Ćwiczenie 5

KATEDRA
INŻYNIERII CHEMICZNEJ I PROCESOWEJ
INSTRUKCJE DO ĆWICZEŃ LABORATORYJNYCH
Ćwiczenie nr 5
Przedmiot: Techniki Rozdzielania Mieszanin
Kierunek studiów: Biotechnologia, semestr 6-ty, studiów I-go stopnia
Opracowali:
Zatwierdził :
dr inż. Grzegorz Boczkaj
prof. dr hab. inż. Marian Kamiński
mgr inż. Malwina Momotko
Gdańsk, 2015
Spis treści
1. Wstęp ...................................................................................................................................... 3
2.
Kontrola jakości frakcji eluatów oraz substancji izolowanych w postaci czystej .............. 3
2.1 Metody oznaczania ilościowego w technikach chromatograficznych ............................. 3
2.2. Badanie czystości ............................................................................................................ 5
2.2.1 Metody określania czystości ..................................................................................... 7
3. Zagadnienia ekonomiki otrzymywania czystych substancji z zastosowaniem technik
chromatograficznych ................................................................................................................ 10
3.1
Efektywność
ekonomiczna
(produktywność)
rozdzielania
preparatywnego
i
procesowego ......................................................................................................................... 10
3.2. Zagadnienia „ekonomicznego” postępowania w skali preparatywnej i procesowej ..... 11
3.2.1 Regeneracja aktywności sorpcyjnej kolumny ............................................................. 11
3.3 Odzysk Eluentów ........................................................................................................... 12
4. Wykonanie ćwiczenia .......................................................................................................... 14
4.1 Oznaczanie wybranych białek w frakcjach eluatów zebranych podczas wcześniejszych
ćwiczeń ................................................................................................................................. 14
4.2 Oznaczanie laktozy w frakcjach eluatów zebranych podczas wcześniejszych ćwiczeń 16
4.3. Kontrola jakości frakcji eluatów zebranych podczas rozdzielania ekstraktu z trawy ... 16
4.4 Część demonstracyjna - otrzymanie czystych substancji z zastosowaniem rotacyjnej
wyparki obrotowej i odzysk eluentów z zastosowaniem destylacji z kolumną rektyfikacyjną
.............................................................................................................................................. 17
5. Wymagania do sprawdzianu ................................................................................................ 17
6. Literatura .............................................................................................................................. 17
Literatura podstawowa ......................................................................................................... 17
Literatura dodatkowa............................................................................................................ 18
7. Sprawozdanie ....................................................................................................................... 19
2
1. Wstęp
Przeprowadzone dotychczas zajęcia laboratoryjne z technik rozdzielania mieszanin
dla studentów 3-go roku Biotechnologii umożliwiły zapoznanie się różnorodnymi technikami
rozdzielania mieszanin, w tym rozdzielania i zbierania frakcji w skali preparatywnej z
zastosowaniem techniki chromatografii cieczowej. Celem ćw. nr 5 jest przede wszystkim
poznanie zasad izolacji w postaci czystych składników poszczególnych frakcji eluatu. Frakcje
zebrane podczas wcześniejszych ćwiczeń zostaną poddane kontroli jakości
w zakresie
określenia składu frakcji, w tym zawartości pożądanego składnika. W przypadku czystych
preparatów zostanie zbadana ich czystość.
2. Kontrola jakości frakcji eluatów oraz substancji izolowanych w
postaci czystej
W przypadku zebranej frakcji eluatu, przed przystąpieniem do dalszych operacji
jednostkowych mających na celu izolację wybranej substancji w postaci czystej, konieczne
jest określenie stężenie pożądanego (cennego) składnika we frakcji. Pozwala to na
zaprojektowanie odpowiednich warunków kolejnych etapów izolacji oraz oszacowanie
zysków finansowych wynikających z teoretycznej wydajności całego procesu. Znajomość
stężenia składnika cennego w zebranej frakcji pozwala również na ocenę efektywności jego
izolacji w kolejnych krokach.
