Ćwicz._2_organizmy wskaźnikowe_01.04.15 r.

Toksykologia - ćwiczenie 2
Zastosowanie organizmów wskaźnikowych do badania jakości wody i powietrza.
Oddziaływanie skażeń chemicznych środowiska na organizmy żywe.
Zadanie 1. Test określający wpływ środków chemicznych, używanych w gospodarstwie domowym, na
wzrost bakterii Pseudomonas fluorescens i Escherichia coli (test szybki na bakteriach)
Cel: Zapoznanie się z szybkim testem na bakteriach jako jednym z najczęściej stosowanych testów
fizjologicznych.
Materiały: jałowa woda destylowana, jałowy roztwór soli fizjologicznej, środki chemiczne (te same co
w ćw.1), zawiesina bakterii: Pseudomonas fluorescens, Escherichia coli, jałowe krążki bibułowe, agar
odżywczy na płytkach, pipety automatyczne, sterylne końcówki do pipet, palnik, końcówki do pipet z
obciętymi końcami, denaturat, głaszczki, pensety, papier milimetrowy.
Wykonanie:
Przygotować 4 połowiczne rozcieńczenia badanych związków (100%, 50%, 25%, 12,5%). Należy
przyjąć wyjściowe stężenie danego związku. Wykonać posiew dywanowy zawiesiny bakterii o
ekstynkcji E=0,1 w ilości 100μl na podłoże z agarem odżywczym. Dalsze czynności wykonać wg
wariantu 1 lub 2 (wskazuje prowadzący).
Wariant 1. Pobrać sterylnie końcówkę do pipety z obciętym końcem, nacisnąć tłok pipety
automatycznej do pierwszego oporu po czym (trzymając wciśnięty tłok) końcówkę pipety umieścić w
agarze odżywczym, aż dotknie ona spodniej części płytki. Wykonane w ten sposób nacięcie umożliwi
wykonanie studzienki, w tym celu należy zwolnić tłok i wyciągnąć agarowy krążek dzięki podciśnieniu.
Agarowy krążek należy wyrzucić. W podobny sposób wykonać jeszcze cztery studzienki, a do każdej z
nich nanieść 50 μl badanego rozcieńczenia, w jednej ze studzienek umieścić kontrolę – roztwór
fizjologiczny lub wodę do rozcieńczeń. Inkubować 24 lub 48h w temperaturze 20˚C. Zmierzyć
szerokość stref zahamowania wzrostu wokół krążków i porównać z próbą kontrolną. Wyniki zebrać w
tabeli oceniając wzrost znakami „+” lub „ –„.
Wariant 2. Na zaszczepionym podłożu położyć 5 jałowych krążków. Na krążki nanieść 10μl badanego
związku o innym stężeniu (4 stężenia) oraz wykonać kontrolę, dodając 10μl soli fizjologicznej.
Podpisać krążki na denku płytki. Inkubować 24 lub 48h w temperaturze 20˚C. Zmierzyć szerokość
stref zahamowania wzrostu wokół krążków i porównać z próbą kontrolną. Wyniki zebrać w tabeli
oceniając wzrost znakami „+” lub „ –„.
Zadanie 2. Test określający wpływ różnych środków chemicznych, używanych w gospodarstwie
domowym, na rzęsie drobnej Lemna minor
Lemna minor jest przedstawicielem roślin naczyniowych. Ze względu na małe rozmiary i łatwą
hodowlę stosuje się ją do badań biotoksykologicznych. Wpływ toksyczny badanej substancji na rzęsę
określa się na podstawie oceny jej stanu fizjologicznego (biomasy, ilości chlorofilu) oraz morfologii,
wielkości, kształtu listków, ich barwy (chloroza), długości korzonków.
Materiały: woda do rozcieńczeń, środki chemiczne ( 1%, 0,5%, 0,25%, 0,125%), hodowla rzęsy,
podłoże dla rzęsy, pipety, ezy lub szklane bagietki, cylindry miarowe, słoiki.
