Oglądaj/Otwórz

UNIWERSYTET M. CURIE-SKŁODOWSKIEJ
ZAKŁAD GENETYKI i MIKROBIOLOGII
ul. Akademicka 19
20-033 Lublin
Prof. dr hab. Anna Skorupska
Tel: (81) 537 50 52
Fax: (81) 537 59 59
[email protected]
Lublin 13.11.2015
Recenzja rozprawy doktorskiej mgr Jakuba Czarneckiego
pt. „Analiza struktury i funkcji chromidów wybranych gatunków bakterii z rodzaju Paracoccus
(Alphaproteobacteria)” (ang. „Analysis of structure and functions of chromids of selected
Paracoccus spp. strains”)
wykonanej w Zakładzie Genetyki Bakterii, Instytutu Mikrobiologii Uniwersytetu
Warszawskiego
pod kierunkiem prof. dr hab. Dariusza Bartosika oraz dr hab. Łukasza Dziewita
Większość bakterii należących do klasy Alphaproteobacteria ma duże genomy złożone z chromosomu
oraz często licznych replikonów pozachromosomowych, czyli plazmidów. Inna charakterystyczna
cecha tej grupy bakterii to zróżnicowane nisze ekologiczne, w których te bakterie bytują. Duży i
zmienny potencjał metaboliczny, jakim się charakteryzują, pozwala na adaptację do zmiennych
warunków środowiska. Badania prowadzone na różnych rodzajach bakterii tej klasy oraz poznanie w
ostatnich latach sekwencji nukleotydowych wielu genomów, zwróciły uwagę na zróżnicowanie
genetyczne replikonów pozachromosomowych. Przedstawiono koncepcję chromidu (Harrison i wsp.
2010), czyli replikonu, który nie jest ani plazmidem, ani chromosomem, gdyż zawiera plazmidowy
system replikacji i partycji oraz niektóre geny chromosomowe nadające mu status niezbędności dla
przeżywania komórek. Chromidy charakteryzują się także zbliżoną do chromosomu ilością par GC
oraz używalnością kodonów w sekwencjach kodujących, co wskazuje na odmienną od „zwykłych”
plazmidów historię ewolucyjną. W miarę dostarczanych dowodów doświadczalnych okazało się, że
postawienie ostrej granicy między plazmidami i chromidami nie do końca się sprawdza, gdyż
chromidy spełniające kryteria bioinformatyczne, nie zawsze są niezbędne do wzrostu w warunkach
laboratoryjnych, a ich wzrostu i utrzymywania się nie można sprawdzić w warunkach naturalnych, w
specyficznych niszach środowiskowych. Najnowsze wyniki uzyskane przez Doktoranta zawierają
propozycje rozszerzenia definicji chromidów, na chromidy pierwszorzędowe niezbędne w każdych
warunkach i chromidy fakultatywnie niezbędne nazwane chromidami drugorzędowymi, co jest
wynikiem nie tylko dyskusji i przemyśleń autorów dotyczących organizacji genomów bakterii, lecz
także przeprowadzenia wielu eksperymentów sprawdzających postawione hipotezy.
Grupa kierowana przez prof. D. Bartosika od wielu lat zajmuje się analizą genetyczną
genomów bakterii, ich organizacją oraz funkcjami metabolicznymi ze szczególnym podkreśleniem roli
1
plazmidów w metabolizmie. Badania te są uznawane w środowisku mikrobiologów, jako oryginalne i
wartościowe osiągnięcia i wielokrotnie cytowane. Rozprawa doktorska mgr J. Czarneckiego jest
kontynuacją badań nad genetyczną organizacją i funkcjami metabolicznymi genomów P. aminophilus
JCM 7686 i P. kondratievae NCIMB 13773 i zawiera obok szczegółowej adnotacji genomu P.
aminophilus także eksperymenty dowodzące zróżnicowanej organizacji i specyficznych funkcji
metabolicznych replikonów pozachromosomowych.