Dla substancji izolowanej w postaci (teoretycznie) czystej, należy zbadać faktyczną czystość,
tzn. określić zawartość składnika cennego w uzyskanym preparacie albo oznaczyć zawartość
wszystkich zanieczyszczeń.
2.1 Metody oznaczania ilościowego w technikach chromatograficznych
Wybór odpowiedniej metody oznaczeń ilościowych ma kluczowe znaczenia dla
funkcjonowania kontroli jakości zbieranych frakcji i izolowanych czystych substancji.
Wybrana metoda powinna charakteryzować się przede wszystkim możliwie największą
dokładnością (minimalizacja błędu oznaczenia) i precyzją (maksymalizacja powtarzalności,
niski rozrzut wyników). Wybór metody zależy od rodzaju badanych próbek, ich liczby,
złożoności matrycy, a także od ceny i dostępności substancji wzorcowych.
3
Obszerny opis metod ilościowych przedstawiono w [*] – do obligatoryjnego zapoznania się
przed przystąpieniem do zajęć laboratoryjnych. Poniższy opis stanowi uzupełnienie do [*] o
praktyczne aspekty stosowania poszczególnych metod oznaczeń ilościowych.
Metoda wzorca wewnętrznego (Internal Standard) ma zastosowanie szczególnie w
przypadku metody analitycznej wymagającej kilku etapowej procedury przygotowania próbek
do analizy. Wzorcem wewnętrznym jest substancja, która pierwotnie nie występuje w próbce
i jest do niej dodawana. Wzorzec wewnętrzny dodawany jest na ogół przed pierwszym
etapem procedury i „towarzyszy” analitom na wszystkich etapach. Często w przypadku
oznaczania wielu analitów w tej samej próbce stosuje się kilka wzorców wewnętrznych
odpowiednich do danej grupy substancji oznaczanych. Kluczowe znaczenie ma tutaj
podobieństwo fizykochemiczne analitów i wzorca wewnętrznego. W ten sposób ewentualne
straty na skutek odparowania, sorpcji na naczyniach i inne mają miejsce w takim samym
stopniu w odniesieniu do analitów i wzorca wewnętrznego. Podczas walidacji metodyki
określana jest zależność stosunku sygnałów analitu i wzorca wewnętrznego (Ai/AIS) od
stosunku ich stężeń (Ci/CIS) na etapie oznaczeń końcowych (po wykonaniu całej procedury
przygotowania próbki). Wykonywane jest to w oparciu o cały zakres oczekiwanych stężeń
analitu przy założonym stałym stężeniu wzorca wewnętrznego, który będzie dodawany do
próbki, albo z zastosowaniem jednego roztworu wzorcowego o założonym stężeniu analitu i
wzorca wewnętrznego. Względny współczynnik odpowiedzi (ang. Relative Responce Factor,
RRF) dla danej substancji i względem wzorca wewnętrznego jest stosowany do obliczenia
stężenia analitu w próbce na podstawie wartości pól powierzchni piku substancji i i wzorca
wewnętrznego, którego stężenie w próbce jest znane (ponieważ analityk wie ile go dodał
przed rozpoczęciem badania). W przypadku procedury jednoetapowej ogromną zaletą metody
jest niewrażliwość na zmianę ilości dozowanej próbki. Ma to szczególne znaczenie w
przypadku problemów z powtarzalnością dozowania.
Metoda wzorca zewnętrznego (External Standard) – nazywana inaczej krzywą
kalibracyjną. Zaletą metody jest możliwość pełnej automatyzacji, w przypadku procedury
jednoetapowej. Zastosowanie automatycznego podajnika próbek ogranicza pracę analityka do
napełnienia fiolek badanymi próbkami i umieszczenia ich w podajniku. W przypadku
manualnego dozowania próbek, metoda nie jest polecana dla początkujących analitów, z
uwagi na możliwe problemy z powtarzalnością dozowania.
