04 Gumprecht.p65

Janusz Gumprecht, Marcin Zychma, Piotr Czank, Joanna Żywiec,
Kamila Gumprecht, Małgorzata Rusek-Zychma, Joanna Przesmycka,
Grzegorz Garbas, Władysław Grzeszczak
PRACA ORYGINALNA
Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Diabetologii i Nefrologii Śląskiej Akademii Medycznej w Katowicach
Związek polimorfizmów I/D genu enzymu
konwertującego (ACE) oraz CMA/B genu chymazy
z przerostem masy lewej komory serca u chorych
z terminalną niewydolnością nerek w przebiegu
nefropatii cukrzycowej oraz bez cukrzycy
leczonych nerkozastępczo w programie
powtarzanych hemodializ — doniesienie wstępne
Association between ACE I/D and chymase CMA/B gene polymorphisms and left
ventricular mass increase in patients with end-stage renal disease due to diabetic
nephropathy and without diabetes — preliminary report
Abstract
Background. Cardiovascular events are the main cause of
mortality in end-stage renal disease patients undergoing
renal replacement therapy. Left ventricular mass increase,
present in 50–70% dialysed patients, is one of commonly
known risk factors that contribute to the high incidence of
sudden death.
The aim of the study was to find out whether there is an
association between left ventricular mass and ACE I/D or chymase CMA/B polymorphisms in the group of dialysed patients
and whether ACE I/D or chymase CMA/B polymorphism influence left ventricular mass increase in 12-months follow up.
Material and methods. The group of 65 ESRD patients
undergoing haemodialysis was analysed: 52 patients without diabetes mellitus (group I) and 13 with diabetic nephropathy (group II). In all patients echocardiography with left
Adres do korespondencji: dr hab. med. Janusz Gumprecht
Katedra i Klinika Chorób Wewnętrznych, Diabetologii i Nefrologii
ul. 3 Maja 13/15, 41–800 Zabrze
e-mail: [email protected]
Diabetologia Doświadczalna i Kliniczna 2003, 3, 5, 417–424
Copyright © 2003 Via Medica, ISSN 1643–3165
ventricular mass index assessment (at baseline and after 12
months) was performed. Each subject was genotyped for
the ACE I/D and CMA/B polimorphisms using the PCR
based protocol.
Results. No associations between ACE I/D polymorphism
and left ventricular mass index or left ventricular mass increase in 12-months follow-up were observed. In the group
of non-diabetic patients there were significantly higher increase of left ventricular mass in 12-months follow-up in
subjects homozygous for the CMA/B G allele compared to
patients homozygous for the CMA/B A allele and A allele
carriers. In the same group, a significant, independent influence of GG genotype on LVMI increase was found.
key words: gene polymorphism, diabetic nephropathy,
end-stage renal disease
Wstęp
Powikłania sercowo-naczyniowe są główną przyczyną zgonów (52%) wśród chorych na przewlekłą nie-
www.ddk.viamedica.pl
417
Diabetologia Doświadczalna i Kliniczna rok 2003, tom 3, nr 5
wydolność nerek leczonych dializami. Czynniki ryzyka
powikłań sercowo-naczyniowych związane są zarówno
z chorobą podstawową, stosowanym leczeniem nerkozastępczym, jak i schorzeniami współistniejącymi [1–6].
Ryzyko zgonu z przyczyn sercowo-naczyniowych
wynosi w tej grupie 9% na rok i jest 10-krotnie większe
niż w populacji ludzi zdrowych. Po 13 latach dializoterapii
około 90% osób umiera z powodu chorób układu krążenia [2, 5, 6]. W Polsce odsetek zgonów z przyczyn sercowo-naczyniowych wśród chorych leczonych w programie powtarzanych hemodializ w 2001 roku wyniósł
aż 64% [7]. Istotne jest również to, że wskaźniki śmiertelności z przyczyn sercowo-naczyniowych od wielu lat
utrzymują się na tym samym wysokim poziomie, pomimo spadku śmiertelności z przyczyn ogólnych.
Przyczyną zwiększonej śmiertelności z powodu chorób
sercowo-naczyniowych jest częstsze występowanie w tej
grupie pacjentów czynników ryzyka zgonu sercowo-naczyniowego, takich jak: nadciśnienie tętnicze, zaburzenia
lipidowe, cukrzyca, brak aktywności fizycznej i starszy wiek.
Drugą grupę przyczyn stanowią czynniki związane
bezpośrednio z chorobą podstawową, takie jak: przewodnienie (przeciążenie objętościowe serca), nadciśnienie tętnicze, niedokrwistość, wtórna nadczynność przytarczyc, zaburzenia elektrolitowe, działanie toksyn mocznicowych, podwyższone stężenie czynników prozakrzepowych, zwiększone stężenie we krwi białek ostrej fazy
oraz obecność przetoki tętniczo-żylnej [4–6].
Charakterystycznym zaburzeniem występującym
w tej grupie chorych jest przerost lewej komory mięśnia
sercowego, który stanowi niezależny czynnik zwiększonego ryzyka nagłego zgonu sercowego. Przerost lewej
komory serca obserwowany u chorych z przewlekłą niewydolnością nerek leczonych za pomocą powtarzanych
hemodializ jest efektem oddziaływania choroby podstawowej, metody leczenia nerkozastępczego oraz częstego występowania w tej populacji nadciśnienia tętniczego [2–4, 8, 9].
Przerost lewej komory jest najczęściej obserwowaną
zmianą strukturalną serca w grupie chorych dializowanych i dotyczy 50–70% chorych leczonych przewlekle
za pomocą powtarzanych hemodializ [4, 8, 9].
Patogeneza przerostu lewej komory serca w tej populacji chorych jest wieloczynnikowa. Do najważniejszych czynników należą: nadciśnienie tętnicze, niedokrwistość, przewodnienie, wtórna nadczynność przytarczyc, stymulacja układu współczulnego, stymulacja
układu renina-angiotensyna, obecność zespolenia tętniczo-żylnego, działanie toksyn mocznicowych [4, 8, 9].
