Automatyczna analiza ilościowa cytologicznych obrazów
Transkrypt
Automatyczna analiza ilościowa cytologicznych obrazów
AUTOMATYCZNA ANALIZA ILOŚCIOWA CYTOLOGICZNYCH OBRAZÓW MIKROSKOPOWYCH WOJCIECH BIENIECKI, SZYMON GRABOWSKI Katedra Informatyki Stosowanej Politechniki Łódzkiej, Al. Politechniki 11, Łódź Streszczenie: Niniejszy artykuł powstał dzięki współpracy Katedry Informatyki Stosowanej z Instytutem Patomorfologii Akademii Medycznej w Łodzi. Praca opisuje techniki przetwarzania kolorowych obrazów biomedycznych na przykładzie cytologicznych obrazów mikroskopowych. Techniki te obejmują redukcję defektów obrazu powstałych podczas akwizycji obrazu oraz zakłóceń wynikłych z niedoskonałości preparatu mikroskopowego. Praca opisuje także proces kwantyzacji i segmentacji badanego obrazu. Omówiono projekt systemu informatycznego wspomagającego pracę laboranta wykonującego analizę ilościową badanego materiału cytologicznego. W dalszej części pracy przedstawiono wybrane metody rozpoznawania obrazu mogące mieć zastosowanie dla obrazów cytologicznych. Szczególny nacisk położono na statystyczne metody rozpoznawania obrazów, w tym metodę k najbliższych sąsiadów (k-NN). Słowa kluczowe: obrazy cytologiczne, segmentacja, k-NN. 1. Badania patomorfologiczne 1.1. Istota badania Do badania raka sutka wykorzystuje się następujące techniki pozyskiwania materiału: - wycinek tkanki histologiczny – podczas badania śródoperacyjnego; pobrany - odcisk tkanki (inprint); szkiełku - rozmaz BAC). (biopsja na zamrożonym aspiracyjna cienkoigłowa Badanie przeprowadza się w celu wykrycia w komórkach nowotworowych receptorów estrogenowych (ER) i progesteronowych (PR). Obecność tych receptorów kwalifikuje pacjentkę do dalszego leczenia. W celu stwierdzenia obecności receptorów w jądrach komórkowych raka, materiał biologiczny barwi się immunohistochemicznie. Jądra komórkowe wykazujące ekspresję dodatnią receptorów barwią się na kolor brunatno-czerwony, podczas gdy pozostałe jądra komórkowe pozostają nie zabarwione i mają kolor niebieski (barwnik ten to hematoksylina Mayera). Badanie histopatologiczne jest metodą najdokładniejszą, jednak pozyskanie i przygotowanie preparatu jest kłopotliwe. Skrawany jest płat o grubości 4 mikronów i umieszczany na szkiełku mikroskopowym. Dzięki takiej obróbce widoczna na preparacie tkanka guza tworzy wyraźne pola, łatwe do odróżnienia od tkanki zdrowej. W badaniu tym, ze względu na dobrą jakość tkanki, można naliczyć 500–700 jąder komórkowych i określić ich ekspresję. Preparat cytologiczny zawiera wymieszane komórki zdrowe i nowotworowe, jądra komórkowe nie otoczone cytoplazmą, krwinki czerwone i struktury niekomórkowe, takie jak śluz, włókna, masy martwicze, skrzepy krwi i włóknika. Wyodrębnienie jąder komórek nowotworowych i określenie ich ekspresji jest kłopotliwe i wymaga analizy większej powierzchni preparatu niż w przypadku badania histologicznego, gdyż pojedynczy obraz mikroskopowy zazwyczaj obejmuje zbyt małą liczbę jąder. Następnie obliczana jest frakcja jąder zawierających receptory i na tej podstawie stawia się diagnozę. Do zbadania pozostaje skuteczność tej metody, tj. określenie, na ile takie badanie jest porównywalne z badaniem wycinka tkanki, a co za tym idzie, ile jąder komórkowych należy brać pod uwagę i z jaką dokładnością należy policzyć frakcję jąder o dodatniej ekspresji. 