Fundusze na badania prowadzone przez Doktoranta pochodziły z różnych źródeł, t.j., z dwóch grantów
Uniwersytetu Warszawskiego realizowanych w latach 2011-2015, dwóch grantów MNiSW - Iuventus
(2010-2011) i Iuventus Plus (2012-2014) oraz aktualnie wykonywanego grantu NCN Opus (20142017). Wszystkie projekty dotyczyły badań nad strukturą genetyczną i funkcją genomów bakterii
rodzaju Paracoccus, a mgr Czarnecki był wykonawcą w tych projektach kierowanych przez prof. D.
Bartosika i dr hab. Ł. Dziewita.
Na pracę doktorską mgr J. Czarneckiego składają się 3 współautorskie prace doświadczalne
opublikowane w latach 2014-2015 w czasopismach indeksowanych w bazie JCR:
1. Czarnecki, J., Dziewit, L., Kowalski Ł., Ochnio, M., Bartosik, D. (2015) Maintenance and
genetic load of plasmid pKON1 of Paracoccus kondratievae, containing a highly efficient
toxin-antitoxin module of the hipAB family. Plasmid 80:45-53
IF=1.578
2. Dziewit, L., Czarnecki, J., Wibberg, D., Radlińska M., Mrozek P., Szymczak M., Schluter A.,
Puhler A., Bartosik D. (2014) BMC Genomics Architecture and functions of a multipartite
genome of the methylotrophic bacterium Paracoccus aminophilus JCM 7686, containing
primary and secondary chromids. BMC Genomics15:124
IF=3.986
3. Dziewit Ł., Czarnecki J. Prochwicz E., Wibberg D., Schluter A., Puhler A., Bartosik D. (2015)
Genome-guided insight into the methylotrophy of Paracoccus aminophilus JCM 7686. Front.
Microbiol. 6:852
IF=3.989
Mgr. J. Czarnecki jest pierwszym autorem w jednej pracy (Plasmid 2015) ze zdecydowanie
dominującą rolą w wykonaniu doświadczeń, analizie bioinformatycznej, opracowaniu wyników i rycin
oraz ze znacznym udziałem, wspólnie z prof. Bartosikiem, w napisaniu manuskryptu. W dwóch
kolejnych pracach jest drugim autorem. W pracy nr. 3 (Front. Microbiol. 2015) udział Doktoranta i dr
hab. Ł. Dziewita w wykonaniu badań i opracowaniu wyników jest równorzędny. Do rozprawy
doktorskiej załączono oświadczenia wszystkich współautorów publikacji, z których wynika, że
Doktorant miał dominujący udział w powstaniu i opublikowaniu prac składających się na rozprawę
doktorską. Jest On współautorem koncepcji badań, wykonywał większość doświadczeń, opracowywał
wyniki badań oraz przygotowywał manuskrypty do publikacji wspólnie z promotorem i dr hab. Ł
Dziewitem.
Poza publikacjami stanowiącymi rozprawę doktorską, mgr J. Czarnecki jest współautorem 3
publikacji notowanych w bazie JCR. Są to 2 prace wykonane w zespole prof. D. Bartosika, dotyczące
2
aktywności metabolicznej i zmienności genetycznej bakterii z rodzaju Paracoccus spp. i
opublikowane w PLoS One w latach 2013, 2014 oraz jedna praca wykonana w zespole prof. E.
Darżynkiewicza i opublikowana w Organic and Biomolecular Chemistry. Opisane publikacje nie
wchodzą w skład rozprawy, jednak dwie z nich ściśle wiążą się z rozprawą doktorską i stanowią
ważny element składowy już znacznego i wartościowego dorobku naukowego mgr J. Czarneckiego
oraz wskazują na dużą aktywność naukową Doktoranta.
