(W JĘZYKU POLSKIM) - wniosek: 294401
Transkrypt
(W JĘZYKU POLSKIM) - wniosek: 294401
Niniejszy projekt dotyczy poznania właściwości biochemicznych nowej izoformy aktyny, a także jej funkcji na poziomie biologii komórki nowotworowej. Komórki zarówno prawidłowe jak i nowotworowe mają zdolność do przemieszczania się w obrębie tkanek. W przypadku komórek prawidłowych tylko część z nich posiada potencjał migracyjny, który jest ściśle kontrolowany przez środowisko otaczające komórki. W niektórych sytuacjach dochodzi do pobudzenia komórek prawidłowych do przemieszczenia się. Gdy dojdzie do zranienia aktywowane fibroblasty, prawidłowe komórki zasiedlające np. skórę kierują się do rany, aby razem z innymi komórkami ją zabliźnić. Natomiast komórki nowotworów złośliwych, czyli takich, które tworzą przerzuty do innych organów, wyzwalając się spod kontroli sygnałów płynących z otaczającego je środowiska jak i innych komórek, nabywają zdolności do niezależnego przemieszczania się w obrębie tkanek. Po tym jak komórki nowotworowe przedostaną się do naczyń krwionośnych, krążą wraz z krwią do momentu przytwierdzenia się do ściany naczynia krwionośnego, a następnie przedostają się do tkanki otaczającej naczynie krwionośne. W obrębie tkanki lub narządu komórki nowotworowe mogą dalej się przemieszczać, aż osiądą w wybranym miejscu, gdzie zaczynają się namnażać, czyli tworzą przerzut nowotworowy. Jak wynika z powyższego opisu, przynajmniej część komórek nowotworowych ma zdolność do poruszania się. Dlatego też tak ważnym aspektem jest pełne zrozumienie procesów, jakie pozwalają komórkom nowotworowym na ruch, a co za tym idzie na tworzenie przerzutów. Białka składające się na szkielet komórki, czyli cytoszkielet można podzielić na trzy grupy: mikrofilamenty, filamenty pośrednie oraz mikrotubule. Podczas gdy mikrotubule odpowiadają głównie za transport organelli oraz prawidłowy podział komórki, a filamenty pośrednie za kształt komórki, mikrofilamenty odpowiedzialne są głównie za ruch komórki. Te ostatnie struktury są zbudowane z aktyny. Monomer aktyny ma unikalną zdolność do tworzenia długich polimerów, które mogą się ze sobą łączyć w równoległe wiązki i przebiegać wzdłuż całej komórki. Ponad 200 białek kontroluje bezpośrednio tworzenie polimerów aktynowych i ich fragmentację. Te dynamiczne zmiany są odpowiedzialne m.in. za ruch komórki. Podczas gdy przy jednej krawędzi komórki tworzą się nowe mikrofilamenty, czyli filamenty aktynowe, w innym miejscu komórki może następować ich rozpad. Co ciekawe, aktyna bierze nie tylko udział w ruchu komórki, ale też pełni wiele innych funkcji np. bez niej nie odbędzie się transkrypcja genów w jądrze komórkowym, a więc jest ona niezbędnym białkiem do funkcjonowania komórek. Do tej pory uważało się, że jest sześć rodzajów, czyli sześć izoform, aktyny. α aktyna z mięśni szkieletowych buduje podstawowe elementy funkcjonalne komórki mięśniowej, czyli sarkomer. Filamenty miozynowe, struktury zbudowane z jednego z białek cytoszkieletu aktynowego, przesuwając się względem mikrofilamentów, generują siłę skurczu mięśnia. α aktyna z mięśnia sercowego odpowiada za skurcz serca, natomiast α aktyna z mięśni gładkich oraz γ aktyna z mięśni gładkich są odpowiedzialne odpowiednio za skurcze mięśni gładkich. Występowanie tych czterech izoform aktyny jest zatem ograniczone do określonego rodzaju tkanki mięśni. Pozostałe dwie izoformy to β i γ aktyny cytoplazmatyczne. Są to aktyny, które występują w każdej komórce, chociaż w komórkach mięśniowych w znacznie mniejszych ilościach niż aktyny mięśniowe. Pomimo bardzo niewielkiej różnicy w budowie, ich składy aminokwasowe różnią się nie więcej niż w 5%, mogą budować różne struktury oraz wiązać różne białka, co wpływa na zróżnicowanie ich funkcji. W ostatnich latach pojawiły się doniesienia, dotyczące głównie komórek nowotworowych, wskazujące na obecność w tych komórkach siódmej izoformy aktyny, nazwanej actbl2. Badania te wykorzystywały analizę białek komórek nowotworowych przy użyciu spektrometrii mas, która pozwala po odpowiedniej obróbce testowanych próbek na detekcję fragmentów białek, a następnie na ich identyfikację. Poznanie genomu człowieka pozwoliło także na identyfikację genu kodującego actbl2. Realizacja poprzedniego grantu o tytule „The role of nuclear localized gelsolin in cel migration (Rola jądrowo zlokalizowanej żelsoliny w migracji komórek)” przyznanego przez Fundację na Rzecz Nauki Polskiej w ramach programu HOMING Plus, który dotyczył jednego z białek wiążących aktynę, zaowocowała szeregiem interesujących wyników. Okazało się m.in., że w części badanych w ramach ww. grantu ludzkich linii komórkowych czerniaka obecna jest właśnie ta siódma izoforma aktyny. Badane linie charakteryzowały się różnymi zdolnościami