1.2. Przebieg pomiaru podczas rutynowych badań patomorfologicznych 1. Przygotowanie odpowiedniej ilości preparatów. Od pacjentki pobiera się materiał na jeden preparat histologiczny, jeden preparat typu inprint i 1–2 preparaty rozmazowe. Na każdym szkiełku połowę materiału barwi się odczynem reagującym z ER i połowę odczynem reagującym z PR. 2. Umieszczenie pod mikroskopem preparatu i wykonanie pewnej ilości zdjęć. Do liczenia jąder komórkowych stosuje się powiększenie 400x. Wybieramy te zdjęcia, na których jądra komórkowe nie są ze sobą zlepione i można wydzielić granice pomiędzy nimi, aby dokładnie je policzyć. Ruch stolika mikroskopowego powinien być tak zaplanowany, aby wybór fragmentów preparatu był możliwie przypadkowy, a jednocześnie, aby zaobserwować jak największą ilość jąder komórkowych. W przypadku materiału histopatologicznego wystarczy wydzielić obszary nie zawierające tkanki zdrowej. 3. Liczenie jąder komórkowych. Etap ten wymaga sporej uwagi. Pomijając obszary zawierające nie rozdrobnioną tkankę, a skupiając się tylko na jądrach komórkowych pływających swobodnie, należy ustalić dodatkowe założenia: a. jak traktować jądra komórkowe wykazujące częściową ekspresję; b. jak liczyć jądra komórkowe, jeśli nie są widoczne w całości na ekranie (tu można np. odrzucać obiekty). 2. Zadania półautomatycznego systemu komputerowego Celem naszych badań jest skonstruowanie w pełni automatycznego systemu analizy obrazów patomorfologicznych. Wymaga to rozwiązania szeregu problemów, a zatem na etapie projektowania niezbędna jest interakcja z człowiekiem (lekarzem lub laborantem). Poniżej podajemy fazy działania interakcyjnego systemu. 1. akwizycja obrazów z kamery analogowej poprzez kartę telewizyjną do komputera PC i digitalizacja obrazów; obrysu jądra komórkowego pozwoli obliczyć jego objętość; 6. klasyfikacja jąder komórkowych: jądra z ekspresją, jądra bez ekspresji, jądra z częściową ekspresją. Ewentualna pomoc operatora; 7. wykonanie analizy statystycznej (w najprostszym przypadku: obliczenie frakcji, określenie maksymalnego błędu). 3. Techniki przetwarzania obrazu Omówione poniżej techniki przetwarzania obrazu mikroskopowego podzieliliśmy na trzy grupy: przetwarzanie wstępne eliminujące większość defektów powstałych w procesie akwizycji, segmentacja obiektów w obrazie i analiza obrazu. 3.1. Przetwarzanie wstępne Obraz mikroskopowy obserwowany przez laboranta przechwytywany jest przez kamerę wideo podłączoną do mikroskopu. Laborant może oglądać obraz na żywo na ekranie monitora i odpowiednio dostroić oświetlenie oraz ostrość obrazu. Ustawienia tych parametrów mają istotny wpływ na przydatność obrazu do dalszego przetwarzania. Następnym etapem jest „wykonanie zdjęcia”, czyli zapisanie obrazu w postaci cyfrowej w pamięci komputera. Podczas tego procesu nieunikniona jest częściowa utrata informacji, którą obrazuje Rys. 1. 2. obróbka wstępna obrazów polegająca na eliminacji zakłóceń powstałych podczas akwizycji, a także wyrównanie histogramu jasności. Dzięki takiej obróbce algorytm dokonujący segmentacji przy różnych obrazach będzie działał w porównywalnych warunkach; 3. określenie parametrów barwnych i morfologicznych obiektów, które będą poszukiwane na obrazie. Krok ten może być wspomagany przez operatora systemu, zaś uzyskane dane zostają dołączane do zbioru uczącego; 4. automatyczna segmentacja obrazu na podstawie powyższych kroków. Program musi wydzielić rozłączne obszary zawierające po jednym jądrze komórkowym. Obszary te będą weryfikowane przez operatora systemu; 5. obrysowanie jąder komórkowych przy użyciu algorytmów progowania. Dokładne określenie Rys. 1. Digitalizacja obrazu. Proces składa się z dwóch etapów: próbkowania i kwantyzacji. Podczas digitalizacji następuje zmniejszenie rozdzielczości przestrzennej i barwnej Rys. 2 przedstawia powiększony fragment zdigitalizowanego obrazu pozyskanego podczas rutynowego badania cytologicznego. Wyraźnie dostrzegalne są m. in. następujące artefakty: poziome prążki (efekt przeplotu), kolorowe paski z lewej strony obrazu (zakłócenia synchronizacji poziomej obrazu), rozmycie krawędzi obiektów (skutek złego ustawienia ostrości). Najprostszym rozwiązaniem, zastosowanym w naszym systemie, jest wyrównanie histogramu jasności, czyli liniowe przeskalowanie jasności. Analizowany obraz cyfrowy jest dodatkowo odszumiany poprzez filtr medianowy zastosowany dla składowej jasności obrazu. Przeprowadzono eksperymenty z maskami medianowymi różnej wielkości. Dla analizowanych obrazów o rozdzielczości 700 x 525 punktów, optymalną maską dla filtru medianowego wydaje się być maska kołowa o średnicy 7 punktów. Należy zwrócić uwagę na fakt, iż w tej fazie przetwarzania nie zajmujemy się poprawą ostrości obrazu. 