DNAPointer® System INSTRUKCJA OBSŁUGI BioVectis
Transkrypt
DNAPointer® System INSTRUKCJA OBSŁUGI BioVectis
DNAPointer® System INSTRUKCJA OBSŁUGI Numer katalogowy 105-100 BioVectis 1 Produkt DNAPointer® System przeznaczony do wykorzystania wyłącznie do celów badawczych Wszystkie znaki towarowe są wyłączną własnością ich przedstawiciela Producent BioVectis ul. Pawińskiego 5 A blok D 02-106 Warszawa, Poland Tel. +48 22 668 71 47 Fax +48 22 668 71 64 e-mail:[email protected] Zamówienia: Tel. +48 22 668 71 47 Fax +48 22 668 71 64 e-mail:[email protected] DNA Pointer® System Rok budowy: 2010 Należy zachować oryginalne opakowanie do momentu zakończenia okresu gwarancji. OSTRZEŻENIE Urządzenie może być źródłem potencjalnie śmiertelnego napięcia i może być obsługiwane tylko przez wykwalifikowany technicznie personel. Proszę dokładnie przeczytać całą instrukcję obsługi przed uruchomieniem urządzenia. Urządzenie DNA Pointer jest zgodne z ustawowymi wytycznymi bezpieczeństwa Unii Europejskiej: 73/23/EEC Dyrektywa Niskonapięciowa 89/336/EEC Dyrektywa EMC 2 Metoda MSSCP (z ang. Multitemperature Single Strand Conformation Polymorphism) To End-User License Agreement (EULA) Ograniczona umowa licencyjna dla zastosowań wyłącznie badawczych End-User License Agreement (EULA) jest umową prawną między użytkownikiem/klientem i właścicielem metody MSSCP (z ang. Multitemperature Single Strand Conformation Polymorphism) oraz producentem DNAPointer® System firmą Krzysztof Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne Sp. z o. o. (Biovectis). Metodę MSSCP można używać tylko w systemie DNAPointer® System i tylko w celach badawczych. Wszelkie komercyjne wykorzystanie metody wymaga dodatkowej umowy licencyjnej pomiędzy Biovectis i użytkownikiem systemu. Metoda w ramach procedury PCT (PCT/PL/01/00012) jest chroniona przez międzynarodowe i krajowe prawa i traktaty. Metoda jest licencjonowana i nie podlega sprzedaży. 1. Przyznanie licencji. Niniejsza Umowa Licencyjna przyznaje Ci prawo do stosowania metody MSSCP w badaniach naukowych tylko w jednej jednostce DNAPointer® System. 2. Opis innych praw i ograniczeń. Metoda nie może być używana na innym urządzeniu niż DNAPointer® System. Metoda jest licencjonowana z DNAPointer® System jako jego integralna część. Na podstawie licencji użytkownika nie wolno wynajmować lub dzierżawić metody MSSCP. Można przenieść na stałe wszystkie swoje prawa wynikające z niniejszej Umowy Licencyjnej tylko jako sprzedaż lub przeniesienie systemu, pod warunkiem, że zaprzestanie się używania metody MSSCP na jakimkolwiek innym sprzęcie. Krzysztof Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne Sp. z o. o. (Biovectis) może wypowiedzieć niniejszą Umową Licencyjną, jeśli postępowanie użytkownika nie jest zgodne z warunkami niniejszej Umowy Licencyjnej. W takim przypadku należy zwrócić właścicielowi metody wszystkie materiały i dokumentację metody MSSCP. 3. Prawa autorskie. Wszystkie prawa własności oraz prawa autorskie do metody (w tym, ale nie wyłącznie, zdjęcia lub teksty włączone do materiałów), załączone 3 materiały drukowane są własnością Krzysztof Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne Sp.z o.o.(Biovectis). 4. Pomoc techniczna. Pomoc techniczną dla produktu, metody i systemu zapewnia firma Krzysztof Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne Sp. z o. o.(Biovectis) lub jej pełnomocnik. Jeśli mają Państwo jakiekolwiek pytania dotyczące niniejszej Umowy, lub też potrzebują skontaktować się z Krzysztof Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne Sp. z o. o. (Biovectis), proszę zapoznać się z danymi teleadresowymi zawartymi w instrukcji użytkownika. 4 DNAPointer® System GWARANCJA Krzysztof Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne sp. z o. o. (Biovectis) gwarantuje, że dostarczony Państwu aparat DNAPointer® System został przetestowany i spełnia wszystkie warunki specyfikacji. Niniejsza gwarancja jest ważna przez 12 miesięcy tylko wtedy, gdy produkt i funkcje zostały wykorzystane zgodnie z instrukcją obsługi. Producent nie bierze odpowiedzialności za straty lub szkody wynikające z nieprawidłowego korzystania z aparatu DNAPointer® System. Odpowiedzialność producenta jest ograniczona do naprawy, wymiany urządzenia lub zwrotu kosztów zakupu. Krzysztof Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne sp. z o.o. (Biovectis) zastrzega sobie prawo do zmiany specyfikacji systemu bez wcześniejszego powiadomienia. Proszę uważnie przeczytać w instrukcji obsługi przed rozpoczęciem korzystania z systemu DNA Pointer® System. POINTER DNA powinny być używane tylko przez osoby odpowiednio wykwalifikowane i przeszkolone. Jeśli system DNA Pointer® System nie jest używany w sposób określony w niniejszej instrukcji, ochrona niniejszej gwarancji może być naruszona. 5 Rozdział 1. Informacje podstawowe 1.1. Wprowadzenie Urządzenie DNA Pointer® System jest narzędziem skutecznej analizy zmienności genetycznej. System jest otwartą platformą dla kilku metod genetycznych w oparciu o elektroforetyczne rozdzielanie kwasów nukleinowych: • Single Temperature - SSCP • MultiTemperature - MSSCP • Gradient Temperature – Gradient temperatury w czasie • Custom – dowolne połączenie powyższych metod DNAPointer System jest szczególnie skuteczny w wykrywaniu mutacji punktowych w analizowanych produktach PCR za pomocą wielotemperaturowego SSCP (MSSCP). DNAPointer® System jest szczególnie przydatny przy analizie niejednorodnego materiału lub analizie wysoce zmiennych regionów DNA. Analiza MSSCP pozwala na wykrycie mniejszościowych wariantów genetycznych w różnorodnym materiale jak również pozwala na wykrycie nowych mutacji punktowych. Zalety Systemu DNA Pointer: System DNA Pointer jest wyposażony w unikalny algorytm kontroli temperatury badanej próbki, który gwarantuje: • wysoki współczynnik wykrywania mutacji i SNP na poziomie 90-95%, • wysoką powtarzalność wyników • krótki czas analizy DNA Pointer® System wyposażony jest w intuicyjne oprogramowanie sterujące procesem elektroforezy. Zastosowanie wymienionych powyżej metod w systemie DNA Pointer® System jest szczególnie skuteczne, gdy do analiz używane są dedykowane i zoptymalizowane zestawy chemiczne. 