Immobilizacja enzymów

Laboratorium z Enzymologii
Ćwiczenie 2
Rok akad. 2014/2015
Immobilizacja enzymów
Enzymy odznaczają się wysoką aktywnością w relatywnie niskich temperaturach (30-110oC) oraz
unikalną selektywnością substratową, regio- i enancjoselektywnością. Jednakże tylko niewielka liczba
reakcji katalizowanych enzymatycznie znajduje zastosowanie na skalę przemysłową. Związane jest to
zazwyczaj z niestabilnością preparatów enzymatycznych, niską produktywnością, wrażliwością na
rozpuszczalniki organiczne i ograniczeniem do prowadzenia reakcji w roztworach wodnych.
Rys 1. Najczęstsze metody immobilizacji
1/10
Laboratorium z Enzymologii
Ćwiczenie 2
Rok akad. 2014/2015
Problemy te mogą zostać rozwiązane przez stosowanie preparatów immobilizowanych. Enzymy
można osadzać na różnych nośnikach, zamykać wewnątrz polimerów, sieciować. Dzięki procesowi
immobilizacji rozpuszczalny, homogeniczny biokatalizator przekształcony zostaje w katalizator
heterogeniczny. Pozwala to na stosowanie procesów ciągłych i ułatwia izolowanie produktów. Bardzo
często rośnie także jego stabilność, maleje wrażliwość na zmiany pH i temperatury (wysoka aktywność
nawet w 80oC). Immobilizacja powoduje też podwyższenie selektywności w porównaniu z enzymem
natywnym. Najczęstsze metody immobilizacji zostały przedstawione na Rys.1.
1. Związanie enzymu z powierzchnią nośnika
a) Adsorpcja
Adsorpcja biokatalizatora na powierzchni nierozpuszczalnego w wodzie nośnika jest jedną
z najstarszych i najłatwiejszych metod immobilizacji. Może być stosowana w przypadku izolowanych
enzymów, jak i żywych komórek. Biokatalizator wiąże się z podłożem dzięki siłom van der Waalsa,
oddziaływaniom jonowym lub przez wytwarzanie wiązań wodorowych. Oddziaływania te są dosyć
słabe i nie powodują zmian konformacyjnych białka. Metoda jest prosta, efektywna, tania i szybka.
Jednakże preparaty tego typu mają ograniczone zastosowanie w reakcjach prowadzonych
w środowisku wodnym, ponieważ często następuje pogorszenie właściwości katalitycznych związane,
nie ze spadkiem aktywności, ale z desorpcją enzymu z nośnika. Natomiast w układach niewodnych
sprawdzają się bardzo dobrze.
Wyróżnia się kilka procedur wiązania białka przez adsorpcję:
•
Prosta adsorpcja – nośnik zawiesza się w roztworze enzymu i po zakończeniu procesu adsorpcji
odmywa się niezwiązane białko,
•
Agregacja – do roztworu białka, zawierającego nośnik, dodaje się rozpuszczalnik organiczny lub
zwiększa siłę jonową w celu wywołania agregacji białka i jego sorpcji na nośniku,
•
Depozycja – roztwór białka z nośnikiem poddaje się łagodnemu suszeniu.
Agregacja i depozycja powodują zwiększenie ilości zaadsorbowanego białka na powierzchni nośnika.
Najczęściej wykorzystywanymi nośnikami są: celit (ziemia okrzemkowa), tlenek glinu, krzemionka,
celuloza, skrobia, alginiany, aktywowany węgiel,
nośniki syntetyczne (najczęściej żywice
jonowymienne).