4
Metoda dodatku wzorca (Standard Addition) umożliwia wykonanie oznaczeń
analitów w oparciu o rzeczywistą matrycę próbki. Szczególnie, kiedy jest bardzo trudne bądź
niemożliwe otrzymanie matrycy (placebo), w której nie znajdowałaby się substancja
oznaczana, np. w przypadku próbek klinicznych i środowiskowych. Szczególną cechą tej
metody jest jej wysoka "odporność" na sytuację niepełnego rozdzielenia analitu oraz gdy pik
substancji oznaczanej nie jest rozdzielony do linii podstawowej od innych substancji, których
piki są jednak znacznie mniejsze w stosunku do substancji oznaczanej.
Metodę prostej normalizacji, stosuje się, gdy wykorzystywany jest detektor
refraktometryczny lub detektor światła rozproszonego. Detektory te wykazują zbliżoną
odpowiedź dla różnych substancji o zbliżonej strukturze i masie cząsteczkowej. Metoda
znajduje zastosowanie w przypadku oznaczeń dokonywanych dla próbek składających się z
kilku substancji albo kilku grup substancji, korzystnie na podobnym poziomie stężeń.
Warunkiem zastosowania metody normalizacji jest wykrywanie przez detektor wszystkich
składników próbki. W przypadku różnej odpowiedzi detektora dla badanych substancji należy
zastosować odpowiednie współczynniki korekcyjne.
2.2. Badanie czystości
Pierwszym etapem przy oznaczaniu czystości badanej substancji jest identyfikacja
jakościowa głównego składnika, w przypadku kiedy nie jest on jednoznacznie określony lub
głównym składnikiem może być jeden z izomerów.
W tym celu należy rozważyć wszelkie dostępne techniki dające możliwość
identyfikacji głównego składnika. W przypadku gdy właściwości fizyczne badanego
materiału są charakterystyczne i dobrze znane, do identyfikacji może posłużyć wyznaczenie
jednego lub kilku charakterystycznych parametrów, takich jak np. temperatura topnienia. W
większości przypadków konieczne jest jednak wykorzystanie bardziej zaawansowanych
technik instrumentalnych takich jak:
•
Chromatografia gazowa (GC),
•
wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC),
•
magnetyczny rezonans jądrowy (NMR),
•
spektrometria mas (MS) ,
•
techniki spektroskopowe (UV, VIS, IR, Ramana).
5
Kolejnym etapem jest zbadanie obecności lub braku typowych zanieczyszczeń, a w
przypadku ich wykrycia, dokonanie oznaczeń ilościowych. W takich przypadkach
powszechne jest, dla oznaczania zanieczyszczeń organicznych, stosowanie technik łączonych,
tj. stanowiących kombinację technik rozdzielania oraz różnych technik detekcji, np.
chromatografia gazowa z detekcją płomieniowo jonizacyjną (GC-FID) czy w sprzężeniu ze
spektrometrią
mas
(GC-MS),
chromatografia
cieczowa
(LC)
z
detektorem
refraktometrycznym (LC-RID), spektrofotometrycznym UV albo UV-DAD (LC-UV/DAD)
oraz masowym (LC-MS).
Typowymi technikami dla zanieczyszczeń nieorganicznych są:
•
fluorescencja rentgenowska (XRF),
•
jonizacja z zastosowaniem plazmy sprzężonej indukcyjnie (ICP) połączona z optyczną
spektroskopią emisyjną (ICP-OES) bądź spektrometrią mas (ICP-MS),
•
neutronowa analiza aktywacyjna (NAA),
•
dla oznaczenia zawartości wody – metoda wagowa (utrata masy podczas suszenia) bądź
miareczkowanie kulometryczne metodą Karla Fischera.
Zaletą technik łączonych jest możliwość wykonania identyfikacji jakościowej i
oznaczenia ilościowego jednocześnie podczas tej samej analizy.
Kluczowym elementem zapewniającym jakość otrzymywanych wyników jest
przeprowadzenie poprawnej procedury walidacyjnej oraz właściwe stosowanie w pełni
scharakteryzowanych materiałów odniesienia (wzorców analitycznych).
Podstawowe klasy czystości produktów, powszechnie stosowane w Polsce wymieniono
poniżej wraz z podanym procentowym zakresem zawartości głównego składnika.
Tabela 1. Klasy czystości
Stopień
uwagi
Klasa
Skrót
Zakres [%]
Techniczny
techn.
