Zmodyfikowana heparyna, jej zastosowanie i zawierająca ją

RZECZPOSPOLITA
POLSKA
(12)
OPIS PATENTOWY
(19)
PL
212357
(13) B1
(11)
(21) Numer zgłoszenia: 368813
(22) Data zgłoszenia: 12.09.2001
(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
Urząd Patentowy
Rzeczypospolitej Polskiej
12.09.2001, PCT/IT01/000472
(87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
(51) Int.Cl.
A61K 31/727 (2006.01)
A61P 9/00 (2006.01)
A61P 17/00 (2006.01)
A61P 37/00 (2006.01)
20.03.2003, WO03/022291
Zmodyfikowana heparyna, jej zastosowanie
i zawierająca ją kompozycja farmaceutyczna
(54)
(73) Uprawniony z patentu:
SIGMA-TAU RESEARCH SWITZERLAND S.A.,
Mendrisio, CH
(43) Zgłoszenie ogłoszono:
04.04.2005 BUP 07/05
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
28.09.2012 WUP 09/12
(72) Twórca(y) wynalazku:
BENITO CASU, Mediolan, IT
GIANGIACOMO TORRI, Mediolan, IT
ANNAMARIA NAGGI, Mediolan, IT
GIUSEPPE GIANNINI, Pomezia, IT
CLAUDIO PISANO, Pomezia, IT
SERGIO PENCO, Pomezia, IT
(74) Pełnomocnik:
PL 212357 B1
rzecz. pat. Rafał Witek
2
PL 212 357 B1
Opis wynalazku
Wynalazek opisany poniżej dotyczy zmodyfikowanych heparyn pozbawionych częściowo reszt
siarczanowych, a także procesu ich wytwarzania oraz ich zastosowania, jako aktywne składniki leków
użytecznych w stanach patologicznych, takich jak nowotwory, z uwzględnieniem form przerzutowych,
jak również dotyczy jakiegokolwiek wskazania terapeutycznego, w którym wykorzystuje się inhibicję
heparanazy oraz kompozycji farmaceutycznych zawierających heparyny.
Stan techniki
Badania przeprowadzane w Tumor Biological Research Unit na Hadassah-Hebrew University
Hospital-Israel (Isr. Med. Assoc. J. 2000, 2, 37-45; J. Med. Chem. 2000, 43, 2591-600; Invasion Matastasis 1994-95, 14, 290-302; Exp. Cell Res.1992, 201, 208-15,) ukierunkowane są na udział czynników wzrostu wiążących heparynę, siarczanu heparanu i enzymów degradujących siarczan heparanu
(heparanaza) w nowotworowej angiogenezie i metastazie. Badania wykonano w celu skriningu i identyfikacji pochodnych heparyny i mimetyków siarczanu heparyny/heparanu o silnej aktywności inhibitującej heparanazę.
Komórki nowotworowe uwalniają enzym heparanazę, endo-beta-D-glukuromdazę, która trawi
łańcuch polisacharydowy proteoglikanów siarczanu heparanu na powierzchni komórki i w macierzy
zewnątrzkomórkowej.
Udział heparanazy w nowotworowej angiogenezie skorelowany jest ze zdolnością do uwalniania bFGF (FGF-2) i innych czynników wzrostu gromadzonych w ECM (macierzy zewnątrzkomórkowej). Powyższe czynniki wzrostu zapewniają mechanizm indukcji neowaskularyzacji w warunkach
normalnych i patologicznych.
Heparanaza może w ten sposób nie tylko ułatwiać inwazję komórek rakowych i metastazę, ale
również nowotworową angiogenezę, dwa krytyczne etapy w rozwoju raka. Specyficzne inhibitory enzymu heparanazy zapobiegają uwalnianiu i aktywacji czynników wzrostu gromadzonych przez siarczan heparanu, jak również rozerwaniu ECM, uważa się je więc za obiecujące w rozwoju leków przeciwrakowych.
Z powyższego wynika, że jednym z możliwych terapeutycznych rozwiązań dla leku przeciwangiogennego jest rozwój silnego i selektywnego inhibitora heparanazy.
Rozważania na temat angiogenezy przedstawiono w publikacji WO 01/55221 zgłoszonej przez
niniejszego zgłaszającego.
Kolejnym ważnym polem działania heparanazy jest zarówno stan zapalny, jak i autoimmunizacja. W istocie, aktywność heparanazy powiązana jest również ze zdolnością aktywowanych komórek
systemu immunologicznego do opuszczania obiegu i wywoływania zapalenia i odpowiedzi alergicznych. Oddziaływania płytek krwi, granulocytów, limfocytów T i B, makrofagów i komórek tucznych
z podśródbłonkową ECM są związane z rozpadem siarczanu heparanu na skutek aktywności heparanazy. Enzym jest uwalniany z przedziałów wewnątrzkomórkowych (tj. lizosomy, specyficzne ziarna)
w odpowiedzi na różnorodne sygnały aktywujące, co wskazuje na udział jego podlegający regulacji
oraz na obecność w stanach zapalnych i alergicznych zmianach chorobowych. Traktowanie zwierząt
doświadczalnych inhibitorami heparanazy (tj. nieantykoagulującymi odmianami heparyny o niskiej
masie cząsteczkowej-LMWH) znacząco zmniejszyło rozmiar doświadczalnego alergicznego zapalenia
mózgu i rdzenia (EAE), wspomaganego adiuwantem zapalenia stawów i odrzucenia przeszczepu u
zwierząt doświadczalnych, co wskazywało, że inhibitory heparanazy mogą być zastosowane do inhibicji chorób autoimmunologicznych i zapalnych.
Heparyna
Heparyna jest heterogenną mieszaniną naturalnie występujących polisacharydów różniących
się długością, stopniem przyłączonych grup siarkowych; heparyna posiada aktywność przeciwkoagulacyjną i jest wydzielana przez występujące w wątrobie komórki tuczne tkanki łącznej (z której pierwotnie została wyizolowana), w mięśniach, płucach, grasicy i śledzionie.
Dodatkowo, oprócz stałej sekwencji została zidentyfikowana w heparynie sekwencja odpowiadająca miejscu aktywnemu dla aktywności antytrombiny.
Przeciwnowotworowa i przeciwprzerzutowa aktywność heparyny i jej pochodnych to efekt zdolności do hamowania heparanazy, blokowania czynników wzrostu i regulacji angiogenezy.
PL 212 357 B1
3
Siarczan heparanu (HS)
Siarczan heparanu jest powszechnie występującym ligandem białek. Białka wiążą się do łańcucha HS w celu spełnienia różnych funkcji, począwszy od prostej immobilizacji lub ochrony przed degradacją proteolityczną do specyficznych zmian biologicznej aktywności, takich jak angiogeneza.
Szkielet węglowodorowy, zarówno w heparynie jak i w siarczanie heparanu, tworzą naprzemiennie D-glukozamina (GlcN) i kwasy heksuronowe (GlcA lub IdoA).
W heparynie, reszty GlcN są głównie resztami N-siarczanowymi, podczas gdy w HS są N-siarczanowymi oraz N-acetylowanymi, z małą ilością niepodstawionych grup NH2.
W HS znajduje się średnio mniej przyłączonych grup O-siarczanowych niż w heparynie.
Zastosowanie heparyny w leczeniu zaburzeń angiogennych, takich jak nowotwory, szczególnie
przerzuty nowotworowe, jest w znacznym stopniu ograniczone przeciwkoagulacyjną aktywnością heparyny.
Heparynę poddano chemicznym modyfikacjom w celu zredukowania jej zdolności przeciwkoagulacyjnych, zachowując jednocześnie jej właściwości przeciwnowotworowe.
Otwarcie jednostki kwasu glukuronowego w miejscu przeciwtrombinowym obniża powinowactwo heparyny do antytrombiny: w ten sposób mogą być użyte heparyny mające obniżoną aktywność
przeciwkoagulacyjną, ale w dalszym ciągu wykazujące własności przeciwangiogenne.
Heparanazy
Heparanazy są enzymami należącymi do rodziny endoglikozydaz (endo-beta-glukuronidazy),
hydrolizującymi wewnętrzne wiązania glikozydowe łańcuchów siarczanu heparanu i heparyny.
Powyższe endoglikozydazy biorą udział w procesie proliferacji komórek, w metastazie i neowaskularyzacji nowotworów.