b) Wiązanie z udziałem metali przejściowych
Metoda ta wykorzystuje chelatujące właściwości metali przejściowych (tytan, wanad, cynk, żelazo,
nikiel, miedź) pozwalające wytworzyć kompleksy z nośnikiem i białkiem. Immobilizację białka
poprzedza wytworzenie chelatu z grupami hydroksylowymi nośnika, a następnie po odmyciu
nadmiaru jonów dodaje się białko, w którym jako ligandy wiążące się z metalem wykorzystywane są
grupy karboksylowe kwasu asparaginowego i glutaminowego, grupy -OH seryny, tyrozyny i treoniny,
2/10
Laboratorium z Enzymologii
Ćwiczenie 2
Rok akad. 2014/2015
grupa -NH2 lizyny, grupa –SH cystieny i pierścień imidazolowy histydyny. Metoda ta ma ograniczone
zastosowanie ze względu na obecność jonów metali przejściowych, co nie jest akceptowane przez
przemysł spożywczy, farmaceutyczny i kosmetyczny.
c) Wiązanie wykorzystujące specyficzne powinowactwo
Jest to bardzo dobrze rokująca metoda wykorzystująca specyficzne powinowactwo biocząsteczek.
Pozwala na związanie enzymu z ligandem w sposób trwały, ale odwracalny w specyficznych
warunkach. Wiązanie przebiega w łagodnych warunkach pH, temperatury i bez rozpuszczalników
organicznych. Możliwość utworzenia korzystnej orientacji enzymu względem nośnika przez
najczęściej wielopunktowe wiązanie z ligandem zapewnia usztywnienie konformacji białka i większą
stabilność preparatu; immobilizacji można poddawać enzymy w formie częściowo oczyszczonej, lub
wręcz homogenaty. Najczęściej stosowanymi ligandami są glikoproteiny i przeciwciała monoklonalne
lub poliklonalne. Na razie szczególnie wysoki koszt tej metody (wytwarzanie ligandów i odpowiednia
modyfikacja enzymów) ogranicza w znacznym stopniu jej zastosowanie.
d) Wiązanie kowalencyjne z nośnikiem
Technika ta polega na wytworzeniu wiązania kowalencyjnego pomiędzy grupami funkcyjnymi nośnika
i białka. Metoda ta zapewnia trwałe związanie enzymu z powierzchnią nośnika, ale jednocześnie jej
zasadniczą wadą są często dość drastyczne warunki, w jakich przebiegają reakcje. Zawsze obserwuje
się więc spadek aktywności enzymu (nawet o 50%) spowodowany zmianami konformacyjnymi i
częściową denaturacją. Wybór odpowiedniej metody bywa często przypadkowy, ponieważ
prawdopodobieństwo wystąpienia konkretnego aminokwasu na powierzchni białka, jak i jego
stabilność w warunkach reakcji, często nie jest znane. Do wytwarzania wiązań najczęściej wykorzystuje
się grupy nukleofilowe aminokwasów: imidazolowe (His), fenylowe (Tyr), -SH (Cys), -NH2 (Lys).
Ogólnie immobilizacja tą metodą przebiega w dwóch etapach:
•
aktywacja nośnika przez przyłączenie reaktywnej grupy łączącej,
•
przyłączenie enzymu.
Jako nośniki wykorzystuje się nośniki nieorganiczne (porowate szkło), polimery naturalne (celuloza,
dekstran, agaroza, skrobia), polimery syntetyczne.
Najważniejsze metody immobilizacji:
a) polimery syntetyczne
3/10
Laboratorium z Enzymologii
Ćwiczenie 2
Rok akad. 2014/2015
b) nośniki nieorganiczne
c) polimery naturalne
2. Sieciowanie (cross-linking)
Wytwarzanie wiązań kowalencyjnych między cząsteczkami białka określane jest terminem crosslinking. Otrzymuje się w ten sposób wielkocząsteczkowe nierozpuszczalne agregaty. Cząsteczki
enzymu mogą być łączone bezpośrednio między sobą lub za pośrednictwem obojętnych białek np.
albumin (Rys. 1). Do sieciowania najczęściej wykorzystuje się związki dwufunkcyjne: aldehyd
glutarowy (OHC-(CH2)3-CHO), heksametylenodiizocyjanian lub heksametylenodiizotiocyjanian oraz
heksanodikarboksyimidynian
dimetylu
(pochodna
kwasu
adypinowego:
CH3OC(=NH)-
-CH2)4C(=NH)OCH3) . Reakcjom ulegać mogą nie tylko wolne grupy NH2, ale także grupy SH i OH.
