Wrocław, 26.08.14 Recenzja rozprawy doktorskiej mgr Piotra

Wrocław, 26.08.14
Recenzja rozprawy doktorskiej mgr Piotra Zygmunta Trzeciaka pt. „Wpływ
podwyższonej temperatury na poziom ekspresji wybranych genów w komórkach
ziarnistych kompleksu wzgórek jajonośny - oocyt u krów w badaniach in vitro”
wykonanej na Wydziale Medycyny Weterynaryjnej Szkoły Głównej Gospodarstwa
Wiejskiego w Warszawie pod kierunkiem promotora pracy dr hab. Anny Marii
Duszewskiej, prof. nadzw. SGGW
dr inż. Rafała Radosława Starzyńskiego –
i
promotora pomocniczego
1.
Ogólna charakterystyka rozprawy
Przedstawiona mi do recenzji rozprawa doktorska mgr Piotra Zygmunta Trzeciaka pt.
„Wpływ podwyższonej temperatury na poziom ekspresji wybranych genów w komórkach
ziarnistych kompleksu wzgórek jajonośny - oocyt u krów w badaniach in vitro”
jest
oprawionym wydrukiem komputerowym złożonym z 113 stron formatu A4. Układ pracy jest
typowy dla dysertacji doktorskich w dziedzinie eksperymentalnych nauk z zakresu biologii i
zawiera
osiem
uporządkowanych,
objętościowo
zrównoważonych,
odpowiednio
ilustrowanych i starannie opracowanych rozdziałów. Wyniki badań są poparte odpowiednio
zredagowanymi wykresami, tabelami i ilustrowane dokumentacją fotograficzną. Praca jest
napisana jasnym językiem naukowym.
Pracę
realizowano
w
Zakładzie
Histologii
Morfologicznych Wydziału Medycyn Weterynaryjnej
i
Embriologii
Katedry
Nauk
SGGW i w Zakładzie Biologii
Molekularnej Instytutu Genetyki i Hodowli Zwierząt PAN w Jastrzębcu. Badani były
finansowane z dotacji celowych SGGW.
2.
Ocena merytoryczna pracy
Ocena ogólna
Niezależnie od kontrowersji dotyczących globalnego ocieplania klimatu, w Polsce w ostatnich
latach obserwujemy zwiększoną liczbę dni w miesiącach letnich, w których temperatura
powietrza osiąga poziom zbliżony do lub ponad 30 oC. Fluktuacje podwyższonej temperatury
otoczenia wpływają na sezonowe zmiany płodności u bydła, które są opisywane przez
Recenzja rozprawy doktorskiej mgr Piotra Zygmunta Trzeciaka pt. „Wpływ podwyższonej temperatury na poziom ekspresji
wybranych genów w komórkach ziarnistych kompleksu wzgórek jajonośny - oocyt u krów w badaniach in vitro”
Strona 1
praktykujących lekarzy weterynarii. Stanowią one istotny problem medyczny i są przyczyną
wymiernych strat gospodarczych.
Jedną z przyczyn takiego stanu jest wrażliwość komórek rozrodczych i zarodków we
wczesnych etapach rozwoju na stres termiczny rozumiany jako kompleks zmian
adaptacyjnych, które mają prowadzić do niwelacji ewentualnych skutków zaburzonej
homeostazy termicznej. Istotnie, wykazano, że skutkiem stresu cieplnego jest zaburzony
proces dojrzewania oocytów, spowodowany zaburzeniami dojrzewania cytoplazmatycznego,
jądrowego, organizacji cytoszkieletu i egzekucją apoptozy co prowadzi do ograniczonej
kompetencji biologicznej tych komórek niezbędnej do utworzenia prawidłowego zarodka.
Jednak należy mieć na uwadze, ze zmiany adaptacyjne oocytów są ograniczone, ponieważ
oocyt jest komórką transkrypcyjnie nieaktywną.
W ocenianej rozprawie doktorskiej została sformułowana oryginalna hipoteza badawcza,
która zakłada, że u krów negatywny wpływ stresu cieplnego na przedimplantacyjny rozwój
zarodków jest uwarunkowany zmienioną ekspresją kluczowych genów sterujących procesem
owulacji w transkrypcyjnie aktywnych komórkach ziarnistych wzgórka jajonośnego a nie
bezpośrednim oddziaływaniem na oocyt.
Komórki ziarniste są komórkami opiekuńczymi dla oocytów. Dlatego przyjęte
założenie, że to właśnie komórka ziarnista w odpowiedzi na stres cieplny będzie spełniać rolę
ochronną wobec oocytu jest logicznym i trafnym uzasadnieniem podjętych badań.
