proteazy cysteinowe oraz ich autogenne

Nowiny Lekarskie 2006, 75, 4, 378–381
AGNIESZKA WYRWIŃSKA1, MACIEJ SIEWIŃSKI2, PIOTR NOWACZKIEWICZ3, LECH TORLIŃSKI1
PROTEAZY CYSTEINOWE ORAZ ICH AUTOGENNE INHIBITORY
W CHOROBACH NOWOTWOROWYCH
CZĘŚĆ II. METODY OZNACZANIA AKTYWNOŚĆI PEPTYDAZ CYSTEINOWYCH
ORAZ ICH INHIBITORÓW
CYSTEINE PROTEINASES AND THEIR AUTOGENOUS INHIBITORS IN NEOPLASTIC DISEASES
PART II: METHODS OF DETERMINATION OF CYSTEINE PEPTIDASES AND THEIR INHIBITORS
1
Katedra Chemii i Biochemii Klinicznej Akademii Medycznej im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu
Kierownik: prof. dr hab. med. Lech Torliński
2
Zakład Nauk Podstawowych Akademii Medycznej we Wrocławiu
Kierownik: dr hab. n. med. Maciej Siewiński
3
Katedra i Klinika Urologii Akademii Medycznej im. Karola Marcinkowskiego w Poznaniu
Kierownik: prof. dr hab. med. Zbigniew Kwias
Streszczenie
W części I artykułu przedstawiliśmy aktualne dane na temat potencjalnych możliwości wykorzystania oznaczeń aktywności proteaz cysteinowych i/lub ich inhibitorów w różnych chorobach nowotworowych na podstawie przeglądu wybranych prac badawczych. Proteazy cysteinowe zaangażowane są w procesy karcinogenezy na wielu poziomach – uczestniczą w transformacji nowotworowej, inwazji, powstawaniu
przerzutów, angiogenezy a także na poziomie kaspazy 3 w procesie apoptozy. Wyniki większości badań potwierdzają możliwość zastosowania pomiaru aktywności endopeptydaz cysteinowych jako markerów „agresywności nowotworów” oraz poziomu ich inhibitorów jako
markerów „obronności” organizmu w diagnostyce oraz monitorowaniu rutynowych metod terapii. Najbardziej popularne i najszerzej dostępne pozostają różne metody laboratoryjne z wykorzystaniem płynów ustrojowych, choć możliwe jest także wykorzystanie materiałów
tkankowych oraz stosowanie różnych technik immunologicznych, immunohistochemicznych i opartych o nowe osiągnięcia genetyki molekularnej. Część II pracy zawiera przegląd metod badawczych oraz dokładniejsze omówienie najczęściej stosowanych, na podstawie dostępnego piśmiennictwa i doświadczeń własnych autorów.
SŁOWA KLUCZOWE: proteazy cysteinowe, inhibitory cysteinowych peptydaz, metody.
Summary
The first part of our article discussed potential applications of assays of cysteine peptidases and of their inhibitors in oncological diagnostics.
Cysteine peptidases play an important role at many levels of carcinogenesis – neoplastic transformation, invasion, metastasis, angiogenesis
and apoptosis. The majority of studies revealed activity of cysteine proteinases as markers of “aggressiveness” and cysteine proteinases
inhibitors as markers of “defensiveness” of human body in the diagnostics and therapy monitoring. The most popular and available are
various laboratory methods involving body fluids, but some tissue materials can be used as well. Many immunological and immunohistochemical technics and molecular genetics are used also. The second part of our paper contains a review of investigation methods and full
particulars of the most popular ones, based on available data and authors’ own experience.
KEY WORDS: cysteine peptidases, autogenous inhibitors, methods.
Wstęp
W części I artykułu przybliżyliśmy czytelnikowi podstawowe wiadomości na temat udziału proteaz cysteinowych i ich inhibitorów w karcinogenezie oraz możliwości
wykorzystania oznaczeń ich aktywności w różnych chorobach, w tym nowotworach. Proteazy cysteinowe zaangażowane są w procesy kancerogenezy na wielu poziomach –
uczestniczą w transformacji nowotworowej, inwazji, powstawaniu przerzutów, angiogenezie i apoptozie, a wyniki
wskazują na zastosowania pomiaru aktywności endopeptydaz cysteinowych jako markerów „agresywności nowotworów” oraz poziomu inhibitorów peptydaz cysteinowych
jako markerów „obronności” organizmu. Badania te mogą
znaleźć zastosowanie w diagnostyce oraz monitorowaniu
terapii. W części II pracy pragniemy przedstawić metody
badawcze oznaczania aktywności cysteinowych peptydaz
oraz ich inhibitorów. Dokładniej omówimy metodykę technik laboratoryjnych, jako najczęściej stosowanych, wspominając jednak także wybrane metody immunologiczne
i genetyczne.