6 Rysunek 1. DNA Pointer® System. DNA Pointer® System składa się z dwóch podstawowych modułów: 1. DNA Pointer® System – jednostka główna (zawierająca wbudowany zasilacz wysokonapięciowy) 2. Komputer PC Notebook z dedykowanym oprogramowaniem sterującym 1.2. Metoda MSSCP DNA Pointer® System połączony z metodą MSSCP jest wyjątkowo skutecznym narzędziem gwarantującym: • Wyższy współczynnik wykrywania mutacji niż przy wykorzystaniu klasycznej metody SSCP. Współczynnik wykrywania dla metody MSSCP wynosi 90-95% w porównaniu z 85-90% przy SSCP. • Krótki czas analizy • Znacząca redukcja kosztów genotypowania (stosując elektroforezę natywną w żelach poliakrylamidowych: nie ma potrzeby oznaczania fragmentów PCR, nie ma potrzeby powtarzania elektroforez SSCP w różnych warunkach temperaturowych) • Wysoką powtarzalność wyników dzięki wykorzystaniu modułu MULTIPOL do równoległego wylewania do 8 żeli 7 • Równoczesną analizę i oczyszczanie próbki do dalszego wykorzystania np. sekwencjonowania –(próbki DNA mogą być odzyskane z ssDNA uzyskanych po elektroforezie w celu późniejszej analizy). Rysunek 2. Porównanie wyników za pomocą genotypu SSCP i MSSCP metody siedmiu wariantów eksonu 7 ludzkiego genu PAH. Siedem różnych wariantów eksonu 7 ludzkiego genu PAH było multiplikowanych w reakcji PCR. Produkty amplifikacji zostały zdenaturowane (94C, 5 min.) i schłodzone na lodzie, a następnie nałożone na natywny żel PA w buforze TBE. Po elektroforezie (około 60 minut) fragmenty ssDNA zabarwiono stosując barwienie srebrem (Silver Stain kit) w czasie 40 minut. (A-C) Wyniki analizy SSCP próbek w różnych temperaturach żelu: (A) 34C, (B) 22C, (C) 10C. (D). Wyniki analizy MSSCP w zakresie temperatur 34/22/10C. 1.3. Specyfikacja Tabela 1. DNAPointer System - dane techniczne Parametr Wartość Rozmiar żelu 2 40 mm x 180 mm 8 Zakres kontroli temperatury 2°C do 65°C Dokładność pomiaru temperatury - 0.2°C w pełnej skali Maksymalne napięcie elektroforetyczne 3000 VDC Maksymalna moc elektroforezy 50 W Maksymalny prąd elektroforezy 300 mA Dokładność kontroli parametrów elektrycznych ± 1,5% 500 A Upływność prądu powodująca odcięcie napięcia elektroforetycznego Zasilanie 220-240 VAC, 50-60 Hz, 600 W Waga netto 26 kg Wymiary (wxhxd ) mm 502 x 504 x 570 mm UWAGA! Aparat ten jest przeznaczony tylko do użytku wewnętrznego. Tabela 2. Warunki środowiskowe Parametr Wartość Zakres temperatury otoczenia 4°C - 35°C. Maksymalna wilgotność względna 80% w zakresie 4°C - 25°C 1.4. Zasady bezpieczeństwa UWAGA! • Urządzenie jest zdolne do wytworzenia potencjalnie śmiertelnego napięcia i może być obsługiwane tylko przez wykwalifikowany personel. • Przeczytaj całą instrukcję operacji przed użyciem. • Podczas elektroforezy pokrywa komory elektroforetycznej ze względów bezpieczeństwa powinna być zawsze zamknięta. • Należy napełniać zbiorniki na bufor elektroforetyczny tylko do wyznaczonego poziomu maksymalnego. • Nie należy przenosić urządzenia, gdy jest uruchomione. 9 • Podczas elektroforezy bardzo niewielkie ilości różnych gazów są wytwarzane na elektrodach w wyniku elektrolizy. Rodzaj gazu zależy od składu wykorzystanego buforu. Urządzenie używać w sprawnie wentylowanym pomieszczeniu. 1.5. Informacje o zamawianiu DNAPointer System numer katalogowy 105-100 10 Rozdział 2. Opis głównych elementów systemu 2.1. Jednostka główna DNAPointer ® System jest zaawansowanym, łatwym w użyciu systemem elektroforetycznym o unikalnej zdolności do kontroli temperatury próbki z dokładnością do 0,2°C. W skład systemu wchodzą: zintegrowany aparat do elektroforezy składający się z komory elektroforetycznej wyposażonej w moduł wymiany ciepła oraz komputer z dedykowanym oprogramowaniem. Temperatura w żelu jest kontrolowana podczas elektroforezy z dokładnością do 0,2C, poprzez kontakt zestawu szyb i żelu z blokiem wymiennika ciepła. Podczas elektroforezy temperatura może być utrzymywana na stałym poziomie (SSCP), lub zmieniać się liniowo (Gradient temperatury) lub zmieniać się krokowo (MSSCP). Precyzyjna regulacja temperatury pozwala wykonywać powtarzalne elektroforezy i skuteczne wykrywać mutacje. Całkowity czas elektroforezy w DNA Pointer® System zależy od aplikacji. Rysunek 3. DNA Pointer® System 11 2.2. Moduł wymiany ciepła Moduł wymiennika ciepła pozwala na prowadzenie elektroforez w warunkach dużej mocy (40-50 W) przy zadanej temperaturze. Zastosowanie wysoce wydajnych termomodułów zapewnia doskonałą stabilizację temperatury próbek w żelu lub dynamiczną jej zmianę. Moduł wymiany ciepła stabilizuje temperaturę żelu podczas elektroforezy w zakresie od 4°C do 65°C z dokładnością 0,2°C. 2.3. Zasilacz wysokonapięciowy Zasilacz wysokonapięciowy jest zintegrowany z systemem DNAPointer. Zapewnia do 50 W mocy podczas elektroforezy. Zasilacz jest zaprogramowany i sterowany oprogramowaniem DNAPointer. 2.4. Jednostka sterująca - Komputer PC Jednostką sterującą jest komputer PC z systemem MS Windows, który dzięki zainstalowanemu oprogramowaniu prowadzi elektroforezę oraz kontroluje wszystkie jej warunki. Parametry elektroforezy projektowane są poprzez łatwy w obsłudze interfejs. Profile elektroforezy można zapisywać i korzystać z nich przy kolejnych elektroforezach. 2.5. Oprogramowanie DNA Pointer® System software Algorytm wprowadzony do oprogramowania pozwala na precyzyjną kontrolę temperatury Algorytm oparty na modelu rozpraszania ciepła pozwala na precyzyjną kontrolę temperatury próbki wewnątrz żelu, niezależnie od mocy zastosowanej w elektroforezie. 