90-99
1-2N
-
Czysty
cz.
99,0-99,9
2-3N
-
Czysty do analiz
cz.d.a.
99,9-99,99
3-4N
czystości
zanieczyszczeń nie można wykryć
6
typowymi metodami analizy chemicznej
zanieczyszczeń nie można wykryć nawet
bardzo czułymi metodami analizy
ch.cz.
Chemicznie czysty
99,99-99,999
4-5N
chemicznej i do ich analizy użyć metod
wykorzystujących zjawiska czysto
fizyczne
Ilość zanieczyszczeń nie zakłóca
Czysty spektralnie
Spektra.cz.
99,999-99,9999
5–6N
pomiarów metodami analizy spektralnej
Podana w kolumnie 4 czystość substancji wyrażona literą N, stosowana jest powszechnie
przede wszystkim do określania czystości substancji gazowych. Czystość określa się poprzez
literę N i cyfrę oznaczającą ujemny logarytm z zawartości objętościowej zanieczyszczeń
(potocznie rzecz mówiąc jest to liczba „dziewiątek” w czystości wyrażonej jako ułamek
dziesiętny).
Zanieczyszczenia występujące w produkcie można zaklasyfikować do jednej z poniższych
grup:
•
Zanieczyszczenia
krytyczne
(kluczowe)
(ang.
Critical
–
Impurities)
są
to
zanieczyszczenia których obecność w produkcie powyżej pewnej określonej wartości
(charakterystycznej dla produktu) stanowi o jego nieprzydatności do określonych
zastosowań
•
Zanieczyszczenia
prawdopodobne
(ang.
Suspected
Impurities)
-
o
wysokim
prawdopodobieństwie występowania w materiale co wynika z procesu jego wytwarzania
(synteza, oczyszczanie, składowanie), a także możliwości występowania przemian np.
rozkład do innych substancji na co wpływają takie właściwości materiału jak: stabilność
termiczna, reaktywność w obecności tlenu, wody lub dwutlenku węgla.
•
Zanieczyszczenia (ang. Contaminants) – są to substancje, których obecność w materiale
nie została przewidziana w oparciu o ‘historię” procesu wytwórczego produktu oraz jego
właściwości fizyko-chemiczne. Obecność takich zanieczyszczeń wskazuje z reguły na
niedoskonałość wiedzy o procesach wytwórczych i/lub właściwościach substancji.
2.2.1 Metody określania czystości
Suma ilości głównego składnika (n ) oraz ilości zanieczyszczeń
PC
(Σn
IC
) jest z
definicji równa całkowitej ilości wszystkich substancji znajdujących się w próbce. Ponadto
(podobnie) suma masy głównego składnika (m ) oraz masy zanieczyszczeń (Σm
PC
7
IC
) jest
równa całkowitej masie wszystkich substancji znajdujących się w próbce. Biorąc pod uwagę
dobrze scharakteryzowany główny składnik materiału, ilość substancji i masa substancji dają
się łatwo przeliczać uwzględniając średnią masę molową (wzór 1) (masę cząsteczkową)
głównego składnika (M ).
PC
(1)
Analogicznie można postąpić przy przeliczaniu ilości i masy każdego ze składników
zanieczyszczeń, uwzględniając średnią masę molową (M ):
IC
(2)
Tak długo, jak jednostki są zgodne, ilości substancji i masa substancji dają się wyrazić
jako ułamki próbki ogólnej. Ułamek molowy x dla składnika C (zarówno PC jak i IC),
C
można zdefiniować jako (3):
(3)
Ułamek wagowy w dla składnika C, definiuje się jako (4):
C
(4)
Zarówno ułamki molowe jak i wagowe sumują się do jedności:
(5)
Istnieją cztery różne podejścia do określenia czystości badanego materiału:
•
bezpośrednie obliczanie n
PC
za pomocą metod:
o grawimetrycznych
o miareczkowych
o oznaczeń ilościowych z zastosowaniem NMR i metody wzorca wewnętrznego (ang.
