plik PDF - Wydział Biologii i Biotechnologii

dr Beata Kurowicka
Katedra Fizjologii Zwierząt
Wydział Biologii i Biotechnologii
Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie
ul. Oczapowskiego 1A
10-719 Olsztyn
tel. (089) 523 42 18
e-mail: [email protected]
AUTOREFERAT
OPIS DOROBKU I OSIĄGNIĘĆ NAUKOWYCH
1. Imię i Nazwisko
Beata Kurowicka
2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe
Praca magisterska
1991 – „Analiza stanu mikrobiologicznego wód kompleksu Wielkich Jezior Mazurskich”
Promotor: dr Aleksander Świątecki. Zakład Mikrobiologii i Immunologii, Wydział
Matematyczno-Przyrodniczy, Wyższa Szkoła Pedagogiczna w Olsztynie
Rozprawa doktorska
1997 – „Dywergencja wydolności termoregulacji u szczurów wyhodowanych w chłodzie i
cieple”
Promotor: prof. dr hab. Michał Caputa, Zakład Fizjologii Zwierząt, Wydział Biologii i
Nauk o Ziemi, Uniwersytet M. Kopernika w Toruniu
3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych/
artystycznych
1991 – 1998 r.
Katedra Biologii Ogólnej, Instytut Biologii, Wydział MatematycznoPrzyrodniczy, Wyższa Szkoła Pedagogiczna w Olsztynie (asystent)
1993-1997 r.
Studia doktoranckie na Wydziale Biologii i Nauk o Ziemi, Uniwersytet M.
Kopernika w Toruniu, Zakład Fizjologii Zwierząt
1998 – 1999 r.
Katedra Biologii Ogólnej, Instytut Biologii, Wydział MatematycznoPrzyrodniczy, Wyższa Szkoła Pedagogiczna w Olsztynie (adiunkt)
1999 – 2013 r. Katedra Fizjologii Zwierząt, Wydział Biologii, Uniwersytet WarmińskoMazurski w Olsztynie (adiunkt)
2014 r. – obecnie Katedra Fizjologii Zwierząt, Wydział Biologii i Biotechnologii, UWM w
Olsztynie (asystent)
2
4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca
2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w
zakresie sztuki (Dz. U. nr 65, poz. 595 ze zm.):
a) tytuł osiągnięcia naukowego:
Oddziaływanie wysokiej temperatury otoczenia w okresie neonatalnym na rozwój
układu rozrodczego i funkcjonowanie osi przysadka-jądra u samców szczura
b) publikacje wchodzące w skład osiągnięcia
(przy publikacjach podano punkty MNiSW wg Komunikatu Ministra Nauki i Szkolnictwa Wyższego w sprawie
wykazu czasopism naukowych z dnia 23. grudnia 2015 r. oraz roku wydania. IF podano z roku wydania, a
dla publikacji z 2015 r. i 2016 r. IF podano z 2015 r.)
1. Kurowicka B, Gajewska A, Amarowicz R, Kotwica G (2008) Effect of warm-rearing and heat
acclimation on pituitary-gonadal axis in male rats. International Journal of Andrology 31(6):
579-587. (MNiSW2008 = 24 pkt, MNiSW2015 = 50 pkt, IF = 4,021)
Mój wkład w powstanie publikacji: jestem autorem korespondencyjnym, przygotowałam pracę do druku,
miałam wiodący udział w planowaniu eksperymentów i znaczący udział w wykonaniu eksperymentów,
przeprowadzeniu analizy jakościowej oraz w analizie statystycznej, interpretacji i opracowaniu wyników.
Swój udział w powstawaniu publikacji szacuję na 60%.
2. Kurowicka B, Dietrich G, Kotwica G (2015) Effect of neonatal or adult heat acclimation on
testicular and epididymal morphometry and sperm production in rats. Reproductive Biology
15(1):1-8. doi: 10.1016/j.repbio.2015.01.001 (MNiSW2015 = 15 pkt, IF = 1,722)
Mój wkład w powstanie publikacji: jestem autorem korespondencyjnym, przygotowałam pracę do druku,
miałam wiodący udział w planowaniu eksperymentów i znaczący udział w wykonaniu eksperymentów,
przeprowadzeniu analizy jakościowej oraz w analizie statystycznej, interpretacji i opracowaniu wyników.
Swój udział w powstawaniu publikacji szacuję na 75%.
3. Kurowicka B, Chrusciel M, Zmijewska A, Doroszko M, Kotwica G, Rahman NA (2015)
Distinct testicular steroidogenic response mechanisms between neonatal and adult heatacclimated male rats. Cellular Physiolology and Biochemistry. 35(5):1729-1743. doi:
10.1159/000373985. (MNiSW2015 = 25 pkt, IF = 4,652)
Mój wkład w powstanie publikacji: jestem autorem korespondencyjnym, przygotowałam pracę do druku,
miałam wiodący udział w planowaniu eksperymentów i znaczący udział w wykonaniu eksperymentów,
przeprowadzeniu analizy jakościowej oraz w analizie statystycznej, interpretacji i opracowaniu wyników.
Swój udział w powstawaniu publikacji szacuję na 72%.
4. Kurowicka B, Chrusciel M, Zmijewska A, Kotwica G (2016) Effect of neonatal or adult heat
acclimation on plasma T3 level, testicular thyroid receptors expression in male rats and
testicular steroidogenesis in vitro in response to triiodothyronine treatment. Polish Journal of
Veterinary Science, 19: 379-386. (MNiSW2015 = 20 pkt, IF = 0,719)
Mój wkład w powstanie publikacji: jestem autorem korespondencyjnym, przygotowałam pracę do druku,
miałam wiodący udział w planowaniu eksperymentów i znaczący udział w wykonaniu eksperymentów,
przeprowadzeniu analizy jakościowej oraz w analizie statystycznej, interpretacji i opracowaniu wyników.
Swój udział w powstawaniu publikacji szacuję na 80%.