Enzymy te są biologicznym celem aktywności przeciwangiogennej. Literatura naukowa obejmuje znaczą ilość doniesień na temat badań prowadzonych nad korelacją struktura/aktywność (patrz
przykład: Lapierre F. et al., Glycobiology, vol. 6, (3), 355-366, 1996). Mimo że liczne aspekty ciągle
wymagają wyjaśnienia, opisano badania dotyczące inhibicji heparanaz przez heparynę i jej pochodne,
wykonane za pomocą testów, które doprowadziły do rozważenia typu struktury i mogą dostarczać
wskazówek w procesie otrzymywania nowych, bardziej selektywnych pochodnych.
W wyżej wspomnianej pracy Lapierre et al., opisano pochodne heparyny otrzymane w wyniku
usunięcia reszt siarczanowych 2-O lub w wyniku otworzenia pierścienia glikozydowego („rozszczepienia glikolu”) (utlenienie nadjodanem a następnie redukcja borowodorkiem sodu). Pochodne te, definiowane jako, kolejno, heparyna pozbawiona reszt siarczanowych 2-O" i „RO-heparyna”, zachowały
częściowo aktywność przeciwangiogenną heparyny, jak wykazano za pomocą testów CAM w obecności kortykosteroidów (ibid. strona 360).
Pochodne N-acylowe heparyny, które są bardziej podobne do siarczanu heparanu niż heparyny, zostały opisane jako hamujące heparanazę, ale tylko w pewnym stopniu, niższym niż pochodne
N-siarczanowe. (Irmira T., Biochemistry 1986, 25, 5322-5328, Ishai-Micheaeli R., et al., Biochemistry
1992, 31, 2080-2088).
Heparyny i FGF
FGF reguluje różnorodne procesy fizjologiczne, takie jak wzrost i różnicowanie komórek, jak
również funkcje uczestniczące w procesach patologicznych, takich jak angiogeneza nowotworowa.
FGF należą do czynników wzrostu (rodzina obejmująca ponad 10 polipeptydów, z których najdokładniej zbadano kwaśny FGF-1 i zasadowy FGF (FGF-2)), do przyłączenia się do receptora FGF
(FGFR) i uaktywnienia go, wymagają obecności czynnika polisacharydowego, heparyny lub HS.
Mimo że szczegółowy mechanizm aktywacji czynników FGF przez heparynę i HS nie jest znany,
wiadomo jednak, że heparyna/FGF/FGFR tworzą kompleks „trzycząsteczkowy” lub „trójskładnikowy”.
W jednym z proponowanych mechanizmów postuluje się, że heparyna i HS indukuje tzw. kanapkową dimeryzację FGF, następnie dimer FGF tworzy stały kompleks z FGFR.
Aktywność przeciwprzerzutowa pochodnych heparyny
Zdolność nowotworu pierwotnego do generowania metastatycznych komórek jest prawdopodobnie głównym problemem, przed którym stoi terapia przeciwnowotworowa. Pochodne heparyny ze
znaczącą zdolnością do blokowania heparanazy wydają się być równie zdolne do hamowania angiogenezy w nowotworach pierwotnych, jak i w przerzutach nowotworowych.
Co więcej, inhibicja heparanazy zmniejsza zdolność migracji komórek rakowych z nowotworu
pierwotnego do innych organów.
4
PL 212 357 B1
Odkryto, że aktywność przeciwprzerzutowa w modelach zwierzęcych jest skorelowana ze zdolnością do inhibicji heparanazy przez heparynę i pochodne heparyny (Bitan M. et al., Isr. J. Med. Sci.
1995, 31, 106-108), a także przez inne siarczanowe polisacharady (Miao, H. Q. et al., Int. J. Cancer
1999, 83,424-431, i zawarte w nim odnośniki). Badania nad zależnością aktywności przeciwprzerzutowej od masy cząsteczki wykazały, że również niskocząsteczkowe heparyny (Sciumbata T., et al.,
Invasion Metastasis 1996, 16, 132-143) i oligosacharydowe polifosforany (Parish C.R. et al., Cancer
Res. 1999, 59, 3433-3441) zachowują znaczącą aktywność przeciwprzerzutową. Mimo że usunięcie
grup N-siarczanowych obniża potencjał przeciwprzerzutowy heparyn, aktywność ta jest częściowo
odnawiana przez N-acylację, N-heksanoilację (Bitan M., 1995), i N-sukcynylację (Sciumbata T., 1996)
z uwolnieniem grup NH2. Odkryto, że aktywność przeciwprzerzutowa heparyn jest odwrotnie skorelowana z ich stopniem przyłączenia reszt O-siarczanowych. Jednakże, selektywne usunięcie reszt 2-O
siarczanowych reszt kwasu idurunowego nie wywołuje silnej redukcji aktywności przeciwprzerzutowej
heparyny (Lapierre F., Glycobiology 1996, 6, 355-366).
Ogólnie, zarówno hamująca heparanazę, jak i przeciwprzerzutowa aktywność heparyn i innych
polisacharydów z przyłączonymi resztami siarczanowymi maleje wraz z malejącą masą cząsteczkową
i stopniem przyłączenia reszt siarczanowych (Bitan M., 1995, 30 Parish C.R. 1999). Jednakże, powyższe aktywności zależą również od szkieletu karboksylowego polisacharydu (rodzaju reszty i pozycji
wiązania glikozydowego) (Parish C. R., 1999). Ze względu na to, że trzycząsteczkowa struktura miejsca aktywnego nie jest jeszcze znana, trudno przewidzieć, który szkielet polisacharydowy i który wzorzec przyłączenia reszt siarczanowych w sposób najbardziej skuteczny hamuje enzym.
Na podstawie obecnej wiedzy, wymogi strukturalne dla cząstek heparynopodobnych, sprzyjających działaniu hamującemu angiogenenezę, dzieli się na dwie kategorie, na podstawie produktu podlegającemu zablokowaniu:
a) inhibicja heparanazy: mimo że enzym ten rozpoznaje i rozszczepia heparynę i sekwencje HS
o przynajmniej ośmiu jednostkach monocukrowych zawierających kwas N-acyloglukozaminoglukuronowy (lub reszty glukozaminy z przyłączonymi resztami N-siarczanowymi, patrz np. D. SandbackPikas et al. J. Biol. Chem., 273, 18777-18780 (1998) i cytowane odnośniki), możliwe jest uzyskanie
jego inhibicji dzięki fragmentom heparyny dłuższym niż tetradekanosacharady (Bitan M. 1995) lub
zawierającym duże ilości grup siarkowych, krótszym oligosacharadom, takim jak siarczan maltoheksozy (MHS) i siarczan fosfomannopentozy (PI-88) (Parish, C. R., 1999). Jednak, zarówno fragmenty
heparyny, jak i silnie usiarczone oligosaharydy są antykoagulantami, charakteryzują się więc własnością niepożądaną przy sporządzaniu potencjalnych leków przeciwprzerzutowych.
b) inhibicja angiogennych czynników wzrostu (typ fibroblast: FGF-1 i FGF2; czynnik wzrostu
śródbłonka naczyń: VEGF; śródbłonowy czynnik wzrostu: VPF): w tym przypadku związki heparynopodobne korzystnie składają się z sekwencji o długości przynajmniej pięciu jednostek monosacharydowych, zawierając kwas 2-siarczano iduronowy i N,6-siarczanową glukozaminę (patrz, przykład
M. Maccarana et al. J. Biol. Chem., 268, 23989-23905 (1993)).
W literaturze przedstawiono krótkie peptydy (5-13 aminokwasów) posiadające 25 aktywność
przeciwangiogenną (US Patent 5,399,667, University of Washington), działające na zasadzie wiązania
się do receptora trombospondyny lub do dłuższych peptydów (około 50 aminokwasów).
Znane są zmodyfikowane czynniki płytek krwi o IC50 = 7 nM- (EP 0 589 719), zdolne do hamowania proliferacji śródbłonkowej.
Szeroko opisano również fragmenty oligosacharydów posiadające aktywność przeciwangiogenną: w istocie, odkryto, że selektywność interakcji może wzrosnąć dzięki zróżnicowaniu sekwencji
węglowodanowej.
Ponadto, heparyna może być również wykorzystana jako nośnik dla substancji, które same posiadają aktywność przeciwangiogenną, takich jak niektóre steroidy wykorzystujące powinowactwo
heparyny do naczyniowych komórek śródbłonka, patrz dla przykładu WO 93/18793, University of
Texas i Imperial Cancer Research Technology, w której to publikacji heparyny zastrzeżono wraz
z kwasowo-labilnymi łącznikami, takimi jak hydrazyna kwasu adypinowego, przyłączanymi do kortyzolu. Efekt przeciwangiogenny połączonych cząsteczek jest silniejszy niż w przypadku niezwiązanych
cząstek nawet, gdy podawane są one jednocześnie.
