dekstran 1

Preparaty krwiozastępcze
Idealne środki krwiozastępcze powinny:
• wypełniać objętościowo układ naczyniowy
• mieć lepkość podobną do krwi
• wytwarzać ciśnienie onkotyczne w celu
utrzymania przez dłuższy czas wody w
naczyniach
• zastępować krwinki czerwone w
przenoszeniu tlenu.
Podział środków krwiozastępczych
1. Środki zastępcze osocza
stosowane w celu zwiększenia objętości krwi
krążącej
 Roztwory koloidowe, np. dekstran
 Preparaty żelatynowo-skrobiowe, np.
hydroksyetyloskrobia
 Krystaloidy
2. Preparaty posiadające zdolność
odwracalnego wiązania tlenu
 Roztwory wolnej hemoglobiny
 Koloidalne połączenia hemoglobiny, np.
krosfumaryl hemoglobiny, rafimer
hemoglobiny, glutamer hemoglobiny
 Fluorokarbonowe substytuty krwi
Dekstrany
Dekstran –polimer glukozy o wysokim
ciężarze cząsteczkowym rozpuszczalny w
wodzie.
Wiązania: (1-6)-a-D-glikozydowe (90-95%)
(1-4) i (1-3)-a-D-glikozydowe – łańcuchy
boczne
M. cząsteczkowa 5104 do 3108 Da
Dekstran jest uzyskiwany głównie w wyniku fermentacji
sacharozy przez pewne rodzaje bakterii kwasu
mlekowego np. Leuconostoc
Dotychczas opisane dekstrany można umownie
zaliczyć do trzech klas:
klasa I - należy tu większość dekstranów.
Zbudowane są z łańcucha głównego - α-1,6glukanowego - do którego poprzez wiązania α-1,2, α1,3 lub α-1,4-glikozydowe przyłączone są łańcuchy
boczne
np. dekstran z Leuconostoc mesenteroides B512F - proste
łańcuchy zawierają wiązania α-1,6-glikozydowe, natomiast
rozgałęzienia rozpoczynają się wiązaniami α-1,3 przyłączonymi
do szkieletu głównego i zawierającymi najczęściej pojedynczą
cząsteczkę glukozy - 40% (ewentualnie dwie - 45%). Stopień
rozgałęzienia to ok. 5 %.
klasa II - alternan - łańcuch główny z na przemian
występującymi wiązaniami α-1,6 i α-1,3 oraz z
łańcuchów bocznych przyłączonych wiązaniem α-1,3
np. rozpuszczalny dekstran z Leuconostoc mesenteroides B
1355 - główny łańcuch zawiera ok 54% wiązań typowych i 35%
wiązań α-1,3-glikozydowych.
klasa III - mutany - w łańcuchu głównym
występują tylko kolejne wiązania α-1,3-glikozydowe
oraz nieliczne α-1,6-glikozydowe
np. nierozpuszczalny polisacharyd Sterptococcus mutans
6715, zawierający w łańcuchu głównym ok. 93% reszt
glukozowych połączonych wiązaniem α-1,3.
Lepkość dekstranów
•Wykazują cechy cieczy newtonowskich
•Lepkość jest niezależna od
pH i stężenia soli w roztworze
•Zależy od stężenia roztworu
i stosunku między wiązaniami
α-1,6; α-1,4 i α-1,3-Dglikozydowymi
Zależność lepkości różnych frakcji dekstranu
od ich stężenia w temperaturze 25ºC.
Produkcja
Organizmem używanym powszechnie w przemysłowej
produkcji dekstranu jest:
Leuconostoc mesenteroides NRRL B12(F) lub
Leuconostoc mesenteroides B512.
W Rosji używa się szczepu Leuconostoc SP4, a w
Czechach i Polsce Leuconostoc L60A.
Podłoża hodowlane
Leuconostoc mesenteroides syntetyzuje dekstran
na pożywce, która może zawierać:
• glukozę, inwertowany cukier, maltozę,
•ekstrakt drożdżowy, namok kukurydziany, namok z
kielków słodowych, hydrolizowaną kazeinę, pepton
• dodatek różnych kationów.