Na szczególna
uwagę również zasługuje dobór genów, których ekspresja w
komórkach ziarnistych
podlegała ocenie: receptor hormonu folikulotropowego, który po
związaniu swojego liganda (FSH) aktywuje ścieżkę sygnalizacyjną prowadzącą do wzrostu
aktywności cyklazy adenylowej, produkcji cAMP i utrzymywania odpowiedniego poziomu
cAMP w oocycie; Wewnątrzkomórkowe stężenie cAMP decyduje o zahamowaniu lub
wznowieniu podziału mejotycznego przez tę komórkę. Z kolei oocyt aktywnie wpływa na
aktywację białek SMAD i kontrolę ekspresji genów kontrolujących proces owulacji i
dyspersji komórek ziarnistych, miedzy innymi genu białka TSG-6, którego poziom
transkrypcji i translacji był oceniany w tej pracy. Ocenie również podlegała ekspresja białka
HSP-70, kluczowego w ochronie komórek przed stresem cieplnym.
Recenzja rozprawy doktorskiej mgr Piotra Zygmunta Trzeciaka pt. „Wpływ podwyższonej temperatury na poziom ekspresji
wybranych genów w komórkach ziarnistych kompleksu wzgórek jajonośny - oocyt u krów w badaniach in vitro”
Strona 2
Najważniejszym osiągnieciem pracy jest wykazanie, że komórki ziarniste wzgórka
jajonośnego odpowiadają na stres cieplny poprzez regulację ekspresji genów kluczowych dla
procesów dojrzewania oocytów i odpowiedzi na stres termiczny. Odpowiedz ta jest zależna
od czasu działania stresorów jak wykazano w porównaniu z badaniami innych autorów. Co
ciekawe, wyniki pracy sugerują intensywną ochronę oocytu poprzez prawdopodobny
parakrynny transport
HSP-70, jednak ta ochrona nie zachowuje kompetencji oocytu
umożliwiającej rozwój zarodków do stadium blastocysty.
Obniżenie poziomu FSHR i
podwyższenie poziomu TSG-6 w odpowiedzi na stres może sugerować przyspieszony proces
odłączania
komórek
ziarnistych
od
oocytu
i
kształtowania
struktur
macierzy
pozakomórkowej, co jest silną przesłanką do dalszych badań nad funkcjonalnym
powiązaniami pomiędzy tymi dwoma rodzajami komórek w warunkach stresu a jednocześnie
jak sugeruje Autor pracy białko TSG-6 i FSHR mogą służyć jako molekularne markery
biologicznej kompetencji oocytów. Ten ostatni aspekt wynikający z podjętych badań może
otwierać nową ścieżkę nieinwazyjnej, pośredniej oceny oocytów niezbędnej w trakcie
uzyskiwania zarodków technikami in vitro. Na podkreślenie zasługuje fakt, że po raz
pierwszy białko TSG-6 zostało wskazane jako marker stresu cieplnego.
Podsumowując wyniki badań przedstawione w pracy doktorskiej mgr inż. Piotra
Zygmunta Trzeciaka wskazują na kluczową rolę komórek ziarnistych w odpowiedzi na stres
termiczny. Są inspirujące do
podjęcia dalszych badań o charakterze podstawowym w
zakresie biologii oocytów. Niosą również bardzo istotne wskazania aplikacyjne dla prac
prowadzonych laboratoriach embriologicznych zajmujących się pozyskiwaniem zarodków
zwierząt technikami in vitro.
Ocena szczegółowa
Edycja pracy jest bardzo staranna. Autor wykazał się dbałością o szczegóły w edycji
tekstu, w opisach rycin i schematów.
Wstęp szczegółowo wprowadza czytelnika w obszar wiedzy objętej zakresem badań.
Pojedyncze uchybienia stylu wynikają prawdopodobnie z konieczności tłumaczenia bardzo
skomplikowanych mechanizmów, które dotyczyły wyjaśnienia istoty molekularnych podstaw
biologii oocytów. Cele pracy wynikają z aktualnego
przeglądu piśmiennictwa, są
sformułowane jasno i konkretnie.
Recenzja rozprawy doktorskiej mgr Piotra Zygmunta Trzeciaka pt. „Wpływ podwyższonej temperatury na poziom ekspresji
wybranych genów w komórkach ziarnistych kompleksu wzgórek jajonośny - oocyt u krów w badaniach in vitro”
Strona 3
Dobór metod badawczych odpowiada celowi pracy. Na uwagę zasługuje różnorodność
metod stosowanych przez Autora. Obejmowały one hodowle oocytów i zarodków w
warunkach in vitro, techniki mikroskopowe oraz
techniki biologii molekularnej.
W
kontekście uzyskanych wyników wskazuje to na biegłość warsztatową Autora pracy.
Niektóre jednak informacje dotyczące zastosowanych metod wymagają w mojej
ocenie koniecznych uzupełnień przed oddaniem pracy do druku.