Przełożenie mechanicznego bodźca przeciążenia
hemodynamicznego na sygnał przerostu miocytów lewej komory serca polega na aktywowaniu lokalnych systemów renina-angiotensyna i słabo poznanych czynników wzrostu powstających w wyniku interakcji pomię-
418
dzy krążącymi katecholaminami i komórkami endotelium aktywowanymi przez stres i napięcie [10].
Ryzyko nagłej śmierci sercowej u chorych z terminalną niewydolnością nerek wzrasta liniowo wraz z przerostem masy mięśnia lewej komory. U chorych dializowanych, u których wskaźnik masy lewej komory przekroczy 165 g/m2, ryzyko nagłego zgonu wzrasta 3,7 razy
w porównaniu z pacjentami dializowanymi z prawidłową
masą lewej komory [2].
Doniesienia dotyczące potencjalnego udziału czynników genetycznych w patogenezie powyższych schorzeń są sprzeczne i niejednoznaczne, tak jak i informacje dotyczące związku czynników genetycznych z przerostem mięśnia lewej komory serca. Dużą rolę przypisuje się genom układu renina-angiotensyna, którego zasadniczym elementem jest enzym konwertujący angiotensynę I (ACE) [11–13, 15].
W 1990 roku Rigat i wsp. [16] wykazali, że polimorfizm I/D genu ACE jest odpowiedzialny za 47% zmienności fenotypowej aktywności enzymu konwertującego
angiotensynę I (ACE) w osoczu. Homozygoty DD charakteryzowały się niemal 2-krotnie wyższą aktywnością
ACE w porównaniu z homozygotami II. U heterozygot ID
występowały wartości pośrednie [16]. Tezę tę potwierdzili także inni badacze. W 1992 roku Cambien i wsp.
[17] wykazali istotną zależność pomiędzy obecnością
homozygotycznego genotypu DD polimorfizmu I/D genu
ACE i zawałem serca w grupie chorych z niskim ryzykiem. Obserwacja ta zapoczątkowała poszukiwania
związku genu ACE i jego polimorfizmów z czynnikami
ryzyka chorób układu sercowo-naczyniowego, w tym
także z przerostem lewej komory serca [17].
Caughey i wsp. [18], Pfeufer i wsp. [19] oraz Utrata
i wsp. [20] wskazali inną niż za pośrednictwem ACE
możliwość tworzenia angiotensyny II. Jest ona związana
z działaniem chymotrypsynopodobnej proteazy serynowej określanej mianem chymazy. Dotychczas jednoznacznie nie określono znaczenia tej możliwości tworzenia angiotensyny II, jednak wydaje się, iż może ona być
odpowiedzialna za nadmierne jej wytwarzanie w niektórych stanach patofizjologicznych, takich jak nadciśnienie tętnicze czy choroba niedokrwienna serca. Jak dotąd zidentyfikowano 2 polimorfizmy genu CMA. Pierwszy zlokalizowany jest w obrębie intronu 2, drugi natomiast w niepodlegającym transkrypcji regionie 5' genu
CMA. Pfeufer i wsp. [19] sugerowali związek locus CMA,
zwłaszcza w połączeniu z genotypem ACE DD, z ryzykiem wystąpienia kardiomiopatii przerostowej [18–21].
Celem pracy była próba odpowiedzi na poniższe pytania:
1. Czy istnieje związek pomiędzy polimorfizmem I/D
genu a masą lewej komory serca u chorych z terminalną niewydolnością nerek leczonych za pomocą
powtarzanych hemodializ?
www.ddk.viamedica.pl
Janusz Gumprecht i wsp. Polimorfizm I/D genu ACE oraz CMA/B genu chymazy a przerost lewej komory u chorych z terminalną niewydolnością nerek
2. Czy istnieje związek pomiędzy polimorfizmem CMA/B
genu chymazy ACE I a masą lewej komory serca
u chorych z terminalną niewydolnością nerek leczonych za pomocą powtarzanych hemodializ?
3. Czy polimorfizm I/D genu ACE I wpływa na przyrost
masy lewej komory serca u chorych z terminalną niewydolnością nerek leczonych za pomocą powtarzanych hemodializ?
4. Czy polimorfizm CMA/B genu chymazy wpływa na
przyrost masy lewej komory serca u chorych z terminalną niewydolnością nerek leczonych za pomocą
powtarzanych hemodializ?
Materiał i metody
Badaniem objęto 65 chorych z terminalną niewydolnością nerek leczonych nerkozastępczo za pomocą powtarzanych hemodializ. Przyczyny niewydolności nerek
w tej grupie chorych były następujące:
— pierwotne kłębuszkowe zapalenie nerek — 27 osób,
— śródmiąższowe zapalenie nerek — 5 osób,
— nefropatia cukrzycowa — 13 osób,
— zwyrodnienie wielotorbielowate nerek — 5 osób,
— nefropatia nadciśnieniowa — 13 osób,
— przyczyny nieznane i niedokładnie określone —
2 osoby.
Wszyscy pacjenci świadomie wyrazili zgodę na udział
w badaniu, którego szczegółowy protokół zaakceptowała Terenowa Komisja Etyki Badań Naukowych działająca
przy Śląskiej Akademii Medycznej w Katowicach.
Średnia wieku analizowanej grupy chorych z terminalną niewydolnością nerek bez cukrzycy (grupa I) wynosiła 54,2 ± 11,6 roku (x ± SD), a wskaźnik masy ciała
(BMI, body mass index) — 23,8 ± 3,4 kg/m2.
Średnie stężenie cholesterolu całkowitego w surowicy krwi w momencie badania w grupie I wynosiło 4,37 ±
± 0,87 mmol/l, cholesterolu frakcji LDL — 2,83 ± 0,73
mmol/l, wartość mediany dla stężenia cholesterolu frakcji HDL — 1,2; 25–75%: 1,0–1,4 mmol/l, triglicerydów —
1,4; 25–75%: 1,0–2,03 mmol/l.
Wartość mediany dla stężenia kreatyniny w surowicy
krwi w grupie I w momencie badania wynosiła 585,8
mmol/l; 25–75%: 455,4–780,1 mmol/l. Mediana czasu, który upłynął od początku obserwacji choroby nerek do
chwili rozpoczęcia leczenia nerkozastępczego, wynosiła
3,0 lata; 25–75%: 0,9–8,0 lat, natomiast mediana czasu
trwania leczenia nerkozastępczego — 38,1 miesięca;
25–75%: 22,6 ± 60,1 miesięcy.
