca. Według badaczy ekspresja p65 korelowała ze
stadium pT, zróżnicowaniem histopatologicznym oraz
częstszym występowaniem przerzutów węzłowych.
Interleukina 10 jest białkiem negatywnie regulującym odpowiedź immunologiczną, poprzez hamowanie
ekspresji genów kodujących prozapalne cytokiny, chemokiny, powierzchniowe cząsteczki adhezyjne i inne
białka odpowiedzialne za aktywację zjawisk odporności
nabytej jak i wrodzonej [21]. Konstytutywna aktywacja
IL-10 wydzielanej m.in. limfocyty T powoduje zmniejszenie produkcji cytokin prozaplnych (IL-6, TNFα, IL-1α,
IL-1β, IL-12p40) i zahamowanie odpowiedzi zapalnej,
również w przebiegu choroby nowotworowej [23]. Wyniki
naszej pracy są zgodne z przedstawionymi obserwacjami
innych autorów i wskazują na związek ekspresji NFκB
z poziomem IL-10 wydzielanej przez komórki monocytarne krwi. W dostępnym piśmiennictwie podkreśla się
mechanizm działania IL-10, poprzez aktywację czynnika
transkrypcyjnego STAT3 (signal transducer and activator
of transcription-3) [21, 25, 44]. Receptor dla L-10 (IL-10R)
zbudowany z dwóch podjednostek IL-10Rα posiada dwa
miejsca wiązania dla JAK1 (Janus kinase 1), których
zadaniem jest fosforylacja cząsteczek [45]. Na poziomie
wewnątrzkomórkowym, w jądrze komórki dochodzi do
transkrypcji genów, kodujących białka hamujące reakcję
zapalną, poprzez blokowanie DNA w regionie genów,
zapisujących informację genetyczną dla cząsteczek prozapalnych [25, 44]. W literaturze dotyczącej omawianego
tematu przedstawiono mechanizm aktywacji STAT3
przez IL-10, który polega na aktywacji hipotetycznych
represorów transkrypcji, które mają zdolność hamowania funkcji, kluczowych prozapalnych czynników m.in.
jądrowego czynnika transkrypcyjnego NFκB i MAPK
(miogen activated protein kinase p38 phosphorylation)
[24, 25]. Według innych autorów mechanizm działania
IL-10 miałby polegać na modyfikowaniu chromatyny, co
uniemożliwiałoby przyłączenie promotorów do nici DNA
i transkrypcję białek [21]. Działanie IL-10 miałoby zatem
polegać na blokowaniu tych cząsteczek już na poziomie
DNA komórki). W piśmiennictwie przedstawiany jest
także mechanizm aktywacji ligazy E3 pod wpływem
aktywności STAT3, która degraduje pozapalne czynniki
transkrypcyjne [21].
Wnioski
1. W przeprowadzonych badaniach wykazano istotne statystycznie zależności między poziomem ekspresji jądrowego czynnika transkrypcyjnego NF B(p65)
a badanymi cechami kliniczno-morfologicznymi guza
nowotworowego.
2. Analiza danych wykazała istotną statystycznie pozytywną korelację poziomu immunoekspresji
NFkB(p65) w cytoplazmie komórek guza z głębokością inwazji nacieku oraz ze stopniem zaawansowania
zmian nowotworowych wg kryteriów klasyfikacji Annerotha, Batsakisa i Luny.
3. Wykazano występowanie istotnych statystycznie
dodatnich korelacji między ekspresją cytoplazmatycznego NFκB(p65) i poziomem IL-10 oznaczonej we krwi
pełnej.
4. W ocenie statystycznej nie potwierdzono istotnych zależności immunoekspresji NFκB(p65) w jądrze
O t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
komórek guza a analizowanymi cechami cechami
kliniczno-morfologicznymi guza nowotworowego.