2.6. DNA Pointer® System Multipol – moduł równoległego wylewania żeli DNA Pointer® System Multipol pozwala na jednoczesne przygotowanie do ośmiu identycznych poliakrylamidowych żeli. Żele poliakrylamidowe powinny być przygotowane co najmniej 18 godziny przed elektroforezą. Stosowanie tej zasady zapewnia wiarygodność wyników i wysokie tempo wykrywania polimorfizmów pojedynczego nukleotydu we fragmentach DNA . Żele odpowiednio zabezpieczone przed wyschnięciem mogą być przechowywane w Multipolu w temperaturze +4°C przez 1 do 2 tygodni. Aby zapobiec 12 wysuszeniu żeli należy Moduł Multipol szczelnie zamknąć, wlewając uprzednio do pudełka kilka mililitrów buforu TBE. DNA Pointer® System MULTIPOL zawiera: 1. Główne pudełko z ruchoma ścianką przednią 1 szt. 2. Śruby dokręcające 8 szt. 3. Arkusze folii 9 szt. 4. Pokrywę 1 szt. 5. Rurkę ze strzykawką 1 szt. 6. Zaworek 1 szt. 7. Uchwyt do podtrzymania korpusu strzykawki 1 szt. Rysunek 4. DNA Pointer® System MULTIPOL 2.7. DNA Pointer® System DryOut – moduł suszenia żeli PA DNA Pointer® System DryOut jest to zestaw do ręcznego wygodnego i łatwego suszenia żeli. Żele są suszone przez noc pomiędzy dwoma arkuszami folii półprzepuszczalnej pozwalającej na odparowanie wody. Wysuszone żele są idealne do skanowania i mogą być przechowywane przez bardzo długi okres bez utraty jakości. 13 Rysunek 5. DNA Pointer® System DryOut 14 Rozdział 3. Rozpakowanie i instalacja 3.1. Rozpakowanie Prosimy o zachowanie wszystkich materiałów opakowaniowych, aż do wygaśnięcia gwarancji. 3.2. Lista elementów zestawu Tabela 3. Lista elementów DNAPointer® System Nr. kat. Opis Ilość 105-100 DNA Pointer® System jednostka główna 1 szt. 105-210 Komputer PC Notebook 1 szt. 200-101 Silver Staining Kit (15 żeli) 1 szt. 200-150 Bufor TBE 10x (pH 8,5) 1 litr 200-131 Poliakrylamidy mix 30% T, 3,3% C (29:1) + 15% glicerolu 100 ml 200-175 Ammonium Persulfate solution 10% (w/v) 5 ml 200-155 TEMED 1 ml 200-141 MSSCP Bufor denaturujący A 5 ml 200-142 MSSCP Bufor denaturujący B 2 ml 200-145 Bufor obciążający (loading buffer) 6x 1 ml 105-111 Przekładki 0,5 mm (2 szt.) 1 zestaw 105-123 Grzebień 0,5 mm x 44 studzienki 1szt. 105-151 Zestaw szyb gr. 3 mm – szyba z nacięciem 1 szt. + 1 zestaw szyba pełna 1 szt. (240 x 197 mm) 105-171 Stelaż do suszenia szyb 1 szt. 105-161 DNA Pointer® System Multipol 1 szt. 105-181 Pojemnik szklany do barwienia żeli PA z pokrywką (210 x 260 x 40 1 szt. mm) 105-191 DNA Pointer® System DRYOUT + folie do suszenia (35 szt.) 1 zestaw 105-200 Oprogramowanie DNA Pointer® System 1 szt. 15 105-195 DNA Pointer® System Instrukcja obsługi 1 szt. 3.3. Wybór miejsca pracy Instalacji DNAPointer® System należy dokonać w dobrze wentylowanym pomieszczeniu. Nie należy umieszczać Pointer DNA w miejsce w pobliżu elementów grzewczych. System powinien zostać zainstalowany na płaskiej, równej powierzchni. UWAGA! Należy unikać zasłaniania otworów wentylacyjnych w obudowie jednostki głównej DNA Pointer® System. Należy zapewnić możliwość swobodnej wentylacji urządzenia. 3.4. Instalacja DNA Pointer® System a) Ustaw DNAPointer® System jednostkę główną na równej powierzchni stołu lub blatu roboczego. b) Umieść w pobliżu jednostki główne komputer PC Notebook. c) Podłącz przewód zasilający do gniazda zasilania znajdującego się na tylnej ściance jednostki głównej DNAPointer® System. Drugi koniec kabla zasilającego podłącz do sieci zasilającej. d) Połącz kablem komunikacyjnym jednostkę główną DNAPointer® System (dokręć nakrętkę przy nasadzie wtyczki portu komunikacyjnego) z komputerem PC umieszczając wtyczkę USB w dowolnym porcie USB komputera. e) Podłącz komputer PC za pomocą dołączonego zasilacza do sieci zasilającej. 16 Rysunek 6. Widok z tyłu jednostki głównej DNA Pointer® System. f) Włącz komputer PC i poczekaj, aż system operacyjny będzie gotowy do pracy. g) Uruchom poprzez dwukrotne kliknięcie program Instacal (ikona na pulpicie komputera) lub START/Wszystkie programy/ Measurement Computing/Instacal (Rysunek 7). Rysunek 7. Ikona programu instalacyjnego Instacal. h) Po prawidłowym podłączeniu jednostki głównej DNA Pointer® System do komputera i uruchomieniu oprogramowania na ekranie komputera powinien pokazać się komunikat jak na rysunku 8. Rysunek 8. Okno zgłoszenia jednostki głównej DNAPointer® System i) Kliknij przycisk OK. Następnie prawym przyciskiem muszy naciśnij na zgłoszonej karcie i wybierz Configure (Rysunek 9). 17 Rysunek 9. Wybór okna konfiguracji. j) Z rozwijanej listy No. Of Channels: wybierz opcję 8 Single Ended, kliknij OK i zamknij program Instacal (Rysunek 10). Rysunek 10. Wybór trybu pracy „8 Sinle Ended”. k) Uruchom oprogramowanie DNAPointer® System software. 18 UWAGA! W celu zapewnienia prawidłowej pracy systemu zaleca się każdorazowo po każdym uruchomieniu komputera lub po rozłączeniu kabla komunikacyjnego ponowna instalację systemu za pomocą programu Instacal. Jeśli po uruchomieniu programu Instacal karta komunikacyjna będzie widoczna należy postępować wg kolejnych poniższych punktów instrukcji l) Usuń kartę komunikacyjną poprzez kliknięcie prawym przyciskiem myszy na nazwie karty i wybór polecenia Remove Board i zatwierdzenie OK (Rysunek 11). Następnie kliknąć przycisk Refresh Boards (Rysunek 12) i postępować wg punktów od 8 do 11. Rysunek 11. Usuwanie karty komunikacyjnej. 19 Rysunek 12. Refresh Boards. 3.5. Instalacja oprogramowania DNA Pointer® System Oprogramowanie DNA Pointer® System software jest zainstalowane w komputerze sterującym PC. W przypadku potrzeby ponownej instalacji oprogramowania prosimy o kontakt z działem technicznym firmy Krzysztof Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne sp. z o.o. Dane teleadresowe zamieszczone są w rozdziale 12. 3.6. Wymagania sprzętowe. Komputer PC: 1. Procesor 600 MHz lub szybszy (Intel, Intel Celeron, AMD) 2. Windows 2000, Windows XP, Windows Vista, Windows 7. 3. 256 MB pamięci RAM lub więcej. 4. 200 MB wolnego miejsca na dysku twardym. 