Mediana czasu trwania nadciśnienia tętniczego w badanej grupie wynosiła 9,3 roku; 25–75%: 6,0–14,0 lat.
Wartości ciśnienia tętniczego wynosiły odpowiednio:
średnie ciśnienie skurczowe przed zabiegiem hemodializy — 150,3 ± 25,0 mm Hg; średnie ciśnienie rozkur-
czowe przed zabiegiem — 89,0 ± 11,6 mm Hg; średnie
ciśnienie skurczowe po zabiegu — 148,1 ± 25,3 mm Hg;
średnie ciśnienie rozkurczowe po zabiegu — 95,0 ±
± 12,6 mm Hg.
Średnia wieku grupy chorych z terminalną niewydolnością nerek w przebiegu nefropatii cukrzycowej (grupa II)
wynosiła 52,1 ± 8,9 roku (x ± SD), a BMI — 22,7 ±
± 7,1 kg/m2.
Średnie stężenie cholesterolu całkowitego w surowicy krwi w momencie rozpoczęcia badania w grupie II
wynosiło 4,82 ± 0,76 mmol/l, cholesterolu frakcji LDL —
2,89 ± 0,65 mmol/l, wartość mediany dla stężenia cholesterolu frakcji HDL — 1,18; 25–75%: 1,0–1,3 mmol/l,
triglicerydów — 1,64; 25–75%: 1,2–2,2 mmol/l.
Wartość mediany dla stężenia kreatyniny w surowicy
krwi w grupie II w momencie badania wynosiła 532,3
mmol/l; 25–75%: 371,3–738,2 mmol/l. Mediana czasu, który upłynął od początku obserwacji choroby nerek do
chwili rozpoczęcia leczenia nerkozastępczego, wynosiła 3,3 roku; 25–75%: 0,5–7,0 lat, natomiast mediana czasu trwania leczenia nerkozastępczego 31,3 miesięcy;
25–75%: 22,5 ± 34,6 miesięcy.
Mediana czasu trwania nadciśnienia tętniczego w badanej grupie wynosiła 7,0 lat; 25–75%: 5,8–12,0 lat. Wartości ciśnienia tętniczego wynosiły odpowiednio: średnie ciśnienie skurczowe przed zabiegiem hemodializy
— 152,1 ± 18,9 mm Hg; średnie ciśnienie rozkurczowe
przed zabiegiem — 86,6 ± 12,3 mm Hg; średnie ciśnienie skurczowe po zabiegu — 143,2 ± 19,8 mm Hg;
średnie ciśnienie rozkurczowe po zabiegu — 98,1 ±
± 10,7 mm Hg. Czas trwania cukrzycy w grupie II wynosił 15,8 ± 4,3 roku.
U wszystkich 65 chorych stosowano leczenie hipotensyjne, w tym u 19 osób — inhibitor konwertazy angiotensyny I, u 50 osób — lek blokujący kanały wapniowe, u 30
osób — lek blokujący receptor adrenergiczny b, a u 21
osób — lek blokujący receptor adrenergiczny a.
Pomiar wartości ciśnienia tętniczego
Wykonywano go przed środkowym w tygodniu zabiegiem hemodializy, w 15 min zabiegu oraz po 15 min
od momentu zakończenia hemodializy. Rutynowy pomiar wartości ciśnienia tętniczego wykonano sfigmomanometrem rtęciowym w standardowych warunkach.
Pomiarów dokonano w pozycji siedzącej, 3-krotnie w odstępach 5 min.
Badanie UKG
Badanie echokardiograficzne wykonano u wszystkich
chorych aparatem Hewlett-Packard Sonos 100, z głowicą o częstotliwości 2,5 MHz z jednoczesną rejestracją
zapisu EKG.
Pomiarów dokonywano w prezentacji jednowymiarowej (M-mode) z dwuwymiarowego echokardiogra-
www.ddk.viamedica.pl
419
Diabetologia Doświadczalna i Kliniczna rok 2003, tom 3, nr 5
mu (2D). Wymiar wewnętrzny lewej komory (EDd, end
diastolic diameter), grubość przegrody międzykomorowej (IVSd, interventricular septum diameter) i ściany
tylnej (PWd, posterior wall diameter) mierzono w fazie
końcoworozkurczowej (początek załamka Q zespołu
QRS) zgodnie z zaleceniami Amerykańskiego Towarzystwa Echokardiograficznego [22].
Masę lewej komory (LVM, left ventricular mass) oceniano 2-krotnie, w odstępie 12 miesięcy, na podstawie
formuły zaproponowanej przez Devereuxa i wsp.:
LVM = 1,04 [(EDd + IVSd +PWd)3 – EDd3] – 13,6.
Wskaźnik masy lewej komory (LVMI, left ventricular
mass index) przedstawiano jako iloraz masy i powierzchni
ciała [22, 23].
przy czym obliczenia wykonano jedynie dla próbek
o stężeniu triglicerydów poniżej 4,5 mmol/l.
Triglicerydy. Do oznaczeń stężenia triglicerydów stosowano zestawy (slajdy) Clinical Chemistry Slide-TRIG,
zawierające w kolejnych warstwach: surfaktant, lipazę,
oksydazę askorbinianową, peroksydazę, kinazę glicerolową, oksydazę L-a-glicerofosforanu oraz bufory z ATP
i MgCl2. Objętość próbki nałożonej na slajd wynosiła
10 ml surowicy, czas reakcji — około 5 min w 37oC,
odczyt przy długości fali 540 nm. Zakres oznaczeń:
10–3525 mg/dl, próbki o odczytach powyżej zakresu
rozcieńczano w proporcji 1:1 w roztworze Kodak Ektachem 7% BSA Solution. Współczynniki zmienności międzyseryjnej (CV) wynosiły 1,3–2,4%.