5. Przeprowadzone badania wskazują na związek
aktywności NFκB(p65) ze stopniem zaawansowania
zmian nowotworowych, określonych według proponowanej klasyfikacji morfologicznej oraz wpływ komórek
immunokompetentnych poprzez wydzielanie IL-10,
cytokiny regulatorowej i antyzapalnej, na przebieg
procesu nowotworowego.
11. Celec P. Nuclear factor kappa B - molecular biomedicine:
PIŚMIENNICTWO
14. Anest V, Cogswell PC, Baldwin AS Jr. IkappaB kinase al-
the next generation. Biomed Pharmacother. 2004; 58(6-7):
365-371.
12. Adli M, Baldwin AS. IKK-i/IKKepsilon controls constitutive, cancer cell-associated NF-kappaB activity via regulation of Ser-536 p65/RelA phosphorylation. J Biol Chem.
2006; 281(37): 26976-26984.
13. Bass res DS, Baldwin AS. Nuclear factor-kappaB and inhibitor of kappaB kinase pathways in oncogenic initiation
and progression. Oncogene. 2006; 25(51): 6817-6830.
1.
Jiang H, Yang BB. p53, epidermal growth factor recep-
pha and p65/RelA contribute to optimal epidermal gro-
tor and proliferating cell nuclear antigen in laryngeal
wth factor-induced c-fos gene expression independent of
squamous cell carcinoma are not predictive markers for
IkappaBalpha degradation. J Biol Chem. 2004; 279(30):
the effect of adjuvant radiotherapy. Acta Otolaryngol.
2009;129(1):101-107.
2.
Lukomski M, Lewy-Trenda I, Stasikowska O, Durko M,
drum DR. Human mesenchymal stem cells stimulated by
Starska K. Morphological tumor front grading and matrix
TNF-alpha, LPS, or hypoxia produce growth factors by an
metalloproteinases type I expression as a prognostic pa-
NF kappa B- but not JNK-dependent mechanism. Am J
rameter of the presence of lymph node micrometastases
in laryngeal carcinoma. Otolaryngol Pol. 2007; 61(5): 8053.
induced COX-2 expression: mediation through MAP ki-
Micozkadioglu D, Unal M, Pata YS, Bastürk M, Cinel L.
nases and NFkB, and inhibition by certain nonsteroidal
Prognostic value of expression of p53, proliferating cell
anti-inflammatory drugs. Adv Exp Med Biol. 2002; 507:
Med Sci Monit. 2008; 14(6): CR299-304.
5.
Kumar B, Cordell KG, D’Silva N, Prince ME, Adams ME,
ting of RelA. Cell Cycle. 2007 Jun 1; 6(11): 1293-1297.
18. Thoms HC, Dunlop MG, Stark LA. p38-mediated inacti-
cancer. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 2008; 134(4):
vation of cyclin D1/cyclin-dependent kinase 4 stimulates
363-369.
nucleolar translocation of RelA and apoptosis in colorectal
Marioni G, Giacomelli L, D’Alessandro E, Staffieri C, Guz-
19. Stark LA, Dunlop MG. Nucleolar sequestration of RelA
ce rate and disease-free interval are related to CD105
(p65) regulates NF-kappaB-driven transcription and apoptosis. Mol Cell Biol. 2005; 25(14): 5985-6004.
20. Starska K, Łukomski M. Regulacja cyklu komórkowego,
551-557.
procesu apoptozy, wydzielania cytokin i cząsteczek adhe-
Yoshimura A, Nishinakamura H, Matsumura Y, Hanada T.
zyjnych w limfocytach T i innych komórkach krwi obwo-
Negative regulation of cytokine signaling and immune re-
dowej oraz komórkach nowotworowych w mechanizmie
sponses by SOCS proteins. Arthritis Res Ther. 2005; 7(3):
aktywacji Toll-like receptors (TLRs) i rodziny cząsteczek
100-110.
transkrypcyjnego czynnika jądrowego NF-B. Postępy Bio-
Lam LT, Wright G, Davis RE, Lenz G, Farinha P, Dang
LM.Cooperative signaling through the signal transdu-
9.
cancer cells. Cancer Res. 2007; 67(4): 1660-1669.
zardo V, Staffieri A i wsp. Laryngeal carcinoma recurren-
L, Chan JW, Rosenwald A, Gascoyne RD, Staudt
8.
apoptosis: a novel mechanism requiring nucleolar targe-
tive markers for larynx preservation in advanced laryngeal
2 (Flk-1/Kdr) expression. Anticancer Res. 2008; 28(1B):
7.