Ocena rozprawy doktorskiej
Rozprawa doktorska mgr J. Czarneckiego to trzy prace eksperymentalne poprzedzone Streszczeniem
polskim i angielskim oraz krótkim Wstępem, w którym Doktorant zwięźle przedstawił dyskusyjną
koncepcję chromidów i wyróżniające własności metaboliczne rodzaju Paracoccus, które były
powodem zainteresowania tymi bakteriami.
Wyodrębnionym Celem pracy była identyfikacja replikonów niezbędnych dla wzrostu i przeżywania
bakterii w genomach dwóch gatunków Paracoccus oraz charakterystyka genetyczna tych
wyróżniających się replikonów.
W kolejnym rozdziale Doktorant omówił uzyskane wyniki badań, które dzielą się na dwa główne
wątki tematyczne. Pierwszy to „Identyfikacja chromidów w bakteriach z rodzaju Paracoccus”, (praca
nr 1 i częściowo nr 2) oraz drugi wątek to „Analiza funkcji zidentyfikowanych chromidów” (praca 2 i
3).
Z definicji chromidów wynika, że są to replikony niezbędne do przeżywania bakterii. Aby
zidentyfikować takie replikony podjęto próbę wyeliminowania wybranych plazmidów w dwóch
gatunkach P. aminophilus i P. kondratievae wykorzystując zjawisko niezgodności regionów replikacji
i partycji. Regiony niezgodności sklonowane na odpowiednich wektorach wahadłowych były
wprowadzane do poszczególnych szczepów i analizowano profil plazmidowy koniugantów. Ta
technika pozwoliła na identyfikację replikonu pKON1 P. kondratievae jako chromidu niezbędnego dla
wzrostu tego szczepu. Chromid pKON1 (95 tys. pz) został zsekwencjonowany i przeprowadzono
analizę bioinformatyczną z dokładną adnotacją genów. Analiza zawartości genetycznej tego plazmidu
wykazała, że przyczyną niezbędności tego chromidu jest występowanie na plazmidzie aktywnego
systemu stabilizacyjnego toksyna-antytoksyna (TA) z rodziny hipAB. Jest to o tyle niezwykłe, że sama
obecność różnych systemów TA na plazmidach nie warunkuje ich stabilności. Jednakże kaseta hipAB
opisana w tej pracy ma silny efekt stabilizujący plazmidy w innych szczepach Paracoccus, co
udowodniono eksperymentalnie. Ważnym wnioskiem wynikającym z tych badań jest fakt, że sama
nieusuwalność plazmidu z wykorzystaniem zjawiska niezgodności nie może być podstawą
identyfikacji chromidów, ponieważ systemy stabilizujące plazmidy oraz systemy restrykcji i
modyfikacji, których często jest kilka w megaplazmidach, nie pozwalają na selekcję bezplazmidowych
klonów. W dalszych nieopublikowanych jeszcze badaniach udowodniono, że kaseta hipAB może być
3
wykorzystana do konstrukcji stabilnych wektorów bakteryjnych utrzymujących się w komórkach
taksonomicznie różnych szczepów bez selekcji antybiotykowej.
Analiza genetyczna chromidu pKON1 wykazała jego dość niezwykłą strukturę, mianowicie ok. 30%
jego sekwencji stanowiły kompletne lub niekompletne sekwencje insercyjne (IS) sklasyfikowane do 5
różnych rodzin. Opisano również 6 nowych IS, niektóre były kilkakrotnie powtórzone. Część
plazmidu pKON1 stanowiły także konserwatywne geny zwykle obecne w chromosomach innych
szczepów Paracoccus lub Rhizobiales, jak system sekrecji typu III (T3SS), system restrykcji i
modyfikacji typu I, geny syntazy fosforanu trehalozy i wiele innych. W podsumowaniu określono
strukturę chromidu pKON1, jako „patchwork”, gdzie geny homologiczne w pokrewnych szczepach,
które zwykle występują na chromosomie są wymieszane z sekwencjami transpozycyjnymi oraz
sekwencjami odpowiadającymi za replikację i utrzymanie plazmidów.
Komentarz i pytania do publikacji nr. 1.
