Peroksydaza glutationowa

RANSEL
ODCZYNNIKI
Peroksydaza Glutationowa
TYLKO DO ZASTOSOWAŃ BADAWCZYCH
Zawartość
Nr Kat.
RS 504
8 x 6.5 ml
8 x 6 t Pół-mikro
8 x 2 t Makro
1. Odczynnik
8 x 6.5 ml
2. Bufor
1 x 70 ml
3. Wodoronadtlenek kumenu 1 x 1 ml
4. Środek rozcieńczający 2 x 200 ml
RS 505
8 x 10 ml
8 x 10 t Pół-mikro
8 x 4 t Makro
1. Odczynnik
8 x 10 ml
2. Bufor
1 x 100 ml
3. Wodoronadtlenek kumenu 1 x 1 ml
4. Środek rozcieńczający 2 x 200 ml
RS 506
8 x 30 ml
8 x 30 t Pół-mikro
8 x 12 t Makro
1. Odczynnik
8 x 30 ml
2. Bufor
1 x 250 ml
3. Wodoronadtlenek kumenu 1 x 1 ml
4. Środek rozcieńczający 4 x 200 ml
Pakiet uzupełniający Supplementary Pack:
MS 181
Odczynnik Drabkina
6 x 500 ml
(1)
METODA UV
Metoda ta jest oparta na takiej samej zasadzie, jak w przypadku Paglia i Valentine. Peroksydaza Glutationowa (GPX)
jest katalizatorem utleniania Glutationu (GSH) przez wodoronadtlenek kumenu Cumene Hydroperoxide. W obecności
reduktazy glutationowej Glutathione Reductase (GR)
i NADPH utleniony glutation Glutathione (GSSG) ulega natychmiastowej konwersji do zredukowanej formy z towa+
rzyszącym temu utlenieniem NADPH do NADP . Mierzone
jest zmniejszenie pochłaniania światła przy długości fali
wynoszącej 340 nm.
ZASADA REAKCJI
GPX
2GSH + ROOH
ROH + GSSG + H2O
+
GSSG + NADPH + H
GR
+
NADP + 2GSH
PRZYGOTOWANIE PRÓBKI
NaleŜy uŜywać heparynizowanej pełnej krwi.
W przypadku próbek uzyskanych u owiec i kóz naleŜy
rozcieńczyć 0.05 ml + 3 ml środka rozcieńczającego;
W przypadku bydła, koni i innych gatunków rozcieńczyć
0.05 ml + 2 ml środka rozcieńczającego.
Próbki ludzkie - patrz UWAGA.
1. Odczynnik
Glutation
Reduktaza Glutationowa
NADPH
2. Bufor
Bufor Fosforanowy
EDTA
3. Wodoronadtlenek kumenu
4. Środek rozcieńczający
PROCEDURA
StęŜenie w teście
4 mmol/l
≥ 0.5 U/l
0.34 mmol/l
Długość fali światła:
Kuweta:
Temperatura:
Pomiar:
340 nm
droga światła 1 cm
o
37 C
względem powietrza
Pipetować do kuwety:
Makro
0.05 mol/l; pH 7.2
4.3 mmol/l
0.18 mmol/l
PRZYGOTOWANIE ROZTWORÓW
1. Odczynnik Reagent
Zrekonstytuować jedną fiolkę odczynnika Reagent 1
przy uŜyciu odpowiedniej objętości bufora Buffer 2:
6.5 ml
dla
8 x 6.5 ml
zestaw (RS 504)
10 ml
dla
8 x 10 ml
zestaw (RS 505)
30 ml
dla
8 x 30 ml
zestaw (RS 506)
Zachowuje stabilność przez 48 godzin w temperaturze
o
od +2 do +8 C lub 8 godzin w temperaturze od +15 do
o
+25 C.
2. Bufor Buffer
Zawartość gotowa do uŜycia. Zachowuje stabilność do
upływu daty waŜności pod warunkiem, Ŝe jest przechowywany w temperaturze od +2 do +8°C.
3. Wodoronadtlenek kumenu Cumene Hydroperoxide
Rozcieńczyć 10 µl przy uŜyciu 10 ml redestylowanej
wody i zmieszać dokładnie przez energiczne wstrząsanie, poniewaŜ kumen jest trudny do rozpuszczenia.
Codziennie przygotowywać świeŜy roztwór. Koncentrat
zachowuje stabilność do upływu daty waŜności pod
warunkiem, Ŝe jest przechowywany w temperaturze od
o
+2 do +8 C.
W celu przeprowadzenia pomiaru objętości wodoronadtlenku kumenu naleŜy stosować pipety z dodatnim
działaniem przemieszczającym i szklane kapilary.
4. Środek rozcieńczający Diluting Agent
Zrekonstytuować zawartość jednej fiolki przy uŜyciu
środka rozcieńczającego Diluting Agent 4 z 200 ml
redestylowanej wody. Zachowuje stabilność przez 4
tygodnie pod warunkiem, Ŝe jest przechowywany w
o
temperaturze od +2 do +8 C lub przez 3 dni w temperao
turze od +15 do +25 C.
Rozc. Próbka
Destyl. H2O
Odczynnik
Kumen
Pół-mikro
Rozcieńcz.
Próbka
Ślepa
próba
Rozc.
Próbka
Ślepa
próba
0.05 ml
--2.50 ml
0.10 ml
--0.05 ml
2.50 ml
0.10 ml
0.02 ml
--1.00 ml
0.04 ml
--0.02 ml
1.00 ml
0.04 ml
Wymieszać,po upływie jednej minuty zmierzyć początkową
absorbancję próbki i próby ślepej, i jednocześnie uruchomić
czasomierz. Dokonać ponownego pomiaru po 1 i 2
minutach. Od wartości wyznaczonej dla próbki odjąć tę,
którą otrzymano dla ślepej próby.
