ĆWICZENIE Nr 2 BADANIE WŁASNOŚCI BIOSORPCYJNYCH

ĆWICZENIE Nr 2
BADANIE WŁASNOŚCI BIOSORPCYJNYCH DROśDśY
Saccharomyces cerevisiae
Uwaga: Ze względu na kontakt z materiałem biologicznym, studenci zobowiązani są uŜywać fartuchów i
jednorazowych rękawiczek.
Rosnące wymagania i coraz większa świadomość ekologiczna społeczeństwa
wymuszają badania nad coraz doskonalszymi metodami oczyszczania wód gruntowych, w
szczególności z metali cięŜkich emitowanych w ogromnych ilościach jak np. ołów, chrom czy
nikiel.
WyróŜnia się trzy mechanizmy opisujące biologiczne wiązanie metali: biosorpcja
(biologiczna adsorpcja) jonów metali na powierzchni mikroorganizmów, wychwyt
wewnątrzkomórkowy jonów metali oraz chemiczna przemiana jonów metali przez
mikroorganizmy. W oczyszczaniu wód gruntowych największe znaczenie ma biosorpcja,
poniewaŜ metale wiązane są najszybciej i w największej ilości.
Pojęcie biosorpcji jest pojęciem ogólnym, zawiera w sobie ogół procesów opisujących
wiązanie jonów metali, jak np. adsorpcja na powierzchni błon komórkowych, wymiana
jonowa, kompleksacja, itp. Znajdujące się w pobliŜu komórek mikroorganizmów jony metali
zbliŜają się do błony komórkowej i odwracalnie wiąŜą się z polarnymi grupami znajdującymi
się na jej powierzchni jak np. grupy hydroksylowe, karboksylowe, aminowe, fosforanowe itp.,
następnie dyfundują biernie przez błonę komórkową i wiąŜą się z polarnymi grupami
wewnątrz komórki. Zasadniczym ograniczeniem szybkości procesów biosorpcji jest dyfuzja
jonów metali przez błony komórkowe, która jest najczęściej procesem pasywnym. W
przypadku Ŝywych komórek, proces biosorpcji metali o podobnych własnościach
chemicznych jak te uczestniczące w metabolizmie moŜe odbywać się poprzez mechanizm
wymiany jonowej, moŜliwy jest równieŜ wychwyt jonów metali. Biosorpcja metali przez
martwą biomasę jest procesem coraz częściej stosowanym ze względu na szereg zalet jak np.
brak konieczności dostarczania substancji odŜywczych, oraz moŜliwość stosowania biomasy,
która jest odporna na obecne w wodach substancje toksyczne.
W badaniu biosorpcji chromianów (zółte) i dichromianów (pomarańczowe) naleŜy
pamiętać o równowadze zaleŜnej od pH występującej w tych układach:
2 CrO42-(aq) + 2 H+ (aq)
Cr2O72-(aq) + H2O
Własność T. Ruman. Obiekt objęty prawem autorskim. Zakaz modyfikowania
1
1. Przygotowanie biomasy S. cerevisiae
a). Przygotować poŜywkę hodowlaną, 1000 ml zawiera:
•
6g ekstraktu z droŜdŜy
•
15g sacharozy
•
0,52g MgSO4.7H2O
•
3g K2HPO4
•
3,76g NaH2PO4
•
3,35g (NH4)2SO4
•
0,017g CaCl2.4H2O
Doprowadzić pH poŜywki do 4,5 za pomocą H2SO4 lub NaOH i zautoklawować
(temp. 121oC, czas ok. 45 min).
b) Inokulować poŜywkę (100 ml) komórkami droŜdŜy (około 100 µg). Hodowlę droŜdŜy
prowadzić w 30oC przez 24h w łaźni wodnej z wytrząsaniem.
c) 24 godzinną hodowlę naleŜy odwirować (10min, 2500rpm), przemyć dwukrotnie wodą
destylowaną i po odwirowaniu suszyć w 100oC przez 24h.
d) Przygotować próbki badane przez wprowadzenie 0,1g suchej biomasy do 10ml wody
destylowanej. Otrzymaną zawiesinę stosować bezpośrednio w badaniu biosorpcji
(punkt 4).
2. Przygotowanie roztworów metali
a) Przygotować 200 ml roztworu K2Cr2O7 (rozpuszczając w 1000ml wody destylowanej
10g K2Cr2O7)
b) W probówkach typu falkon przygotować roztwory soli K2Cr2O7 o odpowiednich pH
(pH poszczególnych roztworów doprowadzić do odpowiednich wartości za pomocą
NaOH i H2SO4):
•
20 ml roztworu K2Cr2O7, pH = 2
•
20 ml roztworu K2Cr2O7, pH = 4
•
20 ml roztworu K2Cr2O7, pH = 5
•
20 ml roztworu K2Cr2O7, pH = 6
•
20 ml roztworu K2Cr2O7, pH = 7
•
20 ml roztworu K2Cr2O7, pH = 9
•
20 ml roztworu K2Cr2O7, pH = 12
Własność T. Ruman. Obiekt objęty prawem autorskim. Zakaz modyfikowania
2
3. Przygotowanie krzywej wzorcowej
a) Aby otrzymać krzywą wzorcową naleŜy sporządzić roztwory soli chromu o
następujących stęŜeniach: 10; 1; 0,5; 0,1; 0,05; 0,01g/l K2Cr2O7
Roztwory o podanych stęŜeniach otrzymać wg poniŜszej tabeli:
Odczynnik\StęŜenie
końcowe dla Cr
0g/l
0,01g/l
0,05g/l
0,1g/l
0,5g/l
1g/l
10g/l
Woda destylowana [ml]
5
4,995
4,975
4,95
4,75
4,5
0
Wyjściowy roztwór soli
Cr [ml]
0
0,005
0,025
0,05
0,25
0,5
5
b) Wykonać pomiary spektrofotometryczne przy długości fali 430nm, jako próbę ślepą
uŜyć roztworów nie zawierających jonów metali.
4. Badanie biosorpcji
1. Do 1 ml zawiesiny droŜdŜy w probówce typu falkon dodać 10 ml odpowiednich
roztworów soli chromu,
2. Mieszaniny wytrząsać przez 1h w temperaturze pokojowej,
3. Próbki odwirować (7000 rpm, 3 min), oddzielić supernatant (probówki typu falcon)
4. Doprowadzić pH supernatantu do 3,0
5. Uzyskane próbki poddać badaniu metodą UV-VIS przy długości fali 430nm, jako
próbę ślepą zastosować wodę destylowaną,
6. Sporządzić wykres zaleŜności absorbancji od stęŜenia jonów metali, wyznaczyć
uzyskane stęŜenia jonów dichromianowych oraz uzasadnić otrzymane wyniki.
Odczynniki
•
PoŜywka dla droŜdŜy (6g ekstraktu z droŜdŜy; 15g sacharozy; 0,52g MgSO4.7H2O; 3g K2HPO4; 3,76g
NaH2PO4; 3,35g (NH4)2SO4; 0,017g CaCl2.4H2O)
•
StęŜony roztwór H2SO4,2M roztwór NaOH,
•
K2Cr2O7
•
DroŜdŜe
Literatura Özer, A., Özer, D., „Comparative study of biosorption of Pb(II), Ni(II) and Cr(VI) ions onto S.
cerevisiae: determination of biosorption heats” Journal of Hazardous Materials (2003) 219-229
Własność T. Ruman. Obiekt objęty prawem autorskim. Zakaz modyfikowania
3