W Biochim. Biophys. Acta (1996), 1310, 86-96 opisano heparyny wiążące się do steroidów (np.
kortyzolu) z grupą hydrazonową C-20, wykazujące wyższą aktywność przeciwangiogenną niż dwie
niepołączone cząstki.
PL 212 357 B1
5
W EP 0 246 654 zgłoszonym przez Daichi Sc. opisano polisacharydy z przyłączonymi grupami
siarczanowymi wykazujące aktywność przeciwangiogenną w II fazie badań. W EP 0 394 971 zgłoszonym przez Pharmacia & Upjohn-Harvard Coli. opisano heksa-sacharydowe fragmenty heparyny o
niskim stopniu przyłączonych grup siarczanowych, zdolne do hamowania wzrostu komórek śródbłonka
i angiogenezy wzbudzanej przez FGF-1. W EP 0 618 234 zgłoszonym przez Alfa Wasserman opisano
metodę przygotowania semisyntetycznych glikozaminoglikanów z heparynową lub heparanową strukturą posiadającą grupę nukleofilową. W WO 95/05182 zgłoszonym przez Glycomed opisano różnorodne siarczanowe oligosachrady o aktywności przeciwkoagulacyjnej, przeciwangiogennej i przeciwzapalnej. W US 5,808,021 25 (Glycomed) opisano metody sporządzenia w dużym stopniu niezdepolimeryzowanej, pozbawionej grup siarczanowych 2-O, 3-O heparyny o stopniu usunięcia grup siarczanowych, w pozycji 2-kwasu idurunowego (I, 2-O) oraz w pozycji 3 jednostki glukozaminy (A, 3-O), w
zakresie 99 - 75% pierwotnej zawartości. Metoda ta obrazuje przyłączenie grup siarczanowych, zachodzące w obecności kationu dwuwartościowego metalu, przykładowo wapna lub miedzi, po którym
ma miejsce liofilizacja otrzymanego produktu. Pozbawione grup siarczanowych heparyny wykazują
aktywność przeciwangiogenną. W EP 0 251 134, Yeda Res & Dev Co Ltd et al., przedstawiono zastosowanie subkoagulujących dawek heparyny lub jej pochodnych, zapobiegających odrzuceniu aloprzeszczepu i służące leczeniu chorób autoimmunizacyjnych. Aktywność heparyny zostaje uruchomiona dzięki inhibicji heparanazy. W WO 88/05301, Univ. Australian Nat., przedstawiono zastosowanie
przeciwprzerzutowej
i/lub
przeciwzapalnej
kompozycji
zawierającej
polisacharyd
z przyłączonymi grupami siarczanowymi, będący inhibitorem heparanazy. Zastrzeżono heparynę,
fukoidan, siarczan pentozanu, siarczan dekstranu. W WO 92/01003, Univ. Texas Sysytem, przedstawiono zastosowanie pochodnej heparyny pozbawionej aktywności przeciwkoagulacyjnej, jako inhibitora heparanazy. Pochodne posiadają sulfoamino lub O-siarczanowe grupy, masa cząsteczkowa wynosi
1000-15000 a każda z końcowych monomerycznych jednostek jest powtarzającą się jednostką monomeryczną z końcowym atomem tlenu wiążącym się do grupy blokującej. W WO 94/014851 i WO
96/06867, Glycomed, zastrzeżono pozbawioną grup siarczanowych 2-O, 3-O śluzówkową heparynę,
lub jej fragmenty, w 96,7% pozbawione reszt siarczanowych w pozycji 2-O i w co najmniej 75% pozbawione reszt siarczanowych w pozycji 3-O, użyteczne jako nie-antykoagukujące inhibitory heparanazy. W WO 95/09637 i WO 96/09828, Glycomed, przedstawiono związki maltooligosacharydowe
o dużym stopniu przyłączonych grup siarczanowych, posiadające właściwości heparynopodobne.
W WO 95/30424, Glycomed, zastrzeżono pozbawioną grupy siarczanowej w pozycji 6-O heparynę lub
jej fragmenty posiadające aktywność inhibitującą. W WO 96/33726, Univ. Australian Nat., przedstawiono oligosacharydy po przyłączeniu reszt siarczanowych jako mimetyki heparyny posiadające aktywność hamującą. W WO 01/35967, Knoll AG, ujawniono metodę leczenia niewydolności serca
i stanów podobnych poprzez podawanie inhibitora heparanazy, wśród których wspomniana heparyna
mająca częściowo zredukowane grupy COOH, lub przynajmniej częściowo usunięte grupy N-siarczanowe, jest N-acetylowana lub posiada przynajmniej częściowo usunięte grupy N,O-siarczanowe lub
też jest N-acetylowana.
Celem niniejszego wynalazku jest znalezienie optymalnych struktur glikozaminoglikanowych do
generowania aktywności przeciwangiogennej, w oparciu o mechanizm inhibicji heparanazy i/lub czynnika wzrostu FGF. Dodatkowym celem wynalazku jest dostarczenie leku o aktywności przeciwangiogennej, zasadniczo pozbawionego typowych skutków ubocznych pochodnych heparyny, takich jak
aktywność przeciwkoagulacyjna.
W WO 01/55221, zgłoszeniu dokonanym przez niniejszego zgłaszającego, ujawniono glikozaminoglikany, szczególnie pozbawione grup siarczanowych heparyny, o stopniu usunięcia grup siarczanowych nie większym niż 60% całkowitej ilości jednostek uronowych. Pochodne te wykazują aktywność przeciwangiogenną i pozbawione są aktywności przeciwkoagulacyjnej. Wspomniane związki
wykazują aktywność przeciwangiogenną w oparciu o inhibicję FGF. Nie przewidziano żadnej aktywności związanej z inhibicją heparanazy.
Ogólnie rzecz biorąc, w WO 01/55221 przedstawiono również zmodyfikowaną heparynę, zawierającą glikozaminowe reszty o różnym stopniu przyłączenia grup N-siarczanowych i opcjonalnie następującej całkowitej lub częściowej acetylacji. Ogólne wskazówki wynikające ze wspomnianej publikacji nie zawierają precyzyjnie opisanych etapów usunięcia grup N-siarczanowych i opcjonalnie następującej całkowitej lub częściowej acetylacji.
Eliminacja grup siarczanowych przeprowadzona w warunkach opisanych w niniejszym wynalazku
powoduje formowanie się jednostek iduronowych z pierścieniem epoksydowym w pozycji 2, 3. Otwarcie
6
PL 212 357 B1
pierścienia epoksydowego w warunkach opisanych w niniejszym wynalazku powoduje wzrost ilości
jednostek L-iduronowych lub L-galakturonowych.
Przedmiotem wynalazku jest zmodyfikowana heparyna zawierająca reszty glukozaminy
o różnym stopniu N-desulfonacji, a następnie N-acetylacji, otrzymana poprzez poddanie heparyny
procesowi obejmującemu następujące etapy, w których:
a) usuwa się grupy N-siarczanowe w wyniku reakcji solwolizy reszt sulfaminowych w roztworze
DMSO:H2O 95:5 obj.:obj., w temperaturze otoczenia przez okres czasu od 0,5 do 8 godzin, do uzyskania całkowitej lub częściowej eliminacji grup siarczanowych w pozycji 2 reszt glukozaminy;
b) prowadzi się N-acetylację wspomnianych całkowicie lub częściowo desulfonowanych grup
w pozycji 2 reszt glukozaminy poprzez poddanie ich działaniu czynnika acetylującego w zasadowym
roztworze wodnym (pH 8-9), uzyskując w wyniku całkowicie lub częściowo acetylowane grupy
w pozycji 2 reszt glukozaminy;
c) prowadzi się utlenianie dioli przy pomocy nadjodanu sodu, uzyskując otwarcie pierścienia glikozydowego i otrzymuje się dwie grupy aldehydowe przypadające na modyfikowaną resztę;
d) prowadzi się redukcję wspomnianych grup aldehydowych do alkoholu pierwszorzędowego;
e) prowadzi się fakultatywną kwaśną hydrolizę związków uzyskanych w etapie d) uzyskując oligosacharydy odpowiadające regularnym sekwencjom; lub alternatywnie
f) produkty otrzymane na etapie d) poddaje się częściowej hydrolizie enzymatycznej przy użyciu
enzymu wybranego z grupy obejmującej: liazy, heparynazy, heparytynazy lub ich odpowiedniki, w celu
otrzymania oligosacharydów zawierających na końcu nieredukującym resztę składającą się z nienasyconego kwasu iduronowego, a na końcu redukującym resztę składającą się z N-sulfoglukozaminy
oraz zawierających przynajmniej jedną resztę otwartego kwasu iduronowego.