Metody otrzymywania dekstranu
METODA FERMENTACYJNA
• Proces jednoetapowy stosowany tradycyjnie do produkcji
dekstranu z wykorzystaniem bogatych podłóż zawierających do
ok. 10% sacharozy jako główne źródło węgla.
•
Jedyny kontrolowany parametr tego procesu: temperatura 20-25ºC.
• Podłoże nie jest natleniane
• Fermentacja jest prowadzona przez 2 do 6 dni.
• Wydajność tego procesu sięga 45% dla odpowiednio
aktywowanych szczepów Leuconostoc mesenteroides.
• Średnia wydajność wynosi około 25% w przeliczeniu na
wyjściową zawartość sacharozy.
• Otrzymujemy w efekcie natywny dekstran o masie
cząsteczkowej z zakresu 50 kDa do 500 MDa.
METODA ENZYMATYCZNA
Polega na wykorzystaniu do syntezy dekstranu
preparatu dekstranosacharazy otrzymywanego z
Leuconostoc mesenteroides.
Proces przebiega w czterech etapach:
1. namnożenie inokulum i produkcja
dekstranosacharazy - niska zawartość cukru w
podłożu, temp. 25ºC, pH -7 (początkowe pH
pożywki wynoszące 6,7-7,2 w miarę upływu czasu
hodowli spada do 6,4-6,9; wówczas obserwuje się
syntezę dekstranosacharazy, która jest
najintensywniejsza w pH 6,7)
2. usuwanie komórek bakterii z podłoża
3. synteza dekstranu - pH - 5,2; 10% sacharozy w
podłożu (zawartość sacharozy powinna być
większa niż 2%, dlatego podczas hodowli ciągłej
stosuje się zasilanie hodowli sacharozą),
odpowiednia ilość enzymu
4. frakcjonowanie i oczyszczanie dekstranu.
Optymalny czas trwania takiej hodowli wynosi ok. 2448 h.
Obniżenie temperatury hodowli powoduje spadek
syntezy wysokocząsteczkowego dekstranu, a
jednocześnie wzrost syntezy dekstranu
niskocząsteczkowego.
Po zakończeniu hodowli dekstran wytrąca się poprzez
dodanie alkoholu metylowego, lub etylowego.
Po rozpuszczeniu dekstran poddaje się hydrolizie do
wymaganej masy cząsteczkowej, a następnie
oczyszcza na wymiennikach jonowych i węglu
aktywnym.
Zalety:
1. możliwość rozdzielenia fazy produkcji enzymu
od fazy fermentacji, przez co proces łatwiej
kontrolować
2. otrzymany produkt jest bardziej homogenny
3. łatwiejsze oczyszczanie
4. wydajność ok 28-30%
5. może być użyta do syntezy dekstranu
klinicznego o określonej, niskiej masie
cząsteczkowej
Produkcja dekstranu klinicznego
Możliwości zastosowania dekstranu zależą ściśle od jednej
konkretnej cechy biopolimeru - od jego masy cząsteczkowej.
Również właściwości pochodnych dekstranu zależą znacznie
od jego masy.
Momentem krytycznym dla produkcji dekstranu przemysłowego
jest otrzymanie czystych preparatów tego polimeru o
kontrolowanej, w wąskim przedziale, masie cząsteczkowej.
Podstawową metodą uzyskiwania dekstranów o określonej,
niskiej masie cząsteczkowej jest proces hydrolizy kwasowej
połączony z frakcjonowaniem dekstranu natywnego
rozpuszczalnikami organicznymi (kosztowny i uciążliwy ).
Po hydrolizie dekstran kliniczny wytrąca się przez dodanie
alkoholu etylowego do stężenia 39-46% lub alkoholu
metylowego do stężenia 42-50%, a następnie suszy.