Razem liczba punktów MNiSW z roku wydania = 84
liczba punktów MNiSW z roku 2015 = 110
Szacunkowy sumaryczny IF = 11,114
Oświadczenia współautorów o udziale własnym w przygotowaniu prac stanowiących szczególne
osiągnięcia naukowe w załączniku nr 7.
3
c) omówienie celu naukowego/artystycznego ww. pracy/prac i osiągniętych wyników wraz z
omówieniem ich ewentualnego wykorzystania
Wpływ środowiska na kształtowanie się fenotypu organizmu stanowi w
ostatnich latach znaczącą część badań ekologicznych, ewolucyjnych lecz również tych,
związanych ze zdrowiem człowieka. Udział środowiska w przebiegu procesów rozwojowych
organizmu, określany jako plastyczność fenotypowa, objawia się poprzez intensywnie badane
mechanizmy epigenetycznej modyfikacji ekspresji genów podczas rozwoju embrionalnego oraz
znacznie słabiej poznane mechanizmy kształtujące fenotyp osobnika, pod wpływem środowiska,
w okresie neonatalnym. Plastyczność fenotypowa oznacza stopień do jakiego doświadczenia,
zbierane przez organizm w trakcie rozwoju ontogenetycznego, w różnych warunkach środowiska
zewnętrznego, wpływają na jego fenotyp. Oznacza to zatem możliwość kształtowania różnych
fenotypów na podstawie jednego genotypu, w zależności od odmiennych warunków
środowiskowych.
Siła oddziaływania poszczególnych elementów środowiska na kształtowanie fenotypu
zależy od wrażliwości organizmu podczas jego rozwoju na działanie danego czynnika.
Wrażliwość ta dotyczy tzw. wartości krytycznych danego czynnika środowiskowego (wielkość
zmiany danego elementu środowiska wywołująca zmiany fenotypu) oraz istnienia tzw. okien
czasowych w trakcie rozwoju osobniczego, podczas których czynnik środowiskowy może
wpływać na ostateczny fenotyp osobnika. Są to tzw. okresy krytyczne w kształtowaniu się
poszczególnych cech fenotypu.
Jednym z istotnych dla funkcjonowania organizmu czynników środowiska jest temperatura
otoczenia. U ssaków i ptaków układ regulacji temperatury zapobiega wahaniom temperatury
wnętrza ciała podczas zmian temperatury otoczenia. Ponieważ rozwój tego układu kształtuje się
podczas życia płodowego i po urodzeniu, możliwe jest zatem dostosowanie czynności tego układu
do środowiska termicznego, czyli podlega on programowaniu przez środowisko w okresie
rozwoju. U zwierząt laboratoryjnych, hodowanych w niskiej bądź wysokiej temperaturze,
wielokrotnie stwierdzano nieodwracalne modyfikacje odruchowej odpowiedzi na temperaturę
otoczenia, podczas kształtowania się ich układu regulacji temperatury. Moje wcześniejsze badania
naukowe koncentrowały się właśnie na ocenie wpływu podwyższonej lub obniżonej temperatury
otoczenia podczas rozwoju ontogenetycznego szczurów na czynność układu regulacji temperatury
[1, 2, 3]. Stwierdziłam podwyższenie set-point temperatury organizmu, wyższą odporność na
hipertermię oraz obniżoną aktywność mechanizmów obrony przed zimnem u szczurów
hodowanych w wysokiej temperaturze otoczenia w okresie neonatalnym.
4
Inspiracją do następnego etapu moich badań (już po osiągnięciu stopnia doktora nauk
biologicznych), było wykazanie przez innych Autorów na wielu modelach doświadczalnych
upośledzenia czynności rozrodczych samców podczas ich ekspozycji na gorąco (Ryc. 1).
Gonady
dorosłych
samców
poddane
hipertermii
Wyższa śmiertelność
potomstwa
Niedotlenienie i niedokrwienie
jąder
Stres oksydacyjny
Apoptoza spermatocytów
i spermatyd
Degeneracyjne
zmiany nabłonka
plemnikotwórczego
Dorosłe
samce
aklimowane
do gorąca
Wzrost aktywności
enzymów szlaku
steroidogenezy w
jądrach oraz
metabolizmu
steroidów w wątrobie
Obniżone stężenie testosteronu
we krwi obwodowej
Obniżone stężenie LH,
prolaktyny i T3/T4 we krwi
obwodowej
Niepłodność lub obniżona płodność
Rycina 1. Najważniejsze skutki działania wysokiej temperatury na organizm dojrzałych płciowo samców.
Ich konsekwencją jest niepłodność lub obniżona płodność samców.
Bazując na wynikach moich poprzednich doświadczeń dotyczących plastycznego
dostosowania układu regulacji temperatury szczurów - po nabyciu umiejętności badania układu
rozrodczego - postawiłam hipotezę, że u samców szczura hodowanych od urodzenia w wysokiej
temperaturze otoczenia zmiany czynności układu rozrodczego nie muszą być tak znaczne, jak w
przypadku ekspozycji dorosłych samców na gorąco (Ryc. 1). Weryfikacja tej hipotezy stanowiła
główny cel podjętych przeze mnie badań, przedstawionych w niniejszym opracowaniu. Kolejnym
celem było wyjaśnienie, czy zmiany morfologii i czynności jąder samców, hodowanych w gorącu
od urodzenia, są nieodwracalne podczas deaklimacji, czyli spełniają kryteria plastyczności
fenotypowej. Nie bez wpływu na podjęcie przeze mnie tych badań były także liczne doniesienia o
spadającej produkcji plemników w jądrach współczesnych mężczyzn i wpływie przegrzewania
gonad na to zjawisko. Przegrzewanie gonady może być powodowane, między innymi, siedzącym
trybem życia, stylem ubierania się, lub też używaniem pieluch jednorazowych w okresie
niemowlęcym.