Korzystnie, heparyna według wynalazku charakteryzuje się tym, że jest wybrana z grupy obejmującej:
- częściowo N-desulfonowaną i N-reacetylowaną heparynę o masie cząsteczkowej (MW)
11200, współczynniku polidyspersji 1,3, stopniu eliminacji grup siarczanowych 1,6 (wyrażonym jako
stosunek molowy SO3-: COO-), zawartości procentowej zmodyfikowanych kwasów uranowych
w porównaniu z ich całkowitą ilością, wynoszącej około 30%, i resztach glukozaminowych o stopniu
N-acetylacji wynoszącym 50%;
- częściowo N-desulfonowaną i N-reacetylowaną heparynę, o masie cząsteczkowej Mn = 4780,
Mw = 10000, współczynniku polidyspersji 2,092, zawartości procentowej zmodyfikowanych kwasów
uranowych w porównaniu z ich całkowitą ilością, wynoszącej około 30%, i resztach glukozaminowych
o stopniu N-acetylacji wynoszącym 50%;
- częściowo N-desulfonowaną i N-reacetylowaną heparynę, o zawartości procentowej zmodyfikowanych kwasów uranowych w porównaniu z ich całkowitą ilością, wynoszącej około 30%, i resztach
glukozaminowych o stopniu N-acetylacji wynoszącym 27%;
- częściowo N-desulfonowaną i N-reacetylowaną heparynę, o zawartości procentowej zmodyfikowanych kwasów uranowych w porównaniu z ich całkowitą ilością, wynoszącej około 30%,
i resztach glukozaminowych o stopniu N-acetylacji wynoszącym 39%;
- częściowo N-desulfonowaną i N-reacetylowaną heparynę, o zawartości procentowej zmodyfikowanych kwasów uranowych w porównaniu z ich całkowitą ilością, wynoszącej około 30%,
i resztach glukozaminowych o stopniu N-acetylacji wynoszącym 64%;
Innym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie wspomnianego wyżej związku według wynalazku do wytwarzania leku o aktywności inhibitującej heparanazę.
Korzystnie, wspomniany wyżej lek ma aktywność przeciwangiogenną.
Zgodnie z wynalazkiem, lek jest korzystnie użyteczny do leczenia stanów zapalnych.
Niniejszy wynalazek związany jest ze zmodyfikowaną heparyną zawierającą reszty glukozaminowe o różnym stopniu usunięcia grup N-siarczanowych, następnie poddaną N-acetylacji, wytworzoną
sposobem ujawnionym w niniejszym opisie.
Związki według wynalazku charakteryzuje wysoki stopień inhibicji haparanazy oraz interesujące
własności przeciwangiogenne, stąd też użyteczne są jako składniki aktywne do przygotowania leków
do leczenia patologii poprzez wykorzystanie inhibicji heparanazy, patologii opartych na nieprawidłowej
angiogenezie, a w szczególności do leczenia przerzutów nowotworowych.
Związki według niniejszego wynalazku hamują również czynniki FGF.
Korzystnie, związki według niniejszego wynalazku wykazują obniżone własności przeciwkoagulacyjne, lub zupełnie ich nie posiadają, co zapobiega wystąpieniu lub zmniejsza skutki uboczne typowe dla
PL 212 357 B1
7
heparyn. Kolejną zaletą jest to, że związki według wynalazku mogą być charakteryzowane za pomocą
instrumentalnych technik analitycznych, takich jak spektroskopia NMR, co umożliwia kontrolę procesu,
całkowicie niezbędną w warunkach przemysłowych.
W modyfikowanych heparynach masa cząsteczkowa (MW) ma istotne znaczenie przy preparowaniu inhibitorów angiogenezy. Istotnie, powszechnie wiadomo, że zredukowanie masy cząsteczkowej (MW) do wielkości odpowiadającej jednostkom pentasacharydu nie powoduje utraty aktywności
przeciwangiogennej. Z drugiej strony, dowiedziono, że od pewnej długości, łańcuchy heparyny raczej
sprzyjają aktywacji FGF niż ją hamują, są one nawet lepszymi inhibitorami heparanazy niż krótsze
łańcuchy. Jednak, optymalna długość łańcucha do inhibicji heparynazy zależy od struktury inhibitora
(szkielet węglowodanowy, pozycje wiązania, miejsca przyłączania grup siarczanowych) i powinna być
określona dla każdego nowego typu potencjalnych inhibitorów.
W niniejszym opisie szczegółowo ujawniono i zastrzeżono jako nowe związki według wynalazku
zawierające reszty glukozaminowe o różnym stopniu usunięcia grup N-siarczanowych, następnie
poddane acetylacji.
Poprzez stopień usunięcia grup siarczanowych rozumiany jest procent nieusiarczonego kwasu
iduronowego w odniesieniu do całkowitego kwasu uronowego obecnego pierwotnie w początkowej
heparynie. Jednym z korzystnych zakresów stopnia desulfatacji jest zakres 40 do około 60%.
Pośród związków opisanych wzorem (I), pierwszym korzystnym związkiem jest heparyna,
w której część grup N-siarczanowych została usunięta i N-reacetylowana; o masie cząsteczkowej
(MW) 11200, o współczynniku polidyspersji 1,3, stopniu usunięcia grup siarczanowych 1,6 (wyrażonym jako stosunek molowy SO3-: COO-), procent zmodyfikowanych kwasów uranowych
w porównaniu z ich całkowitą ilością wynosi około 30% a reszty glukozaminowe posiadają stopień
N-acetylacji na poziomie 50%. Wspomniany związek jest zwany również STl 518.
Drugim korzystnym związkiem jest niskocząsteczkowa (LMW) heparyna pozbawiona częściowo
reszt N-siarczanowych i ponownie N-acetylowana, o masie cząsteczkowej (MW) 11200, współczynniku polidyspersji 1,3, stopniu usunięcia grup siarczanowych 1,6 (wyrażonym jako stosunek molowy
SO3-: COO-), procent zmodyfikowanych kwasów uranowych w porównaniu z ich całkowitą ilością wynosi około 30% a reszty glukozaminowe posiadają stopień N-acetylacji na poziomie 50%. Wspomniany związek jest zwany również ST2168.
Trzecim korzystnym związkiem jest heparyna pozbawiona częściowo reszt N-siarczanowych
i N-reacetylowana, o procencie zmodyfikowanych kwasów uranowych w porównaniu z ich całkowitą
ilością wynoszącym około 30% i resztach glukozaminowych o stopniu acetylacji na poziomie 27%.
Wspomniany związek jest zwany również ST2185.
Czwartym korzystnym związkiem jest heparyna pozbawiona częściowo reszt N-siarczanowych
i ulegająca ponownej N-acetylacji, o procencie zmodyfikowanych kwasów uranowych w porównaniu
z ich całkowitą ilością wynoszącym około 30% i resztach glukozaminowych o stopniu acetylacji na
poziomie 39%. Wspomniany związek jest zwany również ST2186.
Piątym korzystnym związkiem jest heparyna pozbawiona częściowo reszt N-siarczanowych
i ulegająca ponownej N-acetylacji, o procencie zmodyfikowanych kwasów uranowych w porównaniu
z ich całkowitą ilością wynoszącym około 30% i resztach glukozaminowych o stopniu N-acetylacji na
poziomie 64%. Wspomniany związek jest zwany również ST2187.
