M - Biologia grupa 5 @ Lamarr.pl

MODELOWANIE SZLAKÓW METABOLICZNYCH
1. Zagadnienia do samodzielnego przygotowania
a. W jakiej postaci gromadzona jest energia w komórce? Dlaczego ATP może wykonać pracę?
b. Na czym polega mechanizm syntezy ATP w procesie fosforylacji oksydatywnej (teoria
chemiosmotyczna Mitchella)?
c.
Od czego zależy szybkość reakcji katalizowanej przez enzym?
2. Literatura
B. Korzeniewski, “Metabolizm”, RM-FOSZE, Rzeszów 1996, Rozdział 1 i 3. Książka „Metabolizm”
jest dostępna w postaci pliku PDF na stronie internetowej: http://awe.mol.uj.edu.pl/~benio/
D.G. Nicholls, “Bioenergetyka”, PWN, Warszawa 1987, Rozdział 1.2 i 3.2.
3. Wstęp
Każdy z metabolitów M (związków biorących udział w przemianach biochemicznych
komórki, przetwarzanych w szlakach metabolicznych z jednego w drugi poprzez odpowiednie
enzymy) jest przez pewne reakcje produkowany (syntetyzowany; ewentualnie - pobierany z
otoczenia), podczas gdy inne reakcje zużywają go (przekształcają w inne związki; ewentualnie usuwają poza komórkę). Ilustruje to następujący schemat:
produkcja
→ M konsumpcja

→
W tak zwanym stanie stacjonarnym, typowym dla metabolizmu w organizmach żywych, który
nie ulega żadnym zaburzeniom, spełnione są następujące warunki:
a.) szybkość produkcji M równa jest szybkości jego zużycia i obie są stałe w czasie;
b.) stężenie M również pozostaje stałe, co jest prostą konsekwencją punktu a.).
W stanie stacjonarnym następuje zatem stały, jednokierunkowy przepływ strumienia metabolitów
przez szlak metaboliczny (np. A → B → C). Odróżnia go to od stanu równowagi, w którym ma
miejsce zerowy przepływ netto, ponieważ szybkość reakcji “do przodu” jest równa szybkości
reakcji “wstecz” (A ⇔ B). Stan równowagi właściwie nie występuje w organizmach żywych (które
są z natury układami dynamicznymi, strukturami dyssypatywnymi rozpraszającymi energię),
można go natomiast z łatwością otrzymać w probówce, kiedy reakcja zajdzie całkowicie, ustali
się równowagowa proporcja stężeń substratów i produktów, i nic już się nie będzie działo.
Wracając jednak do stanu stacjonarnego, to ma on miejsce wtedy, kiedy
zapotrzebowanie na metabolit M jest stałe, a substraty służące do jego syntezy nie ulegają
wyczerpaniu. Z rozmaitych powodów może jednak wzrosnąć (lub zmaleć) zapotrzebowanie
komórki na dany metabolit. Wtedy zaczyna on być zużywany z większą (mniejszą) szybkością,
niż dotychczas, a więc, mówiąc innymi słowy, następuje aktywacja (lub obniżenie) jego
konsumpcji. Oznacza to zaburzenie stanu stacjonarnego. Gdyby nie nastąpiła jednoczesna
aktywacja (lub zahamowanie) produkcji M, zostałby on w krótkim czasie całkowicie wyczerpany,
ponieważ synteza nie nadążałaby za zużyciem (albo też nagromadziłby się w wielkich ilościach,
gdyż synteza przewyższałaby zużycie). Nie leży to oczywiście “w interesie komórki”, która
potrzebuje M w stężeniu wystarczająco wysokim (aby mogły zachodzić reakcje dla których jest
on substratem), ale niezbyt wielkim, bo zaburzyłoby to równowagę osmotyczną i doprowadziło do
niepotrzebnego nagromadzenia w formie metabolitu M materii, która mogłaby być przekształcona
w inne metabolity potrzebne komórce. Z tych powodów, w organizmach żywych występują
mechanizmy, które aktywują (w sposób pośredni lub bezpośredni) także produkcję M, kiedy
wzrasta jego konsumpcja, a obniżają szybkość syntezy M, kiedy zapotrzebowanie na ten
metabolit spada. Tym samym, zapobiegają one wyczerpaniu M lub jego nadmiernemu
nagromadzeniu, a także zapewniają dostosowaną do potrzeb komórki szybkość przepływu
metabolitów przez szlaki metaboliczne. W ten sposób, mechanizmy te uczestniczą w zachowaniu
stałości warunków wewnętrznych w komórce pomimo zaburzeń pochodzących z otoczenia (w
tym wypadku: zmieniającego się zapotrzebowanie na poszczególne metabolity). Nazywamy to
homeostazą.
