Raport z obecnych postępów: „Projekt naukowy

Raport z obecnych postępów: „Projekt naukowy: Badanie symetrii
dystrybucji inkluzji białkowych i jej wpływu na komórki normalne i
nowotworowe”
1.
Metody
1.1.
Hodowla komórek
Linie komórkowe HEK 293 i HeLa były hodowane na szalkach 96mm (Greiner) w
pożywce DMEM (Gibco) suplementowanej do 10% surowicą bydlęcą (Sigma), 5%
L-glutaminą (Sigma), i 5% antybiotykami – penicylina/streptomycyna (Gibco).
Komórki były trzymane w inkubatorze 37C, 5% CO2.
1.2.
Izolacja plazmidów
Bakterie E. coli (szczep LKB1) były transformowane otrzymanymi plazmidami za
pomocą szoku cieplnego i następnie wysiane na podłożu różnicującym. Otrzymane
kolonie były przenoszone do hodowli wytrząsanej w kolbach stożkowych i
pozostawione na 24 godziny w 37 stopniach. Plazmidy były izolowane z użyciem
kitu Plasmid Midi (A&A Biotechnology), a następnie sprawdzane za pomocą
odpowiednich enzymów restrykcyjnych.
1.3.
Transfekcja
Do komórek wysianych 24 godziny wcześniej na plastikowej szalce 35mm (Greiner)
w gęstości 50 tys./ml w 2 ml suplementowanej pożywki dodany został kroplami
odczynnik do transfekcji (TransIT [Mirus] + Opti-MEM + plazmid 1ug/ul). Po 5,5
godziny do pożywki dodawany był Hoechst 1:10000. Po 30’ pożywka była
zmieniana.
1.4.
Mikroskopia
Zdjęcia były wykonane na mikroskopie fluorescencyjnym Olympus. Zdjęcia timelapse były wykonane na mikroskopie Olympus w 10-minutowych odstępach
czasowych przez 24 godziny.
1.5.
Testy cytotoksyczności
Komórki były wysiewane na szalkach 12-dołkowych po 50 tys./dołek w 1 ml
suplementowanego DMEM. 24 godziny od wysiania dodawane były w odpowiednich
stężeniach substancje chemiczne – nokodazol (Sigma) i MG132 (Sigma). Po
kolejnych 24 godzinach pożywka znad komórek była zbierana do Falcona 15ml,
komórki odklejane trypsyną (Sigma), następnie liczone na komorze Thoma.
2.
Rezultaty
Dzięki uprzejmości naukowców z Polski, Europy i Kanady otrzymaliśmy potrzebne nam
plazmidy:
1.
pCyPrP- eGFP (Koduje białko prionowe bez kotwicy wiążącej z błoną [GPI anchor])
2.
pHtt119Q-eYFP (fragment egzonu 1 huntingtiny z dodatkowymi 119 powtórzeniami
glutaminy)
3.
pECΔF-eGFP (koduje białk CFTR [cystic fibrosis], z mutacją, która [ΔF508]
powoduje mukowiscydozę)
4.
pEC-eGFP (ten sam gen bez mutacji)
Wszystkie plazmidy zostały namnożone w bakteriach, efektywnie wyizolowane i
sprawdzone poprzez cięcie enzymami restrykcyjnymi.
Tranafekcja linii komórkowych HEK i HeLa ujawniła różnorodny fenotyp plazmidów.
Htt-119Q-EYFP (dalej nazywane Htt) wykazuje rozproszoną ekspresję w cytoplazmie do
około 24 godzin po transfekcji, gdy ilość białko zaczyna gwałtownie agregować w 1 duży
agregat o lokalizacji perinuklearnej (Rys. 1 A i B) za równo dla linii HEK jak i HeLa.
Obie formy białka CFTR lokują się w błonie komórkowej (Rys 1. C i D) w obu liniach
komórkowych natomiast CyPrP tworzy rozproszone, drobne inkluzje białkowe w
cytoplazmie a fenotyp różni się w zależności od linii, inkluzje są bardziej rozproszone i
drobniejsze dla HeLa (Rys 1. E) i większe oraz w mniejszej ilości dla HEK (Rys 1. F).
Po potraktowaniu komórek HEK i HeLa inhibitorem proteasomów MG-132 (2,5uM,4h)
fenotyp zmienił się w przypadku Htt z kilku na ponad 70% transfekowanych komórek
(Rys. 1 A), gdzie pojawił się wyraźny perinuklearnie zlokalizowany agregat, w miejscu
rozproszonej, cytoplazmatycznej ekspresji (Rys.2 B). Podobna zmiana nastąpiła w
komórkach HEK z transferowanych dowolną formą CFTR, gdy po potraktowaniu MG132
(1uM,
for 2h, 24h pt) pojawiły się perinuklearne agregaty (Rys. 2 B i C). Jedynie komórki HEK
wykazały wrażliwość na MG-132(1uM, 2h pt), którą można było zaobserwować
gwałtowną zmianą wyglądu i lokalizacji agregatów (Rys. 2 D), która była niewidoczna w
komórkach HeLa (Rys. 2 E).