Internal Standard Quantitative Nuclear Magnetic Resonance - IS-qNMR)
8
o analiza stosunku izotopowego z zastosowaniem spektrometrii mas (ang. Stable
Isotope Ratio Mass Spectrometry)
•
bezpośrednie obliczanie x
PC
lub w : jeśli wszystkie składniki mieszaniny można
PC
rozdzielić w funkcji czasu (procesy chromatograficzne), częstotliwości (metody
spektroskopowe), masy (układy spektrometrii mas) lub innych fizycznych wielkości oraz
jeśli każdy ze składników może zostać wykryty z równomolową lub molowo-masową
czułością, wtedy stosunek sygnału głównego składnika do sumy sygnałów pozwala na
wyznaczenie x
PC
lub w . W przypadku braku równopolowej odpowiedz można stosować
PC
odpowiednie współczynniki korekcyjne dla poszczególnych sygnałów.
•
jednoczesne obliczanie 1 - Σx : Czystość substancji można określić, stosując techniki
IC
termoanalityczne, tj. różnicową analizę termiczną (DTA) i różnicową kalorymetrię
skaningową (DSC). Podstawę do zastosowania tych technik w analizie czystości stanowi
fakt, iż zanieczyszczenia obecne w związkach organicznych wpływają na zakres
temperatur, kształt i powierzchnię endotermicznych pików DTA i DSC, związanych z
topnieniem tych substancji. Na tej podstawie stopień czystości można ocenić, porównując
piki endotermiczne dla próbki badanej oraz wzorca. W oznaczeniach ilościowych stosuje
się natomiast równanie van’t Hoffa, które przedstawia zależność pomiędzy obniżeniem
temperatury topnienia czystej substancji a stężeniem zawartych w niej zanieczyszczeń.
•
kolejne obliczanie 1 - Σx lub 1 - Σw : w przypadku zanieczyszczeń różnego typu często
IC
IC
wynik podany jako czystość materiału jest obliczany na podstawie wyniku kilku
niezależnych oznaczeń np. z metody normalizacji lub normalizacji ze współczynnikiem
(GC-FID albo LC-RID) oraz wyników oznaczeń zawartości wody metodą KarlaFischera.
Bardzo ważnym aspektem metodyki oznaczania czystości konkretnej substancji
otrzymywanej w wyniku rozdzielania techniką cieczowej chromatografii w warunkach
preparatywnych jest zapewnienie ortogonalności warunków rozdzielania na etapie
oznaczania czystości względem etapu izolacji. Pod tym pojęciem rozumie się
zastosowanie warunków, w których wykorzystywany jest zupełnie inny mechanizm
rozdzielania. W ten sposób zanieczyszczenia, które mogły nie rozdzielać się z
składnikiem cennym w warunkach rozdzielania zastosowanych podczas zbierania
9
frakcji będą łatwo rozdzielane na etapie badania czystości. W praktyce, dla substancji
rozdzielanej w skali preparatywnej przykładowo:
•
w warunkach RP, na etapie badania czystości powinny zostać zastosowane
warunki HILIC, IEx albo NP (pod warunkiem zapewnienia rozpuszczalności w
eluencie).
•
w warunkach SEC, na etapie badania czystości powinny zostać zastosowane
warunki RP, HILIC, IEx albo NP.
3. Zagadnienia ekonomiki otrzymywania czystych substancji z
zastosowaniem technik chromatograficznych
3.1 Efektywność ekonomiczna (produktywność) rozdzielania preparatywnego i
procesowego
Efektem jednego rozdzielania jest określona objętość eluatu zebrana jako konkretna
frakcja zawierająca pożądany składnik (albo składniki). Iloczyn objętości zebranego eluatu i
stężenia konkretnego składnika pozwala na obliczenie efektu rozdzielania wyrażonego jako
mole lub (częściej) masa tego składnika. Uwzględnienie czasu potrzebnego na wykonanie
jednego rozdzielania, a następnie na ustabilizowanie warunków pozwalających na wykonanie
kolejnego rozdzielania, pozwala na określenie czasu trwania jednego cyklu rozdzielczego, a
tym samym wyznaczenie masy składnika uzyskiwanego preparatywnie/procesowo w
jednostce czasu. Możliwe jest również uwzględnienie innych aspektów ekonomicznych
procesu, tj. wykorzystywanej masy sorbentu, zużywanej ilości eluentu (zależności poniżej),
amortyzacja aparatury, koszty pracowników lub wynajmu aparatury/pomieszczeń [**].