do ruchu i różnym poziomem ilości actbl2. Analiza bioinformatyczna, jaką przeprowadziliśmy wykazała, że białko actbl2 jest bardzo podobne do β aktyny cytoplazmatycznej. Dzięki technikom biologii molekularnej udało nam się już stwierdzić, że tak jak inne izoformy aktyny, to białko też ma zdolność do tworzenia polimerów, czyli mikrofilamentów, a zatem najprawdopodobniej bierze także udział w ruchu komórek. Należy tutaj wspomnieć, że czerniak, nowotwór komórek pigmentowych, czyli melanocytów jest jednym z najtrudniej wyleczalnych nowotworów. Zaledwie 4% wszystkich nowotworów skóry to czerniaki, ale aż 80% zgonów osób cierpiących na nowotwór skóry spowodowanych jest czerniakiem. Do chwili obecnej brakuje skutecznej terapii dla pacjentów z czerniakiem. Z tego też powodu, im więcej wie się o biologii tego nowotworu, tym lepsze można opracować metody jego terapii. W związku z powyższymi informacjami oraz faktem, że praktycznie brak jest jakichkolwiek prac badawczych mających na celu poznanie właściwości tego białka pod względem biochemicznym oraz funkcjonalnym, niniejszy projekt ma na celu zgłębienie tych aspektów. Zgodnie z programem badań zamierzamy: - Poznać właściwości biochemiczne actbl2. 1. Uzyskamy rekombinowane białko actbl2 w specjalnym systemie pozwalającym na produkcję aktyn. Zazwyczaj badacze produkują białka ludzkie w bakteriach, ale aktyny wymagają odpowiednich białek, aby uzyskać odpowiednią trójwymiarową strukturę (konformację). Dlatego też użyjemy sprawdzonego systemu opartego na komórkach owadzich, które bardzo dobrze nadają się do produkcji ludzkiej aktyny. 2. Mając rekombinowane białko actbl2, przeprowadzimy szereg testów biochemicznych np. określimy, czy to białko lepiej czy gorzej tworzy filamenty aktynowe od innych znanych od dawna aktyn; sprawdzimy z którymi białkami wiążącymi aktynę i z jaką kinetyką oddziałuje actbl2. 3. Uzyskane rekombinowane białko actbl2 pozwoli nam także na podjęcie próby wygenerowania kryształów actbl2. Analiza tych kryształów pozwoliłaby na uzyskanie informacji o strukturze trzeciorzędowej tego białka. - Zrozumieć rolę actbl2 w ruchu komórek nowotworowych. 1. Posiadamy linie komórkowe czerniaka z małą i dużą zawartością actbl2. Aby sprawdzić, jak actbl2 wpływa na zdolność ruchu komórek czerniaka, chcemy w komórkach, które mają dużo nowopoznanej izoformy aktyny, zmniejszyć jej ilość za pomocą odpowiednich technik biologii molekularnej. I na odwrót, mając komórki o małej zawartości actbl2 i używając odpowiednich technik biologii molekularnej, zwiększymy ilość actbl2 w tych komórkach. Po tych manipulacjach poddamy badane komórki różnym testom w warunkach 2D i 3D pod kątem ich zdolności do poruszania się. Zbadamy, czy zmniejszenie/zwiększenie ilości actbl2 powoduje wzrost czy spadek potencjału komórek czerniaka do ruchu. 2. Używając odpowiednich technik barwienia komórek, sprawdzimy, jak nowoodkryta izoforma aktyny lokalizuje się w ciele komórki, z jakimi białkami wiążącymi „klasyczne” izoformy aktyny zajmuje ona te same lokalizacje wewnątrzkomórkowe. Wyniki tych eksperymentów mogą stanowić pierwsze przesłanki, co do szlaków sygnałowych kontrolujących dynamikę np. tworzenia przez actbl2 filamentów, a co za tym idzie ruch komórki. 3. Poprzez zastosowanie odpowiednich metod znakowania oraz rozdzielania mieszaniny białek w polu elektrycznym sprawdzimy, jak białko actbl2 jest modyfikowane po zsyntetyzowaniu (potranslacyjnie) go przez komórki w odpowiedzi na różne sygnały płynące ze środowiska. Modyfikacje potranslacyjne odpowiadają np. za degradację białek. W ten sposób dowiemy się np., jakim mechanizmom kontroli ilości białka w komórce podlega nowoodkryta izoformy aktyny. Podsumowując, rezultaty otrzymane z realizacji tego projektu dadzą wiedzę o nowoodkrytej, zupełnie niezbadanej izoformie aktyny, actbl2, która może mieć duże znaczenie dla ruchu komórek nowotworowych np. w tak niebezpiecznym nowotworze jak czerniak, charakteryzującym się dużym potencjałem metastatycznym. Aby zrealizować niniejszy projekt, zostaną użyte nowoczesne techniki biologii molekularnej, specjalne systemy do produkcji ludzkich białek, szereg testów biochemicznych oraz zaawansowane hodowle ludzkich komórek nowotworowych. Projekt ten będzie realizowany w Zakładzie Patologii Komórki Wydziału Biotechnologii Uniwersytetu Wrocławskiego. Wydział Biotechnologii ma kategorię A+ przyznaną przez Komitet Ewaluacji Jednostek Naukowych oraz jest częścią konsorcjum Wrocławskie Centrum Biotechnologii. Konsorcjum to otrzymało prestiżowy status KNOW (Krajowy Naukowy Ośrodek Wiodący) na lata 2014-2018. Realizacja niniejszego projektu zaowocuje wygenerowaniem nowego etatu dla osoby po doktoracie. Jedno z zadań będzie realizowane we współpracy z niemieckim ośrodkiem naukowym.