Po zaburzeniu danego stanu stacjonarnego, w rozpatrywanym przypadku po aktywacji
procesu produkcji i/lub konsumpcji M, następuje krótkotrwały stan przejściowy, podczas którego
szybkości poszczególnych reakcji oraz stężenia metabolitów ulegają zmianie dopóty, dopóki
szybkości produkcji i konsumpcji poszczególnych metabolitów nie wyrównają się na nowym
poziomie, a stężenia tych metabolitów nie ustabilizują się przy nowej wartości. Wtedy zostanie
osiągnięty nowy stan stacjonarny.
Zasadniczo istnieją dwa główne mechanizmy, które mogą aktywować produkcję M,
dostosowując ją do szybkości zużycia tego metabolitu warunkowanej aktualnymi potrzebami
komórki. Są to:
A. Sprzężenie zwrotne ujemne. Szybkość konsumpcji M zostaje bezpośrednio
aktywowana (następuje wzrost stałej szybkości tego procesu) przez jakiś sygnał
zewnętrzny X. W miarę zużycia M jego stężenie spada. Ponieważ wysokie [M]
hamuje blok reakcji prowadzących do jego syntezy (hamowanie przez produkt),
spadek stężenia M powoduje aktywację (odblokowanie) procesu produkcji M. To z
kolei prowadzi do wzrostu stężenia M, a więc do częściowej kompensacji spadku
tego stężenia spowodowanego wzrostem konsumpcji M. Spadek [M] powoduje, iż
wzrost konsumpcji M (a więc także wzrost przepływu metabolitów przez drogę
biochemiczną) jest mniejszy, niż wynikałoby to ze stopnia aktywacji konsumpcji M
przez X. W przypadku mechanizmu sprzężenia zwrotnego ujemnego proces
produkcji M nie jest aktywowany bezpośrednio przez zewnętrzny czynnik X, lecz
jedynie pośrednio, poprzez spadek [M]. Mechanizm ten prowadzi zatem do
częściowego przeciwdziałania spadkowi stężenia M na skutek zwiększonego
zapotrzebowania na ten metabolit. Działanie sprzężenia zwrotnego ujemnego
ilustruje poniższy schemat:
B. Równoległa aktywacja. Czynnik X aktywuje bezpośrednio (zwiększa stałą szybkości
reakcji) w takim samym stopniu (tyle samo razy) zarówno produkcję, jak i konsumpcję metabolitu
M. W tym wypadku szybkość konsumpcji M, równa w nowym stanie stacjonarnym szybkości
przepływu metabolitów przez dany szlak metaboliczny, rośnie w takim samym stopniu, w jakim
procesy produkcji i konsumpcji M zostały aktywowane przez zewnętrzny efektor X. Natomiast
stężenie M pozostaje niezmienione. Mechanizm równoległej aktywacji ilustruje poniższy
schemat:
Możliwy jest mechanizm pośredni pomiędzy sprzężeniem zwrotnym ujemnym a
równoległą aktywacją, kiedy to produkcja M jest bezpośrednio aktywowana przez zewnętrzny
czynnik X, ale w mniejszym stopniu, niż konsumpcja X.
Jednym z najistotniejszych metabolitów (M) produkowanych i konsumowanych w
komórce jest uniwersalny ‘nośnik energii’, ATP. Zapotrzebowanie na ATP nie jest stałe w czasie.
W spoczynkowym stanie stacjonarnym ATP jest zużywane na procesy niezbędne do
podtrzymania komórki przy życiu, takich jak synteza białek, kwasów nukleinowych lub transport
jonów przez błony komórkowe. Zapotrzebowanie na ATP może wzrosnąć kiedy komórka ma do
wykonania jakąś pracę wymagającą energii. Komórka przechodzi wtedy (poprzez stan
przejściowy) do aktywnego stanu stacjonarnego, charakteryzującego się zwiększoną
konsumpcją i produkcją ATP. Spektakularnym przykładem jest skurcz komórki mięśniowej,
podczas którego zużycie ATP może wzrosnąć 100-krotnie (mięśnie szkieletowe ssaków) lub
nawet 1000-krotnie (mięśnie skrzydeł owadów) w stosunku do wartości spoczynkowej. Wewnątrz
komórki mięśniowej, pobudzonej do skurczu impulsem nerwowym, sygnałem decydującym o
przesuwaniu się wobec siebie filamentów miozyny i aktyny (proces zużywający ATP) jest wzrost
stężenia jonów wapnia (pełniących rolę czynnika X). Z drugiej strony, ciągle pozostaje tematem
debaty naukowej problem w jaki sposób proces fosforylacji oksydatywnej w mitochondriach
“dowiaduje się” o tym, jak szybko powinien on produkować ATP w danej chwili. Zgodnie z
powyższym, konkurują ze sobą dwie skrajne koncepcje:
A. Sprzężenie zwrotne ujemne. Czynnik X (jony wapnia) aktywuje bezpośrednio jedynie
konsumpcję ATP, produkcja ATP jest aktywowana pośrednio poprzez spadek
stosunku [ATP]/[ADP], którego wysoka wartość hamuje fosforylację oksydacyjną w
mitochondriach.