3.1. Segmentacja w dziedzinie kolorów Rys 2. Powiększony fragment zdigitalizowanego obrazu cytologicznego. Widoczne zakłócenia spowodowane są niedoskonałością toru wizyjnego. W analizie obrazów kolorowych najczęściej stosuje się model barwny HSI (Hue, Saturation, Intensity) – Rys. 3. Efekt przeplotu jest spowodowany sposobem kodowania obrazu w systemie telewizyjnym PAL. Cykl tworzenia i przesyłania obrazu trwający 1/25 sek. składa się z dwóch półobrazów, jeden zawiera linie parzyste, drugi nieparzyste. W rezultacie linie parzyste nie są skanowane w tym samym czasie, co linie nieparzyste. Dodatkowo, złe ustawienie parametrów przechwytywania karty telewizyjnej może spowodować, że zostanie zapisany tylko jeden półobraz. Efekt przeplotu można następującymi metodami: próbować usunąć - poprzez wybranie co drugiej linii obrazu i interpolację pozostałych linii; Rys 3. Stożek barwny modelu HSI. - uśrednianie eliminujące również szum. Wykonuje się N zdjęć tego samego obrazu. Statystycznie wartość szumu rośnie wówczas Model ten lepiej odzwierciedla ludzką percepcję kolorów niż schemat RGB, standardowo używany do kodowania obrazów. Barwniki użyte w preparacie cytologicznym mają specyficzne zakresy kolorów, możliwe do opisania w modelu HSI przez składową H, czyli ton barwy. N razy, podczas gdy wartość sygnału rośnie N razy. Powoduje to procentowy spadek szumu w obrazie; - poprzez zastosowanie filtru medianowego współrzędnej pionowej. Brzegi obrazu, na których powstają charakterystyczne zakłócenia barwne, można usunąć, zmniejszając tym nieznacznie powierzchnię analizowanego obrazu. Ze względu na fakt, iż obrazy mogą mieć niedoskonałości związane z nieprawidłowym oświetleniem, zastosowano również korekcję jasności obrazu. Pole preparatu może być oświetlone nierównomiernie (np. środek może być oświetlony mocniej niż brzegi), dodatkowo każdy obraz z analizowanego preparatu może być oświetlony innym natężeniem. Nierównomierność ta może wpływać na proces segmentacji. zabarwienie brunatno-czerwone (ekspresja dodatnia) niebieskie (ekspresja ujemna) zakres składowej H [280; 360] i [0; 10] [180; 280] Tab. 1: Zakresy wartości składowej H (dla jąder kom.) mierzone w przykładowym obrazie cytologicznym. Podane w Tab. 1 zakresy wartości nie są, niestety, stałe dla wszystkich obrazów użytych w eksperymencie. Co gorsza, ze względu na opisane powyżej defekty obrazów, zakresy te dla wyróżnionych obiektów (tj. rodzajów zabarwień) mogą częściowo się pokrywać. Na Rys. 4 pokazano wynik działania algorytmu opartego na progowaniu wartości H dla przykładowego obrazu cytologicznego. W dalszej części eksperymentu zastosowano segmentację barwną z wykorzystaniem algorytmu k-NN (opis w następnym rozdziale). Jako cechy przyjęto wartości H, S, I oraz gradient jasności dla każdego punktu. Segmentacja barwna jest koniecznym, lecz nie dostatecznym etapem analizy obrazu. Może ona służyć np. do wstępnego oddzielania obiektów od tła. Fragmenty obrazu posiadające ton barwy z przedziału skojarzonego z interesującym nas zabarwieniem nie muszą należeć do jąder komórkowych (może to być np. cytoplazma, krwinki). Wydzielenie pojedynczych jąder komórkowych jest zadaniem segmentacji morfologicznej. 