Pierwszą zastosowaną do określania wydajności kolumny preparatywnej wielkością
jest tzw. „przerób” Rh lub Th (ang. throughput), czyli masa substancji i otrzymywana w
jednostce czasu przy użyciu konkretnej kolumny i konkretnego układu chromatograficznego.
Rh =
mi
tc
(1)
mi – masa izolowanej substancji i, tc- czas cyklu rozdzielczego
Th =
mi w
⋅
mw Vc
(2)
10
mw – masa wypełnienia, w- objętościowe natężenie przepływu eluentu, Vc – objętość eluentu zużywana
podczas jednego cyklu rozdzielczego
Przydatnym parametrem „uniwersalnym” pozwalającym na porównywanie różnych
układów chromatograficznych oraz z zastosowaniem kolumn o różnych wymiarach jest tzw.
„produktywność jednostkowa kolumny” (Pt):
Pt =
mi
t c Fc
(3)
i
Pt =
mi
Vc Fc
(3’)
Fc – pole przekroju poprzecznego wypełnienia kolumny
Ze względu na wysoki koszt, zarówno fazy stacjonarnej (sorbentu stanowiącego
wypełnienie kolumny), jak również, organicznych składników eluentu, korzystne jest
stosowanie „łącznie” wzorów (2) i (3’) do określania efektywności ekonomicznej danego
procesu rozdzielczego.
3.2. Zagadnienia „ekonomicznego” postępowania w skali preparatywnej i
procesowej
3.2.1 Regeneracja aktywności sorpcyjnej kolumny
W preparatywnej chromatografii cieczowej, z uwagi na rozdzielanie mieszanin
„rzeczywistych” o bardzo różnym składzie, gdy często występują substancje, które trwale
dezaktywują powierzchnię sorpcyjną fazy stacjonarnej, po kilku, a nawet w kolejnej operacji
rozdzielania, zaczyna obserwować się spadek rozdzielczości kolumny. Wówczas, w
zależności od konkretnego zadania rozdzielczego przyjmuje się dotychczas dwa główne
podejścia:
a. przywrócenie zadowalającej aktywności sorpcyjnej wypełnienia poprzez zastosowanie
podczas każdej operacji rozdzielania eluentu o wyższej sile elucyjnej (wymycie
zanieczyszczeń „mocnym” eluentem) i dokonanie ponownej „reaktywacji” aktywności
sorpcyjnej powierzchni wypełnienia za pomocą eluentu o niskiej sile elucyjnej,
b. cykliczna wymiana sorbentu, co określoną liczbę rozdzielań – stosowana, gdy następuje
trwała dezaktywacja powierzchni sorpcyjnej, lub gdy rozwiązanie a) okazuje się być
rozwiązaniem mniej uzasadnionym ekonomicznie
Alternatywnie do powyższych, stosowanych w praktyce sposobów postępowania,
istnieje również możliwość zastosowania przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie (ang.
11
backflush = BF). Postępowanie polega na wprowadzeniu do układu chromatograficznego
dodatkowego zaworu dwu położeniowego – w jednym położeniu eluent jest wprowadzany do
kolumny od strony „A” a odbierany od strony „B”, a drugim położeniu na odwrót. Z
termodynamicznego punktu widzenia, substancje wprowadzone do kolumny, po czasie
eluowania t przebyły pewne drogi i w przypadku odwrócenia przepływu, po identycznym
czasie t powinny opuścić kolumnę w postaci jednego piku. Wyjątek stanowi przypadek na
tyle silnej sorpcji, a w szczególności chemisorpcji, gdy substancja jest „trwale” związana z
fazą stacjonarną i nie ma możliwości jej usunięcia z zastosowaniem przypływu zwrotnego.
Takie składniki powinny zostać usunięte z wsadu do rozdzielania przed wprowadzeniem go
do kolumny rozdzielczej !