Badania prowadziłam na samcach szczura norweskiego (Rattus norvegicus) rasy Wistar,
podzielonych na cztery grupy doświadczalne. Grupę pierwszą stanowiły samce kontrolne (CR) –
urodzone i hodowane w temperaturze otoczenia 20 C przez 90 dni. Drugą grupę (NHA/WR)
stanowiły samce aklimowane do gorąca w okresie neonatalnym, czyli urodzone i hodowane w
temperaturze otoczenia 34 C przez 90 dni. Badałam również trwałość przystosowań układu
rozrodczego samców do wysokiej temperatury otoczenia, poprzez ocenę czynności i morfologii
układu rozrodczego samców urodzonych w wysokiej temperaturze otoczenia (34 C) i po
osiągnięciu dojrzałości płciowej (45 dzień życia) przeniesionych do temperatury standardowej
(20 C) na okres 45 dni (grupa deaklimowana - DA). Porównanie morfologii i czynności układu
5
rozrodczego samców pod wpływem neonatalnej aklimacji do wysokiej temperatury otoczenia
oraz aklimacji dorosłych samców do takiej temperatury, umożliwiła grupa samców dorosłych
aklimowanych do gorąca, czyli samców urodzonych w temperaturze otoczenia 20 C i po
osiągnięciu dojrzałości płciowej (45 dzień życia) poddanych aklimacji do temperatury 34 C przez
kolejne 45 dni (AHA/WA). Schemat aklimacji termicznej szczurów grup doświadczalnych
przedstawia rycina 2.
poród
dojrzewanie płciowe
0
45
uśmiercanie i pobieranie tkanek
90
Grupy
Dni
Ta = 20 C
CR
Ta = 20 C
Ta = 34 C
AHA/WA
Ta = 34 C
NHA/WR
DA
Ta = 34 C
Ta = 20 C
Rycina 2. Schemat grup doświadczalnych. CR – samce kontrolne wyhodowane w temperaturze otoczenia (Ta)
równej 20 C, AHA/WA – samce aklimowane do gorąca (Ta=34 C) po osiągnięciu dojrzałości płciowej;
NHA/WR – samce aklimowane do gorąca (Ta=34 C) w okresie neonatalnym; DA – samce deaklimowane w
temperaturze otoczenia 20 C po osiągnięciu dojrzałości płciowej. Linia ciągła i przerywana oznaczają czas
utrzymywania zwierząt w określonej temperaturze.
Środowisko może wpływać na regulację ekspresji genów poprzez zmiany w produkcji
hormonów oraz metylacji DNA lub potranslacyjnych modyfikacji białek histonowych. W
badaniach innych autorów wykazano, że regulacja hormonalna leży u podstaw plastyczności
rozwojowej. Z tego powodu, pierwszym etapem moich badań była ocena stężenia hormonów
gonadotropowych, prolaktyny i steroidów płciowych oraz hormonów tarczycy u samców
szczurów badanych grup doświadczalnych [1, 2, 4].
Na ty etapie prowadzonych badań wykazałam:
podwyższone stężenie LH we krwi obwodowej szczurów aklimowanych do gorąca po
osiągnięciu dojrzałości płciowej [1, 2] oraz tych aklimowanych do gorąca w okresie
neonatalnym [2], jak również szczurów deaklimowanych [1] w stosunku do szczurów
kontrolnych;
podwyższenie stężenia FSH we krwi obwodowej szczurów aklimowanych do gorąca w okresie
neonatalnym [2] i deaklimowanych [1] oraz prolaktyny (PRL) [1, 2] we krwi obwodowej
szczurów aklimowanych do gorąca w okresie neonatalnym w porównaniu do samców
kontrolnych i aklimowanych do gorąca po osiągnięciu dojrzałości płciowej;
brak wyraźnych zmian w stężeniu hormonów płciowych (androstendionu, testosteronu,
estradiolu-17 ) w osoczu samców aklimowanych do gorąca, oprócz nieznacznie obniżonego
stężenie androstendionu (A4) w osoczu samców aklimowanych do gorąca w okresie
6
neonatalnym [1, 2] i testosteronu (T) w osoczu samców aklimowanych do gorąca po
osiągnięciu dojrzałości płciowej [1];
obniżenie stężenia wolnej trijodotyroniny (fT3) we krwi obwodowej szczurów poddanych
działaniu gorąca, niezależnie od okresu rozwojowego zwierząt [4]. Stwierdziłam również, że
obniżenie aktywności wydzielniczej tarczycy, u szczurów poddanych neonatalnej ekspozycji
na wysoką temperaturę, ma charakter trwały i nie zmienia się pod wpływem aklimacji
szczurów do temperatury kontrolnej (grupa szczurów deaklimowanych).
Podsumowując, wyniki te wskazują na, zależne od fazy rozwoju układu rozrodczego podczas
ekspozycji na wysoką temperaturę otoczenia, zmiany w regulacji czynności przysadki i gruczołu
tarczowego samców. Ciekawym jest, że zmiany te nie wpływały jednak znacząco na endokrynną
czynność jąderoraz nie były spowodowane reakcją stresową na niekorzystną temperaturę
otoczenia, gdyż stężenie kortykosteronu we krwi krążącej nie różniło się pomiędzy szczurami z
badanych grup.
Siła oddziaływania hormonów na tkanki docelowe zależy, między innymi, od gęstości
swoistych receptorów tych hormonów w komórkach tkanek docelowych. Dlatego też, w jądrach
szczurów grup doświadczalnych sprawdziłam ekspresję receptorów LH, prolaktyny i T3, po
inkubacji skrawków jąder in vitro w warunkach kontrolnych, jak również w odpowiedzi na
egzogenny ligand danego receptora.
W badaniach tych wykazałam:
wzrost podstawowej ekspresji mRNA receptorów LH, jedynie u szczurów deaklimowanych,
przy jednoczesnym hamowaniu ekspresji tego receptora przez LH. W pozostałych grupach
doświadczalnych egzogenne LH stymulowało ekspresję mRNA tego receptora [2];
brak zmian ekspresji mRNA długiej formy receptora prolaktyny (Prlr1, jest to forma aktywna
w transdukcji sygnału prolaktynowego) w jądrach samców aklimowanych do gorąca oraz
wzrost ekspresji mRNA krótkiej formy receptora prolaktyny (Prlr2, forma nieaktywna w
procesie transdukcji sygnału prolaktynowego) w jądrach samców aklimowanych do gorąca
podczas okresu neonatalnego [2];
wzrost ekspresji mRNA receptora
1 hormonów tarczycy (Thra1) w podstawowych
warunkach inkubacji skrawków jąder samców aklimowanych do gorąca w okresie
neonatalnym i deaklimowanych w porównaniu do ekspresji tego genu w jądrach samców
kontrolnych oraz wzrost ekspresji mRNA receptora 1 (Thrb1) w skrawkach jąder samców
deaklimowanych w porównaniu do innych grup doświadczalnych [4].