Oznaczenia biochemiczne
Badania genetyczne
Oznaczenia biochemiczne wykonywano z surowicy
krwi żylnej, pobranej z linii żylnej dializatora przed rozpoczęciem zabiegu hemodializy. Stężenia cholesterolu całkowitego, cholesterolu frakcji HDL oraz triglicerydów
oznaczono za pomocą zestawów Kodak Ektachem Clinical Chemistry Slide, w aparacie Kodak Ektachem 700
Analyzer. Oznaczenia we wszystkich zestawach były
oparte na kolorymetrycznych reakcjach enzymatycznych.
Cholesterol całkowity. Do oznaczeń stężenia
cholesterolu całkowitego stosowano zestawy (slajdy)
Clinical Chemistry Slide CHOL, zawierające w kolejnych warstwach surfaktant, hydrolazę estrów cholesterolu, peroksydazę, barwnik oraz bufory. Objętość
próbki nałożonej na slajd wynosiła 10 ml surowicy,
czas reakcji — około 5 min w 37oC, odczyt przy długości fali 540 nm. Zakres oznaczeń: 50–325 mg/dl,
próbki o odczytach powyżej zakresu rozcieńczano
w proporcji 1:1 w roztworze Kodak Ektachem 7% BSA
solution. Współczynniki zmienności międzyseryjnej
(% CV, coefficient of variation) wynosiły 1,4–4,1.
Cholesterol frakcji HDL. Oznaczenia stężenia cholesterolu frakcji HDL prowadzono identycznie jak w przypadku cholesterolu całkowitego, po uprzedniej precypitacji cząsteczek LDL i VLDL. Do probówki zestawu Kodak Ektachem HDL Cholesterol KIT, zawierającej 0,9 g/l
siarczanu dekstranu 50 000 MW oraz 45 mmol/l chlorku
magnezu, dodawano 0,5 ml surowicy. Po intensywnym
wytrząsaniu przez 30 s próbkę pozostawiano przez
5 min, następnie wirując przez 10 min w 1500 g. Z nadsączu pobierano 10 ml, postępując dalej jak w przypadku oznaczenia cholesterolu całkowitego. Zakres oznaczeń wynosił 0,1–130 mg/dl, a współczynniki zmienności międzyseryjnej (%CV) — 2,9–4,5%.
Cholesterol frakcji LDL. Stężenie cholesterolu frakcji LDL obliczano według wzoru podanego przez Friedewalda i wsp. [24]:
cholesterol LDL = cholesterol całkowity – cholesterol
frakcji HDL – triglicerydy/2,19;
420
Izolacja DNA
DNA izolowano z leukocytów krwi obwodowej.
Oznaczenia polimorfizmu I/D genu ACE
Namnażanie fragmentu DNA. Fragment intronu 16
namnażano metodą polimerazowej reakcji łańcuchowej
(PCR, polymerase chain reaction) z 2 specyficznymi primerami opisanymi przez Rigata i wsp. [16]:
— 5’-CTCGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3’;
— 5’-GATGTGGCCATCACATTCGTCCAGAT-3’.
Metodę PCR prowadzono w amplifikatorze GeneAmp
2400 (firmy Perkin Elmer) lub UNO II (firmy Biometra)
z 200 ng genomowego DNA w 50 ml mieszaniny reakcyjnej o składzie: 10 mmol/l primerów 1 i 2; 2,5 mmol/l
dATP, dGTP, dTTP, dCTP; 10 mmol/l Tris-HCl, pH —
8,8; 1,5 mmol/l MgCl2; 50 mmol/l KCl; 0,1% Triton X-100;
5% dimetylosulfoksyd (DMSO): 20 j./ml polimerazy Prime-Zyme (firmy Biometra).
Po wstępnej denaturacji w temperaturze 95oC przez
5 min prowadzono 30 następujących cykli: 1 min
w temperaturze 95oC, 1 min w 61oC, 1 min w 72oC. Końcową terminację prowadzono przez 7 min w temperaturze 72oC.
Elektroforeza produktów PCR. Uzyskany produkt
PCR rozdzielano na 2-procentowym żelu agarozowym
z dodatkiem bromku etydyny o stężeniu 0,4 mg/l, pod
napięciem 10 V/cm przez 40 min.
Obrazowanie namnożonych fragmentów DNA. Obraz prążków uzyskiwano i dokumentowano za pomocą
zestawu BioDoc z transiluminatorem UV (firmy Biometra). Homozygotę DD obrazowano jako prążek na wysokości 190 par zasad (bp), zaś homozygotę II jako prążek na wysokości 490 par zasad (bp). Obecność obu
fragmentów określała heterozygotę ID.
Preferencyjne namnażanie krótszego fragmentu allelu (ewentualny brak prążka I u heterozygot) wykluczano, wykonując PCR z parą primerów:
www.ddk.viamedica.pl
Janusz Gumprecht i wsp. Polimorfizm I/D genu ACE oraz CMA/B genu chymazy a przerost lewej komory u chorych z terminalną niewydolnością nerek
— 5’-TGGGACCACAGCGCCCGCCACGAC-3’;
— 5’-TCGCCAGCCCTCCCATGCCCATAA-3’, specyficzną dla wstawki insercyjnej, u wszystkich stwierdzanych homozygot DD.
Oznaczanie polimorfizmu CMA/B hCC genu
chymazy
Namnażanie fragmentu DNA. Fragment intronu 2
o długości 285 par zasad (bp) namnażano metodą PCR
z 2 specyficznymi primerami:
— 5’-GGAAATGTGAGCAGATAGTGCAGTC-3’;
— 5’-AATCCGGAGCTGGAGAACTCTTGTC-3’
opisanymi przez Pfeufer i wsp. [19]. Metodę PCR prowadzono w amplifikatorze GeneAmp 2400 (firmy Perkin-Elmer) lub UNO II (firmy Biometra) z 200 ng genomowego DNA w 50 ml mieszaniny reakcyjnej o składzie:
10 mmol/l primerów 1 i 2; 2,5 mmol/l dATP, dGTP, dTTP,
dCTP; 10 mmol/l Tris-HCl, pH — 8,8; 1,5 mmol/l MgCl2;
50 mmol/l KCl; 0,1% Triton X-100; 20 j./ml polimerazy
PrimeZyme (firmy Biometra).