5. Dodatek DotNetFX v.4 20 Rozdział 4. Metoda MSSCP 4.1. Zalecenia dla metody MSSCP Multitemperature Single Stand Conformation Polymorphism (MSSCP) jest prostą i niezawodną techniką elektroforezy, którą można wykorzystać do wykrywania mutacji punktowych w kwasach nukleinowych. Najlepsze wyniki uzyskuje się analizując fragmenty PCR o długości od 150 do 350 par zasad. MSSCP wykorzystuje własności fizyczne kwasów nukleinowych. Pojedyncze nici kwasów nukleinowych przyjmują charakterystyczną strukturę przestrzenną w warunkach natywnych. Struktura ta zależy od sekwencji nukleotydów fragmentu DNA. Pojedynczy fragment nici DNA zawierających mutację punktową przyjmie inną strukturę od typu dzikiego. Różniące się od siebie struktury można rozdzielić za pomocą elektroforezy wykorzystując ich różną mobilność elektroforetyczną. Technika MSSCP jest udoskonaleniem metody SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism), powszechnie stosowanej techniki wykrywania mutacji. Głównymi parametrami fizycznymi wpływającymi na konformery ssDNA i na ich strukturę przestrzenną są pH, siła jonowa i temperatura. W wielotemperaturowym SSCP (MSSCP) separacja elektroforetyczna odbywa się w krokowo zmienianej temperaturze. Zmiany temperatury w trakcie elektroforezy powodują zmianę konformacji przestrzennej fragmentów ssDNA. Działanie takie zwiększa prawdopodobieństwo, że cząsteczki ssDNA różniące się nawet jednym nukleotydem przyjmą różne kształty w kolejnym kroku temperatury analizy MSSCP, a zatem zmienią swoją mobilność elektroforetyczną w stosunku do poprzedniego kroku temperaturowego i ulegną rozdzieleniu. Efekcie, wykrywalność mutacji techniką MSSCP w porównaniu do SSCP jest znacznie wyższa. Metoda MSSCP daje wiarygodne wyniki we wszystkich eksperymentach, gdzie znaczna liczba próbek badana jest pod kątem mutacji znanych i nieznanych. MSSCP może być z powodzeniem stosowane w projektach exon re-sequencing w celu ograniczenia próbek przeznaczonych do ponownego sekwencjonowania. Zaleca się aby podczas analizy MSSCP ilość nanoszonego DNA wynosiła 100-500 ng. 21 Referencje: 1. R. Kaczanowski, L. Trzeciak, K. Kucharczyk, Electrophoresis 2001, 22, 3539-3545. 2. Orita, M., Iwahana, H., Kanazawa, H., Hayashi K., Sekiya, T., Mat. Natl. Acad. Sci. USA 1989, 86, 2766-2770. 3. Hongyo, T., Buzard, GS, Calvert, RJ, Weghorst, CM, Nucleic Acids Res. 1993, 21, 36373642. 4. Murakami Y. Hayashi K., Sekiya, T., Cancer Res. 1991, 51, 3356-3361. 5. Sheffield, VC, Beck, JS, Kwitek, AE, Sandstrom, DW, Stone, EM, Genomics 1993, 16, 325332. 4.2. Protokół MSSCP Protokół MSSCP zawiera sześć kroków, które są wymagane do poprawnego wykonywania elektroforezy metodą MSSCP: 1. Amplifikacja interesującego obszaru za pomocą reakcji PCR. 2. Przygotowanie DNAPointer® System do elektroforezy 2.1. Wylanie żelu. 2.2. Zaprogramowanie profilu elektroforezy MSSCP. 2.3. Przeprowadzenie preelektroforezy. 3. Denaturacja próbek. 4. Naniesienie próbek na żel i przeprowadzenie elektroforezy. 5. Barwienie żelu. 6. Interpretacji wyników. Wszystkie powyższe czynności są opisane w kolejnych rozdziałach instrukcji. 4.3. Amplifikacja DNA w reakcji PCR Długość fragmentów DNA nie powinna przekraczać 150-350 par zasad. W przypadku dłuższych fragmentów obserwujemy stały spadek efektywności wykrywania mutacji przy użyciu metody MSSCP. Produkty PCR wykorzystywane do analizy powinny być specyficzne. Niespecyficzne produkty PCR tworzą dodatkowe prążki w profilu MSSCP co znacznie utrudnia interpretację wyników. 22 Rozdział 5. Przygotowanie systemu do elektroforezy DNA Pointer® System to otwarta platforma oparta na elektroforetycznej separacji DNA/RNA. Skład żelu elektroforetycznego uzależniony jest od zastosowanej metody. Zalecamy stosowanie DNA Pointer® System Multipol do równoległej polimeryzacji do ośmiu żeli, które mogą być przechowywane przez 1 do 2 tygodni w temperaturze +4°C. Wykorzystanie modułu Multipol gwarantuje pełną polimeryzację żelu PA przed elektroforezą oraz ich jednorodność. Przygotowanie żeli w DNA Pointer® System Multipol jest wygodne i szybkie. 5.1. Wylewanie żeli poliakrylamidowych dla elektroforezy MSSCP Procedura postępowania: 1. Przygotuj odpowiednią liczbę czystych, suchych zestawów szybowych – szyby należy umyć wodą destylowaną i wysuszyć na powietrzu. Zaleca się przetrzeć płytki szklane 10% roztworem EtOH przed zalaniem żelu. 2. Przygotuj roztwór akrylamidu zgodnie z dołączoną do zestawu instrukcją. 3. Odkręć śruby dociskające i zdejmij przednią ściankę w DNA Pointer® System Multipol. 4. Umieść pojemnik na płaskiej powierzchni (Rysunek 13). Rysunek 13. Pudełko Multipol umieszczone na płaskiej powierzchni. 5. Umieścić wewnątrz zestawy szybowe składające się z szyb, grzebieni i przekładek i oddziel kolejne zestawy foliowymi arkuszami dystansowymi w następującej kolejności (Rysunek 14): 23 a) Arkusz folii b) Zestaw szybowy z grzebieniem i przekładkami c) Arkusz folii d) Kolejny zestaw szybowy z grzebieniem i przekładkami Itd. Rysunek 14. Złożenie zestawu DNA Pointer® System Multipol. 6. Po umieszczeniu ostatniego zestawu szybowego należy umieścić ostatni arkusz folii, nałożyć ściankę przednią i dokręcić ją za pomocą śrub dociskowych (Rysunek 15). Rysunek 15. Montaż ścianki dociskowej. 7. Ustaw DNA Pointer® System 24 Multipol w pozycji pionowej, umieść pokrywę na górnej powierzchni pojemnika i dokręć ją śrubami (Rysunek 16). Rysunek 16. Montaż ścianki górnej DNA Pointer® System Multipol. 6. Podłącz rurkę ze strzykawką do króćca i napełnij pojemnik roztworem akrylamidu do poziomu wyznaczonego przez krawędź górną włożonych szyb (Rysunek 17). Rysunek 17. Podłączenie rurki do króćca. 25 8. Po wstępnej polimeryzacji żelu (około 1 h) odłącz rurkę i usuń z niej pozostałości akrylamidu. Na powierzchnię polimeryzującycego akrylamidu nalej około 5 ml buforu TBE 0,5x i zamontuj pokrywę górną. Przechowuj żele przez okres od 1 do 2 tygodni. 5.2. Instalacja żelu w komorze elektroforetycznej Procedura postępowania: 1. Wyjąć jeden zestaw szybowy ze spolimeryzowanym żelem i przepłucz zewnętrzne powierzchnie szklane wodą dejonizowaną w celu pozbycia się pozostałości akrylamidu. Należy zwrócić uwagę czy do szyby nie jest przyklejony bezbarwny arkusz folii. 2. Delikatnie wyjmij grzebień, upewniając się, że studzienki nie są uszkodzone. (Grzebień można również usunąć po zalaniu zbiorników buforem) 3. Otwórz pokrywę jednostki głównej DNA Pointer® System. 