Podsumowując, wyniki te wskazują, że w jądrach samców szczurów, hodowanych w gorącu
podczas rozwoju układu rozrodczego, dochodzi do dostosowania poziomu ekspresji receptorów
PRL i T3 do zmienionych ilości krążących w osoczu ligandów tych receptorów.
7
Kolejnym zagadnieniem, które badałam, była ocena wpływu wysokiej temperatury
otoczenia w różnych okresach rozwoju szczurów na syntezę hormonów płciowych przez
izolowane komórki Leydiga [1].
W badaniach tych wykazałam:
wyższą podstawową sekrecję A4 przez komórki Leydiga szczurów aklimowanych do gorąca
po osiągnięciu dojrzałości płciowej oraz niższą podstawową sekrecję T przez komórki Leydiga
samców aklimowanych do gorąca niezależnie od okresu rozwojowego (grupy AHA/WA,
NHA/WR oraz DA);
wyższą sekrecję E2 przez komórki Leydiga samców aklimowanych do gorąca w okresie
neonatalnym;
niższą wrażliwość komórek Leydiga samców aklimowanych do gorąca w okresie neonatalnym
na egzogenny LH;
iż obniżenie aktywności steroidogenezy w komórkach Leydiga samców aklimowanych do
gorąca po osiągnięciu dojrzałości płciowej, może zachodzić na wczesnych etapach procesu,
poprzedzających powstawanie pregnenolonu, gdyż dodanie tego hormonu do inkubowanych
komórek Leydiga samców tej grupy znacznie podwyższało produkcję steroidów.
Podsumowując, wyniki te wskazują na różnice w aktywności enzymów szlaku syntezy hormonów
steroidowych w jądrach samców aklimowanych do gorąca w różnych okresach rozwoju układu
rozrodczego.
Powyższe wyniki skłoniły mnie do podjęcia kolejnych badań, w których oceniłam ekspresję
mRNA i aktywność enzymów szlaku syntezy hormonów steroidowych1. Do realizacji tego celu
użyłam skrawków jąder samców doświadczalnych, które poddano krótkotrwałej (8h) inkubacji in
vitro. Badałam podstawową, jak również stymulowaną przez LH, PRL i T3, ekspresję i
aktywność białka StAR oraz enzymów szlaku syntezy hormonów steroidowych [2, 4].
Badania te wykazały:
obniżenie podstawowej ekspresji mRNA białka StAR w jądrach szczurów aklimowanych do
gorąca po osiągnięciu dojrzałości płciowej. W pozostałych grupach poddanych ekspozycji na
wysoką temperaturę otoczenia ekspresja ta nie ulegała zmianie;
1
Szlak syntezy steroidów w jądrach składa się z następujących po sobie reakcji enzymatycznych prowadzonych
przez następujące białka i enzymy: - StAR – białko umożliwiające transport cholesterolu do wewnętrznej błony
mitochondrium, - CYP11A1 – desmolaza C20-22 cholesterolowa, przekształcająca cholesterol do pregnenolonu,
- HSD3B1 – dehydrogenaza 3 -hydroksysteroidowa/ 5- 4 izomeraza typ 1 – przekształca pregnenolon w
progesteron, - CYP17A1 – 17 hydroksylaza/17-20 liaza - przekształca progesteron do androstendionu,
HSD17B3 – dehydrogenaza 17 hydroksysteroidowa typ3 - przekształca androstendion w testosteron, CYP19A1
– aromataza – przekształca testosteron do estradiolu-17 .
8
wzrost podstawowej ekspresji mRNA genów Cyp11a1 i Hsd3b1 w jądrach szczurów
aklimowanych do gorąca przed osiągnięciem dojrzałości płciowej (grupy NHA/WR i DA),
jednak bez zmiany aktywności enzymów, kodowanych przez te geny, w obu grupach;
obniżenie podstawowej ekspresji genu Cyp19a1 u szczurów aklimowanych do gorąca w
okresie neonatalnym oraz po osiągnięciu dojrzałości płciowej, jak również aktywności
aromatazy w jądrach szczurów aklimowanych do gorąca przed osiągnięciem dojrzałości
płciowej (grupy NHA/WR i DA);
wzrost ekspresji Cyp11a1 w jądrach szczurów aklimowanych do gorąca w okresie
neonatalnym i po osiągnięciu dojrzałości płciowej oraz Hsd17b3 w jądrach samców
aklimowanych do gorąca po osiągnięciu dojrzałości płciowej, bez wpływu na aktywność
enzymów, kodowanych przez te geny, podczas krótkotrwałej ekspozycji na LH;
wzrost aktywności enzymów HSD3B1, CYP17A1 oraz brak hamowania aktywności enzymu
CYP19A1 przez LH, dodane do inkubowanych in vitro skrawków jąder samców
aklimowanych do gorąca przed osiągnięciem dojrzałości płciowej (grupy NHA/WR i/lub DA);
wzrost ekspresji mRNA oraz aktywności enzymu CYP17A1 w skrawkach jąder samców
aklimowanych do gorąca przed osiągnięciem dojrzałości płciowej (grupy NHA/WR i/lub DA)
pod wpływem egzogennej PRL;
brak stymulującego wpływu T3 na ekspresję mRNA białka StAR tylko w jądrach samców
aklimowanych do gorąca po osiągnięciu dojrzałości płciowej;
hamowanie, przez T3, ekspresji Cyp11a1 w skrawkach jąder samców aklimowanych do gorąca
przed osiągnięciem dojrzałości płciowej (grupy NHA/WR i DA) oraz podwyższenie ekspresji
Hsd17b3 w skrawkach jąder samców aklimowanych do gorąca w okresie neonatalnym;
iż znany efekt hamowania transkrypcji genu Cyp19a1 przez T3 był słabiej wyrażony w jądrach
samców aklimowanych do gorąca w okresie neonatalnym;
brak pozagenomowego wpływu T3 na aktywność enzymów steroidogenezy oraz sekrecję
steroidów przez inkubowane skrawki jąder samców grup doświadczalnych.