Po wstępnej denaturacji w temperaturze 94oC przez
4 min prowadzono 39 następujących cykli: 30 s
w temperaturze 94o C, 15 s w 51o C, 30 s w 72o C. Końcową terminację prowadzono przez 7 min w temperaturze 72o C.
Trawienie przy użyciu enzymu restrykcyjnego.
Przez 4 godziny w temperaturze 50oC trawiono 10 ml
produktu PCR przy użyciu 2 j. enzymu restrykcyjnego
BstXI. Allel G zawierał sekwencję CCA(N)5ØNTGG, rozpoznawaną i trawioną przez BstXI. Allel A pozostawał
niestrawiony.
Elektroforeza produktów trawienia. Produkty trawienia rozdzielano na 2-procentowym żelu agarozowym
z dodatkiem bromku etydyny o stężeniu 0,4 mg/l, pod
napięciem 10 V/cm przez 40 min.
Obrazowanie produktów trawienia. Obraz prążków
uzyskiwano i dokumentowano za pomocą zestawu BioDoc z transiluminatorem UV (firmy Biometra). Homozygotę G/G obrazowano jako 2 prążki na wysokości 90
i 195 pary zasad (bp), homozygotę A/A jako prążek na
wysokości 285 par zasad (bp). Obecność 3 prążków
określała heterozygotę A/G .
Analiza statystyczna
Po uzyskaniu wszystkich wyników charakteryzujących badaną grupę za pomocą testu Kołmogorowa-Smirnowa sprawdzono, czy analizowane parametry
mają rozkład normalny. Dla rozkładu normalnego wyniki
przedstawiono jako wartość średnią ± odchylenie standardowe (x ± SD). Wartości parametrów, których rozkład nie spełniał warunków normalności, przedstawiono
jako wartość mediany oraz 25% i 75%.
Zależność pomiędzy badanymi genotypami a wskaźnikiem masy lewej komory serca oceniano, stosując
analizę wariancji oraz test post-hoc Scheffe.
Określając niezależny wpływ badanych genotypów
na wskaźnik masy lewej komory, wykonano analizę regresji wielokrotnej.
Opracowanie statystyczne wykonano za pomocą pakietu Statistica dla Windows, wersja 6.0 (StatSoft Inc.).
Dla wszystkich analiz statystycznych przyjęto jako znamienny poziom istotności równy lub mniejszy niż 0,05.
Wyniki
Charakterystykę kliniczną badanych grup przedstawiono w tabeli 1. Nie stwierdzono istotnych różnic w zakresie
LVMI lub przyrostu wskaźnika lewej komory w 12-miesięcznej obserwacji, w zależności od genotypu polimorfizmu ACE I/D (tab. 2). Wykazano natomiast, iż w grupie I
przyrost masy lewej komory był istotnie wyższy w grupie
homozygot GG polimorfizmu genu chymazy CMA/B niż
u homozygot AA oraz nosicieli allelu A (tab. 3). Podobnej
zależności nie obserwowano w grupie II. Analizując niezależny wpływ szeregu czynników na przyrost LVMI, wykazano istotny wpływ obecności genotypu GG, niezależny od wieku, średniego ciśnienia tętniczego przed hemodializą, czasu od rozpoznania choroby nerek do rozpoczęcia leczenia nerkozastępczego oraz czasu trwania leczenia nerkozastępczego (b = 0,34; p < 0,05). Powyższą
korelację wykazano jedynie w grupie I.
Dyskusja
Jak wykazano w poprzednich badaniach, patogeneza zwiększonej masy lewej komory jest wieloczynnikowa — obejmuje zarówno czynniki hemodynamiczne, jak
i niehemodynamiczne [1–6]. W niniejszej pracy badano
związek pomiędzy polimorfizmami genów kodujących
składowe układu renina-angiotensyna, takimi jak enzym
konwertujący angiotensynę I oraz chymaza, z przyrostem masy lewej komory serca u chorych z terminalną
niewydolnością nerek w przebiegu nefropatii cukrzycowej oraz pacjentów bez cukrzycy leczonych nerkozastępczo za pomocą powtarzanych hemodializ. Obserwacje autorów sugerują, że genetyczne markery analizowane w powyższym badaniu mogą mieć wpływ na
progresję przerostu masy lewej komory niezależnie od
współistniejącego nadciśnienia tętniczego, czynników
hemodynamicznych, szczególnie istotnych w badanych
w prezentowanej pracy grupach chorych z terminalną
niewydolnością nerek i cukrzycą [25]. Czynniki niehemodynamiczne, które mogą wpływać na przerost masy
lewej komory u osób z terminalną niewydolnością nerek
www.ddk.viamedica.pl
421
Diabetologia Doświadczalna i Kliniczna rok 2003, tom 3, nr 5
Tabela 1. Charakterystyka kliniczna badanych grup
Table 1. Clinical characteristic of the examine groups
Chorzy z terminalną
niewydolnością nerek
bez cukrzycy
(Grupa I)
Chorzy z terminalną
niewydolnością nerek
w przebiegu nefropatii
cukrzycowej (Grupa II)
Wiek (lata)
54,2 ± 11,6
52,1 ± 8,9
Wskaźnik masy ciała [kg/m2]
23,8 ± 3,4
22,7 ± 7,1
585,8 (455,4–780,1)
532,3 (371,3–738,2)
1,1 (0,92–1,23)
1,07 (0,87–1,17)
Stężenie kreatyniny w surowicy krwi [mmol/l]
Kt/V