503-508.
17. Thoms HC, Dunlop MG, Stark LA. CDK4 inhibitors and
Fisher SG i wsp. Expression of p53 and Bcl-xL as predic-
expression but not to vascular endothelial growth factor
6.
Physiol Cell Physiol. 2008; 294(3): C675-682.
16. Paik J, Lee JY, Hwang D. Signaling pathways for TNFa-
810.
nuclear antigen, and c-erbB-2 in laryngeal carcinoma.
4.
31183-31189.
15. Crisostomo PR, Wang Y, Markel TA, Wang M, Lahm T, Mel-
logii Komórki 2006; 33(4): 621-634.
21. Murray PJ. STAT3-mediated anti-inflammatory signalling.
Biochem Soc Trans. 2006; 34(6): 1028-1031.
cer and activator of transcription 3 and nuclear factor-
22. Lang R, Rutschman RL, Greaves DR, Murray PJ. Autocri-
{kappa}B pathways in subtypes of diffuse large B-cell
ne deactivation of macrophages in transgenic mice consti-
lymphoma. Blood. 2008; 111(7): 3701-3713.
tutively overexpressing IL-10 under control of the human
Sun XF, Zhang H. NFKB and NFKBI polymorphisms in
CD68 promoter. J Immunol. 2002; 168(7): 3402-3411.
relation to susceptibility of tumour and other diseases. Hi-
23. Rubtsov YP, Rasmussen JP, Chi EY, Fontenot J, Castelli
stol Histopathol. 2007; 22(12): 1387-1398.
L, Ye X, Treuting P, Siewe L, Roers A, Henderson WR Jr,
Lee CH, Jeon YT, Kim SH, Song YS. NF-kappaB as a po-
Muller W, Rudensky AY. Regulatory T cell-derived inter-
tential molecular target for cancer therapy. Biofactors.
leukin-10 limits inflammation at environmental interfa-
2007; 29(1): 19-35.
ces. Immunity. 2008; 28(4): 546-558.
10. Kim HJ, Hawke N, Baldwin AS. NF-kappaB and IKK as
24. Williams LM, Ricchetti G, Sarma U, Smallie T, Foxwell BM.
therapeutic targets in cancer. Cell Death Differ. 2006 May;
Interleukin-10 suppression of myeloid cell activation--a
13(5): 738-747.
continuing puzzle. Immunology. 2004; 113(3): 281-292.
O t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9
33
34
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
25. Murray PJ. Understanding and exploiting the endogeno-
37. Sun XF, Zhang H. NFKB and NFKBI polymorphisms in
us interleukin-10/STAT3-mediated anti-inflammatory re-
relation to susceptibility of tumour and other diseases. Hi-
sponse. Curr Opin Pharmacol. 2006; 6(4): 379-386.
stol Histopathol 2007; 22(12): 1387-1398.
26. Starska K. Rola rodziny cząsteczek transkrypcyjnego
38. Lerebours F, Vacher S, Andrieu C, Espie M, Marty M, Li-
czynnika jądrowego NF-kB w regulacji cyklu komórkowe-
dereau R, Bieche I. NF-kappa B genes have a major role in
go i zjawiska apoptozy w przebiegu onkogenezy i progresji
nowotworu. Otorynolaryngologia 2006; 5(2): 51-56.
27. John Wiley & Sons. TNM Classification of Malignant Tumours. 6th edition Hoboken, New Jersey; 2002.
inflammatory breast cancer. BMC Cancer 2008; 8: 41.