Podsumowując, konsekwencją wykazanych zmian ekspresji i aktywności enzymów szlaku
syntezy hormonów steroidowych, była wyższa w warunkach podstawowych, jak i po stymulacji
LH, sekrecja A4 w jądrach samców aklimowanych do gorąca w okresie neonatalnym oraz
sekrecja T i E2 przez skrawki jąder szczurów wszystkich grup poddanych aklimacji do gorąca w
porównaniu do jąder samców kontrolnych. Nie stwierdziłam natomiast wpływu PRL i T3 na
sekrecję steroidów w żadnej z grup doświadczalnych [2, 4]. Powyższe wyniki, w porównaniu do
uzyskanych po inkubacji izolowanych komórek Leydiga samców grup doświadczalnych,
wykazały istotną rolę współzależności między tkanką śródmiąższową a komórkami kanalika
nasiennego podczas syntezy i uwalniania hormonów steroidowych u szczurów poddanych
9
aklimacji do gorąca, niezależnie od okresu rozwojowego. Potwierdziły one również, że w
komórkach Leydiga, samców aklimowanych do gorąca po osiągnięciu dojrzałości płciowej,
przebieg steroidogenezy może być hamowany na etapie dostępności białka StAR. Badanie
syntezy hormonów steroidowych w jądrach samców poddanych ekspozycji na wysoką
temperaturę otoczenia w różnych okresach rozwojowych pozwoliło wykazać, że szkodliwy
wpływ tego czynnika środowiskowego jest kompensowany poprzez zmiany ekspresji
poszczególnych enzymów szlaku syntezy steroidów i wrażliwości komórek Leydiga na badane
hormony (LH, PRL i T3). W konsekwencji, umożliwia to utrzymanie w miarę prawidłowego
stężenia steroidów we krwi obwodowej szczurów długotrwale aklimowanych do gorąca.
Jednocześnie stwierdziłam, że przystosowania u szczurów dorosłych, poddanych działaniu
gorąca, różnią się w porównaniu do szczurów hodowanych w gorącu przed osiągnięciem
dojrzałości płciowej. Wykazałam jednak, że efekt końcowy, czyli produkcja hormonów
steroidowych i ich stężenie we krwi obwodowej są podobne w obu przypadkach.
Najważniejszą funkcją gonad samców jest produkcja plemników, wspierana przez hormony
płciowe. Od dawna wiadomo, że wysoka temperatura gonady powoduje u dorosłych samców
zaburzenia produkcji plemników, aż do czasowej niepłodności włącznie. W okresie przed
podjęciem przeze mnie niniejszych badań, nieznane były możliwości adaptacji procesu
spermatogenezy do wysokiej temperatury otoczenia w okresie ostatecznego kształtowania się
kanalika nasiennego, czyli przed okresem dojrzałości płciowej. W celu zbadania tego problemu
dokonałam
oceny
procesu
spermatogenezy
poprzez
morfometryczną
charakterystykę
histologicznych skrawków jąder i najądrzy samców doświadczalnych, ocenę liczebności
plemników zgromadzonych w ogonie najądrza oraz ich aktywności ruchowej u szczurów
kontrolnych, aklimowanych do gorąca w okresie dojrzałości płciowej, w okresie postnatalnego
rozwoju układu rozrodczego oraz samców deaklimowanych [1, 2, 3].
W wyniku podjętych badań wykazałam:
zmniejszenie masy jąder u samców wszystkich grup poddanych działaniu wysokiej
temperatury otoczenia, niezależnie od okresu rozwojowego [1, 2], przy równoległym
zmniejszeniu masy ciała. W konsekwencji, indeks gonado-somatyczny (GSI) nie ulegał
znaczącym zmianom w żadnej grupie doświadczalnej [1, 2];
zmiany względnej masy narządów układu rozrodczego samców hodowanych w gorącu
obejmujące:
− zmniejszenie względnej masa głowy najądrza oraz zwiększenie masy ogona najądrza u
szczurów aklimowanych do gorąca w okresie neonatalnym w porównaniu do szczurów
kontrolnych [3],
10
− rozrost pęcherzyków nasiennych i brzusznej prostaty, szczególnie u szczurów poddanych
działaniu wysokiej temperatury w okresie przed osiągnięciem dojrzałości płciowej (grupy
NHA/WR i DA) [3],
zaburzenia struktury i morfometrii kanalików nasiennych jąder samców aklimowanych do
gorąca po osiągnięciu dojrzałości płciowej oraz samców deaklimowanych, obejmujące:
− zmniejszenie powierzchni kanalików nasiennych jader dorosłych samców aklimowanych
do gorąca i samców deaklimowanych, obniżenie częstości stadium XI-XIV cyklu kanalika
nasiennego oraz zmniejszenie liczby komórek Sertoliego w kanalikach nasiennych jądra u
szczurów aklimowanych do gorąca po osiągnięciu dojrzałości płciowej,
− obecność degeneracyjnych zmian nabłonka nasiennego, aż do całkowitego zaniku
aktywnej spermatogenezy w jądrach samców aklimowanych do gorąca po osiągnięciu
dojrzałości płciowej; zmiany te obejmowały 17,6
7,4% przekrojów kanalików
nasiennych,
− zmniejszenie pola powierzchni kanalika najądrza od końcowych segmentów głowy do
końcowych segmentów ogona tego narządu u samców aklimowanych do gorąca po
osiągnięciu dojrzałości płciowej; towarzyszył im wzrost powierzchni nabłonka
kanalikowego i spadek powierzchni zajmowanej przez plemniki,
obniżenie liczebności plemników w ogonie najądrza samców aklimowanych do gorąca po
osiągnięciu dojrzałości płciowej;
zmiany parametrów ruchu plemników z ogona najądrza samców aklimowanych do gorąca w
okresie neonatalnym, obejmujące obniżoną prędkość ruchu krzywoliniowego oraz amplitudy
bocznych wychyleń główki plemnika.