Stężenie cholesterolu całkowitego [mmol/l]
4,37 ± 0,87
4,82 ± 0,76
Stężenie cholesterolu frakcji LDL [mmol/l]
2,83 ± 0,73
2,89 ± 0,65
Stężenie cholesterolu frakcji HDL [mmol/l]
1,2 (1,0–1,4)
1,18 (1,0–1,3)
Stężenie triglicerydów [mmol/l]
1,4 (1,0–2,03)
1,64 (1,2–2,2)
Średnie ciśnienie skurczowe przed hemodializą [mm Hg]
150,3 ± 25,0
152,1 ± 18,9
Średnie ciśnienie rozkurczowe przed hemodializą [mm Hg]
89,0 ± 11,6
86,6 ± 12,3
Średnie ciśnienie skurczowe po hemodializie [mm Hg]
148,1 ± 25,3
143,2 ± 19,8
Średnie ciśnienie rozkurczowe po hemodializie [mm Hg]
Czas trwania leczenia nerkozastępczego (miesiące)
95,0 ± 12,6
98,1 ± 10,7
38,1 (22,6–60,1)
31,3 (22,5–34,6)
Czas od rozpoznania choroby nerek
do rozpoczęcia leczenia nerkozastępczego (lata)
3,0 (0,9–8,0)
3,3 (0,5–7,0)
Wskaźnik masy lewej komory serca [g/m2]
195,3 ± 51,0
218,1 ± 48,3
Wskaźnik masy lewej komory serca po 12 miesiącach [g/m2]
291,1 ± 71,7
326,3 ± 81,3
D wskaźnika masy lewej komory
97,0 ± 45,1
108,1 ± 58,7
9,3 (6,0–14,0)
7,0 (5,8–12,0)
Czas trwania nadciśnienia tętniczego (lata)
Tabela 2. Wartości wskaźnika masy lewej komory serca (LVMI), wskaźnika masy lewej komory po 12-miesięcznej obserwacji
oraz D wskaźnika masy lewej komory w badanych grupach w zależności od genotypu polimorfizmu I/D genu ACE
Table 2. Left ventricular mass index values (LVMI), left ventricular mass index after 12 month observation and D left ventricular mass index in examined groups according to genotype of the ACE I/D polymorphism
Grupa I
Grupa II
II (n = 10)
ID (n = 27)
DD (n = 15)
II (n = 2)
LVMI [g/m ]
194,8 ± 54,9
193,1 ± 52,1
206,3 ± 47,3
216,3 ± 51,7
215,1 ± 52,1 219,3 ± 55,3
LVMI po 12 miesiącach [g/m2]
295,6 ± 87,3
300,8 ± 82,6
299,1 ± 63,4
308,5 ± 77,1
324,7 ± 78,6 327,1 ± 65,1
D LVMI
100,2 ± 43,4
108,8 ± 48,7
94,3 ± 51,1
92,6 ± 40,2
99,1 ± 53,7 108,6 ± 58,1
2
ID (n = 7)
DD (n = 4)
Tabela 3. Wartości wskaźnika masy lewej komory serca (LVMI), wskaźnika masy lewej komory po 12-miesięcznej obserwacji
oraz D wskaźnika masy lewej komory w badanych grupach w zależności od genotypu polimorfizmu CMA/B genu chymazy
Table 3. Left ventricular mass index values (LVMI), left ventricular mass index after 12 month observation and D left ventricular mass index in examined groups according to genotype of the CMA/B chymase polymorphism
Grupa I
Grupa II
AA (n = 21)
AG (n = 22)
GG (n = 9)
AA (n = 6)
LVMI [g/m ]
195,2 ± 55,3
201,3 ± 51,7
195,5 ± 54,7
218,5 ± 58,1
221,0 ± 71,6 224,1 ± 50,5
LVMI po 12 miesiącach [g/m2]
284,9 ± 68,4
300,1 ± 717
328,7 ± 79,9
330,4 ± 72,3
311,7 ± 60,9 345,1 ± 72,2
D LVMI
90,3 ± 39,9
99,8 ± 48,6
133,3 ± 60,6* 111,7 ± 45,8
90,8 ± 52,1 121,9 ± 45,4
2
*p < 0,05 w porównaniu z nosicielami genotypu AA oraz nosicielami allelu A
422
www.ddk.viamedica.pl
AG (n = 5)
GG (n = 2)
Janusz Gumprecht i wsp. Polimorfizm I/D genu ACE oraz CMA/B genu chymazy a przerost lewej komory u chorych z terminalną niewydolnością nerek
zarówno z nefropatią cukrzycową, jak i bez cukrzycy,
obejmują m.in. wiek i otyłość, zaburzenia reologiczne
krwi, podaż sodu oraz oporność insulinową [26–30].
Adams i wsp. [31] oraz Verhaaren i wsp. [32] w przeprowadzonych badaniach u bliźniąt sugerowali, iż LVM oraz
jej zmienność mogą być częściowo wyjaśnione wpływem czynników dziedzicznych. W kolejnych badaniach,
przeprowadzonych wśród osób bez niewydolności nerek, wykazano związek pomiędzy polimorfizmem I/D
genu ACE I a masą i przerostem lewej komory serca.
U osób będących homozygotami dla allelu delecji (D)
genu ACE obserwowano większe ryzyko przerostu lewej komory serca [33, 34]. Sugerowana zależność powyższego polimorfizmu ze zmianami masy lewej komory prawdopodobnie wynika ze zmiennego wpływu na
osoczowe stężenie i aktywność ACE. Osoby z genotypem DD charakteryzują się 2-krotnie wyższą aktywnością enzymu konwertującego niż homozygoty II, natomiast u heterozygot ID notuje się wartości pośrednie
[16]. W prezentowanej pracy, zarówno w grupie chorych z terminalną niewydolnością nerek w przebiegu nefropatii cukrzycowej, jak i w grupie osób bez cukrzycy
leczonych nerkozastępczo, nie wykazano istotnego
związku pomiędzy przerostem masy lewej komory serca
a poszczególnymi genotypami polimorfizmu I/D genu
ACE. Podobnej zależności nie obserwowano również
w trzech spośród czterech badań przeprowadzonych
u chorych dializowanych [13–15]. Jedynie Osono i wsp.