W podrozdziale 3.1 pt. ” Pobieranie materiału do badań” należy wskazać porę roku,
ewentualnie temperaturę otoczenia, która panowała przed ubojem krów, od
których
pobierano jajniki z rzeźni. Wysoka temperatura otoczenia panująca przed ubojem mogła
wpływać na jakość pozyskiwanych COCs i
tym samym wyniki przeprowadzonych
eksperymentów.
W rozdziale 3.8.1 pt. „Izolacja całkowitego RNA brakuje informacji o ilości
uzyskiwanego RNA lub o liczbie komórek ziarnistych i oocytów wykorzystywanych w
każdym z powtórzeń.
W rozdziale 3.9.4 pt. „Immunoblotting” brakuje informacji dotyczącej kontroli
pozytywnej i negatywnej używanych przeciwciał
W rozdziale 3.13 pt. „Immunocytochemiczna analiza HSP 70 w oocytach” brak jest
informacji o liczbie oocytów poddanych analizie.
Na rycinie 5 w oknie ANALIZA sformułowanie „analiza kompetencji komórek
ziarnistych na podstawie dojrzewania oocytów i rozwoju zarodków in vitro” nie jest
adekwatna do zamierzeń , ponieważ zastosowany układ doświadczalny nie jest wykluczający
dla bezpośredniego wpływu podwyższonej temperatury na oocyt. Wymaga to dodatkowego
komentarza.
Starannie opracowany rozdział „Wyniki” nie budzi zastrzeżeń i jest wiarygodnym
dowodem prawidłowo przeprowadzonych eksperymentów i uzyskanych wyników.
Dyskusja jest bardzo dojrzałą interpretacją uzyskanych wyników. Autor wykazuje
bardzo rozległa wiedzę o molekularnym podłożu zaobserwowanych zmian i umiejętnie
rozważa możliwy udział badanych białek w ochronie oocytów przed stresem termicznym w
Recenzja rozprawy doktorskiej mgr Piotra Zygmunta Trzeciaka pt. „Wpływ podwyższonej temperatury na poziom ekspresji
wybranych genów w komórkach ziarnistych kompleksu wzgórek jajonośny - oocyt u krów w badaniach in vitro”
Strona 4
kontekście badań innych autorów. Ogólnie, w całej pracy liczba cytowanych publikacji (
głównie anglojęzycznych) wynosi 212. Jednak pragnę zwrócić uwagę na nie uwzględnienie w
dyskusji pracy Rispoli i wsp. z 2013 roku, w której autorzy, w nieco odmiennym układzie
doświadczalnym, badali ekspresję genów komórek ziarnistych w warunkach stresu
termicznego.
Wnioski zostały sformułowane prawidłowo w sposób adekwatny do uzyskanych
wyników.
Konkluzja
Reasumując uważam, że przedstawiona mi do recenzji rozprawa jest wartościową
pracą
naukową
przedstawiającą
oryginalne
wyniki
badań
identyfikujące
istotne
mechanizmy towarzyszące stresowi termicznemu w oocytach i komórkach ziarnistych
wzgórka jajonośnego u krów a także wskazującą kierunek dalszych poszukiwań w tym
zakresie. Dlatego, biorąc pod uwagę ważność problemu biologicznego, któremu jest
poświęcona
oceniana
rozprawa,
oryginalną
koncepcje
przedstawionych
badań,
przeprowadzone poprawnie doświadczenia wymagające opanowania nowoczesnych metod
badawczych i uzyskanie oryginalnych wyników wskazujących na potwierdzenie stawianej
hipotezy stwierdzam, że rozprawa doktorska odpowiada warunkom określonym w art. 13
ust.1 ustawy z dnia 14 marca 2003r o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o
stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz.U. Nr 65, poz.595 z późn.zm) i zwracam się do
Wysokiej Rady Wydziału Medycyny Weterynaryjnej, Szkoły Głównej Gospodarstwa
Wiejskiego w Warszawie o dopuszczenie mgr inż. Piotra Zygmunta Trzeciaka do dalszych
etapów przewodu doktorskiego. Jednocześnie zwracam się do Wysokiej Rady Wydziału
Medycyny Weterynaryjnej, Szkoły Głównej Gospodarstwa Wiejskiego w Warszawie z
wnioskiem o nagrodzenie tej pracy stosowną nagrodą.
Wrocław, 26.10.2014
Prof. dr hab. Anna Chełmońska-Soyta
Recenzja rozprawy doktorskiej mgr Piotra Zygmunta Trzeciaka pt. „Wpływ podwyższonej temperatury na poziom ekspresji
wybranych genów w komórkach ziarnistych kompleksu wzgórek jajonośny - oocyt u krów w badaniach in vitro”
Strona 5