prace oryginalne - Dental and Medical Problems

prace oryginalne
Dent. Med. Probl. 2010, 47, 2, 177–181
ISSN 1644-387X
© Copyright by Wroclaw Medical University
and Polish Dental Society
Agnieszka Wójtowicz, Anna Malm
Wpływ chlorheksydyny in vitro na tworzenie biofilmu
przez drożdżaki Candida albicans kolonizujące
ontocenozę jamy ustnej
Influence of Chlorhexidine in vitro on the Ability of Biofilm Formation
of Candida albicans Isolates from Oral Cavity
Katedra i Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej z Pracownią Diagnostyki Mikrobiologicznej
Uniwersytetu Medycznego w Lublinie
Streszczenie
Wprowadzenie. Biofilm jest czynnikiem patogenności wielu drobnoustrojów, w tym również mikroflory kolonizującej jamę ustną, która może być czynnikiem etiologicznym tzw. zakażeń stomatologicznych. Zakażenia te mają
charakter endogenny, przewlekły i często nawracający ze względu na naturalną oporność drobnoustrojów tworzących biofilm na antyseptyki, chemioterapeutyki czy antybiotyki. Jednym z czynników etiologicznych zakażeń
stomatologicznych mogą być drożdżaki z rodzaju Candida, głównie Candida albicans.
Cel pracy. Ocena wpływu chlorheksydyny in vitro na fazę adhezji szczepów C. albicans kolonizujących ontocenozę
jamy ustnej; faza ta jest niezbędnym etapem dla wytworzenia biofilmu.
Materiał i metody. Ocenie poddano 50 szczepów C. albicans mających zdolność tworzenia biofilmu, wyizolowanych z ontocenozy jamy ustnej zdrowych osób. Oznaczano MIC chlorheksydyny (najmniejsze stężenie hamujące) dla komórek planktoidalnych C. albicans mikrometodą podwójnych rozcieńczeń oraz MBIC chlorheksydyny
(minimalne stężenie hamujące powstanie biofilmu), z użyciem MTT oraz menadionu; w obu metodach stosowano
polistyrenowe 96-dołkowe płytki titracyjne.
Wyniki. Zakres wartości MIC chlorheksydyny dla komórek C. albicans w formie planktoidalnej wynosił 0,00075–
–0,006%, a zakres wartości MBIC chlorheksydyny dla komórek tworzących biofilm wynosił 0,00075–0,0048%.
Wnioski. Potwierdzono skuteczność obecnie stosowanych w profilaktyce stomatologicznej preparatów zawierających chlorheksydynę w stężeniach (0,1–2%), obejmujących swoim spektrum zarówno komórki C. albicans w formie planktoidalnej, jak i tworzące biofilm (Dent. Med. Probl. 2010, 47, 10, 177–181).
Słowa kluczowe: chlorheksydyna, biofilm, zakażenia stomatologiczne, Candida albicans.
Abstract
Background. Biofilm is an important factor responsible for pathogenicity of many microorganisms, including the
microflora colonizing oral cavity, which can be regarded as potential etiological agent of dental infections. These
infections are endogenous, chronic and frequently recurrent due to the natural resistance of microorganisms forming a biofilm to antiseptics, chemiotherapeutics or antibiotics. One of the etiological agents of dental infections may
be the yeasts from the genus Candida, mainly C. albicans.
Objectives. The aim of this study was to assess the influence of chlorhexidine in vitro on adhesion of C. albicans
isolates from oral cavity, adhesion phase being a necessary step of biofilm production.
Material and Methods. A total of 50 C. albicans strains with the ability to form a biofilm were isolated from the
oral cavity of healthy people. Determination of chlorhexidine MIC (minimum inhibitory concentration) for C.
albicans planktonic cells were performed by microdilution method, while that of chlorhexidine MBIC (minimal
biofilm inhibitory concentration) was performed using MTT and menadione; in both methods the polystyrene
96-well titration plates were used.
Results. MIC of chlorhexidine for C. albicans cells in the planktonic form ranged from 0.00037–0.006%, while
MBIC of chlorhexidine for biofilm forming cells ranged from 0.00075–0.048%.