3.2. Segmentacja morfologiczna obrazu Preparaty mikroskopowe używane w rutynowych badaniach patomorfologicznych posiadają szereg cech utrudniających automatyczną segmentację obrazu. Obiekty często łączą się w większe grupy, co wymaga zastosowania algorytmów rozdzielających je. Jednym z nich może być metoda watershed. Rys 4. Segmentacja barwna przy użyciu składowej H dla obrazka cytologicznego. Zastosowano następujące przedziały wartości H: tło {0,199}, ekspresja ujemna {200,299}, ekspresja dodatnia {300,359}. Użytkownik programu generuje zbiór uczący klikając w wybrane przez niego punkty obrazka i przypisując je do jednej z trzech grup: obiekty z ekspresją dodatnią, obiekty z ekspresją ujemną oraz tło. Odległość w przestrzeni cech zdefiniowano jako sumę modułów różnic poszczególnych składników koloru i gradientu jasności: Algorytm watershed został wymyślony dla potrzeb segmentacji przez Beuchera i Lantuejoula [6]. Opracowano zarówno sekwencyjną, jak i równoległą implementację tej metody. Idea algorytmu polega na traktowaniu obrazka jako mapy topograficznej, gdzie wysokość oznacza jasność, gradient jasności lub wartość pewnej składowej koloru. Algorytm rozpoczyna pracę w „kotlinach” obszaru, tj. minimach lokalnych. W każdym kroku iteracji „poziom wody” podwyższany jest o 1 dla każdej kotliny i następuje zalewanie obszarów kotliny niższych niż ten poziom wody. ρ(x1,x2) = Hx1 −Hx2 + Sx1 −Sx2 + Ix1 −Ix2 + ∇x1 −∇x2 , a więc zastosowano metrykę miejską. Miało to na celu poprawę wydajności algorytmu. Wyniki działania algorytmu minimalnoodległościowego 1-NN dla tego samego obrazka prezentuje Rys. 5. Rys 5. Segmentacja barwna obrazu cytologicznego algorytmem 1-NN dla cech H, S, I, grad(I). Obraz wynikowy zawiera mniejsze zakłócenia, niż obraz poddany progowaniu barw. Rys 6. Porównanie metod segmentacji: a) oryginalny obrazek, b) progowanie, c) watershed. W momencie, gdy zalewane obszary zbliżają się do siebie, konstruowane są na ich granicy linie podziału. Efektywne działanie algorytmu możliwe jest dla obrazów o małym zaszumieniu, gdyż w przeciwnym wypadku następuje podział na zbyt wiele regionów (ang. oversegmentation). Wynik działania metody zależny jest także od określenia sąsiedztwa punktów i kierunku zalewania. jest rozkład histogramu wybranych cech należących do obiektu punktów (jasności, nasycenia, tonu koloru). Bardziej skomplikowane metody opisu tekstury bazują na analizie Fouriera lub na analizie fraktalnej. 3.4. Pomiar cech morfologicznych Efekt działania metody watershed pokazano na Rys. 6. Algorytm został w tym wypadku użyty w celu rozdzielenia zlepionych obiektów. Wartości użyte dla tego obrazu to jasności punktów. Zastosowanie gradientu jasności jest przydatne przy wyznaczaniu obrysu obiektów. Przedmiotem eksperymentu medycznego jest pomiar cech morfologicznych wyróżnionych obiektów należących do dwóch klas, czyli jąder komórkowych wykazujących ekspresję dodatnią i ujemną. Pomiar obejmuje: - liczbę obiektów widocznych na obrazku; - pole powierzchni obiektów. 3.3. Analiza obrazów Pomiar pola powierzchni Interesujące patologa obiekty, czyli jądra komórkowe, występują razem z innymi obiektami opisanymi w rozdziale 1. Formalne opisanie cech tych obiektów jest trudne, ponieważ w każdym preparacie mogą wyglądać one nieco inaczej (por. Rys. 2, 4, 7). Problemy z pomiarem pola powierzchni jąder komórkowych wynikają z tego, że preparat jest pewnym dwuwymiarowym przekrojem przestrzeni trójwymiarowej, w której znajdują się mierzone obiekty. Mamy więc tylko przekroje obiektów, które mogą wprowadzać pewne niedokładności. Zjawisko to opisuje się jako efekt Holmesa. Obrazuje je Rys. 8. Rys. 8. Zniekształcenia wielkości obiektów w preparacie mikroskopowym. Obiekty A i C są tej samej wielkości, podczas gdy na preparacie obiekt C będzie