39. Wu W, Pan C, Yu H, Gong H, Wang Y. Heparanase expression in gallbladder carcinoma and its correlation to prognosis. J Gastroenterol Hepatol. 2008; 23(3): 491-497.
28. Starska K, Kulig A, Łukomski M. Anneroth, Batsakis and
40. Xiao XB, Mai HQ, Cao SM, Zhang Y, Sun R, Hong MH.
Luna’s modified classification as prognostic factor in pa-
Gene expression profile of immune cells from patients
tients with laryngeal carcinoma. Otolaryngol Pol. 2003;
with nasopharyngeal carcinoma of stage T3-4N0. Ai Zheng
57(2): 229-235.
2005; 24(2): 135-140.
29. Bonizzi G, Karin M. The two NF-kappaB activation
41. Korkolopoulou P, Levidou G, Saetta AA, El-Habr E, Efti-
pathways and their role in innate and adaptive immunity.
chiadis C, Demenagas P, Thymara I, Xiromeritis K, Bo-
Trends Immunol. 2004; 25(6): 280-288.
viatsis E, Thomas-Tsagli E, Panayotidis I, Patsouris E.
30. Mémet S. NF-kappaB functions in the nervous system:
Expression of nuclear factor-kappaB in human astrocyto-
from development to disease. Biochem Pharmacol. 2006;
mas: relation to pI kappa Ba, vascular endothelial growth
72(9): 1180-1195.
factor, Cox-2, microvascular characteristics, and survival.
31. Gilmore TD. Introduction to NF-kappaB: players, pathways,
perspectives. Oncogene. 2006; 25(51): 6680-6684.
Hum Pathol 2008; 39(8): 1143-1152.
42. Meir T, Dror R, Yu X, Qian J, Simon I, Pe’er J, Chowers
32. Hoffmann A, Natoli G, Ghosh G. Transcriptional regu-
I. Molecular characteristics of liver metastases from uveal
lation via the NF-kappaB signaling module. Oncogene.
melanoma. Invest Ophthalmol Vis Sci 2007; 48(11): 4890-
2006; 25(51): 6706-6716.
4896.
33. Perkins ND, Gilmore TD. Good cop, bad cop: the different
43. Jin X, Wang Z, Qiu L, Zhang D, Guo Z, Gao Z, Deng C,
faces of NF-kappaB. Cell Death Differ. 2006; 13(5): 759-
Wang F, Wang S, Guo C. Potential biomarkers involving
772.
IKK/RelA signal in early stage non-small cell lung cancer.
34. Basak S, Kim H, Kearns JD, Tergaonkar V, O’Dea E, Wer-
Cancer Sci 2008; 99(3): 582-589.
ner SL, Benedict CA, Ware CF, Ghosh G, Verma IM, Hoff-
44. Williams L, Bradley L, Smith A, Foxwell B. Signal trans-
mann A. A fourth IkappaB protein within the NF-kappaB
ducer and activator of transcription 3 is the dominant me-
signaling module. Cell. 2007; 128(2): 369-381.
diator of the anti-inflammatory effects of IL-10 in human
35. Escárcega RO, Fuentes-Alexandro S, García-Carrasco M,
macrophages. J Immunol 2004; 172(1): 567-576.
Gatica A, Zamora A. The transcription factor nuclear fac-
45. Donnelly RP, Sheikh F, Kotenko SV, Dickensheets H. The
tor-kappa B and cancer. Clin Oncol (R Coll Radiol). 2007;
expanded family of class II cytokines that share the IL-
19(2): 154-61.
10 receptor-2 (IL-10R2) chain. J Leukoc Biol 2004; 76(2):
36. Sethi G, Sung B, Aggarwal BB. Nuclear factor-kappaB
314-321.
activation: from bench to bedside. Exp Biol Med (Maywood) 2008; 233(1): 21-31.
O t o l a r y n g o l o g i a P o l s k a t o m 6 3 , n r 7, w r z e s i e ń 2 0 0 9