Conclusions. The results confirm the efficacy of dental preparations containing chlorhexidine in concentrations
(0.1–2%) active against either planktonic or biofilm forming cells of C. albicans (Dent. Med. Probl. 2010, 47, 10,
177–181).
Key words: chlorhexidine, biofilm, dental infections, Candida albicans.
178
Biofilm jest czynnikiem patogenności wielu
drobnoustrojów, w tym również mikroflory kolonizującej jamę ustną, która może być czynnikiem
etiologicznym tzw. zakażeń stomatologicznych [1].
Zakażenia te mają charakter endogenny, przewlekły i często nawracający ze względu na naturalną
oporność drobnoustrojów tworzących biofilm na
antyseptyki, chemioterapeutyki czy antybiotyki.
Jednym z czynników etiologicznych tych zakażeń
mogą być drożdżaki z rodzaju Candida, głównie
Candida albicans. Szacuje się, iż w ontocenozie jamy ustnej osób zdrowych nosicielstwo tych
drożdżaków wynosi 40–75% [2]. W sprzyjających
warunkach mogą być czynnikiem etiologicznym
stanów zapalnych błony śluzowej jamy ustnej oraz
periodontopatii.
Biofilm Candida spp. jest strukturą zbudowaną z różnych form morfologicznych komórek
drożdżaków (blastospor, pseudostrzępek, strzępek), przylegających do powierzchni ożywionej
lub nieożywionej oraz do siebie nawzajem. Struktura ta jest otoczona polisacharydową substancją
pozakomórkową [3, 4]. Tworzenie się biofilmu jest
procesem złożonym i wielostopniowym. Pierwsza
faza – adhezja – jest związana z niespecyficznymi
oddziaływaniami fizycznymi, a następnie specyficznymi oddziaływaniami chemicznymi między
strukturami powierzchniowymi komórek drożdżaków a ligandami obecnymi na kolonizowanym
podłożu. Jest to niezbędny etap dla powstania biofilmu [5].
Chlorheksydyna jest wykorzystywana w praktyce lekarskiej już od 1957 roku, jako jeden z najczęściej używanych antyseptyków w stomatologii.
Wyniki wielu prac potwierdzają jej najszerszy zakres działania przeciwgrzybiczego w porównaniu
do innych antyseptyków stosowanych w stomatologii; wyróżnia się szczególnie dużą skutecznością
w stosunku do C. albicans [6]. Udowodniono również jej właściwości przeciwbakteryjne w stosunku
do większości bakterii bytujących w jamie ustnej
[6–8]. Chlorheksydyna, należąca do grupy bisguandiów, ma silny ładunek dodatni, co powoduje łączenie się tego antyseptyku z ujemnie naładowaną
błoną komórkową drożdżaków, prowadząc do zaburzeń osmotycznych i lizy komórki. Związek ten
ma również zdolność do łączenia się z powierzchnią błony śluzowej jamy ustnej i pelikulą na powierzchni zębów, stopniowo ulegając uwalnianiu,
przedłużając swoje działanie antyseptyczne nawet
do 24 godzin [6, 9–11]. Chlorheksydyna występuje
w postaci płynnej, jako wodny roztwór dwuglukonianu chlorheksydyny, ale również jako składnik preparatów złożonych, jest dostępna w postaci
kremów, lakierów, żeli i tabletek do ssania.
Chlorheksydyna jest ważnym środkiem wspomagającym w leczeniu stanów zapalnych przy-
A. Wójtowicz, A. Malm
zębia, profilaktyce próchnicy oraz w leczeniu
kandydozy jamy ustnej, jako uzupełnienie terapii
antymikotykami. Liczne doniesienia wskazują na
jej szczególną rolę w leczeniu endodontycznym.
Celem tego leczenia jest uzyskanie wolnego od
drobnoustrojów światła kanału korzeniowego,
gdzie poza mechanicznym opracowaniem kanału używa się wielu środków do płukania kanału,
w tym chlorheksydynę [2, 6, 9, 10]. Antyseptyk
ten znalazł zastosowanie również jako składnik
wkładki dokanałowej i środek do dezynfekcji materiałów stosowanych do wypełnienia kanałów.