Wzmiankowane glikozaminoglikany według niniejszego wynalazku, w których część grup N-siarczanowych została usunięta i opcjonalnie podstawiona grupami N-acetylowymi, mogą być wytworzone
sposobem obejmującym następujące etapy, w których:
a) usuwa się grupy N-siarczanowe w wyniku reakcji solwolizy reszt sulfaminowych w roztworze
DMSO:H2O 95:5 obj.:obj., w temperaturze otoczenia przez okres czasu od 0,5 do 8 godzin, do uzyskania całkowitej lub częściowej eliminacji grup siarczanowych w pozycji 2 reszt glukozaminy;
b) prowadzi się N-acetylację wspomnianych całkowicie lub częściowo desulfonowanych grup
w pozycji 2 reszt glukozaminy poprzez poddanie ich działaniu czynnika acetylującego w zasadowym
roztworze wodnym (pH 8-9), uzyskując w wyniku całkowicie lub częściowo acetylowane grupy
w pozycji 2 reszt glukozaminy;
c) prowadzi się utlenianie dioli przy pomocy nadjodanu sodu, uzyskując otwarcie pierścienia glikozydowego i otrzymuje się dwie grupy aldehydowe przypadające na modyfikowaną resztę;
8
PL 212 357 B1
Do grupy zmodyfikowanych heparyn należą:
heparyna, w której część grup 2-O-siarczanowych została usunięta, możliwa do uzyskania
w procesie opisanym powyżej, przy czym etap a) i b) jest pominięty, etap c) jest prowadzony przez 45 min
PL 212 357 B1
9
w 60°C; etap d) w 70°C w pH 7, oraz posiadająca masę cząsteczkową (MW) wynoszącą 11200,
współczynnik polidyspersji D 1,3, stopień eliminacji grup siarczanowych 1,99 (wyrażany jako stosunek
molowy SO3-: COO-), zawartość zmodyfikowanych kwasów uranowych w porównaniu z ich całkowitą
ilością około 50% (również dalej nazywana STl 514);
drobnocząsteczkowa (LMW) heparyna, w której część grup 2-O-siarczanowych została usunięta, możliwa do uzyskania w procesie opisanym powyżej, przy czym etap a) i b)
jest pominięty, etap c)
jest prowadzony przez 45 min w 60°C; etap d) w 70°C w pH 7, 25 po nim następują kolejne etapy
prowadzone poprzez dezaminację; oraz posiadająca masę cząsteczkową (MW) wynoszącą 3050,
współczynnik polidyspersji D 2,2, stopień eliminacji grup siarczanowych 1,99 (wyrażany jako stosunek
molowy SO3-: COO-), zawartość zmodyfikowanych kwasów uranowych w porównaniu z ich całkowitą
ilością około 50% (również dalej nazywana ST2010);
drobnocząsteczkowa (LMW) heparyna, w której część grup 2-O-siarczanowych została usunięta, możliwa do uzyskania w procesie opisanym powyżej, przy czym etap a) i b) jest pominięty, etap c)
jest prowadzony przez 45 min w 60°C; etap d) w 70°C w pH 7, po nim następują kolejne etapy prowadzony poprzez dezaminację; oraz posiadająca masę cząsteczkową Mn = 5800, Mw = 7520, współczynnik polidyspersji D 1,294, zawartość zmodyfikowanych kwasów uranowych w porównaniu
z ich całkowitą ilością, wynosząca około 50% (również dalej nazywana ST2184);
N-acetylowana heparyna (50%), możliwa do uzyskania w procesie opisanym powyżej, przy
czym etap a) jest prowadzony przez 2 godziny w temperaturze pokojowej; etap b) przez 2 godziny
w 4°C, etap c) jest prowadzony w 4°C przez jedną noc, etap d) przez 3 godz. w temperaturze pokojowej; oraz posiadająca masę cząsteczkową (MW) wynoszącą 11200, współczynnik polidyspersji D wynoszący 1,3, stopień eliminacji grup siarczanowych 1,6 (wyrażany jako stosunek molowy SO3-: COO-), zawartość procentowa zmodyfikowanych kwasów uranowych w porównaniu z ich całkowitą ilością około
30% (również dalej nazywana STl518).
N-acetylowana, drobnocząsteczkowa (LMW) heparyna (50%), możliwa do uzyskania w procesie
opisanym powyżej, przy czym etap a) jest prowadzony przez 2 godziny w temperaturze pokojowej;
etap b) przez 2 godziny w 4°C, etap c) jest prowadzony w 4°C przez jedną noc, etap d) przez 3 godz.
w temperaturze pokojowej, etap c) prowadzony jest poprzez deaminację kwasem azotawym w 4°C
przez 17 min, po czym przeprowadza się redukcję grup aldehydowych z użyciem borowodorku w temperaturze pokojowej przez 3 godziny; oraz posiadająca masę cząsteczkową Mw = 4780, Mn = 10000, współczynnik polidyspersji D wynoszący 2,092, zawartość zmodyfikowanych kwasów uranowych
w porównaniu z ich całkowitą ilością około 30% (również dalej nazywana ST2168).
N-acetylowana heparyna (27%) możliwa jest do uzyskania w procesie opisanym powyżej, przy
czym etap a) jest prowadzony przez 2 godziny w temperaturze pokojowej; etap b) przez 2 godziny w 4°C,
a pozostałe etapy są pominięte; oraz posiada masę cząsteczkową Mn = 10890, Mw = 22370, współczynnik polidyspersji D 2,054 (również dalej nazywana ST2037).
N-acetylowana heparyna (39%) możliwa do uzyskania w procesie opisanym powyżej, przy
czym etap a) jest prowadzony przez 2 godziny w temperaturze pokojowej; etap b) przez 2 godziny
w 4°C, a pozostałe etapy są pominięte; oraz posiada masę cząsteczkową Mn = 10210, Mw = 21270,
współczynnik polidyspersji D 2,083 (również dalej nazywana ST2038).
N-acetylowana heparyna (64%) możliwa do uzyskania w procesie opisanym powyżej, przy
czym etap a) jest prowadzony przez 2 godziny w temperaturze pokojowej; 5 etap b) przez 2 godziny
w 4°C, a pozostałe etapy są pominięte; oraz posiada masę cząsteczkową Mn = 11070, Mw = 22000,
współczynnik polidyspersji D 1,987 (również dalej nazywana ST2041).
N-acetylowana heparyna (27%) możliwa do uzyskania w procesie opisanym powyżej, przy
czym etap a) jest prowadzony przez 2 godziny w temperaturze pokojowej; etap b) przez 2 godziny
w 4°C, a pozostałe etapy są pominięte; oraz posiada zawartość zmodyfikowanych kwasów uronowych
w porównaniu z ich całkowitą ilością około 30% (nazywana dalej również ST2185).
N-acetylowana heparyna (39%) możliwa do uzyskania w procesie opisanym powyżej, przy
czym etap a) jest prowadzony przez 2 godziny w temperaturze pokojowej; etap b) przez 2 godziny
w 4°C, a pozostałe etapy są pominięte; oraz posiadająca zawartość zmodyfikowanych kwasów uronowych w porównaniu z ich całkowitą ilością około 30% (również dalej nazywana ST2186).
N-acetylowana heparyna (64%) możliwa do uzyskania w procesie opisanym powyżej, przy
czym etap a) jest prowadzony przez 2 godziny w temperaturze pokojowej; etap b) przez 2 godziny
w 4°C, a pozostałe etapy są pominięte; oraz posiadająca zawartość zmodyfikowanych kwasów uronowych w porównaniu z ich całkowitą ilością około 30% (również dalej nazywana ST2187).
10
PL 212 357 B1
Sposób otrzymywania związków STl514, STl513, STl516 i STl515 został szczegółowo opisany
w publikacji zgłoszenia WO 01/55221.
Masy cząsteczkowe oznaczano stosując technikę HPLC-GPC (wysokosprawnej chromatografii cieczowej - chromatografii żelowej). Stopień eliminacji grup siarczanowych określano za pomocą pomiaru
konduktometrycznego, a procent zmodyfikowanych kwasów uronowych obliczano za pomocą 13C-NMR.
MW oznacza masę cząsteczkową, a D - współczynnik polidyspersji, wyrażany w postaci 30 MW/Mn.
Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, produktami wyjściowymi są glikozaminoglikany różnego pochodzenia, korzystnie naturalnie występujące heparyny. Możliwe jest również zastosowanie chemicznie zmodyfikowanych heparyn, zawierających od 0 do 100% grup N,6-disiarczanowych. Wychodząc od produktów
o różnej zawartości glukozaminy posiadającej grupę 6-O-siarczanową, możliwe jest modulowanie długości
regularnych sekwencji pomiędzy jednym otwartym kwasem iduronowym a następnym.
Według wynalazku, glikozaminoglikany, które zawierają otwarte pierścienie glikozydowe są
przez specjalistów w dziedzinie zwyczajowo nazywane pochodnymi RO, co oznacza, że pierścień
glikozydowy został otwarty w wyniku reakcji utleniania, po której nastąpiła reakcja redukcji (ang. Reduction-Oxidation - RO). Otwieranie pierścienia glikozydowego w ten sposób jest też zwyczajowo
nazywane reakcją rozszczepienia glikolu („glycol splil”), z powodu powstawania dwóch pierwszorzędowych grup hydroksylowych w pierścieniu. Wspominane związki będą również nazywane pochodnymi „RO” lub pochodnymi „Glycol Split”.