większy. Podobna zależność występuje pomiędzy obiektami B i D. Rys 7. Fragment obrazu cytologicznego. Wskazano różne struktury mogące zakłócić działanie automatycznej segmentacji. Przeprowadzenie tego etapu w sposób automatyczny wymaga metod sztucznej inteligencji, np. statystycznych metod rozpoznawania obrazów, sieci neuronowych. Podstawowym założeniem dla skonstruowania klasyfikatora jest formalny opis cech obiektów w celu ich klasyfikacji. Stosować można następujące parametry morfologiczne: - pole powierzchni; - obwód; - średnice; - współczynniki kształtu; - spójność obszaru; - liczbę otworów. Analizie podlegać może także tekstura danego obiektu. Najprostszym sposobem opisania tekstury Dokładna korekcja wielkości powierzchni jąder komórkowych jest niemożliwa, gdyż nie widzimy tak jak na Rys. 7, które jądra komórkowe są przecięte i w jakiej płaszczyźnie. Można założyć, że wielkość jąder komórkowych ma pewien rozkład prawdopodobieństwa i na tej podstawie obliczać pole powierzchni. Z kolei porównując jasność obiektów i ostrość ich krawędzi można wykryć odcinki kul takie jak A, B na Rys. 8 i wyeliminować je z dalszych obliczeń. Pomiar liczby obiektów Pomiar liczby obiektów widocznych na jednym obrazku powinien uwzględniać przypadki, gdy pewne obiekty nie mieszczą się w całości na obrazkach. Stosuje się w tym wypadku pewien margines (Rys. 9), dzięki któremu możemy wyróżnić obiekty brzegowe. Znając rozkład wielkości i gęstość obiektów na obrazku, można określić statystycznie błąd wynikający z operacji wyłączania obiektów brzegowych. W praktyce często testuje się parametr k w ograniczonym zakresie, np. od 1 do 30. Wartość k, która oferuje najmniejszą wartość frakcji błędów klasyfikacji, może być stosowana do klasyfikacji nowych punktów, czyli punktów spoza zbioru uczącego. Rys 9. Określanie obiektów brzegowych obrazka na podstawie marginesu: a) wyłączamy obiekty leżące całkowicie na marginesie, b) wyłączamy obiekty leżące częściowo na marginesie. 4. Rozpoznawanie obrazów metodą k najbliższych sąsiadów Nieparametryczna reguła decyzyjna k najbliższych sąsiadów (k-NN) została zaproponowana prawie pół wieku temu w pracy [1] i mimo to wciąż należy do najefektywniejszych metod klasyfikacji. Klasyfikowanemu punktowi z przestrzeni cech reguła ta przyporządkowuje klasę najliczniej reprezentowaną wśród k najbliższych mu punktów (sąsiadów) w zbiorze odniesienia, zwanym też zbiorem uczącym. Liczbę k dobiera się eksperymentalnie tak, aby prawdopodobieństwo mylnej klasyfikacji było jak najmniejsze. Zbiór uczący bardzo często zawiera cechy nadmiarowe, nie mające związku z rozpatrywanymi klasami. Znany jest fakt, że cechy nadmiarowe komplikują i pogarszają jakość klasyfikacji. Z tego powodu pożądane jest przeprowadzanie selekcji cech. Gdy liczba cech jest niewielka, np. 10, to wyboru najlepszego zestawu możemy dokonać drogą pełnego przeglądu wszystkich kombinacji cech, licząc dla każdej z nich frakcję błędów odpowiadającą optymalnej wartości k. W przypadku większej liczby cech stosujemy często strategię kolejnego dołączania cech (FSS – Forward Selection Strategy) lub strategię kolejnego odrzucania cech (BSS – Backward Selection Strategy). Obie te strategie zostały opisane w pracy [2]. Opiszmy tylko strategię kolejnego dołączania cech, gdyż wymaga ona mniejszego nakładu obliczeń. Pierwszym krokiem tej strategii jest wybór jednej cechy, która oferuje najmniejszy błąd klasyfikacji. Następnie do tej cechy, na wszystkie możliwe sposoby, dołączamy drugą cechę i wybieramy parę z najmniejszym średnim błędem klasyfikacji. Trzecią i kolejne cechy dołączamy w podobny sposób, kończąc na pełnym zestawie cech. Do klasyfikacji obrazów cytologicznych używamy następujących czterech cech: Rys 10. Przykład działania reguły 3-NN. Próbka q będzie