Inne możliwości częściowej depolimeryzacji dekstranu:
przy użyciu zasad
enzymów
ultradzwięków
temperatury
Żadna z tych metod nie została jednak wprowadzona do
praktyki przemysłowej
Udoskonalone metody otrzymywania
niskocząsteczkowych dekstranów - znajdujących
zastosowanie kliniczne
• zastosowanie oczyszczonej dekstranosacharazy w
połączeniu z odpowiednimi akceptorami glikozylowymi.
- Zaobserwowano, że wprowadzenie niektórych cukrów do mieszaniny
reakcyjnej zawierającej enzym i sacharozę prowadzi do syntezy
oligosacharydów kosztem wysokocząsteczkowego dekstranu.
- Najbardziej efektywne w tym procesie okazały się maltoza,
izomaltoza i dekstrany o niskiej masie.
- Opisana metoda nie została jednak zastosowana na szeroką skalę,
ponieważ pojawiają się znaczne trudności w analizie i oczyszczaniu
produktów reakcji, a także występuje konieczność użycia drogiego
wysoce oczyszczonego enzymu - dekstranosacharazy.
• Zaproponowana w latach 90-tych metoda produkcji
dekstranu opiera się na wykorzystaniu kultury
mieszanej dekstranotwórczych bakterii Leuconostoc
mesenteroides oraz drożdży Lipomyces starkeyi
rozkładających dekstran.
Metoda ta pozwala wykluczyć etap hydrolizy kwasowej,
a uzyskiwany produkt niskocząsteczkowy jest bardziej
jednorodny niż otrzymywany na drodze tradycyjnej.
Zastosowanie dekstranu i jego pochodnych
kliniczne
- Roztwory dekstranu wywierają znaczne ciśnienie osmotyczne
dzięki zdolności wiązania wody. Wpływa to na zwiększenie
objętości osocza, a tym samym na polepszenie przepływu krwi
w naczyniach włosowatych oraz zmniejszenie jej lepkości.
-Zaletą tego środka krwiozastępczego jest to, że utrzymuje się
w organizmie dostatecznie długo, aby spełnić swoją rolę, a
jednocześnie nie odkłada się w tkankach w takim stopniu jak
inne środki.
- Ponadto przy jego stosowaniu nie trzeba uwzględniać grupy
krwi ani obawiać się zakażeń krwiopochodnych oraz możliwe
jest jego długie przechowywanie (w odróżnieniu od krwi).
-Dekstran do zastępowania osocza powinien mieć masę od
50 kDa do 100 kDa, a stosowany jako regulator przepływu
krwi od 20 kDa do 60 kDa
- Najpowszechniej stosowany jest dekstran 40 (masa 40
kDa), dekstran 70 oraz dekstran 1 – używany jako hapten
przed podaniem dekstranu o wyższej masie, który znacznie
zmniejsza częstość występowania niepożądanych reakcji.
- Otrzymano również produkt stanowiący połączenie
dekstranu z hemoglobiną, który można zastosować jako
substytut krwi, ponieważ taki kompleks łączy funkcję
zamiennika osocza i przenośnika tlenu.
Dalsze kliniczne zastosowania dekstranu
• składnik roztworów stosowanych w krioprezerwacji
• roztwory do przechowywania organów wykorzystywanych w
transplantacji
• składnik implantów – np. stomatologicznych
Przykładem materiału stosowanego do regeneracji ubytków
kostnych, w którego skład wchodzi dekstran jest Fisiograft
Powder (proszek).
• antykoagulant – np. zapobieganie zatorom żylnym
Wykorzystany jest do tego celu siarczan dekstranu. Związek ten
wchodzi w reakcje z β-lipoproteinami.
• znalazł on również zastosowanie w różnych metodach
analitycznych i preparatywnych, m.in. w oznaczaniu zawartości
cholesterolu i innych lipoprotein w surowicy oraz procedurze
oczyszczania przeciwciał IgM.
http://micro.org.pl/doku.php/grupa5:index