W przypadku kolejnego zastosowania niniejszego wynalazku, aldehydy i pierwszorzędowe grupy
hydroksylowe otrzymywane w wyniku opisanej powyżej reakcji otwierania pierścieni glikozydowych („glycol
split”) są poddawane dalszej modyfikacji funkcjonalnej. Stąd, związki według wzoru (I) mogą również posiadać jednakowe lub różne grupy, jak zdefiniowano powyżej dla X i X’, przyłączone przez pierwszorzędowe grupy hydroksylowe powstałe po otwarciu pierścienia glikozydowego, na przykład grupy oligosacharydowe lub peptydowe, w zakresie od pojedynczego sacharydu lub aminokwasu do dłuższych łańcuchów,
w preferowanym przypadku składających się z dwóch lub trzech jednostek.
Heparyny według wynalazku mogą być również stosowane jako nośniki innych rodzajów leków,
poprzez odpowiednie połączenie z częścią heparynową, która jest zdolna do tworzenia stabilnego
wiązania w normalnych warunkach produkcji i przechowywania wytworzonego leku, która jednakże
uwalnia transportowany lek w organizmie, korzystnie w pobliżu docelowego narządu. Przykładowymi
lekami, które mogą być w ten sposób transportowane, są steroidowe i niesteroidowe leki przeciwzapalne, kortykosteroidy i inne leki o właściwościach przeciwprzerzutowych, w przypadku których wystąpi korzystny efekt wzmocnienia efektu przeciwprzerzutowego w wyniku nakładania się aktywności
poszczególnych
elementów:
aktywności
związków
według
niniejszego
wynalazku
i aktywności czynników przeciwprzerzutowych, przyłączonych do związków według wynalazku, przy
czym dodatkową zaletą będzie zwiększona selektywność i niższa toksyczność ogólnoustrojowa. Przykładami takich leków są inhibitory metaloproteinaz. Innymi lekami, które mogą być z korzyścią transportowane są te, które działają na poziomie śródbłonka.
Związki według wzoru (I), w przypadku których X i X’ są grupami innymi niż hydroksylowe
i aldehydowe mogą być również używane jako nośniki dla leków, przy czym grupy X i X’ działałyby
jako „wysięgniki” dla transportowanej cząsteczki, czyli na przykład glikozaminoglikanu według niniejszego wynalazku, oddzielające ją od cząsteczki działającej jako nośnik, w sytuacjach, kiedy byłoby to
pożądane z powodów farmakokinetycznych lub farmakodynamicznych.
W przypadku związków według niniejszego wynalazku, będących pochodnymi heparyny, są one
otrzymywane z heparyny jako takiej, przez usuwanie grup N-siarczanowych, a następnie N-acylację przy
użyciu technik znanych specjalistom w dziedzinie. Przykładowo, usuwanie grup N-siarczanowych, jest
prowadzone poprzez solwolizę w roztworze DMSO:H2O o proporcjach 95:5 obj:obj, w temperaturze pokojowej, przez okres czasu od 0,5 do 8 godzin, a N-acylacja w warunkach zasadowych przy pomocy, na
przykład, bezwodników kwasowych (np.: octowy, heksanowy, sukcynylowy, piwalonowy).
W następnej kolejności usuwane są grupy 2-O-siarczanowe, co przeprowadza się w obecności
czynników zasadowych, takich jak wodorotlenek sodu, w temperaturze sięgającej od pokojowej do
100°C, w postaci preferowanej od 50 do 70°C, na przykład w 60°C, przez okres czasu wystarczająco
długi do uzyskania żądanego stopnia eliminacji 25 grup 2-O-siarczanowych. Stopień eliminacji grup 2-O-siarczanowych jest kontrolowany poprzez zmianę parametrów procesu, takich jak stężenia odczynników, temperaturę i czas reakcji. W przykładowy, korzystny sposób, utrzymywane są stałe stężenia
substratu (glikozaminoglikan) na poziomie 80 mg/ml i NaOH na poziomie 1M, stała temperatura 60°C
a usuwanie grup siarczanowych jest kontrolowane przez czas reakcji trwającej od 15 do 60 min. Spe-
PL 212 357 B1
11
cjalista w dziedzinie może zmieniać warunki reakcji, na przykład poprzez podniesienie temperatury i
skrócenie czasu jej trwania, metodą prób i błędów w praktyce eksperymentalnej lub wykorzystując
swoją ogólną wiedze w dziedzinie.
Działanie czynnikami kwaśnymi prowadzi do powstawania produktów pośrednich, charakteryzujących się obecnością pierścienia epoksydowego w części pozbawionej grup Siarczanowych. W sposób
zupełnie niespodziewany, takie produkty pośrednie okazały się być obdarzone własnościami hamowania
heparanazy, podobnymi do wykazywanych przez związki według wzoru (I). Niniejszy wynalazek związany
jest zatem z pochodną heparyny, w której część grup 2-O-siarczanowych została usunięta i heparyną
o obniżonym ładunku, w szczególności heparyną, w której usuniętych zostało nie więcej niż 60% grup 2-Osiarczanowych, charakteryzującą się obecnością pierścienia epoksydowego w miejscu usunięcia grup
siarczanowych. Wzmiankowane związki, charakteryzujące się obecnością pierścienia epoksydowego, są
również objęte niniejszym wynalazkiem.
Utworzone pierścienie epoksydowe są następnie otwierane, również przy pomocy powszechnie
znanych technik. Procent powstających pierścieni epoksydowych jest wyznaczany jako stosunek powierzchni sygnałów 13C-NMR przy około 55 ppm, charakterystycznych dla węgli 2 i 3 pierścieni kwasu
uronowego zawierającego grupę epoksydową i całkowitej ilości sygnałów anomerycznych (Cl reszt
glukozaminy i kwasu uronowego). Jeśli otwieranie pierścienia epoksydowego jest prowadzone
w wysokiej temperaturze uzyskiwana jest reszta kwasu galakturonowego, natomiast gdy w niskiej
temperaturze, uzyskiwana jest reszta kwasu iduronowego. Przykładowe korzystne związki zawierające pierścień epoksydowy są otrzymywane w procesie opisanym powyżej i zawierają odpowiednio 14%
(związek zwany dalej STl 509), 24% (związek zwany dalej STl525) i 30% (związek zwany dalej
STl526) epoksydowanych kwasów uronowych.
Heparyna, w której część grup siarczanowych została usunięta, jest następnie poddawana reakcji otwierania pierścieni glikozydowych (reakcji glycol split, w skrócie RO), w procesie opisanym
powyżej i reakcji degradacji Smitha (w skrócie SD).
Alternatywnie, związki według wzoru (I) mogą być również otrzymywane z pominięciem półproduktu epoksydowego, czyli poprzez bezpośrednią reakcję otwierania pierścieni glikozydowych, a następnie reakcję degradacji Smitha.
Opisany dotychczas proces prowadzi do powstawania związków według wzoru (I), w których
zarówno grupy X, jak i X’ są grupami -CH2OH.
Otrzymanie grup X i X’ innych niż -CH2OH umożliwiają dostępne dla specjalistów w dziedzinie,
metody modyfikowania grup hydroksylowych przez inne grupy wskazane w podanych powyżej definicjach (patrz, na przykład, schemat na stronie 4, związki STl828, STl829, STl917 i STl919). Dla przykładu, przyłączenie aminokwasu lub peptydu dokonuje się poprzez poddawanie aldehydowego półproduktu uzyskanego w wyniku otwierania pierścieni glikozydowych, reakcji redukcyjnego aminowania
(Hoffmann J. et al., Carbohydrate Research, 117, 328-331 (1983), która może być prowadzona w
roztworze wodnym i nie powoduje uszkodzenia struktury heparyny.
Heparyny według wynalazku mogą być następnie degradowane przy użyciu czynników kwaśnych w odpowiednich warunkach pH, np. w pH 4, do otrzymania mieszaniny oligosacharydów, która
zachowuje własności przeciwangiogenne.
Przedmiotem niniejszego wynalazku są kompozycje farmaceutyczne zawierające jako składnik
aktywny przynajmniej jedną ujawnioną zmodyfikowaną heparynę. Składnik aktywny według niniejszego wynalazku będzie występował w mieszaninie z odpowiednimi nośnikami i/lub zarobkami, powszechnie stosowanymi w technologii farmaceutycznej, takimi jak na przykład opisane w ostatnim
wydaniu podręcznika „Remington’s Pharmaceutical Sciences Handbook”. Kompozycje według niniejszego wynalazku będą zawierać terapeutycznie skuteczną ilość składnika aktywnego.
Sposób dozowania będzie określony przez specjalistę w dziedzinie, np. klinicystę lub lekarza
pierwszego kontaktu, właściwie do rodzaju leczonej choroby i stanu pacjenta lub jednocześnie
z podawanymi innymi składnikami aktywnymi. Przykładowo, mogą być zastosowane dawki z zakresu
od 0,1 do 100 mg/kg.