1. Oznaczanie aktywności enzymów proteolitycznych
metodą kolorymetryczną
Materiał biologiczny: Płyny ustrojowe: surowica, ślina
(np. w chorobach przyzębia [1], nowotworach głowy i szyi
[2]), mocz, płyn wysiękowy, płyn mózgowo-rdzeniowy,
nasienie. Do śliny dodaje się środek hamujący rozwój flory
bakteryjnej (np. 0,02% azydek sodu). Pobrane od pacjentów próbki odwirowuje się, odrzucając osad. Tak przygotowany materiał można zamrażać i przechowywać w niskiej temp. (od -20 do -40°C) do czasu badania. Metodą tą
379
Proteazy cysteinowe oraz ich autogenne inhibitory w chorobach nowotworowych
można także oznaczać aktywność cysteinowych peptydaz
oraz ich inhibitorów w materiale tkankowym uzyskanym w
biopsji lub w trakcie zabiegu operacyjnego (np. z nowotworów żołądka [3], węzłów chłonnych). Przygotowuje się w
tym celu homogenaty tkankowe, które następnie poddawane są wirowaniu, a właściwy materiał do badań stanowi
supernatant, który również można zamrażać.
Opis metody: W metodzie tej działaniu oznaczanych
enzymów proteolitycznych poddaje się syntetyczny substrat
– BANA (N-benzoyl–DL–arginine–β–naphtylamine =
N-benzoyl-DL-naphtylamide hydrochloride). Aktywność
cysteinowych peptydaz obecnych w badanym materiale
hydrolizuje 0,05 mM BANA uwalniając produkt reakcji –
β-naftyloaminę, którą oznacza się metodą kolorymetryczną.
Warunki reakcji prowadzi się w temperaturze 37°C i pH =
6,0 w buforze fosforanowym z dodatkiem 0,02 M EDTA
i DL-cysteiny oraz 0,1% merkaptoetanol, inkubacja trwa
około 12 godzin. Jedna jednostka aktywności enzymu
(1 mEU) jest definiowana jako ilość enzymu uwalniająca
1 nmol produktu (β-naphtyloaminy) na godzinę, w przeliczeniu na 1 mg białka całkowitego, które można oznaczać
metodą Bradforda [4] lub Lowry’ego [5] – stosując albuminę wołową jako standard) [6, 7].
2. Oznaczanie aktywności enzymów proteolitycznych
metodą spektrofluorometryczną (Barretta i Kirschke)
Materiał biologiczny: jak wyżej. Metodę spektrofluorometryczną wykorzystywano także do badania aktywności katepsyn B i L w liniach komórek nowotworowych
(np. nowotworów płuc [8]). Materiał bezpośrednio poddawany badaniu stanowiło specjalnie przygotowane
medium z hodowli komórkowych.
Opis metody: Tu substratem poddawanym działaniu
katepsyn jest Z-Phe-Arg-AMC dla katepsyny L oraz
Z-Arg-Arg-AMC dla katepsyny B, z których pod wpływem hydrolizy uwalnia się 7-AMC (= 7-amino-4methyl-coumarin). Warunki reakcji dobiera się podobnie
jak wyżej – temp. 37°C, pH = 6,0 (bufor fosforanowy,
EDTA, DTT), krótszy jest czas inkubacji 20–60 minut,
a reakcję hydrolizy kończy się dodając do próbki kwas
jodooctowy. W oznaczeniach kontrolnych stosuje się
(pochodzi z mikroorganizmów) inhibitor proteaz cysteinowych – E-64 oraz próbę zerową. Fluorescencję uzyskanego produktu (7-AMC) mierzy się przy użyciu
spektrofluorometru (długość fali wzbudzenia λ = 370
nm, emisji λ = 440 nm). Wartości fluorescencji badanej
próbki odejmuje się od fluorescencji oznaczenia kontrolnego zawierającego E-64, a następnie cechuje wg produktu reakcji – 7-AMC. Jednostka aktywności enzymu
(1 mEU) jest definiowana jako ilość enzymu, która
uwalnia 1 nmol (nM) 7-AMC w ciągu minuty, w przeliczeniu na 1 mg białka [9, 10].