OBLICZANIE
StęŜenie peroksydazy glutationowej Glutathione Peroxidase moŜna obliczyć na podstawie zaleŜności podanej
poniŜej:
U/l hemolizatu = 8412 x -A 340 nm / minutę
(Patrz informacje techniczne technical brief, gdzie
podano przykład).
ZAKRES REFERENCYJNY
27.5 - 73.6 U/g Hb
4171 - 10881 U/l
Zakres ten został zmierzony dla europejskiej populacji roboczej. Zaleca się, aby kaŜde laboratorium określiło swój
własny zakres prawidłowy.
KONTROLA JAKOŚCI
W celu skontrolowania dokładności precyzji i dokładności
dostępny jest test RANSEL (Nr Kat. SC 692 10 x 1 ml)
LINIOWOŚĆ
JeŜeli zmiana absorbancji na minutę przekracza 0.1 przy
340 nm, naleŜy odpowiednio rozcieńczyć próbkę przy uŜyciu środka rozcieńczającego i pomnoŜyć wynik przez
współczynnik rozcieńczenia.
abc
INSTRUKCJA - RANSEL - RS 504
(2,3)
UWAGA
W przypadku uŜywania pełnej, heparynizowanej krwi ludzkiej, do jej rozcieńczania zaleca się uŜycia odczynnika
Drabkina. Wynika to z obecności peroksydaz w krwi ludzkiej, co moŜe dać fałszywie podwyŜszone wyniki, a dodanie
cyjanku powoduje wyeliminowanie tego dodatniego zakłócenia. JednakŜe rozcieńczenie krwi przy uŜyciu środka
rozcieńczającego (roztwór 4) jest niezbędne przed dodaniem odczynnika Drabkina w celu spowodowania przemiany glutationu w postać zredukowaną. Wynika to z tego, Ŝe
cyjanek w formie utlenionej szybko prowadzi do inaktywacji.
Metoda opisana poniŜej jest zalecana przy uŜyciu odczynnika Drabkina o podwójnej mocy (Nr Kat. MS 181):
Przygotowanie: Rozcieńczyć zawartość jednej fiolki odczynnika Drabkina przy uŜyciu 480 ml wody redestylowanej. Przechowywać w taki sposób, aby zabezpieczyć go
przed światłem. Zachowuje stabilność przez 6 miesięcy lub
do upływu terminu waŜności, w zaleŜności od tego, co nastąpi wcześniej, pod warunkiem, Ŝe jest przechowywany
o
w temperaturze od +15 do +25 C.
Strona 2 / 2
Roztwór 3 jest szkodliwy, jeŜeli zostanie połknięty lub dostanie się do organizmu w postaci wziewnej. Powoduje on
podraŜnienie i jest łatwopalny.
Roztwór Drabkina zawiera cyjanek i moŜe być śmiertelnie
niebezpieczny, jeŜeli zostanie połknięty.
Na Ŝądanie dostępne są arkusze danych dotyczących
zdrowia i bezpieczeństwa Health and Safety Data Sheets.
Odczynniki mogą być uŜywane tylko do celów zgodnych z ich przeznaczeniem, przez odpowiednio wykwalifikowany personel laboratoryjny, w odpowiednich
warunkach laboratoryjnych.
LITERATURA
1. Paglia, D.E. and Valentine, W.N., J. Lab. Clin. Med.,
1967; 70: 158.
2. Kraus, R.J. & Ganther, H. E. Biochem. & Biophys. Res.
Comm 1980; 96: 1116.
3. Prohaska, J.R., Oh, S.H., Hoekstra, W.G. & Ganther,
H.E. Biochem. & Biophys. Res. Comm. 1977; 74: 64.
Rozcieńczyć 0.05 ml heparynizowenej, pełnej krwi przy
uŜyciu 1 ml środka rozcieńczającego; inkubować przez 5
minut i dodać 1 ml odczynnika Drabkina o podwójnej mocy.
Dobrze wymieszać i przeprowadzić oznaczenie w normalny
sposób. Zaleca się, aby oznaczenia dla próbek były przeprowadzane w czasie 20 minut od dodania odczynnika
Drabkina.
ŚRODKI OSTROśNOŚCI
Tylko do diagnostyki prowadzonej w warunkach in vitro. Nie
pipetować przy uŜyciu ust. Zachować typowe środki ostroŜności obowiązujące przy kontakcie z odczynnikami stosowanymi w warunkach laboratoryjnych.
Roztwór 2 zawiera azydek sodu Sodium Azide. NaleŜy unikać połknięcia lub zetknięcia ze skórą albo błonami śluzowymi. W przypadku kontaktu ze skórą spłukać obszar duŜą
ilością wody. W przypadku kontaktu z oczami lub jeŜeli
zostanie połknięty, zwrócić się natychmiast do lekarza.
Azydek sodu wchodzi w reakcję z ołowianymi lub miedzianymi elementami układu hydraulicznego, tworząc potencjalnie wybuchowe azydki. Kiedy usuwa się do odpadów tego
typu odczynniki, naleŜy spłukać je duŜą objętością wody
w celu uniknięcia gromadzenia się azydku. NaraŜone
metalowe powierzchni powinny być wyczyszczone przy
uŜyciu 10% wodorotlenku sodowego sodium hydroxide.
RANDOX Laboratories Ltd., Ardmore, Diamond Road, Crumlin, Co. Antrim, United Kingdom, BT29 4QY
Tel:CRUMLIN (028)94422413 Telex:748135 RANDOX G Fax.No.INT.44 (028)94452912 UK (028)94452912
Wersja zweryfikowana 04/09/00 CB
abcd
abc