Fakt łączenia się z twardymi tkankami zębów
umożliwia uzyskanie długotrwałego dużego stężenia leku w kanale korzeniowym, co przyczynia
się do zwiększenia skuteczności terapii. Kolejną
ważną cechą jest jej mała szkodliwość dla tkanek
okołowierzchołkowych i brak działania toksycznego. Chlorheksydyna skutecznie eliminuje Enterococcus faecalis oraz C. albicans, które aż w 75%
przypadków są odpowiedzialne za rekolonizację
kanału i niepowodzenia w leczeniu endodontycznym, dlatego też w tych sytuacjach klinicznych jest
polecane zastosowanie 2% chlorheksydyny [11].
Celem pracy była ocena wpływu chlorheksydyny in vitro na fazę adhezji, będącą niezbędnym
etapem dla wytworzenia biofilmu przez szczepy
C. albicans izolowane z ontocenozy jamy ustnej.
Materiał i metody
Materiał biologiczny
W badaniach użyto 50 szczepów C. albicans
o potwierdzonej zdolności do tworzenia biofilmu,
wyizolowanych z ontocenozy jamy ustnej zdrowych osób z różnych grup wiekowych. Osoby
uczestniczące w badaniach lub ich opiekunowie
wyrazili zgodę na pobranie wymazu z błony śluzowej jamy ustnej. Materiałem wyjściowym była
18 h hodowla drożdżaków w temp. 37oC w płynnym podłożu Sabourauda suplementowanym
100 mM glukozą.
Określenie najmniejszego
stężenia hamującego
chlorheksydyny wobec komórek
planktoidalnych C. albicans
Wartości MIC (minimal inhibitory concentration) chlorheksydyny dla komórek planktoidalnych C. albicans zostały oznaczone mikrometodą
seryjnych rozcieńczeń w podłożu płynnym Sabourauda, z użyciem polistyrenowych 96-dołkowych
płytek titracyjnych. Wykonywano wiele seryjnych
179
Chlorheksydyna in vitro a adhezja C. albicans
rozcieńczeń chlorheksydyny w płynnym podłożu Sabourauda i do każdego dołka na płytce
titracyjnej dodawano 2 µl zawiesiny badanych
drożdżaków o gęstości 0,5 w skali McFarlanda,
przygotowanej w tym samym podłożu. Następnie
płytki inkubowano 48 h w temp. 37­­oC, po czym
dokonywano odczytu absorbancji przy długości fali 490 nm (A490) za pomocą czytnika ELISA
ELx800 (BioTek). Za wartość MIC chlorheksydyny uznawano najmniejsze stężenie, przy którym
nie obserwowano wzrostu drożdżaków w postaci
zmętnienia, w porównaniu z próbą kontrolną zawierającą tylko podłoże Sabourauda oraz antyseptyk. Dla każdego szczepu oznaczenie wartości
MIC wykonywano w dwóch powtórzeniach.
Określenie najmniejszego
stężenia chlorheksydyny
hamującego fazę adhezji
w trakcie formowanie się
biofilmu C. albicans
(MBIC – minimal biofilm
inhibitory concentration)
W celu określenia wpływu chlorheksydyny na
fazę adhezji wykorzystywano również 96-dołkowe płytki titracyjne oraz MTT-bromek 3-(4,5-dimetylo-2-tiazolilo)-2,5-difenylo-2H tetrazoliowy.
Z użyciem płytek titracyjnych wykonywano wiele
seryjnych rozcieńczeń chlorheksydyny w płynnym
podłożu Sabourauda. Wyjściowe stężenia chlorheksydyny wynosiły od 0,25 × MIC do 4 × MIC
oznaczonych dla komórek planktoidalnych C. albicans. Na płytki titracyjne nanoszono 100 µl
50
zawiesiny badanych drożdżaków o gęstości 4 w skali McFarlanda, przygotowanej w tym samym podłożu. Płytki inkubowano 1,5 h w temp. 37oC w celu zahamowania adhezji komórek drożdżaków.