4. Przesuń przedni panel dociskowy zwalniając zatrzaski, przekręcając je ruchem skrętnym do środka aparatu i odciągając do siebie panel (Rysunek 18). Rysunek 18. Otwieranie przedniego panelu komory elektroforetycznej. 5. Umieść zestaw szybowy z żelem pomiędzy panelem dociskowym i płytą termiczną w taki sposób by wycięcie w jednej z szyb zwrócone było na zewnątrz aparatu. 6. Dociśnij przedni panel dociskowy, przekręć zatrzaski ruchem skrętnym na zewnątrz a następnie je zatrzaśnij. 26 5.3. Napełnienie zbiorników buforowych W celu przygotowania buforu elektroforetycznego patrz załącznik. Na jedną elektroforezę zużywany jest bufor elektroforetyczny w objętości około 400 ml. Należy zwrócić uwagę by napełniając zbiorniki buforowe nie przekroczyć poziomu maksymalnego zaznaczonego na zbiorniku wyżłobioną linią. 5.4. Czyszczenie studzienek przed elektroforezą Przed elektroforezą należy pozbyć się ze studzienek ewentualnych pozostałości żelu PA. W tym celu należy przemyć każdą studzienkę silnym strumieniem roztworu buforu TBE używając 1 ml pipety lub strzykawki. 5.5. Programowanie profilu elektroforezy Szczegółowy opis zaprogramowania profilu elektroforezy w DNA Pointer® System przedstawiony jest w załączniku. Prosimy o zapoznanie się przed uruchomieniem elektroforezy. 5.6. Preelektroforeza Preelektroforeza pozwala na stabilizację żelu przed elektroforezą. Podczas preelektroforezy, która trwa około 100 Vxh w temperaturze 20°C, 30 W usuwany jest nadmiar jonów z żelu. Pozwala to na wykonywanie bardziej powtarzalnych rozdziałów kw. nukleinowych. 5.7. Przygotowanie próbek Próbki powinny być wymieszane z buforem denaturującym w stosunku 1:2 lub wyższym. Do analizy powinno wyć wykorzystywane od 100 do 500 ng DNA dla każdej próbki. Procedura postępowania: a) Wymieszanie próbki z buforem denaturującym b) Denaturacja termiczna w temperaturze 95°C przez 5 min c) Przełożenie próbek na lód I dodanie 1/6 objętości buforu denaturującego B d) Nakładanie próbek na żel 27 UWAGA! Dla grzebienia o ilości zębów 44 maksymalna objętość próbki (z buforami) powinna wynosić 10 uL. Dla grzebienia o ilości zębów 33 maksymalna objętość próbki (z buforami) powinna wynosić 14 uL. 5.8. Elektroforeza Proces elektroforezy w DNA Pointer® System po nałożeniu próbek i uruchomieniu procesu nie wymaga uwagi. Rozdział odbywa się automatycznie i trwa około 1,5-2 godzin w zależności od długości fragmentów DNA, gęstości i rodzaju użytego poliakrylamidu i parametrów elektrycznych elektroforezy. 5.9. Usunięcie żelu Po zakończeniu elektroforezy zasilacz przełącza się w tryb Gel Saver. Jest to końcowy etap, w którym utrzymywane są warunki 30V i +4°C w celu zapobieżenia dyfuzji biernej próbek w trakcie oczekiwania na działanie użytkownika. Po przejściu w tryb Gel Saver na ekranie pojawia się odpowiedni komunikat. Procedura postępowania: a) Wyłącz tryb Gel Saver odpowiednim przyciskiem b) Wybierz opcję New Electrophoresis jeśli zamierzasz prowadzić kolejną elektroforezę lub zakończ działanie programu. c) Wyłącz DNA Pointer® System poprzez wyłączenie wyłącznika głównego d) Otwórz pokrywę e) Usuń bufor elektroforetyczny poprzez otwarcie zaworów i zlanie buforu wężykami. f) Zamknij zawory g) Oczyść zbiorniki buforowe wodą destylowaną zlewając wodę tak jak bufor elektroforetyczny. h) Otwórz przedni panel dociskowy komory. i) Wyjmij zestaw szybowy z żelem w środku. j) Pozostaw pokrywę aparatu DNA Pointer® System otwartą w celu osuszenia. 28 k) Delikatnie wydobądź żel rozkładając szyby. Umieścić żel w roztworze 10% EtOH i rozpocznij procedurę barwienia (patrz załącznik dotyczący barwienia srebrem oraz suszenia żeli). l) Barwienie za pomocą Silver Stain Kit. Uwaga! Aby utrzymać wysoką jakość barwienie srebrem nie wolno dotykać powierzchni żelu. m) Suszenie żelu w zestawie DNA Pointer® System DryOut. n) Skanowanie i analiza żelu. 29 Rozdział 6. Analiza żelu W celu archiwizacji lub dalszej obróbki obrazu żelu należy żel zarchiwizować przy użyciu dedykowanego systemu archiwizacji żeli KTE Video (nr kat. 134-190). Dalsza obróbkę obrazu żelu można przeprowadzić za pomocą oprogramowania GelScan (nr kat. 190-100) Rysunek 19. Analiza MSSCP mutacji punktowych w eksonie 1 genu ludzkiego KCNE1. Produkty PCR po denaturacji zostały rozdzielone w 9% żelu poliakrylamidowym T w temperaturze 35-15-5°C. Po elektroforezie żel barwiono Silver Stain Kit (nr kat. 200-101), suszono i skanowano. 30 Rozdział 7. Utrzymanie 7.1. Czyszczenie Wszystkie części plastikowe DNA Pointer® System wykonane są z PMMA. Należy je czyścić wodą z łagodnym detergentem. Nie należy używać rozpuszczalników organicznych (etanol, kwasy) do czyszczenia części plastikowych. Ich grozi trwałym zniszczeniem części plastikowych. Po każdej elektroforezie należy przepłukać górny i dolny zbiornik buforowy wodą destylowaną w celu usunięcia resztek żelu PA oraz buforu elektroforetycznego. Po płukaniu należy pozostawić aparat z otwartą pokrywą przednią do wyschnięcia. W okresach 6-miesięcznych należy kontrolować poziom płynu chłodniczego. W razie potrzeby należy go uzupełnić wodą destylowaną z dodatkiem glikolu etylenowego. 7.2. Awarie systemu Żadna część DNA Pointer® System nie może być serwisowana przez osoby nie przeszkolone. W razie konieczności urządzenie powinno zostać przekazane do autoryzowanego serwisu lub do producenta. 