B. Równoległa aktywacja. Czynnik X aktywuje bezpośrednio w podobnym stopniu
zarówno konsumpcję, jak i produkcję ATP, zaś stężenie ATP (stosunek [ATP]/[ADP])
utrzymuje się na względnie niezmienionym poziomie.
Problem który z powyższych mechanizmów odgrywa zasadniczą rolę, nie doczekał się jeszcze
definitywnego rozwiązania na drodze eksperymentalnej. Można jednak rozważyć w sposób
teoretyczny który z nich byłby korzystniejszy, czyli bardziej efektywny ze względu na zachowanie
homeostazy w komórce. Do oceny efektywności obu mechanizmów mogą posłużyć 3 kryteria:
1. To, który z mechanizmów powoduje większy wzrost szybkości konsumpcji ATP przy tej
samej aktywacji konsumpcji ATP (wzroście stałej szybkości konsumpcji ATP). Zakładamy dla
potrzeb ćwiczenia, iż czynnik X (jony wapnia) zwiększa stałą szybkości konsumpcji ATP w
komórce mięśniowej 80 razy. Oznacza to, iż w czasie skurczu komórka “chciałaby” zużywać
80 razy więcej ATP w jednostce czasu, niż w stanie spoczynkowym (np. u antylopy w czasie
ucieczki przed gepardem). Zachodzi pytanie który z mechanizmów jej na to pozwoli.
2. To, który z mechanizmów powoduje mniejsze zmiany w stężeniu ATP (w stosunku
[ATP]/[ADP]). Duży spadek w [ATP] zahamowałby reakcje utrzymujące komórkę przy życiu
(synteza białek, kwasów nukleinowych, transport jonów), których przebieg sprzężony jest z
hydrolizą ATP. Zahamowanie tych procesów mogłoby doprowadzić do uszkodzenia lub
śmierci komórki;
3. To, w którym z mechanizmów występuje krótszy stan przejściowy pomiędzy spoczynkowym
stanem stacjonarnym i aktywnym stanem stacjonarnym. Dla homeostazy komórki i całego
zwierzęcia istotne jest dostosowanie się do nowych warunków tak szybko, jak to tylko
możliwe.
Powyższy problem można badać teoretycznie przy pomocy dynamicznego modelu
kinetycznego, opisującego w sposób ilościowy procesy produkcji i konsumpcji ATP. W modelu
kinetycznym szybkość wszystkich opisywanych procesów (np. reakcji enzymatycznych) jest
wyrażona jako funkcja stężeń rozmaitych metabolitów (substratów, produktów, inhibitorów,
aktywatorów itp.). Szybkości zmian stężeń poszczególnych metabolitów w czasie są wyrażone w
postaci układu równań różniczkowych. Wartości poszczególnych parametrów (szybkości, stężeń)
w kolejnych momentach czasowych obliczane są przy pomocy komputera - pozwala to na
prześledzenie zmian tych parametrów w czasie. Możemy np. zobaczyć, co się z nimi stanie w
momencie wzrostu zapotrzebowania na ATP. W niniejszym ćwiczeniu wykorzystany będzie
bardzo uproszczony model produkcji i zużycia ATP w mięśniu.
Cele ćwiczenia
a. Nauka samodzielnej interpretacji wyników naukowych (w tym przypadku: symulacji
komputerowych) oraz samodzielnego formułowania wniosków i rozwiązywania problemów
badawczych.
b. Pokazanie przydatności komputerowych modeli kinetycznych do rozwiązywania problemów
biochemicznych I fizjologicznych.
5. Aparatura
Jedyną używaną aparaturą będzie komputer. Symulacje zostaną przeprowadzone przy
pomocy programu ATP2, napisanego na użytek ćwiczeń.
6. Opis modelu
Model układu produkcji i konsumpcji ATP
Równania kinetyczne
max
vPROD = VPROD
⋅
[ ADP]
[ ADP] + Km
vKONS = kKONS ⋅ [ ATP]
szybkość produkcji ATP
szybkość konsumpcji ATP
Parametry
max
PROD
V
= 10
szybkość maksymalna produkcji ATP
k KONS = 0.01
stała szybkości konsumpcji ATP
Km = 9
stała Michaelisa-Menten procesu produkcji ATP ze względu na [ADP]
A = 101
suma stężeń nukleotydów adeninowych: [ATP] + [ADP]
Zmienna niezależna
[ ATP]
stężenie ATP
Zmienna zależna
[ ADP] = A − [ ATP]
stężenie ADP
Równanie różniczkowe (szybkość zmiany stężenia ATP w czasie)
d[ ATP] / dt = vPROD − vKONS
Aktywacja produkcji i konsumpcji ATP
“konsumpcja * n” oznacza, że stała szybkości konsumpcji została zwiększona przez X n razy;
“produkcja * n” oznacza, że szybkość maksymalna produkcji została zwiększona przez X n razy.