3. Oznaczanie aktywności pro-katepsyn (prekursorów proteaz cysteinowych)
W celu aktywacji prokatepsyn dodaje się do badanych próbek pepsynę, inkubacja (preinkubacja) trwa 60
minut w temp. 37°C, przy pH = 3,0 (bufor octowy).
Następnie bada się aktywność enzymów proteolitycznych jak wyżej. W oznaczeniach kontrolnych stosuje się
próbki bez pro-katepsyny, próbki poddawane tylko inkubacji (37°C przez 60 minut bez innych odczynników)
oraz próbki inkubowane w 37°C przez 60 minut z dodatkiem buforu octowego (bez pepsyny). Aktywność prokatepsyny wylicza się jako różnicę aktywności katepsyny po preinkubacji z pepsyną i aktywności katepsyny
„wolnej” (w próbce nie poddawanej działaniu pepsyny)
[11, 12, 3].
4. Oznaczanie aktywności inhibitorów proteaz tiolowych za pomocą papainy metodą kolorymetryczną
Materiał biologiczny: jak wyżej.
Opis metody: W metodzie tej wykorzystuje się papainę jako łatwo dostępne źródło enzymu imitującego
endopeptydazy cysteinowe. Aktywność papainy oznacza
się rutynowo w reakcji z BANA metodą kolorymetryczną (patrz wyżej), następnie bada się tą samą metodą
aktywność papainową w próbkach z dodatkiem materiału biologicznego zawierającego inhibitory proteaz. Jedną
jednostkę aktywności inhibitora definiuje się jako ilość
inhibitora, która hamuje jedną jednostkę aktywności
papainowej. Uzyskana w ten sposób wartość odpowiada
aktywności wolnych inhibitorów proteaz cysteinowych
(ICP37 w przeliczeniu na białko całkowite oznaczone
metodą Bradforda). Wiadomo jednak, że część inhibitorów proteaz cysteinowych pozostaje w formie nieaktywnej, związanej w kompleksy enzym-inhibitor. Uwolnienie związanych inhibitorów można uzyskać przez 20minutową preinkubację próbki w pH = 2,0 (bufor glicynowy) i temp. 80–100°C (niszczy się też wtedy proteazy,
a inhibitory uwalniają się). Oznaczona w tak przygotowanym materiale aktywność inhibitorów proteaz odpowiada ich aktywności całkowitej (ICP80). Ilość inhibitorów związanych w kompleksy jest różnicą pomiędzy
ICP80 i ICP37 = ∆ICP [13, 14].
5. Inaktywacja α2-makroglobuliny
α2-makroglobulina (zawarta w materiale biologicznym)
jest głównym naturalnym inhibitorem endoproteaz (nie
tylko cysteinowych) i może interferować z oznaczeniem
ICP. Minakata [14] opisał metodę inaktywacji α2-makroglobuliny (α2-M) przy użyciu metylaminę (w 55°C przy
pH 7,5) ICP pozostają w tych warunkach całkowicie stabilne). Znalazła ona rutynowe zastosowanie w oznaczeniach
aktywności cystatyn w płynach i homogenatach tkanek
zawierających ten inhibitor [11, 16].
6. Oznaczanie aktywności cystatyn wobec pepsyny
metodą spektrofluorometryczną (wg Heidtmana)
W metodzie tej oznacza się całkowitą aktywność inhibitorową, tj. po preinkubacji próbek materiału w wysokiej temp. (100°C przez 10 minut). Stosuje się tu
oczyszczoną papainę, której aktywność określa się poprzez miareczkowanie z E-64. Próbki inkubuje się z
papainą w temp. 37°C, pH = 5,5 (0,05 % Brij-35 w buforze octowym), z dodatkiem EDTA, DTT przez 5–10
Agnieszka Wyrwińska i inni
minut. Dochodzi wtedy do powstawania kompleksów
enzym-inhibitor, a tym samym dezaktywacji enzymu.
Pozostała w próbce aktywność papainowa odzwierciedla
pośrednio aktywność inhibitorów w badanym materiale.
Mierzy się ją dodając substratu dla katepsyny B – Z-PheArg-AMC. Próbki inkubuje się w 37°C przez 30 minut,
reakcje proteolizy hamuje się dodając kwas jodooctowy.
Wartość fluorescencji określa się przy długości fali
wzbudzenia λ = 370 nm i emisji λ = 440 nm wobec próby zerowej, którą przygotowuje się dodając kwas jodooctowy przed substratem, a fluorescencję odczytuje w
oparciu o uwolniony produkt reakcji – 7-AMC. Równocześnie przygotowuje się oznaczenie kontrolne, w którym materiał biologiczny zastępuje się mieszaniną buforową w celu określenia „nie zablokowanej” aktywności
papainy. Jednostka aktywności inhibitorowej wobec
papainy jest równa jednej jednostce aktywności papainy
i odpowiada ilości inhibitora całkowicie hamującego
aktywność papainy. Liczbę tę ustala się przez ekstrapolację krzywej miareczkowania do zerowej aktywności
papainy [6, 16].
