"Rybozymy. RNA - nośnik informacji i narzędzie katalizy

Marek Kudła
Rybozymy
RNA – nośnik informacji i narzędzie
katalizy enzymatycznej
Właściwości RNA umożliwiające katalizę
enzymatyczną
• Możliwość tworzenia skomplikowanej
struktury II i III rzędowej przez parowanie
krótkich odcinków w obrębie cząsteczki.
• Tworzenie niestandardowych par zasad.
• Obecność grupy hydroksylowej przy węglu
2` rybozy.
• Możliwość koordynacji kationów metali
dwuwartościowych.
Rodzaje znanych rybozymów
Rybozym
Liczba znanych przykładów
Rozmiar
Hammerhead
HDV
Hairpin
Varkud sattelite
Intron grupy I
Intron grupy II
11
2
1
1
>1500
>900
40
90
70
160
210
500
Rnaza P
>500
300
Spliceosom
(U2+U6 snRNA)
70, 50
180, 100
Rybosom
(23 S rRNA)
>900
2600
Właściwości i pochodzenie rybozymów
naturalnych.
• Hammerhead, Hairpin, VS i HDV są rybozymami występującymi w
wirusach i katalizują reakcję specyficznego (uzależnionego od
sekwencji) przecięcia nici RNA uczestnicząc w procesie
namnażania się wirusa.
• RNAza P jest nukleoproteiną, w której RNA tworzy centrum
reakcji, a białko odpowiada za utrzymanie RNA w aktywnej
konformacji.
• Jedynie 23S rRNA przeprowadza odmienną reakcję – tworzenie
wiązania peptydowego.
• Rybozymy uzyskane metodą ukierunkowanej ewolucji in vitro
potrafią przeprowadzać bardzo różnorodne reakcje enzymatyczne.
•Hammerhead
•Hairpin
•HDV
•VS
Hairpin
HDV
Hammerhead
Mechanizm reakcji transestryfikacji
katalizowanej przez rybozymy naturalne
Ogólny mechanizm reakcji
transestryfikacji na przykładzie rybozymu
typu Hammerhead
Kwasy i zasady Lewisa w cząsteczkach
rybozymów – porównanie z enzymami
białkowymi.
W przypadku enzymów białkowych (np. RNAza S) resztą
aminokwasową pełniącą rolę kwasu lub zasady Lewisa jest
najczęściej histydyna, której pKa≈7 , co oznacza, że w
pH=7 w przybliżeniu tyle samo cząsteczek jest
zjonizowanych (i ma właściwości kwasowe), co
niezjonizowanych (z właściwościami zasadowymi).
A:H+ - kwas Lewisa
:B – zasada Lewisa
Porównanie pKa zasad
azotowych z pKa grup bocznych
aminokwasów
Widok centrum reakcji rybozymu
Hairpin z wskazaniem zasad
uczestniczących w stabilizacji
stanu przejściowego.
P
2’OH
Stan przejściowy reakcji dla intronu grupy
I Tetrahymena
Strzałkami zaznaczono kationy
metali uczetniczące w stabilizacji
stanu przejściowego.
Zastosowania rybozymów
• Systemy badawcze służące do wyciszania genów
przez specyficzne przecięcie produkowanego przez
gen mRNA.
• Możliwe zastosowanie w terapii
przeciwretrowirusowej.
• Leczenie chorób związanych z ekspansją trójek
nukleotydowych i anomalnymi długościami
transkryptu np. w chorobie Huntingtona lub
dystrofii mięśniowej.
Podstawowe problemy w zastosowaniu
rybozymów
• Wektory dla rybozymów.
• Uzyskanie kolokalizacji rybozymów z
docelowym mRNA.
• Konieczność uwzględnienia interakcji
mRNA z białkami, które mogą blokować
dostęp rybozymów do miejsc w kwasie
nukleinowym przeciw którym są
skierowane.
U16Rz – rybozym do
którego wstawiono
sekwencje pochodzące z
U16 snRNA.
Wykazuje on taką samą
lokalizację jak U3
snRNA na terenie jądra.
Uzyskane wyniki
świadczą o możliwości
sterowania lokalizacją
cząsteczek RNA.