7. Wykonanie ćwiczenia
a. Włączyć komputer. Wejść do katalogu ATP. Uruchomić program atp2.exe. Po
wprowadzeniu stopnia aktywacji produkcji i konsumpcji (podanego dla
poszczególnych symulacji w następnych podpunktach) ukaże się wykres
przedstawiający zależność wartości szybkości produkcji ATP oraz stosunku
[ATP]/[ADP] (oś Y) od czasu (oś X). Umowne jednostki na osi Y odnoszą się
zarówno do szybkości konsumpcji ATP, jak i stosunku [ATP]/[ADP]. Końcowe
wartości szybkości (ang. rate) oraz stosunku [ATP]/[ADP] są przedstawione w
okienkach w górnej części monitora komputera. Aktywacja następuje (o ile w ogóle
ma miejsce) w punkcie czasowym 2 (w jednostkach umownych).
b. Przeprowadzić symulację spoczynkowego stanu stacjonarnego, w którym brak
jakiejkolwiek aktywacji. Zatem, zarówno konsumpcja, jak i produkcja ATP jest
aktywowana 1-krotnie (* 1) (to właśnie odpowiada brakowi aktywacji). Przerysować
otrzymany wykres i zanotować spoczynkowe wartości szybkości zużycia ATP oraz
stosunku [ATP]/[ADP]. Opisać, z jakim stanem mamy do czynienia.
c.
Przeprowadzić symulację aktywacji układu (przejścia do aktywnego stanu
stacjonarnego) przy użyciu mechanizmu sprzężenia zwrotnego ujemnego.
Aktywujemy konsumpcję ATP 80 razy, natomiast produkcja nie jest bezpośrednio
aktywowana (= aktywacja 1 raz). Przerysować otrzymany wykres. Zanotować, jak
zmieniły się w wyniku aktywacji: szybkość konsumpcji ATP oraz stosunek
[ATP]/[ADP]. Opisać spoczynkowy stan stacjonarny, aktywny stan stacjonarny oraz
stan przejściowy. Zmierzyć przybliżoną długość trwania (w jednostkach umownych)
stanu przejściowego.
d. Przeprowadzić symulację aktywacji układu (przejścia do aktywnego stanu
stacjonarnego) przy użyciu mechanizmu równoległej aktywacji. Aktywujemy zarówno
konsumpcję, jak i produkcję ATP 80 razy. Przerysować otrzymany wykres.
Zanotować, jak zmieniły się w wyniku aktywacji: szybkość konsumpcji ATP oraz
stosunek [ATP]/[ADP]. Opisać spoczynkowy stan stacjonarny, aktywny stan
stacjonarny oraz stan przejściowy. Zmierzyć przybliżoną długość trwania (w
jednostkach umownych) stanu przejściowego.
e. Przeprowadzić symulację aktywacji układu (przejścia do aktywnego stanu
stacjonarnego) przy użyciu jakiegoś mechanizmu pośredniego pomiędzy
sprzężeniem zwrotnym ujemnym i równoległą aktywacją. Wymyślić, ile może
wynosić (ilokrotna ma być) aktywacja konsumpcji i produkcji ATP przy takim
mechanizmie. Przerysować otrzymany wykres i opisać go analogicznie do dwóch
poprzednich wykresów.
8. Opracowanie wyników
a. Opisać, jakie zmiany w szybkości konsumpcji ATP oraz w stosunku [ATP]/[ADP]
zaszły na czterech powyższych wykresach w czasie trwania symulacji i dlaczego (co
spowodowało te zmiany, o ile one zaszły). Skorzystać z kinetycznego opisu modelu
przedstawionego powyżej.
b. W oparciu o trzy przedstawione wcześniej kryteria zdecydować i uzasadnić, który z
analizowanych mechanizmów (sprzężenie zwrotne czy równoległa aktywacja) jest
bardziej korzystny ze względu na zachowanie homeostazy oraz funkcjonowanie
komórki i dlaczego.
UWAGA: Sprawozdania będą oddawane i oceniane w trakcie ćwiczeń.
9. Słowniczek terminów angielskich użytych w programie ATP2
activation - aktywacja
arbitrary units - jednostki umowne
concentration - stężenie
consumption - konsumpcja
production - produkcja
rate - szybkość