Przykładowe kompozycje farmaceutyczne mogą być podawane doustnie lub pozajelitowo, dożylnie, domięśniowo, podskórnie, przezskórnie lub w formie sprayu do nosa lub doustnego. Kompozycje
farmaceutyczne właściwe do podawania mogą być w formie tabletek, twardych lub miękkich kapsułek,
proszków, roztworów, zawiesin, syropów i stałych form do bezpośredniego przygotowania preparatów
płynnych. Produkty do pozajelitowego podawania mogą być, na przykład, w jakiejkolwiek formie do
domięśniowego, dożylnego i podskórnego wstrzykiwania, jak również w formie roztworów, zawiesin i
12
PL 212 357 B1
emulsji. Należy również wspomnieć o postaci liposomowej. Tabletki obejmują również postaci do kontrolowanego uwalniania składnika aktywnego, zarówno podawane doustnie, w formie tabletek pokrytych odpowiednimi warstwami, proszków w mikrokapsułkach, kompleksów związanych z cyklodekstrynami, postaci o przedłużonym działaniu, na przykład postaci podawane podskórnie, takie jak iniekcje
lub implanty o przedłużonym działaniu.
Związki według niniejszego wynalazku posiadają aktywność przeciwheparanazową i przeciwangiogenną. Dzięki temu, nadają się do wytwarzania preparatów używanych w leczeniu podmiotów,
ogólnie ssaków, szczegółowo organizmów ludzkich, cierpiących z powodu nieprawidłowej angiogenezy
lub podmiotów wymagających leczenia obejmującego zahamowanie aktywności haparanazowej.
Przykładami chorób leczonych przy pomocy preparatów będących przedmiotem niniejszego
wynalazku są guzy pierwotne, przerzuty, retinopatie cukrzycowe, łuszczyca, pozasoczewkowy rozrost
włóknisty, nawrot zwężenia po plastyce naczynia, połączenie omijające zwężenie tętnicy wieńcowej,
zapalenie, zapalenie stawu/stawów, choroby autoimmunologiczne, odrzuty aloprzeszczepu, choroby
sercowo-naczyniowe, choroba włóknisto-proliferacyjna, choroby wynikające z nieprawidłowej agregacji
płytek, choroby wynikające z nieprawidłowego rozrostu mięśnia gładkiego, zespół Goodpasture’a,
ostre zapalenie kłębuszkowe nerek, nadciśnienie płucne u noworodków, astma, zastoinowa niewydolność serca, nadciśnienie płucne u dorosłych, nerkopochodne nadciśnienie naczyniowe, rozrostowa
retinopatia, doświadczalne eksperymentalne zapalenie mózgu i rdzenia, stwardnienie rozsiane, cukrzyca insulinozależna, choroba zapalna jelita, wrzodziejące zapalenie okrężnicy, choroba Crohn’a.
Korzystnie, związki według niniejszego wynalazku są w znacznym stopniu pozbawione skutków
ubocznych typowych dla heparyny. W szczególności, związki według niniejszego wynalazku są
znacznie pozbawione aktywności przeciwkoagulacyjnej. Przez znaczne pozbawienie takiej aktywności
specjalista w dziedzinie rozumie brak aktywności lub aktywność pomijalną z punktu widzenia zastosowania klinicznego. Aktywność inhibicji heparanazy określano metodą wprowadzoną przez grupę
Vlodavsky'go (Bitan M. et al., 1995). Jest to metoda oparta na określaniu stopnia spowodowanej przez
heparanazę fragmentacji łańcuchów siarczanów heparanu w proteoglikanach heparanosiarczanowych
(HSPG). Znakowana siarczanem macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) jest najczęściej stosowana jako
źródło HSPG. ECM znakowana siarczanem jest inkubowana z rekombinowaną heparanazą w pH 6,2,
bez dodatku i z dodatkiem zwiększających się stężeń testowanego związku. Do określania stopnia
degradacji proteoglikanu, pożywka w której prowadzona jest inkubacja jest zbierana i poddawana
filtracji żelowej na kolumnach Sepharose 6B (0,9 x 30 cm). Frakcje (0,2 ml) są eluowane przy pomocy
PBS przy prędkości przepływu 5 ml/godz. i badane pod kątem radioaktywności. Objętość wyłączona
(Vo) jest oznaczana przy pomocy błękitnego dekstranu, a całkowita dostępna objętość (Vt) przy pomocy czerwieni fenolowej.
Fragmenty łańcuchów bocznych HS po degradacji są wymywane z kolumny Sepharose 6B przy
0,5 < Kav < 0,8 (pik II). W podanych warunkach eksperymentalnych dobre inhibitory heparanazy hamują fragmentację HS w stężeniach 10 μg/ml lub niższych.
Wyniki przedstawiono poniżej w tabeli 1.
Tabela 1
Inhibicja heparanazy przez dawki z zakresu od 25 μg/mI do 5 μg/ml
Inhibicja
25 μg/ml
10 μg/ml
5 μg/ml
Heparyna
100%
n.d.
> 100%
ST1516*
Heparyna 40% RO
100%
n.d.
> 85%
STl514*
Heparyna 50% RO
100%
100%
> 85%
STl 515*
Heparyna 27,5% RO
100%
100%
100%
Heparyna 50% NAe 30% RO
100%
100%
> 85%
Dawka
STl518
* Związek odnośnikowy ujawniono w WO 01/55221
Warto przy tym nadmienić, że ST1518 wykazuje wysoką aktywność inhibitorową, nawet
w stężeniach 1 μg/ml.
PL 212 357 B1
13
Związki według niniejszego wynalazku, a w szczególności nowe związki, były testowane pod
kątem aktywności względem czynników wzrostu FGF, przy użyciu modelu eksperymentalnego opisanego w WO 01/55221 i wykazywały aktywność porównywalną z ujawnioną w cytowanym dokumencie.
Wynalazek zilustrowano za pomocą poniższych przykładów.
Przykład 1
ST1518
Do wodnego roztworu zawierającego 1 g heparyny, uprzednio uzyskanego poprzez wymycie
z kolumny Amberlite IR 120, dodawano nadmiar pirydyny. Roztwór odparowywano w warunkach obniżonego ciśnienia; uzyskaną pirydynową sól heparyny rozpuszczano w 50 ml mieszaniny DMSO/H2O
95:5 i mieszano w 20°C przez 2 godziny, tak aby otrzymać stopień eliminacji grup siarczanowych na
poziomie około 50%.
Następnie, roztwór był rozcieńczany taką samą objętością nasyconego roztworu NaHCO3. Roztwór poddano dializie do wody destylowanej stosując membrany o granicy rozdziału 1000-2000 D.
Ostateczny produkt izolowano poprzez odparowywanie w warunkach obniżonego ciśnienia.
N-acetylowaną heparynę otrzymywano w wyniku N-acetylacji 50% N-desulfonowanej heparyny. 1 g
heparyny rozpuszczono w 10 ml wody destylowanej; roztwór schłodzono do 154°C i wysycono kwaśnym
węglanem sodu; do tego roztworu dodawano 625 μl bezwodnika octowego, po czym mieszaninę mieszano przez 2 godziny w 4°C. Podczas reakcji kontrolowano i utrzymywano pH na poziomie około 8,
poprzez dodawanie kwaśnego węglanu sodu. Następnie, otrzymany roztwór był dializowany do wody
destylowanej przy pomocy membran o granicy rozdziału 1000-2000 D.
1 g 50% N-acetylowanej heparyny rozpuszczono w 25 ml wody destylowanej i schłodzono do
4°C. Następnie, po dodaniu 25 ml roztworu 0,2 M NaIO4, roztwór mieszano przez 20 godzin bez dostępu światła, po czym reakcję zatrzymano poprzez dodanie glikolu etylenowego i eliminowano sól
metodą ultrafiltracji w układzie stycznym. Do odsolonego roztworu dodawano w kilku porcjach 400 mg
NaBH4 Roztwór mieszano przez 3 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie zobojętniano rozcieńczonym HCl i odsalano stosując ultrafiltrację w układzie stycznym.
Widmo 13C NMR otrzymanego związku przedstawiono na figurze 1.
Przykład 2
ST2010 i ST2184
5 g heparyny rozpuszczano w 63 ml 1 N roztworu NaOH. Roztwór mieszano 45 min w 60°C, schładzano i zobojętniano rozcieńczonym HCl. Następnie, roztwór mieszano przez 48 godzin w 70°C, schładzano i dializowano do wody destylowanej przy pomocy membran o granicy rozdziału 1000-2000 D.
