Streszczenie

mgr inż. Wioleta Januchta
Temat rozprawy doktorskiej: Synteza i badania biologiczne nowych funkcjonalizowanych
analogów batracyliny jako potencjalnych związków przeciwnowotworowych
Batracylina jest heterocykliczną aminą wyselekcjonowaną w trakcie poszukiwań
nowych leków przeciwnowotworowych przez Narodowy Instytut Rakowy w Bethesda, USA.
Wykazała ona wysoką aktywność cytotoksyczną oraz przeciwnowotworową wobec kilku
eksperymentalnych modeli komórek nowotworowych, w tym linii opornych na adriamycynę,
cisplatynę oraz metotreksat. W 2007 roku batracylina weszła do I fazy badań klinicznych
mających na celu określenie bezpieczeństwa jej stosowania u chorych na nowotwory.
Ponieważ
nie
wykazano
odpowiedniego
wpływu
BAT
na
zahamowanie
rozwoju
nowotworów, w 2011 roku badania zakończono.
Niska rozpuszczalność BAT w wodzie, wysoka toksyczność oraz mała biodostępność
i konieczność stosowania wysokich dawek leku stoją na przeszkodzie wykorzystania tego
związku w praktyce klinicznej, co przyczyniło się do poszukiwania jej nowych analogów o
lepszych właściwościach farmakologicznych. W ten nurt badań wpisuje się również temat
mojej pracy doktorskiej. Uzyskałam dwa nowe typy analogów batracyliny zawierające w swej
strukturze dodatkowe cząsteczki, pochodne tuftsyny/retro-tuftsyny oraz adenozynę. Tuftsyna,
bioaktywny tetrapeptyd pochodzenia zwierzęcego, stymuluje rożne funkcje makrofagów,
wykazuje aktywność bakteriobójczą, przeciwnowotworową oraz przyczynia się do wzrostu
niespecyficznej odporności organizmu gospodarza przeciw licznym infekcjom. Natomiast
adenozyna będąc endogennym nukleozydem purynowym, nie tylko stanowi prekursor
nukleotydów adeninowych, ale jest również neuromodulatorem odgrywającym istotną rolę
w funkcjonowaniu wielu komórek. Dzięki wiązaniu się z receptorami adenozyny (AR),
stanowi czynnik ochronny w stanach niedokrwienia i niedotlenienia serca oraz innych tkanek,
jak również, w zależności od pobudzonego AR, wpływa m.in. na pracę serca, agregację
płytek, napięcie mięśni gładkich czy układ immunologiczny.
Zakładałam, że wprowadzenie nowych cząsteczek do BAT może przyczynić się do
zwiększenia
jej
specyficzności
addytywnego/synergistycznego
oddziaływania
tuftsynę.
i
działania
aktywności
reszt
przeciwnowotworowej
adenozyny
i
tuftsyny
ze
w
wyniku
względu
z receptorami adenozyny i stymulację układu immunologicznego
na
przez
Batracylinę otrzymałam opracowaną w naszym zespole zmodyfikowaną metodą
Czerniaka-Einhorna. Jako substrat wykorzystałam p-fenylenodiaminę, którą przeprowadziłam
w symetrycznie chronioną grupami acetylowymi pochodną, po czym poddałam ją reakcji
Czerniaka-Einhorna i w wyniku hydrolizy grup ochronnych oraz cyklizacji uzyskałam BAT.
Syntezę odpowiednio chronionej tuftsyny/retro-tuftsyny oraz ich pochodnych acylowanych na
ε-aminowej
grupie
przeprowadziłam
lizyny
dodatkowym
metodą
klasyczną
aminokwasem
w
(Gly,
roztworze
z
Ala,
Val,
wykorzystaniem
Leu,
Ile)
mieszanych
bezwodników z chloromrówczanem izobutylu i NMM. Jest to synteza wieloetapowa, która
wymaga wprowadzania i zdejmowania odpowiednich osłon grup funkcyjnych. Analogi BAT
z oligopeptydami uzyskałam przy użyciu T3P jako odczynnika kondensującego, który dawał
najczystsze
produkty
z najlepszą
wydajnością.
Natomiast
analogi BAT
zawierające
adenozynę otrzymałam w reakcji podstawienia nukleofilowego rybozydu 6-chloropuryny
aminokwasowymi pochodnymi BAT. Użycie linkera do połączenia dwóch cząsteczek jest
powszechnie stosowaną metodą, a od jego długości i budowy bardzo często zależy aktywność
biologiczna związku.
Struktura otrzymanych nowych analogów została potwierdzona na podstawie analizy
widm 1 H NMR,
13
C NMR i MS, a ich czystość za pomocą HPLC.
W przeprowadzonych badaniach biologicznych określono żywotność komórek za
pomocą testu MTT oraz wpływ badanych związków na aktywność katalityczną kompleksu
rozszczepialnego
indukcję
topoizomeraza-DNA,
uszkodzeń
DNA.