7. Oznaczanie aktywności cystatyn wobec katepsyny B
metodą spektrofluorometryczną (wg Heidtmana)
Tu również oznacza się całkowitą aktywność inhibitorową, ale zamiast papainy dodaje się oczyszczoną
ludzką katepsynę B pochodzenia wątrobowego. Stężenia
aktywnego enzymu określa się poprzez stechiometryczne miareczkowanie przy użyciu inhibitora E-64. Próbki
inkubuje się z katepsyną B w temp. 37°C w buforze
fosforanowym o pH = 6,0 zawierającym 0,02 nM EDTA
i DTT przez 5–10 minut. Dochodzi wtedy do powstawania kompleksów enzym-inhibitor, a tym samym dezaktywacji enzymu. Pozostała w próbce aktywność katepsyny B odzwierciedla pośrednio aktywność inhibitorów
w badanym materiale. Pomiaru aktywności katepsyny
dokonuje się tak jak to opisano powyżej przy użyciu
papainy i porównuje z próbą kontrolną, w której zamiast
materiału biologicznego dodaje się sól fizjologiczną.
Jedna jednostka aktywności inhibitorowej wobec katepsyny B jest równa jednej jednostce aktywności katepsyny [6, 16].
8. Oznaczanie stężenia cystatyny C w surowicy
Jak wspomniano w części I niniejszej pracy udowodniono udział proteaz cysteinowych i cystatyn w
wielu procesach nie tylko patologicznych, ale również
fizjologicznych. Najbliższa praktycznego, powszechnego zastosowania wydaje się być cystatyna C, wydzielana
przez niemal wszystkie komórki ludzkiego organizmu w
stanie zdrowia. Jej stężenie w surowicy zależy przede
wszystkim od stopnia przesączania kłębuszkowego.
Według wielu autorów czułość i specyficzność cystatyny C
jako markera wydolności nerek jest porównywalna lub
nawet wyższa od stosowanego dotychczas stężenia kreatyniny. Najczęściej stosowane metody jej oznaczania to
różne odmiany metod z zastosowaniem cząstek opłaszczonych specyficznymi przeciwciałami – radiometria,
380
nefelometria, turbidymetria. Dostępne są nawet zautomatyzowane systemy do przeprowadzania licznych i szybkich
analiz (np. nefelometr firmy Dako Ltd [cat. No. K0071;
Ely, United Kingdom]) [17, 18].
9. Metody immunologiczne
Niektórzy badacze równocześnie z oznaczeniami
biochemicznymi katepsyn B i L i/lub cystatyn w płynach
ustrojowych i/lub homogenatach z materiałów tkankowych stosują techniki z użyciem przeciwciał monoklonalnych. Najczęściej wykorzystywane w tym celu metody to immunoelektroforeza, immunodyfuzja, immunoblotting, a także badania histopatologiczne – materiał
operacyjny lub biopsyjny zamraża się, a następnie przygotowuje na kriostacie cienkie skrawki poddawane reakcjom immunochistochemicznym (np. trzystopniowa
technika peroksydazowo-antyperoksydazowa) lub immunofluorescencyjnym. Metodą tą oznacza się tylko
poziom oznaczanych markerów, a nie ich biologiczną
aktywność [19, 20].
10. Metody biologii molekularnej
Jako bardzo precyzyjne i otwierające nowe możliwości narzędzie badawcze, metody inżynierii genetycznej
stają się coraz popularniejsze także w badaniach nad
proteazami cysteinowymi i ich inhibitorami. Znalazły
one zastosowanie nie tylko w oznaczeniach ilościowych
cystatyn (np. określenie ekspresji mRNA CMAP – cystatin-like metstasis associated protein [21]), ale także w
próbach opracowania eksperymentalnej terapii genowej
(transfekowanie cDNA cystatyny C do wybranych klonów komórek nowotworowych mózgu [22]).
Piśmiennictwo
1. Radwan-Oczko M., Ziętek M., Siewiński M., KiliańskaKanaffa U.: Aktywność inhibitorów proteinaz tiolowychcystatyn w ślinie osób z progresywnymi chorobami przyzębia. Czas. Stomat., 1999, LII, 80–84.