przypisana do klasy „kółek”. Prawdopodobieństwo mylnej klasyfikacji oszacowuje się poprzez użycie zbioru walidacyjnego (ang. validation set) lub metodą minus jednego elementu (ang. leave-one-out). Metoda ta polega na klasyfikacji każdego punktu ze zbioru odniesienia (tj. uczącego) wg reguły k-NN ze zbiorem odniesienia pomniejszonym o klasyfikowany aktualnie punkt. Stosunek liczby mylnie klasyfikowanych w ten sposób punktów do liczebności całego zbioru odniesienia, czyli frakcja błędów klasyfikacji, estymuje prawdopodobieństwo mylnej decyzji. Stosując metodę minus jednego elementu możemy oszacować frakcje błędów klasyfikacji dla wszystkich możliwych wartości k. - składowe barwne danego punktu H, S oraz I; - gradient jasności punkcie. estymowany w danym W zadaniu segmentacji barwnej mamy do czynienia z trzema klasami punktów: należące do jąder komórkowych „niebieskich”, należące do jąder „czerwonych” i pozostałe (np. należące do cytoplazmy). Z analizy statystyk zbioru uczącego wynika, iż zadanie trójdecyzyjne, z którym mamy tu do czynienia, można zdekomponować do sieci trzech zadań dwudecyzyjnych, tj. przypisywać osobno każdy punkt po kolei tylko do jeden z dwóch klas. W każdym z podzadań można wykorzystywać osobne cechy i osobne wartości k (jak podaliśmy wyżej, te parametry klasyfikacji estymowane są w procesie uczenia przy pomocy zbioru uczącego i reguły minus jednego elementu). Finalna decyzja, tj. przypisanie próbki do jednej z trzech klas, nastąpi w wyniku głosowania klasyfikatorów składowych (dwudecyzyjnych). 5. Podsumowanie Automatyczne systemy analizy obrazów mikroskopowych są projektami bardzo złożonymi i kosztownymi, tak więc nieliczne ośrodki badawcze mogą sobie pozwolić na ich zakup. Celem współpracy Katedry Informatyki Stosowanej Politechniki Łódzkiej i Instytutu Patomorfologii Akademii Medycznej jest stworzenie systemu opartego o posiadany sprzęt komputerowy i optyczny oraz technologie wykonywania preparatów mikroskopowych. Dlatego też obecnie dążymy do stworzenia systemu informatycznego półautomatycznego, wspomagającego uciążliwy dla laboranta etap liczenia jąder komórkowych i porządkującego otrzymane wyniki. Dalsze plany przewidują poprawę algorytmów korekcji błędów obrazu (np. braku ostrości), algorytmów segmentacji oraz identyfikacji obiektów. 6. Bibliografia [1] Fix E., Hodges J. L., Discriminatory Analysis: Nonparametric Discrimination Small Sample Performance. From project 21-49-004, Report Number 11, USAF School of Aviation Medicine, Randolph Field, Texas, pp. 280–322, 1952. [2] Devijver P. A., Kittler J., Pattern Recognition: A Statistical Approach. Prentice Hall, London, 1982. [3] Gonzales R., Woods W., Digital Image Processing. Addison Wesley, 1993. [4] Teuber J., Digital Image Processing. Teknisk Forlag, Copenhagen, Denmark 1989. [5] Zieliński K., Strzelecki M., Komputerowa analiza obrazu biomedycznego. PWN, W-wa, Łódź, 2002. [6] Beucher S., Lantuejoul C., Use of watersheds in contour detection. In Proc. International Workshop on Image Processing, Real-Time Edge and Motion Detection/ Estimation, Rennes, Sept. 1979. Internet [http1] I. T. Young, J. J. Gerbrands, L. J. van Vliet Fundamentals of Image Processing, http://www.ph.tn.tudelft.nl/Courses/FIP/ noframes/fip.html [http2] Applied Scientific Instrumentation, Inc, http://homepage.mac.com/myers/imaging/ [http3] Reindeer Graphics, The Image Processing and Measurement Cookbook, http://www.reindeergraphics.com/tutorial/ [http4] Serge Beucher, Image Segmentation and mathematical morphology, http://cmm.ensmp.fr/~beucher/wtshed.html [http5] Matlab news and notes, http://www.mathworks.com/company/newsletter/win02/ watershed.shtml [http6] Holmes Effect, University of Dellware http://www.udel.edu/Biology/Wags/b667/lect6/lect6_11.gif