Ogromną zaletą tej metody jest prostota i wyeliminowanie znacznego udziału nośnika, ale
jednocześnie usieciowanie powoduje ograniczenie dostępu substratów do centrów aktywnych enzymu.
Rys 2. Sieciowanie enzymu za pomocą aldehydu glutarowego
4/10
Laboratorium z Enzymologii
Ćwiczenie 2
Rok akad. 2014/2015
Sieciowanie może być prowadzone nie tylko w roztworze białka, ale też w postaci mikrokrystalicznej.
Uzyskane w ten sposób „cross-linking enzyme crystals” (CLEC) wykazują wyjątkową odporność
chemiczną (także na działanie proteaz) i mechaniczną, w porównaniu do tradycyjnego sieciowania.
Zasadniczą wadą całego procesu jest jednak wysoki koszt, ponieważ enzymy muszą być odpowiednio
czyste, a kryształy odpowiedniego rozmiaru.
3. Zamykanie w żelu
Biokatalizatory mogą zostać „uwięzione” w makroskopowej matrycy, przez którą swobodnie mogą
przenikać cząsteczki reagentów. W zależności od typu procesu i reaktora preparat może mieć różne
formy np. kulek, włókien itp. Ze względu na łagodne warunki, metoda ta może być stosowana także
do immobilizacji żywych komórek. W tym przypadku najczęściej używa się żeli agarowych,
alginianów, κ-karaginianów. Formowanie żelu z biokatalizatorem może być przeprowadzone przez
zmianę temperatury lub siły jonowej roztworu (Rys 3).
Rys 3. Zamykanie biokatalizatora w żelu
Zamykanie enzymów w alginianie
Alginian sodu jest liniowym polisacharydem izolowanym najczęściej z brązowych morskich alg
i wodorostów. Zbudowany jest z dwóch kwasów uronowych: β-D-mannuronowego (M)
i α-L-glukuronowego (G) (Rys 4).
W zależności od pochodzenia, łańcuchy mogą być
homopolimerami M lub G, kopolimerami M i G, a także mieszaniną wszystkich typów polimerów.
Kwas alginowy tworzy rozpuszczalne w wodzie sole z kationami metali alkalicznych i kationem
amonowym, natomiast sole kationów wielowartościowych (np. wapnia) będą tworzyły żele.
Dwuwartościowy kation wapnia wiąże się z dwiema grupami karboksylowymi kwasu glukuronowego
w obrębie tego samego lub sąsiednich łańcuchów, co prowadzi do zmniejszenia rozpuszczalności (Rys
5 a i b). Ponieważ metoda opiera się na obecności reszt kwasu glukuronowego (który występuje
5/10
Laboratorium z Enzymologii
Ćwiczenie 2
Rok akad. 2014/2015
w mniejszych ilościach niż kwas mannuronowy), wielkość porów w żelu (decydująca o szybkości
dyfuzji reagentów) nie zależy od warunków immobilizacji, ale od materiału wyjściowego.
2 Na(Alginian) + Ca2+ → Ca(Alginian)2 ↓ + 2 Na+
Żele alginianowe są termostabilne w zakresie 0-100oC, a ogrzewanie nie powoduje „upłynniania”.
Jednakże żel można łatwo przeprowadzić w zol przez dodanie wysokich stężeń soli sodowych,
potasowych lub amonowych.
Rys 4. Struktura składników kwasu alginowego
a)
b)
Rys 5. Struktura przestrzenna alginianu wapnia
6/10
Laboratorium z Enzymologii
Ćwiczenie 2
Rok akad. 2014/2015
4. Zamykanie w membranach
Nie jest to ściśle metoda immobilizacji, ale zapewnia ona umieszczenie enzymu w ograniczonej
przestrzeni, izolując go w ten sposób od środowiska reakcyjnego. Małe cząsteczki mogą swobodnie
przenikać przez membranę, natomiast enzym pozostaje w niej „uwięziony”. Podzielenie przestrzeni
reakcyjnej na kompartmenty przez membrany imituje „biologiczną immobilizację” w komórce,
ponieważ wiele enzymów działa w powiązaniu z błonami biologicznymi.