Do
dystrybucję
badań
komórek
w cyklu komórkowym i
wyselekcjonowano
ludzkie
linie
komórkowe:
niedrobnokomórkowego raka płuc A549 oraz białaczki promielocytarnej HL-60. Ewaluacja
właściwości
cytotoksycznych
chlorowodorku
batracyliny
wykazała
umiarkowane
jego
właściwości cytotoksyczne. Otrzymane chlorowodorki oligopeptydów tuftsyny/retro-tuftsyny
nie wykazały aktywności cytotoksycznej. Znacznie lepszą aktywnością niż chlorowodorek
batracyliny
charakteryzowały
się
analogi
batracyliny
z
pochodnymi
retro-tuftsyny.
Najbardziej aktywne okazały się jednak aminokwasowe pochodne batracyliny. Natomiast ich
analogi z adenozyną nie wykazały aktywności w przeprowadzonych testach. Ponadto,
zbadano
wpływ
oligopeptydowych
analogów
BAT
na
aktywność
kompleksu
rozszczepialnego topoizomeraza-DNA. Wykazano, że nie hamują one w znacznym stopniu
relaksacji DNA przez topoizomerazę typu I, natomiast dają dobre wyniki w przypadku
inhibicji
relaksacji DNA
komórkowego
nowotworowych
oraz
przez topoizomerazę
morfologii
wybranymi
jądra
typu
IIα.
komórkowego,
oligopeptydowymi
analogami
W
po
wyniku
analizy
traktowaniu
BAT
można
cyklu
komórek
stwierdzić,
że przyrost frakcji sub-G1 był znaczący w populacji komórek inkubowanych z tymi
związkami.
mgr inż. Wioleta Januchta
Temat rozprawy doktorskiej: Synthesis and biological evaluation of novel functionalized
batracylin analogues as potential anticancer compounds.
Batracylin (BAT) is a drug which showed high antitumor and cytotoxic activity toward
several experimental tumor cell models. BAT had been tested in phase I clinical trial in
patients with advanced solid tumors and lymphomas. This clinical investigation found that
BAT was tolerated in most patients. However, due to absence of a stronger signal for
antitumor activity, further development of BAT had been stopped. Tuftsin (TKPR) is a
tetrapeptide that has been shown to possess immunologic, tumoricidal, and bactericidal
activities. Adenosine (ADO) is an endogenous purine nucleoside and an antiarrhythmic drug
with negative chronotropic and dromotropic action.
The chemical part of the work involved synthesis of BAT via modified method based on the
Czerniak-Einhorn reaction. I synthesized also the protected tuftsin/retro-tuftsin derivatives
containing isopeptide bond between ε-amino group of lysine and carboxyl group of simple
amino acids such as Gly, Ala, Val, Leu, Ile. Protected peptides were obtained using mixed
anhydride method.
New analogues of BAT with tuftsin/retro-tuftsin derivatives were
synthesized using T3P as a coupling agent in solvent mixture. The amino acid-batracylin
derivatives were synthesized using DCC and DMAP in anhydrous methyl chloride in good
yelds 48-64%. Finally, the new analogues of adenosine with batracylin derivatives were
synthesized using highly reactive DIEA in solvent mixture. The bond between 6-chloropurine
riboside and an amine group of batracylin derivatives was achieved during reaction in
anhydrous ethanol.
Synthesized analogues were subjected to biological tests. The MTT viability test was used to
estimate cytotoxicity of the compounds. Cytotoxic activity testing was performed using
different human tumor cells: lung adenocarcinoma (A549) and human promyelocytic
leukemia (HL-60). BAT showed moderate cytotoxic properties. Conjugation of BAT with
tuftsin alone did not appreciably change the cytotoxicity of the analogues, compared to BAT.
In contrast, retro-tuftsin-BAT analogues were about 2-fold (for HL-60 cells) and about 5-fold
(for A549 cells) more cytotoxic that BAT. This was particularly striking for retro-tuftsin
analogues branched with leucine or isoleucine which showed about 10 times or more
increased cytotoxicity against both tumor cells than the parent compound BAT and its
branched BAT-tuftsin analogues. Several of the aminoacid-BAT precursors showed greatly
increased cytotoxicity toward both tumor cell types compared to BAT. Sensitvity toward both
A549 and HL-60 cells was higher from about 2- to more than 25-fold compared to the BAT.
The majority of aminoacid-adenosine-BAT analogues were completely biologically inactive
toward both A549 as well as HL-60 cells. Only one was specifically cytotoxic toward A549
cells but showed comparable activity to BAT. Studied analogues did not appreciably inhibit
DNA relaxation mediated by type I DNA topoisomerase. Effect of studied compounds on
DNA relaxation mediated by topoisomerase IIα enzyme was much more pronounced and drug
dose-dependent. Treatment of tumor cells with BAT and its analogues, at doses corresponding
to their IC90 concentrations, resulted in a rapid (within 3 h) phosphorylation of the H2AX
histone which is a typical marker of double-stranded DNA breaks. Analysis of cell cycle
progression and nuclear morphology after treatment of tumor cells with analogues revealed
that biological action of BAT and its tuftsin/ retro-tuftsin analogs was cell-type specific. The
BAT-tuftsin analogue increased debris fraction by about 3.5-fold, compared to BAT.