Po fazie adhezji odpłukiwano płytki dwukrotnie
za pomocą PBS (zbuforowanej soli fizjologicznej),
usuwając komórki, które nie uległy adhezji oraz
antyseptyk. Następnie dodawano 100 µl podłoża
Sabourauda suplementowanego 100 mM glukozą
i inkubowano 48 h w temp. 37oC. Po trzykrotnym
przemyciu powstałego biofilmu z użyciem PBS
dodawano 40 µl MTT o stężeniu 1 mg/ml, 2 µl
0,4 mM roztworu menadionu oraz 158 µl PBS,
w celu wizualizacji powstałego biofilmu. MTT redukuje się do fioletowego formazanu, co jest wyrazem aktywności dehydrogenazy mitochondrialnej
żywych komórek. Po 3 h inkubacji w temp. 37oC
dokonywano pomiaru absorbancji przy długości fali 490 nm (A490) za pomocą czytnika ELISA
ELx800 (BioTek) po przeniesieniu 100 µl roztworu
do pustego dołka płytki titracyjnej [12]. Za wartość MBIC chlorheksydyny uznawano najmniejsze
stężenie, przy którym wartość A490 była porównywalna z wartością A490 próby kontrolnej (podłoże Sabourauda z antyseptykiem). Dla każdego
szczepu oznaczenie wartości MBIC wykonywano
w dwóch powtórzeniach.
Wyniki
Jak wskazuje ryc. 1, zakres wartości MIC dla komórek C. albicans w formie planktoidalnej wynosił
0,00037–0,006%, a zakres wartości MBIC chlorheksydyny dla komórek tworzących biofilm, czyli stężeń
hamujących fazę adhezji, wynosił 0,00075–0,048%.
komórki planktoidalne
planktonic cells
biofilm
45
liczba szczepów
number of strains
40
35
30
25
Ryc. 1. Porównanie
aktywności chlorheksydyny in
vitro wobec komórek Candida
albicans planktoidalnych
(MIC) i tworzących biofilm
(MBIC)
20
15
10
5
0
0,00037
0,00075
0,0015
0,003
0,006
0,012
stężenie chlorheksydyny (%)
chlorhexidine concentration (%)
0,024
0,048
Fig. 1. Comparison of chlorhexidine activity in vitro
against planktonic (MIC) and
biofilm forming (MBIC) cells
of Candida albicans
180
A. Wójtowicz, A. Malm
Tabela 1. Porównanie aktywności chlorheksydyny in
vitro wobec komórek Candida albicans planktoidalnych
i tworzących biofilm
Table 1. Comparison of chlorhexidine activity in vitro
against planktonic and biofilm forming cells of Candida
albicans
Parametry
(Parameters)
Stężenie chlorheksydyny
(Chlohexidine concentration)
%
MIC50
0,00075
MIC90
0,003
Zakres MIC
0,00037–0,006
MBIC50
0,003
MBIC90
0,006
Zakres MBIC
0,00075–0,048
Zgodnie z danymi przedstawionymi w tabeli 1,
wartość MBIC50,­­ czyli stężenia hamującego fazę
adhezji 50% szczepów, była 4-krotnie wyższa niż
wartość MIC50­­dla komórek planktoidalnych, czyli
stężenia hamującego wzrost 50% szczepów. Wartość MBIC90 (stężenie hamujące fazę adhezji 90%
szczepów) była dwukrotnie wyższa od wartości
MIC90 dla komórek planktoidalnych (stężenie hamujące wzrost 90% szczepów).