31 Rozdział 8. Wsparcie techniczne 8.1. Dane teleadresowe - kontakty Krzysztof Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne Sp. z o.o. ul. Pawińskiego 5A/D 02-106 Warszawa, Polska Tel.: +48 22 668 71 64 Tel.: +48 22 668 71 47 Fax: +48 22 668 71 64 Email: [email protected] 32 Rozdział 9. Sprzęt i akcesoria DNA Pointer® System Akcesoria Tabela 4. Akcesoria Numer katalogowy Opis 105-161 Multipol DNA Pointer – zestaw do wylewania kilku żeli jednocześnie 105-151 Szyby DNAPointer® (szkło float) 105-171 Statyw do suszenia szyb 105-181 Pojemnik szklany przezroczysty z pokrywą 105-111 Przekładki teflonowe gr. 0,5 mm 105-112 Przekładki teflonowe gr. 1,0 mm 105-121 Grzebień teflonowy 0,5 mm/24 studzienek 105-122 Grzebień teflonowy 0,5 mm/33 studzienki 105-123 Grzebień teflonowy 0,5 mm/44 studzienki 105-124 Grzebień teflonowy 1,0 mm/24 studzienek 105-125 Grzebień teflonowy 1,0 mm/33 studzienki 105-126 Grzebień teflonowy 1,0 mm/44 studzienki 152-102 Kable połączeniowe 105-191 Dryout Zestaw do suszenia żeli 33 Rozdział 10. Procedury dodatkowe 10.1. Ekstrakcja ssDNA z żelu. Podczas elektroforezy MSSCP konformery ssDNA są rozdzielane i mogą być ekstrahowane z żelu a następnie używane jako matryca do sekwencjonowania metodą Sangera. 10.2. MSSCP Starter Kit MSSCP Starter Kit jest dedykowanym zestawem odczynników chemicznych przeznaczonym do genotypowania metodami MSSCP i SSCP. Zoptymalizowany zestaw zawiera wszystkie materiały niezbędne do przygotowania i uruchomienia metod MSSCP i SSCP systemie DNA Pointer® System. Zestaw zawiera roztwór akrylamidu, katalizatory polimeryzacji, bufor elektroforetyczny TBE oraz bufory denaturujące do przygotowania próbki. Odczynniki zapewniają wysoki współczynnik wykrywania SNP, wysoką jakość rozdziałów i ich powtarzalność. 10.3. Przygotowanie roztworu akrylamidu do wylania żelu Czułość MSSCP i SSCP jest uzależniona od typu żelu stosowanego do elektroforezy. Zazwyczaj używane są żele poliakrylamidowe o stężeniu 6-10% akrylamidu i stężeniu bisakrylamidu 1,5-5%. Glicerol w stężeniu 3-5% jest powszechnie stosowany jako dodatek do żelu i zazwyczaj poprawia czułość wykrywania polimorfizmów pojedynczego nukleotydu. Żele do techniki MSSCP przygotowywane są w buforze TBE. Zalecamy stosowanie żeli przygotowanych z użyciem 0,75x TBE oraz buforów elektroforetycznych o stężeniu 0,5x TBE. Zalecamy przygotowywanie żeli za pomocą zestawu DNA Pointer® System Multipol. UWAGA! Żel poliakrylamidowy powinien być przygotowany co najmniej 18 godzin przed elektroforezą. Rekomendujemy przygotowanie 4 lub 8 żeli w zestawie DNAPointer® System Multipol. Zabezpieczone żele mogą być przechowywane w temperaturze+4°C przez 1 do 2 tygodni. Aby zapobiec wysuszeniu żelu należy wlać około 5 ml 1x TBE lub 0,75x TBE na górę każdej żelu i owinąć go szczelnie folią lub pozostawić w szczelnie zamkniętym pudełku DNA Pointer® System Multipol. Stężenie żelu zależy od wielkości badanego fragmentu PCR. Stężenie żeli stosowanych w 34 MSSCP wynosi od 6% dla fragmentów PCR dłuższych niż 300 bp do 10% dla fragmentów krótszych niż 150 bp. Tabela 5. Przygotowanie 10%T, 3,3%C, 5% glicerolu w 0,75x TBE dla DNA Pointer® System Multipol. 4 żele 8 żeli 12 ml 24 ml 53,3 ml 106,6 ml APS 10% (w/v) 1,12 ml 2,24 ml H2O 93,42 ml 186,84 ml 160 l 320 µl 10x TBE buffer Roztwór akrylamidu (30% T, 3,3 %C 15% glycerol) TEMED 10.4. Przygotowanie buforu elektroforetycznego TBE Zalecamy stosowanie 0,5x TBE jako buforu do elektroforezy. Aby przygotować 400 ml 0,5x TBE należy zmieszać 20 ml 10x TBE z 380 ml dejonizowanej wody (miliQ 18,4 MOhm) 10.5. Zestaw Silver Stain Kit Zestaw do barwienia Silver Stain Kit to zestaw odczynników chemicznych do barwienia żeli poliakrylamidowych MSSCP. Zoptymalizowany zestaw do barwienia srebrem zapewnia powtarzalne nieradioaktywne wykrywanie kwasów nukleinowych lub białek w żelu poliakrylamidowym w sposób szybki, wygodny i wydajny. Zestaw wykrywa już 10 pg DNA z minimalnym tłem. Barwienie trwa ok. 40 min. 10.6. Wizualizacja DNA w MSSCP z Silver Stain Kit Silver Stain Kit zawiera: 1. Utrwalacz - 125 ml. Przechowywać w temperaturze pokojowej. 2. Roztwór srebra - 15 ml. Przechowywać w temperaturze pokojowej. 3. Wywoływacz A - 1000 ml. Przechowywać w temperaturze pokojowej. 35 4. Wywoływacz B - 3 ml. Przechowywać w temperaturze pokojowej. UWAGA! Pojemniki przeznaczone do barwienia srebrem powinny być dokładnie oczyszczone. Do barwienia zalecamy stosowanie tylko dejonizowanej wody 18,4 mOhm lub wody destylowanej. Procedura barwienia: Czas [min] (dla żelu gr. 0,5 mm) Denaturacja 3-5 min 10% EtOH - 110 ml Usunięcie roztworu za pomocą pompki Utrwalacz 2 min, powtórzyć 2 razy 8 ml + 212 ml of H2O Usunięcie roztworu za pomocą pompki Srebrzenie 1 ml roztworu srebra dodać do 110 ml wody 10 min Usunięcie roztworu za pomocą pompki Płukanie (powtórzyć 3 razy) 5 sekund H2O, 110 ml Usunięcie roztworu za pomocą pompki Wywołanie 60 ml Wywoływacz A dodać do 240 ml wody, dodać 132 l Wywoływacza B bezpośrednio przed użyciem Pierwszy raz 3 min lub do zaciemnienia roztworu, drugi raz i trzeci raz do pojawienia się prążków Optymalna temperatura wody to 18 °C Usunięcie roztworu za pomocą pompki Zatrzymać reakcję kiedy prążki są wyraźne I zadowalające poprzez dodanie 100 ml 10% 10 min kwasu octowego Usunięcie roztworu za pomocą pompki Przemycie w wodzie (3 razy) Pierwszy raz – 15 sekund 36 Drugi I trzeci raz po 10 min Uwagi ogólne: 1. Wszystkie płukania są wykonywane ze 110 ml roztworu. 2. Należy unikać dotykania żelu nawet przez rękawice. 3. Wytrzymałość mechaniczna żelu jest obniżona podczas barwienia, należy traktować go delikatnie. 4.Najlepszą ostrość zostaje osiągnięta po płukaniu w kwasie octowym lub po wysuszeniu. Uwagi 1. Wszystkie czasy inkubacji wizualizacji prążków są zoptymalizowane dla 0,5 mm grubości żelu. Zwiększenie grubości żelu o 100% powinno wydłużyć czas barwienia o 100%. 2. Roztwór srebra powinien być przygotowany bezpośrednio przed użyciem. 3. Aby zwiększyć kontrast barwienia i zmniejszyć poziom tła należy zmienić roztwór każdorazowo kiedy pojawia się ciemny osad. 4. Należy zatrzymać reakcję, gdy osiągnięta została odpowiednia intensywność prążków (zwykle 5-10 min). Literatura: 1. Wray, W., T. Boulikas, V.P. Wray i R. Hancock. 1981 roku. Barwienie srebrem białka w żelu poliakrylamidowym. Anal. Biochem 118: 197-203. 10.7. Suszenie żelu W zestawie DryOut żele suszone są w dwóch arkuszy folii w temperaturze pokojowej. Po wysuszeniu żele mogą być przechowywane bez utraty jakości przez długi czas. Zestaw DryOut obejmuje: 1. ramki 2 szt. 2. stolik 3. Folię do suszenia 35 szt. 4. Zaciski 8 szt. Procedura: 37 1. Arkusz folii zwilżyć wodą. 3. Na stoliku umieścić jedną z ramek. 