Wykonanie:
Hodowlę macierzystą podstawową prowadzić w kolbach stożkowych o pojemności 200 cm³
wypełnionych do 100cm³ pożywką dla rzęsy przy oświetleniu 2500 luxów w temperaturze 20°C. Co 810 dni przesadza się dwie – cztery rośliny (3 członowe) do kolby ze świeżą pożywką.
Przygotować połowiczne rozcieńczenia badanych związków w wodzie do rozcieńczeń, tak aby po
wprowadzeniu do podłoża hodowlanego dały żądane ostateczne stężenie. Wykonać test w pięciu
stężeniach i trzech powtórzeniach dla każdego skażenia, (w tym kontrola). Zaszczepić pożywkę
pięcioma roślinami z hodowli macierzystej. Przygotowane próby umieścić w termoluminestacie w
warunkach hodowli macierzystej. Inkubować 7 dni, mieszać hodowle raz w ciągu dnia. Po 7 dniach:
zaobserwować zmiany morfologiczne roślin, określić ciężar i zmierzyć długość korzeni. Wyniki
uśrednić i zebrać w tabeli, podać wnioski.
Zadanie 3. Test określający wpływ różnych środków chemicznych, używanych w gospodarstwie
domowym, na glonach z rodzaju Chlorella lub Scenedesmus, metodą liczenia komórek pod
mikroskopem w komorze Fuchsa-Rosenthala
Materiały: płynna hodowla glonów z rodzaju Chlorella lub Scenedesmus, komora Fuchsa-Rosenthala,
szkiełka nakrywkowe, pipety, bibułka
Komora Fuschsa-Rosenthala jest dość grubym szkłem, na którym podzielono jeden kwadrat na 16
mniejszych kwadracików. Kiedy komorę nakryje się szkiełkiem nakrywkowym, wtedy objętość
wewnętrzna wyniesie 3,2mm³
Wykonanie:
Próbę z hodowli płynnej należy rozcieńczyć, a następnie przenieść pipetą glony do komory. Komórki
liczy się w 8 losowo wybranych kwadracikach, czyli w połowie pól komory. Liczbę komórek glonów w
1ml zawiesiny należy obliczyć ze wzoru:
X = (a * 2)* 1000 /3,2*R
gdzie:
x – liczba komórek/ ml,
a – liczba komórek policzonych w 8 kwadratach,
1000 – liczba, która sprowadza wartość do objętości 1 cm³, czyli 1 ml,
3,2 mm³ - wewnętrzna objętość komory,
R - rozcieńczenie
Zadanie 4. Zatrucie
tlenkami azotu
ostre
organizmu
roślinnego
kwaśnymi
gazami: dwutlenkiem siarki i
Cel: Zapoznanie się z następstwami działania dużego stężenia kwaśnych gazów na organizm roślinny
Przypadki zatrucia ostrego roślin na skutek zanieczyszczenia powietrza emisjami przemysłowymi zdarzają się
stosunkowo rzadko, np. podczas katastrof ekologicznych spowodowanych awariami. Zatrucia takie mogą też
powodować opady atmosferyczne o wyjątkowo niskim pH.
Materiały: eksykatory, krystalizatory z uprawą hydroponiczną rzeżuchy, naczyńko wagowe, łyżeczka
metalowa do spalań, stężony kwas azotowy, opiłki miedziowe, siarka
Wykonanie:
Przygotować trzy eksykatory. Do każdego z nich wstawić krystalizator z uprawą hydroponiczną rzeżuchy.
Eksykator z hodowlą kontrolną zamknąć. Do drugiego eksykatora wprowadzić łyżeczkę z palącą się siarką.
Eksykator zamknąć niezwłocznie po spaleniu siarki i usunięciu łyżeczki. Do trzeciego eksykatora wstawić
naczyńko wagowe ze stężonym kwasem azotowym. Do naczyńka wsypać opiłki miedziowe. Eksykator
zamknąć.
W wyniku spalania siarki w drugim eksykatorze powstaje dwutlenek siarki. W trzecim eksykatorze miedź
reaguje ze stężonym kwasem azotowym z wydzieleniem bezbarwnego tlenku azotu. W wyniku reakcji
tlenku azotu z tlenem atmosferycznym powstaje brunatny dwutlenek azotu:
3 Cu + 8 HNO3
→
3 Cu(NO3)2 + 4 H2O + 2 NO
2 NO + O2
→
2 NO2
Zaobserwować reakcję roślin i orientacyjny czas, po jakim ona nastąpi.