2 g heparyny, w której część grup 2-O-siarczanowych została usunięta, rozpuszczano w 50 ml
wody destylowanej i schładzano do 4°C. Następnie, po dodaniu 50 ml roztworu 0,2 M NaIO4, roztwór
był mieszany przez 20 godzin bez dostępu światła. Reakcja zatrzymano poprzez dodanie glikolu etylenowego, a sole eliminowano stosując ultrafiltrację w układzie stycznym. Do odsolonego roztworu
dodawano w kilku porcjach 800 mg NaBH4. Roztwór mieszano przez 3 godziny w temperaturze otoczenia, a następnie zobojętniano rozcieńczonym HCl i odsalano stosując ultrafiltrację w układzie
stycznym.
400 mg utlenionej-zredukowanej heparyny rozpuszczano w 25 ml wody destylowanej. Po dodaniu
7 mg NaNO2, pH doprowadzono do 2, przy pomocy rozcieńczonego HCl i roztwór mieszano przez
17 min w 4°C. Reakcję zatrzymano poprzez zobojętnianie. Do odsolonego roztworu dodawano w kilku
porcjach 60 mg NaBH4. Roztwór mieszano przez 3 godziny w temperaturze otoczenia, a następnie zobojętniano rozcieńczonym HCl i frakcjonowano przy pomocy filtracji żelowej. Zebrano dwie frakcje
o różnych masach cząsteczkowych: ST2010 o masie Mw = 3050 i ST2184 o masie Mn = 5800, a Mw =
7520. Widmo 13C NMR związku ST2010 przedstawiono na figurze 2.
Przykład 3
ST2041
Do wodnego roztworu zawierającego 2 g heparyny, wymytego uprzednio z kolumny Amberlite
IR 120, dodawano nadmiar pirydyny. Roztwór odparowywano przy pomocy obniżonego ciśnienia;
uzyskaną pirydynową sól heparyny rozpuszczano w 100 ml mieszaniny DMSO/H2O 95:5 i mieszano
w 20°C przez 4 godziny, tak aby otrzymać stopień eliminacji grup siarczanowych około 64%.
Następnie, roztwór rozcieńczano taką samą objętością nasyconego roztworu NaHCO3. Roztwór
dializowano do wody destylowanej przy pomocy membran o granicy rozdziału 1000-2000 D. Ostateczny
produkt izolowano poprzez odparowywanie w warunkach obniżonego ciśnienia. Widmo 13C NMR
związku ST2041 przedstawiono na figurze 3.
14
PL 212 357 B1
Zastrzeżenia patentowe
1. Zmodyfikowana heparyna zawierająca reszty glukozaminy o różnym stopniu N- desulfonacji,
a następnie N-acetylacji, otrzymana poprzez poddanie heparyny procesowi obejmującemu następujące etapy, w których:
a) usuwa się grupy N-siarczanowe w wyniku reakcji solwolizy reszt sulfaminowych w roztworze
DMSO:H2O 95:5 obj.:obj., w temperaturze otoczenia przez okres czasu od 0,5 do 8 godzin, do uzyskania całkowitej lub częściowej eliminacji grup siarczanowych w pozycji 2 reszt glukozaminy;
b) prowadzi się N-acetylację wspomnianych całkowicie lub częściowo desulfonowanych grup
w pozycji 2 reszt glukozaminy poprzez poddanie ich działaniu czynnika acetylującego w zasadowym
roztworze wodnym (pH 8-9), uzyskując w wyniku całkowicie lub częściowo acetylowane grupy w pozycji 2 reszt glukozaminy;
c) prowadzi się utlenianie dioli przy pomocy nadjodanu sodu, uzyskując otwarcie pierścienia glikozydowego i otrzymuje się dwie grupy aldehydowe przypadające na modyfikowaną resztę;
d) prowadzi się redukcję wspomnianych grup aldehydowych do alkoholu pierwszorzędowego;
e) prowadzi się fakultatywną kwaśną hydrolizę związków uzyskanych w etapie d) uzyskując oligosacharydy odpowiadające regularnym sekwencjom; lub alternatywnie
f) produkty otrzymane na etapie d) poddaje się częściowej hydrolizie enzymatycznej przy użyciu
enzymu wybranego z grupy obejmującej: liazy, heparynazy, heparytynazy lub ich odpowiedniki, w celu
otrzymania oligosacharydów zawierających na końcu nieredukującym resztę składającą się z nienasyconego kwasu iduronowego, a na końcu redukującym resztę składającą się z N-sulfoglukozaminy
oraz zawierających przynajmniej jedną resztę otwartego kwasu iduronowego.
2. Heparyna według zastrz. 1, znamienna tym, że wybrana z grupy obejmującej:
- częściowo N-desulfonowaną i N-reacetylowaną heparynę o masie cząsteczkowej (MW) 11200,
współczynniku polidyspersji 1,3, stopniu eliminacji grup siarczanowych 1,6 (wyrażonym jako stosunek
molowy SO3-: COO-), zawartości procentowej zmodyfikowanych kwasów uronowych w porównaniu
z ich całkowitą ilością, wynoszącej około 30%, i resztach glukozaminowych o stopniu N-acetylacji
wynoszącym 50%;
- częściowo N-desulfonowaną i N-reacetylowaną heparynę, o masie cząsteczkowej Mn = 4780,
Mw = 10000, współczynniku polidyspersji 2,092, zawartości procentowej zmodyfikowanych kwasów
uronowych w porównaniu z ich całkowitą ilością, wynoszącej około 30%, i resztach glukozaminowych
o stopniu N-acetylacji wynoszącym 50%;
- częściowo N-desulfonowaną i N-reacetylowaną heparynę, o zawartości procentowej zmodyfikowanych kwasów uronowych w porównaniu z ich całkowitą ilością, wynoszącej około 30%, i resztach
glukozaminowych o stopniu N-acetylacji wynoszącym 27%;
- częściowo N-desulfonowaną i N-reacetylowaną heparynę, o zawartości procentowej zmodyfikowanych kwasów uronowych w porównaniu z ich całkowitą ilością, wynoszącej około 30%, i resztach
glukozaminowych o stopniu N-acetylacji wynoszącym 39%;
- częściowo N-desulfonowaną i N-reacetylowaną heparynę, o zawartości procentowej zmodyfikowanych kwasów uronowych w porównaniu z ich całkowitą ilością, wynoszącej około 30%, i resztach
glukozaminowych o stopniu N-acetylacji wynoszącym 64%;
3. Zastosowanie związku według zastrz. 1 albo 2 do wytwarzania leku o aktywności inhibitującej
heparanazę.
4. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że lek ma aktywność antyangiogenną.
5. Zastosowanie według zastrz. 3 albo 4, znamienne tym, że lek jest użyteczny do leczenia
stanów zapalnych.
6. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. od 3 do 5, znamienne tym, że wspomniany lek
jest użyteczny do leczenia chorób autoimmunologicznych.
7. Zastosowanie według dowolnego z zastrz. od 3 do 6, znamienne tym, że leczona choroba
jest wybrana z grupy składającej się z: guzów pierwotnych, przerzutów, retinopatii cukrzycowych, łuszczycy, pozasoczewkowego rozrostu włóknistego, nawrotu zwężenia po plastyce naczynia, połączenia
omijającego zwężenie tętnicy wieńcowej, zapalenia, zapalenia stawów, chorób autoimmunologicznych,
odrzutów aloprzeszczepu, chorób sercowo- naczyniowych, choroby włóknistoproliferacyjnej, chorób
wynikających z nieprawidłowej agregacji płytek, chorób wynikających z nieprawidłowego rozrostu mię-
PL 212 357 B1
15
śnia gładkiego, zespołu Goodpasture’a, ostrego zapalenia kłębuszkowego nerek, nadciśnienia płucnego
u noworodków, astmy, zastoinowej niewydolności serca, nadciśnienia płucnego u dorosłych, nerkopochodnego nadciśnienia naczyniowego, rozrostowej retinopatii, doświadczalnego eksperymentalnego
zapalenia mózgu i rdzenia, stwardnienia rozsianego, cukrzycy insulinozależnej, choroby zapalnej jelita,
wrzodziejącego zapalenia okrężnicy, choroby Leśniowskiego-Crohna.
8. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca przynajmniej jeden związek według zastrz. 1 albo 2
jako składnik aktywny z domieszką dopuszczalnych farmaceutycznie nośników i zaróbek.
Rysunki
16
PL 212 357 B1
Departament Wydawnictw UP RP
Cena 4,92 zł (w tym 23% VAT)