4. Umieścić połowę nasączonej folii na stoliku, tak aby folia obejmowała całą ramkę. 5. Umieścić żel na folii a następnie zalać go niewielką ilością wody. 6. Przykryć żel drugą połową folii upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza pomiędzy obiema warstwami folii. 7. Nałożyć na folię z żelem drugą ramkę, a następnie spiąć ramki zaciskami (po 2 zaciski po każdej stronie). 8. Umieścić statywy w pionie. Pozwolić na wypływ wody z pomiędzy plastrów folii. 9. Pozostawić do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez noc (Rysunek 20). Rysunek 20. Suszenie żelu. Ważne: Przed suszeniem żelu należy przepłukać żel w wodzie w celu usunięcia kwasu octowego, który mógłby spowodować pękanie żelu podczas suszenia. Suszone żele mogą być przechowywane w dzienniku laboratorium przez długi czas bez utraty jakości. Żele grubsze niż 1,5 mm lub z koncentracją poliakrylamidu wyższą niż 10% powinna być zanurzona przed suszeniem przez 10-15 min w roztworze 50-65% MeOH (v/v) + 5% glicerol, aby zapobiec ich pękaniu podczas suszenia. 38 Rozdział 11. Oprogramowania DNAPointer 11.1. Uruchamianie aplikacji Rysunek 21. Ikona programu Uruchomienie aplikacji następuje poprzez dwukrotne kliknięcie na ikonę o nazwie dnapointer.exe znajdującą się na pulpicie komputera sterującego (Rysunek 21) Po uruchomieniu zostanie przez 3 s wyświetlony ekran powitalny (Rysunek 22). Następnie program przejdzie do okna logowania. Rysunek 22. Ekran powitalny 11.2. Okno logowania Okno logowania pozwala użytkownikowi na zalogowanie się do programu po uprzednim wyborze własnego konta z rozwijanej listy. Przyciśnięcie przycisku Login zatwierdza wybór i przenosi użytkownika do okna wyboru profilu. Każde konto użytkownika przechowuje w swojej własnej przestrzeni użytkownika dane dotyczące utworzonych profili elektroforezy (Rysunek 23). Formularz New User: pozwala na dodanie nowego użytkownika. Utworzenie nowego konta użytkownika zatwierdzane jest przyciskiem Add user. Przycisk Delete user zatwierdza polecenie usunięcia konta użytkownika wybranego na liście User. Przycisk Exit program powoduje wyjście z programu. 39 Rysunek 23. Okno logowania 11.3. Okno wyboru trybu pracy Okno wyboru trybu pracy pozwala na wybór jednej z dwóch opcji: 1. New - tworzenie nowego profilu elektroforezy 2. Existing - korzystanie z wcześniej utworzonego profilu elektroforezy Po wybraniu jednej z dwóch opcji program przenosi użytkownika do kolejnego okna. Przycisk Back przenosi użytkownika do poprzedniego okna. Przycisk Sernice Panel zarezerwowany jest dla serwisu. Okno serwisowe zabezpieczone jest hasłem i użytkownik nie ma do niego dostępu. Rysunek 24. Okno wyboru trybu pracy 11.4. Okno wyboru profilu elektroforezy Okno wybory profilu elektroforezy pozwala użytkownikowi na wybór jednej z czterech opcji (Rysunek 25): 1. One Temperature - tworzenie profilu elektroforezy SSCP 2. Multitemperature - tworzenie profilu elektroforezy MSSCP 3. Gradient - tworzenie profilu elektroforezy o liniowo zmiennej temperaturze w czasie 40 4. Custom - tworzenie profilu elektroforezy łączącej w jednym procesie cechy elektroforezy SSCP lub MSSCP z Gradientową Po wybraniu jednej z czterech opcji program przenosi użytkownika do formularza projektowania profilu. Przycisk Back przenosi użytkownika do poprzedniego okna. Okno wyboru profilu elektroforezy dla obu opcji z punktu B.5 jest takie samo. Rysunek 25. Okno wyboru profilu elektroforezy 11.5. Profil - One Temperature Okno projektowania profilu elektroforezy One Temperature pozwala na utworzenie profilu elektroforezy SSCP. Sekcja Preelectrophoresis służy do wprowadzenia parametrów preelektroforezy. Parametry Preelektroforezy: 1. Power [W] - moc preelektroforezy 2. Gel Temp [C] - temperatura żelu 3. Duration [Vxh] - czas wyrażony w woltogodzinach Sekcja Concetration of samples służy do wprowadzenia parametrów fazy zagęszczania próbek. Parametry fazy zagęszczania próbek: 1. Voltage [V] - napięcie 2. Gel Temp [C] - temperatura żelu 3. Duration [min] - czas wyrażony w minutach Sekcja Electrohoresis phase #1 służy do wprowadzenia parametrów fazy elektroforezy właściwej. Parametry fazy właściwej elektroforezy: 1. Power [W] - moc preelektroforezy 2. Gel Temp [C] - temperatura żelu 3. Duration [Vxh] - czas wyrażony w woltogodzinach 41 Sekcja Gel Saver służy do wprowadzenia parametrów fazy Gel Saver Parametry fazy gel saver: 1. Voltage [V] - napięcie 2. Gel Temp [C] - temperatura żelu 3. Duration [min] - nieskończoność Należy wprowadzić wszystkie parametry i zachować profil przyciskając przycisk Save profile (Rysunek 26) Rysunek 26. Okno projektowania profilu One Temperature (SSCP) 11.6. Profil - Multitemperature Okno projektowania profilu elektroforezy Multitemperature pozwala na utworzenie profilu elektroforezy MSSCP. Sekcja Preelectrophoresis służy do wprowadzenia parametrów preelektroforezy. Parametry Preelektroforezy: 1. Power [W] - moc preelektroforezy 2. Gel Temp [C] - temperatura żelu 3. Duration [Vxh] - czas wyrażony w woltogodzinach Sekcja Concetration of samples służy do wprowadzenia parametrów fazy zagęszczania próbek. Parametry fazy zagęszczania próbek: 1. Voltage [V] - napięcie 2. Gel Temp[C] - temperatura żelu 3. Duration[min] - czas wyrażony w minutach 42 Sekcja Electrohoresis phase #1 służy do wprowadzenia parametrów fazy elektroforezy właściwej. Po wprowadzeniu parametrów i naciśnięciu przycisku Add Step 2 sekcja zmieni nazwę na Electrohoresis phase #2 umożliwiając wprowadzenie parametrów dla drugiego kroku elektroforezy MSSCP, a przycisk zmieni nazwę na Add Step 2. Możliwe jest zaprogramowanie do 9 kroków elektroforezy MSSCP. Parametry fazy właściwej elektroforezy: 1. Power [W] - moc preelektroforezy 2. Gel Temp [C] - temperatura żelu 3. Duration [Vxh] czas wyrażony w woltogodzinach Sekcja Gel Saver służy do wprowadzenia parametrów fazy Gel Saver