Introny grupy I i II
*
Splicing autokatalityczny
intronów grupy I i II **
szczegóły
* - GTP inicjujące
reakcję transestryfikacji
** - aktywna reszta
adeniny decydująca o
właściwościach
katalitycznych.
linie ciągłe – introny
linie przerywane - egzony
C5
Aktywność transferazowa intronu L19
RNA IVS
C4
C5
C6
Aktywność polimerazowa
intronu L21 RNA Sca1
Polimeryzacja DNA katalizowana przez
rybozym
• Wycięty intron grupy II genu bI1
pochodzący z Saccharomyces cerevisiae ma
zdolność do katalizowania polimeryzacji
DNA in vitro.
• Reakcja przebiega w kierunku 3` 5`.
• Poszczególne deoksyrybonukleotydy są
włączane do powstającej cząsteczki ze
zróżnicowaną efektywnością.
Aktywność ligazy
Aktywność polimerazy DNA
Efektywność inkorporacji poszczególnych
deoksyrybonukleotydów
Samoreplikujący się rybozym
• Rybozym R3C o aktywności ligazy, która katalizuje tworzenie
się wiązania 3`-5` fosfodiestrowego otrzymany drogą ewolucji
in vitro.
• Rybozym ten został przekonstruowany tak, by katalizował
reakcję łączenia się dwóch substratów oligonukleotydowych w
produkt będący identyczny z rybozymem.
• Substraty są rozpoznawane dzięki komplementarnemu łączeniu
się z rybozymem służącym jako matryca.
Kompleks rybozymu R3C z substratami
Miejsce ligacji
substratów
A+B T
Cykl autoreplikacji rybozymu R3C
Szybkość reakcji ligacji katalizowanej
przez rybozym R3C
Ukierunkowana ewolucja in vitro a
rybozym R3C
Ewolucja in vitro
• Uleganie ewolucji według
zasad Darwinowskich.
• Replikacja przeprowadzana jest
przez cząsteczki, które nie są
częścią ewoluującego systemu.
Rybozym R3C
• Ze względu na prostotę reakcji
przeprowadzanej przez R3C nie
podlega on ewolucji.
• Rybozym katalizuje reakcję
autoreplikacji.
Żaden z tego rodzaju systemów nie odzwierciedla
prawdopodobnych pierwotnych etapów ewolucji życia na Ziemi.
Rybozym, który mógłby funkcjonować jako pełny model
samopowielających się molekuł z ery świata RNA musiałby
posiadać właściwości charakterystyczne dla obu tych systemów.
Transferaza peptydylowa dużej
podjednostki rybosomu
• Centrum reakcji tworzenia wiązania peptydowego
jest cząsteczka 23S rRNA.
• Pomimo, że za katalityczną aktywność transferazy
odpowiada RNA, nie udało się jeszcze
skonstruować cząsteczki 23S rRNA, która
wykazywałaby aktywność w nieobecności
towarzyszących białek.
• Niezbędna do aktywności katalitycznej okazała się
sekwencja CCA na 3` końcu cząsteczek tRNA, a w
szczególności adenina.
Bibliografia:
1. „The chemical repertoire of natural ribozymes” J.A. Doudna,
T.R. Cech, Nature, lipiec 2002, vol.418, ss.222-228
2. „Intracellular ribozyme applications” D. Castanotto et alles,
Biochemical Society, 2002, ss.1140-1145
3. „After the ribosome structures: How does peptidyl
transferase work?” P.B. Moore, T.A. Steitz, RNA, 2003, ss.155159
4. „DNA polymerization catalysed by a group II intron RNA in
vitro” M. Hetzer, R.J. Schweyen, M.W. Mueller, Nucleic Acids
Research, 1997, Vol.25, No.9, ss.1841-1844
5. „Crystal structure of a hairpin ribozyme-inhibitor complex
with implications for catalisys” P.B. Rupert, A.R. FerréD’Amaré, Nature, kwiecień 2001, vol.410, ss.780-786
Bibliografia:
1. „In vitro evolution suggests multiple origins for the
hammerhead ribozyme” K. Salehi-Ashtiani, J. W. Szostak,
Nature, październik 2001, vol. 414, ss. 82-85
2. „A self-replicating ligase ribozyme” N. Paul, G. F. Joyce,
PNAS, październik 2002, vol. 99, no. 20, ss. 12733-12740
3. „Tajemnice ewolucji molekularnej” Aleksandra Kubicz, PWN
Warszawa-Wrocław 1999
4. „Biofizyka kwasów nukleinowych dla biologów” pod red.
Marii Bryszewskiej, Wandy Leyko, PWN Warszawa 2000