2. Siewiński M., Kręcicki T., Rak J. et al.: Thiol proteinase inhibitors in saliva of patients with laryngological cancer.
Diagn. Oncol., 1992, 2, 141–144.
3. Saleh Y., Siewiński M., Kielan W., Ziółkowski P.: Regulation of cathepsin B, L expression in vitro in gastric cancer tissues by egg white cystatin. J. Exp. Ther. Oncol., 2003, 319–
324.
4. Bradford M.M.: A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 1976, 72, 248 –
254.
5. Lowry O.H., Rosenberg NJ., Ferr A.L., Randall R.J.: Protein
measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem.,
191, 193, 265–275.
6. Barret A.J.: An improved color reagent for use in Barrett’s
assay of cathepsin B. Anal. Biochem. J., 1976, 76, 374–376.
7. Kręcicki T., Siewiński M. Serum cathepsin B-like activity
as a potential marker of laryngeal carcinoma. Eur. Arch.
Otorhinolaryngol., 1992, 249, 293–295.
8. Heidtmann H.H., Slage U., Abrahamson M., Bencina M.,
Kastelic L., Kopitar-Jerala N., Turk V., Lah T.T.: Cathepsin
381
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
Proteazy cysteinowe oraz ich autogenne inhibitory w chorobach nowotworowych
B and cysteine proteinase inhibitors in human lung cancer
cell lines. Clin. Exp. Metastasis, 1997, 15, 368–381.
Barrett A.J.: Fluorometric assay for cathepsin B and H with
methylcoumarylamide substrates. Biochemistry, 1980, 187,
909–912.
Barrett A.J., Kirschke H.: Cathepsin B, cathepsin H and cathepsin L. Methods. Enzymol., 1981, 80, 535–561.
Bohley P., Seglen PO. Protheases and proteolysis in the lysosome. Experientia, 1992, 48, 151–157.
Pagano M., Capony F., Rochefort. Pro-cathepsin D can activate in vitro procathepsin B cecreted by ovarian cancers. C.
R. Acad. Sci., II309, 7–12.
Siewiński M.: Method of purification of urinary thiol proteinase inhibitors (UTPI) from human urine. Cancer Biochem.
Biophys., 1991, 12, 33–44.
Siewiński M., Kręcicki T., Jarmułowicz J. et al.: Cysteine
proteinase inhibitors in serum of patients with head and neck
tumors. Diagnostic Oncology 1993: Proceedings Third International Conference on Head and Neck Cancer. San Francisco, July 26–30, 1992, 247.
Minakata K., Asano M., Sato T., Harada N.: Assay of αcysteine protinase inhibitor in serum or plasma. Hoppe – Seyler’s. Z. Physiol. Chem., 1982, 363, 493–498.
Siewiński M., Saleh J., Gryboś M. Et al. Determination of
cysteine peptidases-like activity and their inhibitors in the serum of patients with ovarian cancer treated by conventional
chemotherapy and vitamin E. J. Exp. Ther. Oncol., 2004, 4,
189–193.
Swan S.K.: The search continues – an ideal marker of GFR
[Editorial]. Clin. Chem., 1997, 43, 913–914.
18. Stowe H., Lawrence D., Newman D.J. et al.: Anatylical Performance of o Particle-enhanced Nephelometric Immunoassay for Serum Cystatin C using Rate Analysis. Clin. Chem.,
2001, 47, 1482–1485.
19. Levicar N., Strojnik T., Kos J. et al.: Lysosomal enzymes, cathepsins in brain tumor invasion. J. Neurosurgery, 2001, 48,
3, 598–605.
20. Saleh J., Siewiński M., Sebzda T. et al.: Inhibition f cathepsin
B activity in human breast cancer tissue by cysteine peptidase
inhibitor isolated from human placenta:immunohistochemical
and biochemical studies. Folia Histochem. Cytobiol., 2003, 3,
161–167.
21. Utsunomiya T., Hara Y., Kataoka A. et al.: Cystatin-like metastasis associated protein mRNA expression in human colorectal cancer is associated with both liver metastasis and patient survival. Clin. Cancer. Res., 2002, 8, 8, 2591–2594.
22. Konduri S.D., Yanamandra N., Siddique K. et al. : Modulation of cystatin C expression impairs the invasive and tumorigenic potential of human glioblastoma cells. Oncogene,
2002, 21, 57, 8705–8712.
Adres do korespondencji:
Lek. med. Agnieszka Wyrwińska
Katedra Chemii i Biochemii Klinicznej AM
Ul. Grunwaldzka 6
60-780 Poznań
tel. (061) 8546590
fax. (061) 8546599