Omówienie
Jednym z czynników etiologicznych zakażeń
stomatologicznych mogą być drożdżaki z rodzaju
Candida, głównie C. albicans. Drożdżak ten jest
uważany za jeden z najważniejszych drobnoustrojów odpowiedzialnych za niepowodzenia w leczeniu endodontycznym [2, 6]. Chlorheksydyna odznacza się najwyższą skutecznością w porównaniu
do innych preparatów stosowanych w eradykacji
tego drożdżaka z kanałów zębowych. W leczeniu
endodontycznym stosuje się stężenia tego antyseptyku 0,02–2%, do odkażania jamy ustnej są zalecane stężenia 0,1–0,2%, a do odkażania płytkowych
uzupełnień protetycznych 0,2–1% [6]. Wiadomo,
iż C. albicans będący przyczyną zakażeń stomatologicznych znajduje się nie tylko na płytce nazębnej, ale także na grzbietowej części języka czy
na błonie śluzowej policzków, a najważniejszym
czynnikiem wirulencji tych drożdżaków jest zdolność tworzenia biofilmu. Zjawisko formowania
biofilmu jest obecnie poważnym problemem stomatologicznym, a poszukiwanie substancji aktywnych wobec biofilmu jest pilną potrzebą współczesnej stomatologii; istnieje konieczność stosowania
odpowiednich antyseptyków jako uzupełnienie
mechanicznych zabiegów usuwania biofilmu.
W badaniach własnych oceniono wpływ
chlorheksydyny – najpopularniejszego w stomatologii antyseptyku – na fazę adhezji szczepów
C. albicans izolowanych z ontocenozy jamy ustnej. Na pierwszym etapie pracy określono wrażliwość na chlorheksydynę komórek planktoidalnych C. albicans (MIC = 0,00037–0,006%).
Przedstawione wyniki zgodne są z danymi innych autorów. Wg Patel et al. [13] zakres MIC
chlorheksydyny dla tego typu komórek wynosił
0,008–0,16 mg\ml (0,0008–0,016%). Doniesienia
te oraz wyniki własne potwierdzają skuteczność
stężeń tego antyseptyku stosowanych w preparatach stomatologicznych wobec komórek planktoidalnych C. albicans.
Liczne dane z piśmiennictwa wskazują również na skuteczność chlorheksydyny w stosunku do
biofilmu, tworzonego przez różne drobnoustroje,
w tym przez C. albicans [6, 7, 14, 15]. Wrażliwość
biofilmu C. albicans na ten antyseptyk zależy jednak od stopnia dojrzałości tej struktury. Badania
korelacji między stopniem dojrzałości biofilmu
a MIC chlorheksydyny wskazują, iż wraz z dojrzewaniem biofilmu wartości te rosną, a struktura
dojrzałego biofilmu może wykazywać całkowitą
oporność na ten antyseptyk nawet w stężeniu
2% [16]. Dane przedstawione w niniejszej pracy
wskazują na skuteczność działania chlorheksydyny na fazę adhezji, stanowiącą wstępny etap
tworzenia biofilmu, już w stężeniach ≤ 0,048%.
Różnice w stężeniach chlorheksydyny hamujących tworzenie biofilmu w zależności od stopnia
jego rozwoju mogą być wynikiem oddziaływania
chlorheksydyny jedynie na powierzchniowe warstwy biofilmu i jej ograniczonej penetracji w tę
strukturę [17].
Należy zwrócić uwagę na monitorowanie
oporności szczepów C. albicans na ten antyseptyk ze względu na powszechność jego stosowania
i długi czas aplikacji sprzyjający selekcji szczepów
o obniżonej wrażliwości. Zjawisko narastania
oporności wobec chlorheksydyny opisywano np.
po długotrwałych 2-tygodniowych cyklach leczniczych.
Wnioski
Uzyskane rezultaty potwierdzają skuteczność
obecnie stosowanych w profilaktyce stomatologicznej preparatów zawierających chlorheksydynę w stężeniach obejmujących swoim spektrum
zarówno komórki C. albicans w formie planktoidalnej, jak i tworzące biofilm. Należy jednak monitorować stopień oporności szczepów C. albicans
na ten powszechnie używany antyseptyk w stomatologii.
Chlorheksydyna in vitro a adhezja C. albicans
181
Piśmiennictwo
[1] Suci P. A., Tyler B. J.: Action of chlorhexidine digluconate against yeast and filamentous forms in an early stage
Candida albicans biofilm. Antimicrob. Agents. Chemother. 2002, 46, 3522–3531.