Podsumowując, wykazałam, że przebieg spermatogenezy jądrowej jest bardziej zaburzony u
samców poddanych aklimacji do gorąca po osiągnięciu dojrzałości płciowej niż u samców
poddanych aklimacji w okresie neonatalnym. Jednocześnie u szczurów aklimowanych do gorąca
podczas rozwoju układu rozrodczego stwierdziłam przerost gruczołów rozrodczych dodatkowych,
który stanowił najbardziej widoczny, niekorzystny efekt działania wysokiej temperatury na
morfologię układu rozrodczego tej grupy szczurów.
PODSUMOWANIE KOŃCOWE
W przedstawionych badaniach wykazałam, że wysoka temperatura otoczenia w okresie
neonatalnym wpływa na kształtowanie się oraz czynność układu rozrodczego samców szczura
poprzez zmiany regulacji aktywności wydzielniczej przysadki i gruczołu tarczowego.
Jednocześnie zmiany stężenia hormonów gonadotropowych, prolaktyny i T3 mogą być częściowo
kompensowane zmianami ekspresji receptorów dla tych hormonów w jądrach oraz ekspresji i
11
aktywności enzymów szlaku syntezy hormonów steroidowych. Prowadzi to do utrzymania prawie
nie zmienionego stężenia steroidów płciowych we krwi obwodowej. Prawidłowa regulacja
produkcji
hormonów
steroidowych
umożliwia
również
prawidłowy przebieg procesu
spermatogenezy, a w konsekwencji utrzymanie prawidłowej liczebności plemników w ogonie
najądrza. Najwyraźniejszym skutkiem negatywnym działania gorąca, podczas kształtowania się
układu rozrodczego samców szczura, jest rozrost gruczołów płciowych dodatkowych i zaburzenie
aktywności ruchowej plemników. Część różnic w ekspresji i aktywności enzymów szlaku syntezy
A.
Przebieg steroidogenezy
Zmiany stężenia LH, FSH, steroidów płciowych,
prolaktyny i fT3 we krwi obwodowej
Samce aklimowane do gorąca
po osiągnięciu dojrzałości
płciowej
Przez izolowane
komórki
Leydiga
T
Zmiany ekspresji receptorów LH,
prolaktyny i T3 w jądrach
Zmiany sekrecji hormonów
Przez
skrawki
jąder
A4
Samce aklimowane do gorąca
po osiągnięciu dojrzałości
płciowej
T, E2
Samce aklimowane do gorąca
w okresie neonatalnym
A4,
Prlr2
PRL
T
LH,
A4
Samce aklimowane do gorąca
w okresie neonatalnym
E2
Samce deaklimowane
Samce deaklimowane
FSH
Zmiany ekspresji i aktywności
enzymów szlaku syntezy
steroidów w jądrach warunkach
podstawowych i po stymulacji:
Samce aklimowane
do gorąca w okresie
neonatalnym
B.
Brak zmian indeksu
gonado-somatycznego
Hsd3b1, CYP19A1
Cyp19a1
Cyp11a1
HSD3B1, CYP17A1
PRL
T3
Samce deaklimowane
Cyp11a1,
Hsd17b3
Thrb1
Lhr
Samce aklimowane do
gorąca po osiągnięciu
dojrzałości płciowej
Star
LH
Thra1
fT3
Cyp17a1, CYP17A1
Hsd17b3
Cyp11a1
Morfologia układu rozrodczego i jej zaburzenia
Samce aklimowane do gorąca
po osiągnięciu dojrzałości
płciowej
Samce aklimowane do gorąca
w okresie neonatalnym
Zmiany względnej masy
gruczołów dodatkowych
Samce deaklimowane
Liczebności plemników
w ogonie najądrza
Zaburzenia struktury i morfometrii
kanalików nasiennych
Prędkości ruchu krzywoliniowego
i amplitudy bocznych wychyleń główki
plemnika
Rycina 3. Schemat opracowany na podstawie wyników własnych, uzyskanych podczas badania aktywności osi
przysadka–jądro (A) oraz morfologii układu rozrodczego i przebiegu spermatogenezy (B) w jadrach samców
aklimowanych do gorąca po osiągnięciu dojrzałości płciowej, samców aklimowanych do gorąca w okresie
neonatalnym oraz samców deaklimowanych po osiągnięciu dojrzałości płciowej.
oznaczają odpowiednio
podwyższenie lub spadek danej wartości stwierdzonej w grupie doświadczalnej w porównaniu do tej wartości
stwierdzonej w grupie kontrolnej. Cyp11a – sposób oznaczenia ekspresji mRNA badanego genu, CYP11A1 –
sposób oznaczenia aktywności enzymu kodowanego przez badany gen.
steroidów w jądrach, wykazanych przeze mnie, pomiędzy szczurami poddanymi neonatalnej
ekspozycji na wysoką temperaturę oraz szczurami kontrolnymi, wydaje się być nieodwracalna
12
poprzez proces deaklimacji. Przykładowo, podstawowa ekspresja Cyp11a1 i Hsd3b1 lub
regulowana prolaktyną ekspresja i aktywność CYP17A1 są podobnie zmienione w jądrach
szczurów deaklimowanych, jak w jądrach szczurów aklimowanych do gorąca w okresie
neonatalnym. Wydaje się, że badanie regulacji aktywności promotora tych genów może stanowić
atrakcyjny cel kolejnych doświadczeń, które pogłębią wiedzę o relacjach między środowiskiem a
rozwijającym się układem rozrodczym.