[11] wykazali związek genotypu DD z masą lewej komory u chorych dializowanych. Inną możliwością tworzenia
angiotensyny II w stosunku do enzymu konwertującego
jest droga związana z działaniem chymazy, jednak dotychczas nie określono jednoznacznie jej roli. Wydaje
się jednak, iż może być ona odpowiedzialna za nadmierne jej wytwarzanie w niektórych stanach patofizjologicznych [35]. Lokalizacja polimorfizmu CMA/B w obrębie niepodlegającego transkrypcji regionu 5’ genu chymazy, a także opisywana zależność z nasileniem stopnia przerostu u chorych z kardiomiopatią przerostową
wskazują na możliwy związek powyższego polimorfizmu
ze wzrostem miejscowego tworzenia angiotensyny II
[19]. Powyższe spostrzeżenia prawdopodobnie potwierdzają wyniki uzyskane w niniejszej pracy. Wykazano, iż
w grupie chorych z terminalną niewydolnością nerek,
o innej niż cukrzyca etiologii, przyrost masy lewej komory w 12-miesięcznej obserwacji jest istotnie wyższy
w grupie homozygot GG polimorfizmu genu chymazy
CMA/B, w porównaniu z homozygotami AA oraz nosicielami allelu A. Podobnej zależności nie obserwowano
w populacji chorych z terminalną niewydolnością nerek
w przebiegu nefropatii cukrzycowej. Ponadto analizując
niezależny wpływ szeregu czynników na przyrost wskaźnika masy lewej komory, wykazano istotny wpływ obecności genotypu GG, niezależny od wieku, średniego ciś-
nienia tętniczego przed hemodializą, czasu od rozpoznania choroby nerek do rozpoczęcia leczenia nerkozastępczego oraz czasu trwania leczenia nerkozastępczego. Brak opisywanych zależności w grupie chorych na
cukrzycę może wynikać z niedostatecznej liczebności
analizowanej populacji. Jest to obserwacja wstępna, dlatego aby jednoznacznie potwierdzić lub wykluczyć powyższe zależności, należy przeprowadzić dalsze badania, obejmujące zdecydowanie więcej chorych z terminalną niewydolnością nerek w przebiegu nefropatii cukrzycowej.
Podsumowując, można stwierdzić, iż wyniki niniejszych badań dotyczących polimorfizmów I/D genu ACE
oraz CMA/B genu chymazy wskazują na możliwy udział
co najmniej jednego z analizowanych markerów w genetycznej predyspozycji do rozwoju i przerostu masy
lewej komory u chorych z terminalną niewydolnością
nerek leczonych za pomocą dializ.
Streszczenie
Wstęp. Powikłania sercowo-naczyniowe są główną przyczyną zgonów chorych z terminalną niewydolnością nerek
leczonych nerkozastępczo. Uznanym czynnikiem ryzyka
nagłego zgonu u pacjentów dializowanych jest przerost mięśnia sercowego.
Celem pracy było uzyskanie odpowiedzi na pytania, czy
u chorych z terminalną niewydolnością nerek leczonych dializami istnieje związek pomiędzy masą lewej komory a polimorfizmem genu enzymu konwertującego angiotensynę I
lub polimorfizmem CMA/B genu chymazy oraz czy polimorfizm genu enzymu konwertującego angiotensynę I lub polimorfizm CMA/B genu chymazy mają wpływ na przerost
masy lewej komory w 12-miesięcznej obserwacji.
Materiał i metody. Badaniami objęto 65 chorych z terminalną niewydolnością nerek leczonych nerkozastępczo metodą powtarzanych hemodializ; w tym 52 osoby bez
cukrzycy (grupa I) i 13 osób z nefropatią cukrzycową (grupa II). U wszystkich pacjentów 2-krotnie (w odstępie 12 miesięcy) wykonano badanie echokardiograficzne. Oznaczono
polimorfizm I/D genu ACE oraz polimorfizm CMA/B hCC
genu chymazy. Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej za pomocą analizy wariancji, regresji wielokrotnej
oraz testu post-hock.
Wyniki. W 12-miesięcznej obserwacji nie wykazano związku
wskaźnika masy lewej komory ani jego przyrostu z polimorfizmem genu ACE I/D. W grupie osób bez cukrzycy (grupa I)
stwierdzono istotnie większy przerost masy lewej komory
u homozygot GG polimorfizmu genu chymazy CMA/B w porównaniu z homozygotami AA oraz nosicielami allelu A. W grupie tej zanotowano również istotny, niezależny wpływ obecności genotypu GG na przyrost wskaźnika masy lewej komory.
słowa kluczowe: polimorfizm genu, nefropatia cukrzycowa,
terminalna niewydolność nerek
www.ddk.viamedica.pl
423
Diabetologia Doświadczalna i Kliniczna rok 2003, tom 3, nr 5
Piśmiennictwo
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
424
Harnett J., Foley R., Kent G. i wsp. Congestive heart failure
in dialysis patients: Prevalence, incidence, prognosis and
risk factors. Kidney Int. 1995; 47: 884–890.
Silberberg J., Barre P., Prichard S., Sniderman A. Impact of
left ventricular hypertrophy on survival in end-stage renal
disease. Kidney Int. 1989; 36: 286–290.
Harnett J., Kent G., Barre P., Taylor R., Parfrey P. Risk factors for the developments of left ventricular hypertrophy in a
prospectively followed cohort of dialysis patients. J. Am.
Soc. Nephrol. 1994; 4: 1486–1490.
Greaves S., Gamble G., Collins J., Whalley G., Sharpe D.
Determinants of left ventricular hypertrophy and systolic dysfunction in chronic renal failure. Am. J. Kidney Dis. 1994;
24: 768–776.
Foley R., Parfrey P., Sarnak M. Clinical epidemiology of cardiovascular disease in chronic renal disease. Am. J. Kid.
Dis. 1998; 32: S112–S117.
Eknoyan G. On the epidemic of cardiovascular disease in
patients with chronic renal disease and progressive renal
failure: a first step to improve the outcomes. Am. J. Kid.
Dis. 1998; 32: S1–S5.
Puka J., Rutkowski B., Lichodziejewska-Niemierko M., Lao M.
i Krajowy Zespół Konsultanta Medycznego w Dziedzinie Nefrologii. Raport o stanie leczenia nerkozastępczego w Polsce
2001. Wyd. Akademia Medyczna w Gdańsku, Gdańsk 2002.
Lai K., Ng J., Whitford J. i wsp. Left ventricular function in
uremia: echocardiographic and radionuclide assessment in
patients on maintenance hemodialysis. Clin. Nephrol. 1985;
23: 125–129.