[2] Miranda T. T., Vianna C. R., Rodrigues L., Monteiro A. S., Rosa C. A., Correa A.: Diversity and frequency
of yeasts from the dorsum of the tongue ad necrotic root canals associated with primary apical periodontitis. Int.
Endod. J. 2009, 42, 839–844.
[3] Mnichowska-Polanowska M., Giedrys-Kalemba S.: Metody i techniki stosowane w badaniach nad biofilmem
Candida. Mikol. Lek. 2009, 16, 238–244.
[4] Dorocka-Bobkowska B., Konopka K.: Powstawanie biofilmu Candida i jego znaczenie w patogenezie zakażeń
przewlekłych – przegląd piśmiennictwa. Dent. Med. Prob. 2003, 40, 405–410.
[5] Strużycka I., Stępień I.: Biofilm – nowy sposób rozumienia mikrobiologii. Nowa Stomatol. 2009, 14, 3, 85–89.
[6] Mohammadi Z., Abbott P.: The properties and applications of chlorhexidine in endodontics. Int. Endod. J. 2009,
42, 288–302.
[7] Takeuchi Y., Guggenheim B., Filieri A., Baehni P.: Effect of chlorhexidine/thymol and fluoride varnishes on
dental biofilm formation in vitro. Eur. J. Sci. 2007, 115, 468–472.
[8] Filoche S. K., Soma K., Sissons C. H.: Antimicrobial effects of essential oils in combination with chlorhexidine
digluconate. Oral Microbiol. Immuol. 2005, 20, 221–225.
[9] Malicka B., Ziętek M., Grzebieluch W.: Zastosowanie chlorheksydyny w stomatologii. Dent. Med. Prob. 2005,
42, 497–505.
[10] Turk B. T., Sen B. H., Ozturk T.: In vitro antimicrobial activity of calcium hydroxide with different vehicles
against Enterococcus faecalis and Candida albicans. J. Endod. 2007, 108, 297–301.
[11] Wujec P., Pawlicka H.: Standardowe środki płuczące polecane w leczeniu endodontycznym – przegląd piśmiennictwa. Dent. Med. Probl. 2008, 45, 466–472.
[12] Zaw M. T., Samaranayake Y. H., Samaranayake L.P.: In vitro biofilm formation of Candida albicans and nonalbicans Candida species under dynamic and anaerobic conditions. Arch. Oral Biol. 2007, 52, 761–767.
[13]Patel M., Coogan M.: Antifungal activity of the plant Dodonaea viscose var. angustifolia on Candida albicans
from HIV-infected patients. J. Ethnopharmacol. 2008, 118, 173–176.14.
[14]Redding S., Bhatt B., Rawls R., Siegel G., Scott K., Lopez-Ribot J.: Inhibition of Candida albicans biofilm
formation on denture material. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. 2009, 107, 669–672.
[15]Pusateri C., Monaco E., Edgerton M.: Sensitivity of Candida albicans biofilm cells grown on denture acrylic to
antifungal proteins and chlorhexidine. Arch. Oral Biol. 2009, 54, 588–594.
[16]Chandra J., Kuhn D. M., Mukherjee P. K., Hoyer L. L., McCormick T., Ghannoum M. A.: Biofilm formation
by the fungal pathogen Candida albicans: development, architecture, and drug resistance. J. Bacteriol. 2001, 183,
5385–5394.
[17] Kittel E., Kamysz E., Bartoszewicz M., Junka A., Smutnicka D., Mączyńska B., Kamysz W., Kittel M.:
Biofilm infekcyjny i płytka bakteryjna w zapaleniu przyzębia i tkanek okołowierzchołkowych: procedury zabiegowe i okołozabiegowe ograniczające rekolonizację – wyniki badań. Sepsis 2009, 2, 237–240.
Adres do korespondencji:
Agnieszka Wójtowicz
ul. Chodźki 1
20-093 Lublin
tel./faks: +48 81 742 37 72
e-mail: [email protected]
Praca wpłynęła do Redakcji: 4.06.2010 r.
Po recenzji: 21.06.2010 r.
Zaakceptowano do druku: 21.06.2010 r.
Received: 4.06.2010
Revised: 21.06.2010
Accepted: 21.06.2010