Aby sprawdzić czy duże agregaty tworzone przez Htt119Q-EYFP są opisanymi wcześniej
agresomami został przeprowadzony test z użyciem nokodazolu. Ponieważ powstawanie
agresomów jest ściśle zależne od transportu mikrotubularnego, nie powinny one
powstawać w obecności nokodazolu, który niszczy cytoszkielet mikrotubularny. Po
dodaniu zarówno nokodazolu (0,1ug, 4h) jak i MG-132 (2,5uM, 4h) do pożywki komórek
HEK zaobserwowano znaczny spadek ilości agresomów (Rys. 3 A i B).
Wyniki analiz time-lapse nie zostały jeszcze do końca zanalizowane, jednakże wskazują
one na ogromne tempo agregacji Htt w warunkach stresowych, gdy białko z całej komórki
lokalizuje się perinuklearnie w jednym, dużym agregacie w ciągu 10 minut, czyli podczas
1 klatki na time-lapse (obserwacja).
Rysunek Fenotyp komórek transfekowanych wektorami ekspresyjnymi. (A) Komórka HeLa 12h po transfekcji pHtt119QEYFP (B) Komórki HeLa 36h po transfekcji pHtt119Q-EYFP. Fenotyp ekspresji (C) CFTR i (D) CFTRdF 24h po
transfekcji komórek HEK. Porównanie komórek (E) HEK i (F) HeLa 24h po transfekcji plazmidem pCyPrP-EGFP.
Rysunek Zmiany w komórkach transfekowanych plazmidami ekspresyjnymi po ekspozycji na działanie MG132. (A)
Ilościowa analiza zmian stosunku komórek z dużym, perinuklearnym agresomem do komórek z rozproszoną ekspresją w
komórkach HEK, 12h po transfekcji. (B) Przykładowe zdjęcie przestawiające agregaty w komórkach HEK po dodaniu
MG132. (C i D) Agregacja białek CFTR i CFTRdF po dodaniu MG132 w komórkach HEK. Komórki HEK (E) i HeLa (F)
po dodaniu MG132.
Rysunek Różnicaw fenotypie agregacji po dodaniu (A) MG132 (B) i MG132 razem z nokodazolem w komórkach HEK,
24h po transfekcji.
3.
Dyskusja
Według naszej wiedzy dotyczącej podejmowanych badań, po raz pierwszy zostały
zaobserwowane: dynamika formowania agresomów oraz zadziwiająca szybkość tego
procesu. Tempo tworzenia agresomów może wskazywać na wagę tego procesu dla
podtrzymania życia komórki w warunkach stresowych. Odnotowano także znaczącą
różnicę w fenotypie agregacji białka prionowego w komórkach prawidłowych i
nowotworowych. Jeżeli dane te zostaną potwierdzone dalszymi badaniami, będzie to
oznaczało, że komórki nowotworowe są upośledzone w formowaniu agresomów z
rozproszonych agregatów. Może to stanowić potencjalny cel dla terapii przeciwnowotworowych. Wstępne dane pokazują także, że produkt białkowy używany w
projekcie konstruktu kodującego fragment huntingtyny ma tendencję do gwałtownej
agregacji w postaci agresomu po przekroczeniu określonego stężenia lub/i w warunkach
stresowych. Z tego, co wiemy, obserwacje te nie zostały opisane w literaturze naukowej i
mogą mieć duże znaczenia dla rozwoju biologii i medycyny.
4.
Rozbudowa projektu
Niedawno (kwiecień 2012) została wykryta i scharakteryzowana subpopulacja komórek w
linii HeLa, która wykazuje liczne cechy komórek macierzystych (Zhang, 2012). Komórki
w tej subpopulacji cechują się wysoką ekspresją białka powierzchniowego Bcrp1 (Rys. 4
A) i usunięcie ich z hodowli powoduje wymarcie całej linii (Rys. 4 B).
Rysunek (A) Analiza cytometryczna linii HeLa wykazała obecność subpopulacji z wysoką ekspresją Bcrp1. (B) Pomiar
przeżywalności komórek w hodowli po usunięciu komórek z najwyższą ekspresją Bcrp1 (z Zhang, 2012).
Kupno tego przeciwciała i zastosowanie go w badanej linii umożliwiłoby ustalenie, czy
nowotworowe komórki macierzyste występujące w linii HeLa specyficznie pozbywają się
agregatów białkowych w porównaniu z resztą populacji. Czy podobna populacja jest
możliwa do znalezienia w linii HEK i czy występuje tam podobne zjawisko.
Aby dokładnie mierzyć wpływ trucizn takich jak MG132, nokodazol czy paklitaksel na
komórki prawidłowe i nowotworowe wymagany jest efektywny test cytotoksyczności.
Takim testem jest test MTT, w którym do pożywki komórek dodaje się barwnik MTT,
który jest metabolizowany przez mitochondria żywych komórek do fioletowego
formazanu, którego absorbancję można mierzyć na dowolnym spektrofotometrze przy
długości fali 570nm a następnie analizować ilościowo. Proste liczenie komórek nie daje
rzetelnych rezultatów.
Aby ustalić czy agregaty białkowe (zwłaszcza Htt i CFTR) są agresorami czy po prostu
dużymi agregatami potrzebny jest bardziej specyficzny test niż sprawdzenie skuteczności
działania nokodazolu. Jedną z bardziej specyficznych cech charakteryzujących agresomy
jest charakterystyczna klatka wimentynowa, która powstaje wokół agresomu. Zakup i
użycie przeciwciała na wimentynę umożliwiłoby jednoznaczne potwierdzenie czy dany
agregat jest agresomem.