Zadanie 5. Wpływ kwaśnych gazów na intensywność transpiracji
Cel: Zbadanie zmian
atmosferycznych
intensywności
transpiracji
spowodowanych działaniem kwaśnych opadów
Materiały: młode pomidory, kolby, korki z przewierconymi otworami, czarne płótno, pehametr, odczynniki do
przygotowania pożywki Knoppa, roztwory kwasu siarkowego i wodorotlenku sodowego do ustawiania pH
Wykonanie:
Dziesięć młodych pomidorów umieścić w kolbach z korkami z otworami. Kolby wypełnić pożywką do uprawy
hydroponicznej przygotowaną wg przepisu podanego niżej. Połowę pożywki doprowadzić kwasem siarkowym
do pH=3.5, resztę wodorotlenkiem sodowym do pH=6.6. Pięć pomidorów hodować w pożywce o obniżonym
pH, pięć w pożywce o pH obojętnym. Zaznaczyć poziom pożywki we wszystkich kolbach. Po dwóch dniach
uzupełnić pipetą wytranspirowaną wodę do kreski, zanotować ilość dolanej wody. Czynność tą powtórzyć
kilkakrotnie w odstępach mniej więcej tygodniowych. Wyniki przedstawić na wykresie ilości wytranspirowanej
wody w zależności od czasu.
Przygotowanie i prowadzenie hodowli hydroponicznej:
Pożywka Knoppa: Ca(NO3)2 • 4 H2O - 1.5 g; KNO3 - 0.25 g; MgSO4 • 7 H2O - 0.25 g; KCl - 0.12 g; KH2PO4 - 0.25
g; FeCl3 5% - 5 kropel; mikroelementy -1 cm3; woda destylowana 1 dm3;
Zmodyfikowany roztwór mikroelementów wg Arnona: H3BO3 - 2.86 g; MnCl2 • 4 H2O - 1.81 g; ZnSO4 • 7 H2O 0.222 g; CuSO4 • 5 H2O - 0.079 g; H2MoO4 - 0.084 g; woda destylowana - 1 dm3
Przygotowanie siewek do kultur wodnych: 10-14 dni przed ćwiczeniami wysiać nasiona do czystego,
wysterylizowanego piasku kwarcowego. Doniczkę zakryć szybą. Na spodeczek pod doniczką nalać wody,
codziennie ją uzupełniać, tak, aby piasek był stale wilgotny. Gdy siewki osiągną 2-3 cm wzrostu (powinny mieć
pierwsze liście dobrze rozwinięte) wyjąć je z piasku i umieścić w zlewkach z pożywkami: podważyć nożem
piasek i przenieść wraz z siewkami do krystalizatora z wodą; poruszając delikatnie spłukać wodą piasek. Jeżeli
bielmo jest duże, nasiona uciąć nie uszkadzając korzeni.
Nasiona można też umieścić na gazie rozciągniętej na wypełnionym wodą krystalizatorze, który stoi w większym
krystalizatorze, również wypełnionym wodą i przykrytym. Siewki pozostawić w krystalizatorze do chwili
rozwinięcia dwóch pierwszych liści. Wodę uzupełniać w miarę jej ubywania. Gdy siewki mają dwa pierwsze
liście, umieścić je w otworach pokrywek (korków) umocowując je watą.
Prowadzenie kultur wodnych: Słoje (kolby), pomalowane od zewnątrz farbą czarną a następnie białą lub
osłonięte czarnym płótnem napełnić pożywką do ok. 0.5-1.0 cm od górnej krawędzi (korka). W otworach
pokrywek (korków) umieścić badane siewki uszczelniając otwory watą. Korzenie powinny być zanurzone w
pożywce do szyjki korzeniowej, tak by nie zamoczyć waty. Hodowlę prowadzić w miejscu dobrze oświetlonym.
Codziennie przewietrzać pożywkę przelewając ją do naczynia zapasowego i z powrotem uzupełniając ubytki
pożywki co kilka dni.