1. Czy porównywano sekwencje nukleotydowe hipAB pKON1 z innymi sekwencjami hipAB
obecnymi w szczepach Paracoccus sp., w których nie było efektu stabilizacji? Czy
chromosomalna kaseta hipAB z P. aminophilus jest identyczna z tą obecną na chromidzie?
2. Czy wg. Doktoranta stabilne utrzymywanie w komórce plazmidu/ów, które nie mają istotnych
funkcji metabolicznych niezbędnych dla przeżycia komórki ma jakieś znaczenie dla komórki,
czy jest tylko dodatkowym obciążeniem?
3. Czy nagromadzenie się na jednym replikonie 30% sekwencji o dużej zdolności do
transpozycji i rekombinacji może być niebezpieczne dla stabilności chromosomu, czy jest to
raczej efekt „zrzucania” na plazmid genów nieistotnych?
4. Str. 12. (Wstęp) Doktorant napisał, że chromidy są równocenne chromosomom i plazmidom.
Chyba raczej nie są ani chromosomami ani plazmidami.
5. Str. 50 publikacji nr. 1. Napisano, że ryzosfera kukurydzy jest naturalnym środowiskiem
rizobiów. Rizobia jako saprofity glebowe pewnie występują w ryzosferze kukurydzy, ale ich
naturalną ryzosferą jest ryzosfera roślin bobowatych (motylkowatych).
Publikacja nr. 2.
Praca w BMC Genomics z 2014 r. jest obszerną, bardzo dobrze opracowaną prezentacją zarówno
pełnej sekwencji nukleotydowej P. aminophilus JCM 7686 jak i potencjalnej funkcji poszczególnych
genów. Szczep ten został wybrany do badań ze względu na interesującą, złożoną organizację genomu,
ale przede wszystkim ze względu na ważny dla środowiska metabolizm jakim jest zdolność do
zużywania zredukowanych związków jedno-węglowych, takich jak N,N-dimetyloformamid,
formamid, metanol i metyloaminy, jako jedynych źródeł węgla i energii. Genom tego szczepu składa
się z chromosomu (3.6 mln pz) i 8 plazmidów o wlk. od 5.6 do 438 kpz., co razem wynosi 4.9 mln pz.
Zidentyfikowano 4573 ORFów z tego 1157 na plazmidach. Podzielono zidentyfikowane potencjalne
białka na grupy funkcyjne. Stwierdzono również obecność w genomie licznych transpozonów,
4
sekwencji IS oraz profagów. Udało się wyindukować jeden z kilku profagów; fag ten jest jedynym
opisanym w Paracoccus. W analizie funkcjonalnej plazmidów, stosując eliminację plazmidów z
użyciem systemów niezgodności poszczególnych plazmidów stwierdzono, że tylko jeden plazmid
pAMI5 jest nieusuwalny, istotny dla przeżywania komórek i sklasyfikowany jako chromid
pierwszorzędowy. Kolejny plazmid pAMI6 wprawdzie był eliminowany z komórek, lecz był
niezbędny do wzrostu tylko na podłożu minimalnym. Wg. koncepcji autorów ten plazmid
sklasyfikowano, jako chromid drugorzędowy, niezbędny w określonych warunkach środowiskowych.
Plazmid pAMI5 wśród wielu genów chromosomalnych zawierał jedyne geny podstawowego
metabolizmu odpowiedzialne za biosyntezę NAD de novo oraz za transport związków amonowych, co
najprawdopodobniej tłumaczy niezbędność tego chromidu w komórkach. Przedstawiona w tej
publikacji dogłębna adnotacja funkcjonalna genomu P. aminophilus będzie niewątpliwie bardzo
użyteczna, jako sekwencja referencyjna w dalszych badaniach Alphaproteobacteria.
Pytania:
1. Czy brano pod uwagę możliwość częściowej delecji plazmidu pAMI1 lub kointegracji z
pAMI2. Zdjęcie profilu plazmidów (file 12) może wskazywać na taką możliwość. Czy
eliminacja plazmidu była sprawdzana np. przez hybrydyzację z markerami plazmidu pAMI1?