Poddanie dorosłych samców szczura działaniu wysokiej temperatury otoczenia w dłuższym
okresie czasu również modyfikuje czynność osi przysadka - jądro oraz ekspresję i aktywność
enzymów szlaku syntezy steroidów. Jednakże modyfikacje te różnią się w porównaniu do tych
stwierdzonych u szczurów eksponowanych na gorąco w okresie neonatalnym. Jednocześnie u
dorosłych samców szczura poddanych aklimacji do gorąca stwierdza się zaburzenie procesu
produkcji plemników oraz ich liczby w ogonie najądrza. Takich zmian nie wykazałam u szczurów
poddanych neonatalnej aklimacji do gorąca. Sugeruje to istnienie mechanizmów plastycznego
dostosowania regulacji przebiegu spermatogenezy, lub też innych niedostrzeżonych do tej pory
mechanizmów, zapobiegających jego zaburzeniom.
Przedstawioną, na początku opracowania, hipotezę badawczą potwierdziłam wynikami
przedstawionymi powyżej (rycina 3), a dalsze poszukiwanie możliwych przyczyn lepszego
dostosowania układu rozrodczego samców aklimowanych do wysokiej temperatury w okresie
neonatalnym stanowi cel planowanych, przeze mnie, w przyszłości badań .
5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo - badawczych
(wykaz omawianych publikacji podano na końcu akapitu)
5.1. Czynność układu regulacji temperatury szczurów w warunkach endotoksemii i stresu
termicznego
Opracowano i przetestowano metodę oceny górnej temperatury krytycznej (CTmax) u
szczurów, której podstawą jest ocena zachowania zwierzęcia podczas ekspozycji na wysoką
temperaturę otoczenia. Test ten umożliwia przyżyciowe badanie CTmax bez konieczności
uśmiercania zwierząt. Zbadano CTmax u szczurów hodowanych od urodzenia w wysokiej
temperaturze otoczenia i porównano z wynikami uzyskanymi u szczurów kontrolnych oraz
szczurów otrzymujących różne dawki lipopolisacharydu bakteryjnego [2, 3].
Wykazano, iż bardzo wysokie = toksyczne dawki lipopolisacharydu (LPS) ze ścian bakterii
gram ujemnych, choć zwiększają śmiertelność zwierząt doświadczalnych, to nie upośledzają
czynności układu regulacji temperatury. Wyniki przeprowadzonych badań nie potwierdziły
udziału LPS, pochodzącego ze ścian bakterii jelitowych, w zaburzeniach mechanizmów
termoregulacji i w konsekwencji śmierci cieplnej w warunkach szoku termicznego [3, 4].
Stwierdzono również zmiany w stężeniu osoczowych lipoprotein w odpowiedzi na stres
termiczny oraz LPS [3].
5.2. Czynność układu oksytocyna/receptor oksytocyny w układzie rozrodczym świni podczas
cyklu rujowego i wczesnej ciąży oraz cyklu rujowym u krowy
13
Wykazano zmiany w ekspresji receptora oksytocyny w macicy świń pomiędzy 14-16 dniem
cyklu rujowego a 14-16 dniem ciąży oraz w jajowodzie krów w przebiegu cyklu rujowego [5,
6].
Wykazano zależne od ekspresji receptora oksytocyny, zmiany w aktywności skurczowej
mięśniówki macicy świń oraz jajowodu krów. Zbadano również wpływ progesteronu na
aktywność skurczową mięśniówki macicy świń w 14-16 dniu cyklu rujowego i wczesnej ciąży
[6, 7].
Wykazano wpływ oksytocyny na ekspresję enzymów szlaku syntezy prostaglandyny F2 i E2
oraz produkcję obu prostaglandyn przez mięśniówkę i śluzówkę macicy świń z okresu
luteolizy i wczesnej ciąży. Wykazano również wpływ progesteronu na szlak przekazywania
sygnału przez oksytocynę w mięśniówce i śluzówce macicy świń w obu okresach
reprodukcyjnych [8, 9, 10, 11].
5.3. Wykazanie wpływu oksytocyny na oś podwzgórze-przysadka-nadnercza dojrzałych
płciowo loszek - badania in vivo i in vitro.
Oksytocyna w warunkach in vitro zwiększa sekrecję hormonów tropowych przysadki (ACTH,
PRL i LH) oraz -endorfiny z komórek przedniego płata przysadki świń z fazy lutealnej cyklu
rujowego [12].
Oksytocyna podawana i.v. zwiększa stężenie kortyzolu i kortykosteronu w osoczu loszek,
wzrost koncentracji glikokortykoidów był wyższy u loszek w fazie lutealnej niż w
pęcherzykowej cyklu rujowego [13, 14].
Oksytocyna in vitro zwiększa sekrecję kortyzolu przez komórki kory nadnerczy uzyskane od
loszek w fazie lutealnej cyklu rujowego [13, 14].
5.4. Udział oksytocyny w regulacji wydzielania progesteronu przez ciałko żółte świni
Stwierdzono, że oksytocyna stymuluje produkcję progesteronu przez komórki lutealne świń z
8-10 dnia cyklu rujowego poprzez wzrost hydrolizy fosfatydyloinozytolu i następnie
zwiększenie stężenia wewnątrzkomórkowych jonów Ca2+ [15].
5.5. Udział czynników procesu zapalnego w regulacji produkcji prostaglandyn przez błonę
śluzową i mięśniową macicy świń w okresie cyklu rujowego i wczesnej ciąży
Wykazano udział TNF , IL1β i IL6 w regulacji syntezy, uwalniania oraz metabolizmu
prostaglandyny F2α przez endometrium świń i możliwość udziału tych cytokin w
mechanizmie ochrony ciałka żółtego w okresie wczesnej ciąży oraz luteolizie ciałka żółtego
podczas cyklu rujowego świń [16].
Zbadano udział IL1β w regulacji syntezy prostaglandyny E2 przez śluzówkę i mięśniówkę
macicy świń podczas cyklu rujowego i wczesnej ciąży. Wykazano stymulujący wpływ badanej
cytokiny na ekspresję enzymów szlaku syntezy PGE2 oraz wzrost sekrecji badanej
prostaglandyny przez śluzówkę i mięśniówkę macicy świń ciężarnych z dni 10-11 oraz 12-13
lecz nie w dniach 14-15. Śluzówka i mięśniówka macicy we wszystkich badanych dnia cyklu
rujowego wydzielała więcej PGE2 pod wpływem IL1 β, przy zróżnicowanym wpływie
badanej cytokiny na ekspresję enzymów szlaku syntezy PGE2 co wskazuje na możliwość
akumulacji prostaglandyny E2 w mięśniówce [17].