London G.M., Guerin A.P., Marchais S.J. i wsp. Cardiac and
arterial interactions in end-stage renal disease. Kidney Int.
1996; 50 (2): 600–608.
Holtz J. The cardiac rennin-angiotensin system: Physiological relevance and pharmacological modulation. Clin. Invest.
1993; 71: S25–S34.
Osono E., Kurihara S., Hayama N. i wsp. Insertion/deletion
polymorphism in intron 16 of the ACE gene and left ventricular hypertrophy in patients with end-stage renal disease.
Am. J. Kidney Dis. 1998; 32: 725–730.
Lindpainter K., Lee M., Larson M. i wsp. Absence of association of genetic linkage between the angiotensin-converting enzyme gene and left ventricular mass. N. Engl. J. Med.
1996; 334: 1023–1028.
Nagahara T., Ishigami T., Sano T. i wsp. Angiotensin-converting enzyme gene insertion/deletion polymorphism and
left ventricular hypertrophy in hemodialysis patients. Jpn.
Heart J. 1997; 38: 821–830.
Yildiz A., Akkaya V., Hatemi A. i wsp. No association between deletion type angiotensin-converting enzyme gene
polymorphism and left ventricular hypertrophy in hemodialysis patients. Nephron 2000; 84: 130–135.
Wang A., Chan J., Wang M. i wsp. Cardiac hypertrophy and
remodeling in relation to ACE and angiotensinogen genes
genotypes in Chinese dialysis patients. Kidney Int. 2003;
63: 1899–1907.
Rigat B., Hubert C., Alhenc-Gelas F., Cambien F., Corvol P.,
Soubrier F. An insertion/deletion polymorphism in the angiotensin I-converting enzyme gene accounting for half the
variance of serum enzyme levels. J. Clin. Invest. 1990; 86:
1343–1346.
Cambien F., Poirier O., Lecerf L. i wsp. Deletion polymorphism in the gene for angiotensin converting enzyme is
a potent risk factor for myocardial infarction. Nature 1992;
359: 641–644.
18. Caughey G.H., Schaumberg T.H., Zerweck E.H. i wsp. The
human mast cell chymase gene (CMA1): Mapping to the
cathepsin G/ granzyme gene cluster and lineage-restricted
expression. Genomics 1993; 15: 614–620.
19. Pfeufer A., Osterziel K.J., Urata H. i wsp. Angiotensin-converting enzyme and heart chymase gene polymorphism in hypertrophic cardiomyopathy. Am. J. Cardiol. 1996; 78: 362–364.
20. Urata H., Boehm K.D., Philip A. i wsp. Cellular localisation
and regional distribution of an angiotensin II-forming chymase in the heart. J. Clin. Invest. 1993; 91: 1269–1281.
21. Urata H., Kinoshita A., Perez D.M. i wsp. Cloning of the gene
and cDNA for human heart chymase. J. Biol. Chem. 1991;
266: 17173–17179.
22. Devereux R.B., Feigenbaum H., Gutgessel H. i wsp. American Society of Echocardiography Committee on Standards
Subcommitee on Quantitation of Two-Dimensional Echocardiograms. Recommendations for quantitation of the left ventricle two-dimensional echocardigraphy. J. Am. Soc.
Echocard. 1989; 2: 358–367.
23. Devereux R.B., Roman M. J. Evaluation of cardiac and
vascular structure and function by echocardiography and other
noninvasive techniques. W: Laragh J.H., Brenner B.M. (red.).
Hypertension: pathophysiology, diagnosis and management. Raven Press Ltd., New York 1995: 1969–1986.
24. Friedewald W., Levy R., Fredrickson D. Estimation of the
concentration of low-density lipoprotein cholesterol in plasma without use of preparative ultracentrifuge. Clin. Chem.
1972; 18: 499–502.
25. Weidmann P., Beretta-Piccoli C., Trost B. Pressor effects
and responsiveness accompanying diabetes mellitus. Hypertension 1985; 29: 33–42.
26. Lindpaintner K., Sen S. Role of sodium in hypertensive cardiac hypertrophy. Circ. Res. 1985; 57: 610–617.
27. Messerli F., Sungaard-Rise K., Ventura H., Dunn F., Oigman W.,
Frolich E. Clinical and hemodynamic determinants of left
ventricular dimensions. Arch. Intern. Med. 1984; 144: 477–
–481.
28. Devereux R., Drayer J., Chien S. Whole blood viscosity as
a determinant of cardiac hypertrophy in systemic hypertension. Am. J. Cardiol. 1984; 54: 592–595.
29. Schmieder R., Messerli F., Garavaglia G., Nunez B. Dietary
salt intake. A determinant of cardiac involvement in essential hypertension. Circulation 1988; 78: 951–956.
30. Lind L., Andersson P., Andren P., Hänni A., Lithell H. Left
ventricular hypertrophy in hypertension is associated with
insulin resistance metabolic syndrome. J. Hypertens. 1995;
13: 433–438.
31. Adams T., Yanowitz F., Fisher A. i wsp. Heritability of cardiac size: an echocardiographic and electrocardiographic
study of monozygotic and dizygotic twins. Circulation 1985;
71: 39–44.
32. Verhaaren H., Schieken R., Mosteller M., Hewitt J., Eaves L.,
Nance W. Bivariate genetic analysis of left ventricular mass
and weight in pubertal twins (the Medical College of Virginia twin study). Am. J. Cardiol. 1991; 68: 661–668.
33. Raynolds M., Bristow M., Bush E. i wsp. Angiotensin-converting enzyme DD genotype in patients with ischaemic or
dilated cardiomyopathy. Lancet 1993; 342: 1073–1075.
34. Schunkert H., Hense H., Holmer S. i wsp. Association between a deletion polymorphism of the angiotensin-converting enzyme gene and left ventricular hypertrophy. N. Engl.
J. Med. 1994; 330: 1634–1638.
35. Hollenberg N.K., Fisher N.D., Price D.A. Pathways for angiotensin II generation in intact human tissue: evidence from
comparative pharmacological interruption of the renin system. Hypertension 1998; 32: 387–392.
www.ddk.viamedica.pl