2. Tworzenie agregatów w komórkach wyleczonych z pAMI1 może wskazywać na defekt w
genach dla polisacharydów powierzchniowych. Czy na plazmidzie pAMI1 identyfikowano
geny dla egzopolisacharydów (EPS), czy innych polisacharydów?
Publikacja nr. 3
Kontynuacją analizy metabolizmu P. aminophilus JCM 7686 jest publikacja we Front. Microbiol z
2015 r., w której autorzy opisują mechanizm metylotrofii tego szczepu odmienny od już opisanych w
innych szczepach Paracoccus. Został on określony, jako heterotroficzna metylotrofia zależna od cyklu
serynowego. Ponieważ szczep nie ma genu dla RuBisCo (karboksylaza rybulozo-1,5-dwufosforanu) to
asymilacja związków C1 musi zachodzić poprzez cykl serynowy. Analiza sekwencji genomu
wykazała obecność genów odpowiedzialnych za kilkuetapową asymilację jedno-węglowych
związków takich jak metanol, metylowane aminy czy formamid i dimetyloformamid, których
zużywanie jest zależne od genów zlokalizowanych na chromosomie oraz na chromidach pAMI5,
pAMI6 i innych pozachromosomowych replikonach. Obok szerokiej analizy bioinformatycznej,
badano wzrost szczepu JCM 7686 na różnych związkach C1 takich jak metanol, metyloaminy czy
formamid i jego pochodne, oraz poziom transkrypcji genów zaangażowanych w metylotrofię w
warunkach metylotroficznych i niemetylotroficznych Wybrane geny zidentyfikowanych szlaków
metylotroficznych były nokautowane, a uzyskane mutanty sprawdzane na aktywność metylotroficzną.
Praca zawiera również wyniki szerokiej analizy porównawczej grup genów odpowiedzialnych za
metylotrofię w 17 szczepach rodzaju Paracoccus spp. Aktywność metylotroficzna tych szczepów, lecz
także innych bakterii należących do Alphaproteobacteria jak Roseobacter, Rhizobium, Agrobacterium
5
ma ogromne znaczenie biotechnologiczne dla remediacji środowisk zanieczyszczonych DMF i innymi
związkami metylowymi.
W podsumowaniu, stwierdzam, że rozprawa stanowi istotny wkład w zrozumienie funkcjonowania
złożonych, wieloczęściowych replikonów bakterii, ich roli w adaptacji do zmiennego środowiska
bytowania, a także funkcji biotechnologicznej w oczyszczaniu gleby i innych środowisk z
zanieczyszczeń związkami metylowymi. Dokładne opisanie genomu P. aminophilus ma również
znaczenie dla środowiska mikrobiologów, jako ogromny zasób informacji dotyczącej potencjalnej
funkcji metabolicznej genów.
Rozprawa doktorska mgr Jakuba Czarneckiego przedstawiona w postaci trzech oryginalnych
współautorskich prac badawczych opublikowanych w czasopismach naukowych indeksowanych w
JCR, w których Doktorant pełni dominującą lub znaczącą rolę w pełni uzasadnia wniosek o nadanie
mu stopnia naukowego doktora nauk biologicznych i odpowiada warunkom stawianym pracom
doktorskim określonym w ustawie o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule
w zakresie sztuki z dnia 14 marca 2003 roku (Dz. U. z 2003 r., Nr 65, poz. 595) z późniejszymi
zmianami. Wnoszę do Rady Wydziału Biologii Uniwersytetu Warszawskiego o dopuszczenie Pana
mgr Jakuba Czarneckiego do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Ponadto z uwagi na wysoką
wartość merytoryczną pracy stawiam wniosek do Rady Wydziału Biologii UW o jej wyróżnienie.
Prof. dr hab. Anna Skorupska
6