5.6. Wpływ środowiska termicznego w okresie życia postnatalnego na czynność układu
rozrodczego samic szczurów
14
Hodowla samic szczurów w wysokiej temperaturze otoczenia w okresie neonatalnym (WR)
powoduje opóźnienie dojrzewania płciowego, lecz nie wpływa na długość cykli płciowych
samic szczura. Jednocześnie wywołuje wzrost stężenia PRL i progesteronu oraz obniżenie
stężenia FSH w osoczu samic w fazie metaestrus cyklu rujowego. Zmianom tym odpowiada
wyższa sekrecja progesteronu przez ciałka żółte samic WR zarówno w warunkach
podstawowych jak i w odpowiedzi na LH [18].
Wykaz prezentowanych publikacji
1. Caputa M, Demicka A, Dokladny K, Kurowicka B (1996) Anatomical and physiological
evidence for efficacious selective brain cooling in rats. Journal of thermal Biology 2(1): 21-28.
(Praca opublikowana przed doktoratem)
2. Caputa M, Dokladny K, Kurowicka B (1998) Behavioral approeach to the study of the upper
limit of temperature tolerance in rats. Physiology & Behavior 65: 183-189.
3. Caputa M, Dokladny K, Kurowicka B (2000) Endotoxaemia does not limit heat tolerance in
rats: the role of plasma lipoproteins. European Journal of Applied Physiology 82:142-50.
4. Caputa M, Dokładny K, Kurowicka B, Rogalska J (2004) Brain and body temperature
changes and behavior of rats injected with various doses of endotoxin. Acta Biologica
Cracoviensia Series Zoologia 46:13-25.
5. Oponowicz A, Franczak A, Kurowicka B, Kotwica G (2006) Relative transcript abundance of
oxytocin receptor gene in porcine uterus during luteolysis and early pregnancy. Journal of
Applied Genetics 47: 345-351.
6. Kotwica G, Kurowicka B, Franczak A, Grzegorzewski W, Wrobel M, Mlynarczuk J, Kotwica
J (2003). The concentrations of catecholamines and oxytocin receptors in the oviduct and its
contractile activity in cows during the estrous cycle. Theriogenology 60:953-64.
7. Kurowicka B, Franczak A, Oponowicz A, Kotwica G (2005): In vitro contractile activity of
porcine myometrium during luteolysis and early pregnancy: effect of oxytocin and
progesterone. Reproductive Biology 5: 151-169.
8. Franczak A, Kurowicka B, Oponowicz A, Petroff BK, Kotwica G (2006): The effect of
progesterone on oxytocin-stimulated intracellular mobilization of Ca2+ and prostaglandin E2
and F2 secretion from porcine myometrial cells. Prostaglandins & other Lipid Metabolics 81
(1-2): 37-44.
9. Franczak A, Wocławek-Potocka I, Oponowicz A, Kurowicka B, Kotwica G (2004) Oxytocin
stimulates prostaglandin F2 secretion and prostaglandin F synthase protein expression in
porcine myometrial tissue. Reproductive Biology 4: 177-184.
10. Franczak A, Kotwica G, Kurowicka B, Oponowicz A, Wocławek-Potocka I, Petroff BK
(2006) Expression of enzymes of cyclooxygenase pathway and secretion of prostaglandyn E2
and F2 by porcine myometrium during luteolysis and early pregnancy. Theriogenology 66:
1049-1056.
11. Kotwica G, Oponowicz A, Kurowicka B, Franczak A, Bogacka I 2010 The effect of
progesterone on oxytocin-stimulated intracellular Ca2+ mobilisation and prostaglandin
secretion in porcine endometrium. Polish Journal of Veterinary Sciences 13: 615-622.
12. Kotwica G, Staszkiewicz J, Skowroński MT, Siawrys G, Bogacka I, Franczak A,
Kurowicka B, Kraziński B, Okrasa S (2006) Effects of oxytocin alone and in combination
with selected hypothalamic hormones on the ACTH, -endorphin, LH and PRL secretion by
anterior pituitary cells of cyclic pigs. Reproductive Biology 6: 115-131.
15
13. Kotwica G, Franczak A, Okrasa S, Koziorowski M, Kurowicka B (2002): Effects of
mating stimuli and oxytocin on plasma cortisol concentration in gilts. Reproductive Biology 2:
25-37.
14. Kotwica G, Kamińska B, Franczak A, Kurowicka B, Staszkiewicz J, Skowroński M,
Kraziński B, Okrasa S (2004) The effect of oxytocin on cortisol and corticosterone secretion in
cyclic gilts – in vivo and in vitro studies. Reproductive Biology 4: 35-50.
15. Franczak A, Kurowicka B, Kowalik M, Ciereszko RE, Kotwica G (2009): The effect of
oxytocin on progesterone secretion, phosphoinositide hydrolysis and intracellular mobilisation
of Ca2+ in porcine luteal cells. Acta Veterinaria Hungarica 57: 115-125.
16. Franczak A, Zmijewska A, Kurowicka B, Wojciechowicz B, Kotwica G (2010) Interleukin
1β-induced synthesis and secretion of prostaglandin E2 in the porcine uterus during various
periods of pregnancy and the estrous cycle. Journal of Physiology and Pharmacology 61:73342.
17. Franczak A, Zmijewska A, Kurowicka B, Wojciechowicz B, Petroff BK, Kotwica G
(2012) The effect of tumor necrosis factor α (TNFα), interleukin 1β (IL1β) and interleukin 6
(IL6) on endometrial PGF2α synthesis, metabolism and release in early-pregnant pigs.
Theriogenology 77: 155-165.
18. Kurowicka B, Gajewska A, Franczak A (2006) Effect of early thermal experience on
pituitary-gonadal axis in female rats. Reproductive Biology 6: 63-77.
16