Enzymy mogą być zamykane w micelach lub liposomach tworzących się w obecności odpowiednich
środków powierzchniowo-czynnych (Rys 6). Woda uwięziona wewnątrz tego typu struktur zapewnia
wysoką aktywność enzymu. Micele zderzają się ze sobą i dzięki temu następuje wymiana zawartości
i reakcja może przebiegać wydajnie i szybko. Wadą tego typu immobilizacji są problemy podczas
izolacji produktów (związki powierzchniowoczynne w tym momencie przeszkadzają).
Rys 6. Zamykanie enzymu w micelach i liposomach
Bardziej przydatnymi układami są reaktory zawierające membrany syntetyczne. Produkuje się
membrany różnych typów o określonej wielkości porów w zależności od zapotrzebowania. Membrany
takie długo były wykorzystywane w oczyszczaniu białek np. za pomocą dializy, czyli małe cząsteczki
mogą swobodnie dyfundować przez membranę. Na Rys 7 przedstawiono przykładowy schemat
reaktora.
Rys 7. Reaktor membranowy
7/10
Laboratorium z Enzymologii
Ćwiczenie 2
Rok akad. 2014/2015
Literatura
1. Ćwiczenia z biochemii, praca zbiorowa red. L. Kłyszejko-Stefanowicz, PWN 2003
2. K. Faber, Biotransformation in Organic Chemistry, Sprinter, 2004
3. J. Bryjak, Immobilizacja enzymów. Część 1: Metody konwencjonalne, Wiadomości
Chemiczne, 2004, 58, 691
4. J. Bryjak, Immobilizacja enzymów. Część 2: Reaktory membranowe, Wiadomości
Chemiczne, 2004, 58, 747
Część doświadczalna
W trakcie ćwiczeń należy wyznaczyć zawartość białka w surowym i wysolonym PLE oraz
przygotować dwa preparaty: PLE i lipazę Amano PS immobilizowane w 2% roztworze alginianu sodu,
a następnie zbadać aktywność otrzymanych preparatów w reakcji z maślanem p-nitrofenylu
i wyciągnąć wnioski.
1.1. Wyznaczenie ilości białka w preparatach PLE (metoda Lowry’ego)
W oznaczeniu wykorzystuje się reakcje barwne: biuretową (jonów miedzi (II) z wiązaniami
peptydowymi) oraz reakcje zachodzące pomiędzy resztami tyrozyny, tryptofanu i histydyny
(prawdopodobnie) a odczynnikiem Folina-Ciocalteu (FC). Aminokwasy te redukują jony Mo6+/W6+
zawarte
w
odczynniku
FC,
a
stężenie
produktów
o
barwie
niebieskiej
mierzy
się
spektrofotometrycznie przy λ=750nm.
Odczynniki: roztwór wzorcowy BSA 150μg/ml, bufor fosforanowy pH 7,20; odczynnik Lowry’ego,
odczynnik Folina-Ciocalteu.
Sprzęt: próbówki szklane i wirówkowe, kolby miarowe, pipety, zlewki, bagietka, kolorymetr.
Wykonanie:
1. Do próbówki typu Falcone o poj. 15ml odważyć 300 mg surowego PLE i dodać 4 ml buforu
fosforanowego o pH=7,2.
2. Do próbówki wirówkowej typu Ependorff odważyć 50 mg PLE wysolonego i dodać 1,5 ml
buforu fosforanowego o pH=7,2.
3. Obie próbówki dokładnie mieszać przez kilka minut, a następnie odwirować przez 10 min
(10000 obr/min).
4. Każdy supernatant zlać oddzielnie do próbówki z miarką i zmierzyć jego objętość.
5. Do kolby miarowej o pojemności 100 ml odpipetować 1 ml supernatantu PLE surowego,
dopełnić wodą destylowaną do kreski i dokładnie wymieszać.