Parametry fazy gel saver: 1. Voltage [V] - napięcie 2. Gel Temp [C] - temperatura żelu 3. Duration [min] - nieskończoność Należy wprowadzić wszystkie parametry i zachować profil przyciskając przycisk Save profile (Rysunek 27) Rysunek 27. Okno projektowania profilu Multitemperature (MSSCP) 11.7. Profil – Gradient Okno projektowania profilu elektroforezy Gradient pozwala na utworzenie profilu elektroforezy o gradientowo zmiennej temperaturze w czasie. Sekcja Preelectrophoresis służy do wprowadzenia parametrów preelektroforezy. Parametry Preelektroforezy: 43 1. Power [W] - moc preelektroforezy 2. Gel Temp [C] - temperatura żelu 3. Duration [Vxh] - czas wyrażony w woltogodzinach Sekcja Concetration of samples służy do wprowadzenia parametrów fazy zagęszczania próbek. Parametry fazy zagęszczania próbek: 1. Voltage [V] - napięcie 2. Gel Temp [C] - temperatura żelu 3. Duration [min] - czas wyrażony w minutach Sekcja Electrohoresis phase #1 służy do wprowadzenia parametrów fazy elektroforezy właściwej. Parametry fazy właściwej elektroforezy: 1. Duration[min] - czas wyrażony w minutach 2. Start Temp [C] - temperatura początkowa 3. End Temp [C] - temperatura końcowa 4. Power [W] - moc preelektroforezy 5. Gradient [C/min] - gradient Sekcja Gel Saver służy do wprowadzenia parametrów fazy Gel Saver Parametry fazy gel saver: 1. Voltage [V] - napięcie 2. Gel Temp[C] - temperatura żelu 3. Duration[min] - nieskończoność Należy wprowadzić wszystkie parametry i zachować profil przyciskając przycisk Save profile (Rysunek 28). 44 Rysunek 28. Okno projektowania profilu Gradient 11.8. Profil – Custom Okno projektowania profilu elektroforezy Custom pozwala na utworzenie profilu elektroforezy o cechach elektroforezy zarówno gradientowej jak i stałej lub schodkowej (MSSCP lub SSCP). Sekcja Preelectrophoresis służy do wprowadzenia parametrów preelektroforezy. Parametry Preelektroforezy: 1. Power [W] - moc preelektroforezy 2. Gel Temp [C] temperatura żelu 3. Duration [Vxh] - czas wyrażony w woltogodzinach Sekcja Concetration of samples służy do wprowadzenia parametrów fazy zagęszczania próbek. Parametry fazy zagęszczania próbek: 1. Voltage [V] - napięcie 2. Gel Temp [C] - temperatura żelu 3. Duration [min] - czas wyrażony w minutach Sekcja Electrohoresis phase #1 służy do wprowadzenia parametrów fazy elektroforezy właściwej. Wprowadzenie odpowiednich parametrów pozwala na zaprojektowanie etapu elektroforezy o charakterystyce temperatury gradientowej jak i stałej. Przycisk Add Step pozwala na dodanie kolejnego kroku jak to miało miejsce w przypadku tworzenia profilu elektroforezy Multitemperature Parametry fazy właściwej elektroforezy: 1. Duration [min] - czas wyrażony w minutach 2. Start Temp [C] - temperatura początkowa 3. End Temp [C] - temperatura końcowa 4. Power [W] - moc preelektroforezy 5. Gradient [C/min] - gradient Sekcja Gel Saver służy do wprowadzenia parametrów fazy Gel Saver Parametry fazy gel saver: 1. Voltage [V] - napięcie 2. Gel Temp [C] - temperatura żelu 3. Duration [min] - nieskończoność Należy wprowadzić wszystkie parametry i zachować profil przyciskając przycisk Save profile. 11.9. Zapisywanie profilu elektroforezy Po utworzeniu profilu elektroforezy należy ją zapisać w pamięci komputera za pomocą formularza. Należy nadać profilowi specyficzną nazwę i nacisnąć przycisk Save (Rysunek 29). 45 Rysunek 29. Okno projektowania profilu Gradient 11.10. Preelektroforeza Po zapisaniu profilu pojawia się okno przygotowujące do Preelektroforeza. Należy wypełnić kolejne polecenia: 1. Zainstalować żel w komorze elektroforetycznej 2. Wlać do zbiorników bufor elektroforetyczny 3. Zamknąć pokrywę aparatu 4. Włączyć zasilanie aparatu włącznikiem na tylnej ściance jednostki głównej Rysunek 30. Okno uruchomienia elektroforezy 46 Rysunek 31. Okno główne programu W oknie głównym programu wyświetlanych jest szereg informacji przydatnych użytkownikowi: 1. Preelectrophoresis time left – czas pozostały do końca Preelektroforeza czyli do momentu w którym możliwe będzie naniesienie próbek a żel. 2. Gel Temp[C] – temperatura próbek w żelu. 3. Linie wykresu: a. Cienkie linie wykresu oznaczają zaprojektowany teoretyczny przebieg zmiennych w czasie parametrów i. Linia czarna- zaprojektowany wykres temperatury ii. Linia czerwona – zaprojektowany wykres mocy elektroforezy iii. Linia niebieska - zaprojektowany wykres napięcia elektroforezy b. Grube linie wykresu oznaczają rzeczywisty przebieg parametrów w czasie i. Linia czarna- rzeczywisty wykres temperatury ii. Linia czerwona – rzeczywisty wykres mocy elektroforezy iii. Linia niebieska - rzeczywisty wykres napięcia elektroforezy Widoczny w oknie głównym przycisk Pause jest aktywny tylko w momentach kiedy przerwanie elektroforezy jest możliwe. Pozostaje nieaktywny kiedy czynności system wykonać nie może. Po prawej stronie przy krawędzi znajdują się dwie skale. Czerwona skala dotyczy mocy elektroforezy. Niebieska skala dotyczy napięcia elektroforezy. Po lewej stronie przy krawędzi znajduje się jedna czarna skala. Można za jej pomocą odczytać wartość temperatury w danej chwili. 47 Kiedy Preelektroforeza dobiegnie końca wyświetlany jest odpowiedni komunikat (Rysunek 32). Rysunek 32. Okno informujące o zakończeniu Preelektroforeza Po nałożeniu próbek cały proces przebiegnie automatycznie i nie będzie wymagał uwagi użytkownika. Należy zastosować się do poleceń zawartych w komunikacie: 1. Otworzyć pokrywę aparatu 2. Nałożyć próbki na żel 3. Zamknąć pokrywę 4. Uruchomić elektroforezę 11.11. Elektroforeza Rysunek 33. Faza zagęszczania próbek 48 Rysunek 34. Faza Elektroforezy #1 - 35°C Rysunek 35. Faza Elektroforezy #2 - 15°C 49 Rysunek 36. Faza Elektroforezy #3 - 5°C Rysunek 37. Zakończanie elektroforezy Rysunek 38. Gel Saver 11.12. Wyjście z programu Możliwe jest zatrzymanie elektroforezy w trakcie jej trwania. Należy to zrobić pauzując proces przyciskiem Pause ( nie zawsze jest aktywny) a następnie wybierając z belki górnej poleceń polecenie Quit. 50