8/10
Laboratorium z Enzymologii
Ćwiczenie 2
Rok akad. 2014/2015
6. Do kolby miarowej o pojemności 25 ml odpipetować 1 ml supernatantu PLE wysolonego,
dopełnić wodą destylowaną do kreski i dokładnie wymieszać.
7. Przygotować 21 próbówek szklanych i postępując zgodnie z tabelą 1 odpipetować
odpowiednie roztwory.
8. Zmierzyć absorbancję przygotowanych roztworów przy długości fali 750 nm.
9. Obliczyć stężenia BSA (w µg/ml) w roztworach wzorcowych a następnie wykreślić krzywą
wzorcową (A=f(µg/ml)).
10. Obliczyć ilość mg białka na 1 g preparatu (pamiętać o rozcieńczeniach!).
Tabela 1.
Ozn.
Roztwór
BSA
Woda
Białko
O.
badane
Lowry
Czekać
O. CF
Zero
-
1,000
-
5
0,5
S1; S2
-
0,500
0,500
5
0,5
S3; S4
-
0,250
0,750
5
0,5
S5; S6
-
-
1,000
5
0,5
W1; W2
-
-
1,000
5
0,5
W3; W4
-
0,500
0,500
5
1; 2
0,200
0,800
-
5
0,5
3; 4
0,400
0,600
-
5
0,5
5; 6
0,600
0,400
-
5
0,5
7; 8
0,800
0,200
-
5
0,5
9; 10
1,000
-
-
5
0,5
20 min
0,5
Czekać
30 min
Wszystkie objętości podano w ml.
S1-S6 – PLE surowa; W1-W4 – PLE wysolona
1.2. Immobilizacja PLE
Odczynniki: preparat enzymatyczny PLE, lipaza Amano PS, alginian sodu, 0,3 mol/l roztwór chlorku
wapnia.
Sprzęt: zlewki 25, 100 ml, lejek Schotta, kolba ssawkowa, mieszadło magnetyczne, strzykawka,
bagietka, pipety 1 i 5 ml, cylinder miarowy.
Wykonanie: Do zlewki 25 ml odważyć 0,2g alginianu sodu i dodać 10 ml wody. Zawartość delikatnie
mieszać bagietką do całkowitego rozpuszczenia alginianu i odstawić na 30 min. Następnie dodać 1 ml
9/10
Laboratorium z Enzymologii
Ćwiczenie 2
Rok akad. 2014/2015
otrzymanego wcześniej supernatantu surowego PLE. Po wymieszaniu otrzymaną zawiesiną napełnić
strzykawkę. W zlewce o poj. 100 ml umieścić 50 ml 0,3-molowego roztworu chlorku wapnia
i postawić na mieszadle magnetycznym. Następnie pojedynczymi kroplami wstrzykiwać roztwór
alginianu (1 kropla/sek.). Po zakończeniu zawiesinę mieszać jeszcze 5 min, a potem na lejku Schotta
odsączyć otrzymany preparat i przemyć go 10 ml wody.
Analogicznie przygotować preparat Amano PS, tylko w próbówce wirówkowej odważyć 150 mg
lipazy i rozpuścić ją w 1,5 ml buforu fosforanowego pH 7,20.
1.3.
Badanie
i
porównywanie
aktywności
hydrolitycznej
preparatów
natywnych
i immobilizowanych.
Odczynniki: maślan p-nitrofenylu, aceton, bufor fosforanowy o pH=7,2, preparat enzymatyczny PLE
(surowy i immobilizowany), lipaza Amano PS (surowa i immobilizowana).
Sprzęt: próbówki szklane, pipety.
Wykonanie: Do czterech próbówek szklanych wprowadzić 1-2 krople maślanu p-nitrofenylu, 1 ml
acetonu i 5 ml buforu fosforanowego o pH=7,2. Następnie do próbówek 1 i 2 dodać niewielką ilość
natywnego preparatu PLE i lipazy Amano PS, natomiast do próbówek 3 i 4 odpowiednio PLE
i Amano PS immobilizowane. Zawartość każdej próbówki wymieszać, zapisać obserwacje i wyciągnąć
wnioski.
10/10