Oprócz zalety, jaką jest możliwość usunięcia w przepływie zwrotnym substancji
obecnych w kolumnie po elucji frakcji będącej celem preparatywnego otrzymywania, drugim
niezmiernie ważnym aspektem jest ciągle stała aktywność sorpcyjna kolumny, taka sam, jaka
miała miejsce na początku rozdzielania. Przepływ zwrotny spełnia powyższe zadania w
przypadku elucji izokratycznej. Zapewnienie tej samej aktywności sorpcyjnej kolumny oraz
„zrównoważenie” oddziaływań faza stacjonarna – eluent pozwala na zachowanie jednakowej
retencji substancji, co w przypadku zautomatyzowanych układów zbierania frakcji ma istotne
znaczenie praktyczne. Zastosowanie przepływu zwrotnego eluentu w kolumnie pozwala,
więc, na zwiększenie „żywotności” kolumny w warunkach preparatywnych i procesowych, a
przy tym ogranicza ilość eluentu zużywaną na przywrócenie aktywności sorpcyjnej kolumny
do warunków „początkowych” przed kolejnym rozdzielaniem, gdy zanieczyszczenia
pozostałe w kolumnie eluowane są z zastosowaniem tzw. elucji skokowej z zastosowaniem
eluentu o bardzo wysokiej sile elucyjnej.
3.3 Odzysk Eluentów
Najważniejszym czynnikiem, decydującym o opłacalności stosowania PLC, jako techniki
otrzymywania substancji, jest ilość (koszt) organicznych składników eluentu utraconych
podczas wzbogacania oraz izolacji rozdzielanych i otrzymywanych substancji. Eluenty
stosowane do rozdzielania, w skali preparatywnej są z reguły odzyskiwane praktycznie w 100
%-ach. W celu recyrkulacji zużytego eluentu w warunkach izokratycznych z reguły wystarcza
przedestylowanie rozpuszczalnika, co pozwala na usunięcie nielotnych zanieczyszczeń.
Dlatego celowe jest stosowanie elucji izokratycznej w PLC, tak dalece, jak to możliwe. W
12
przypadku konieczności stosowania elucji gradientowej, a jest to często niezbędne w
przypadku rozdzielania i otrzymywania peptydów i białek z zastosowaniem PLC, istnieje
konieczność zastosowania bardziej sprawnego układu rozdzielczego dla rozdzielania i
odzysku składników eluentu w postaci czystej. Przy pełnym odzysku i recyrkulacji
organicznych składników eluentu mogą one zostać w skali procesowej zredukowane do ok.
500 US$/kg czystego produktu.
W celu poznania zasad prowadzenia, odparowania próżniowego, krystalizacji,
liofilizacji, ekstrakcji ciecz – ciecz destylacji oraz rektyfikacji zaleca się Studentom
zapoznanie z pozycjami [***].
Wysoki koszt rozpuszczalników o wymaganej czystości (HPLC, MS) oraz
ograniczenie emisji do środowiska lotnych związków organicznych, LZO (z ang. Volatile
Organic Compounds - VOC) powoduje, że laboratoria farmaceutyczne oraz chemiczne
poszukują metod redukcji użycia rozpuszczalników, zwiększenia stopnia ich odzysku, bądź
recyklingu. W efekcie pozwola to na zwiększenie wydajności otrzymywania produktu,
redukcję kosztów jego pozyskiwania oraz poprawę bezpieczeństwa pracy.
Wybór sposobu ("technologii") odzysku rozpuszczalników z mieszanin jest
determinowany przez właściwości fizyko-chemiczne składników, tzn., lotność, polarność
(stąd, m.in., rozpuszczalność w cieczach polarnych, albo niepolarnych), ciepło parowania,
skłonność do tworzenia mieszanin azeotropowych itp. Zależy też od liczby składników,
szczególnie, gdy ich właściwości fizykochemiczne są zbliżone. W przypadku "wsadu",
złożonego z dwóch lub kilku, a nawet wielu składników, które wykazują szeroki zakres
lotności, z reguły stosuje się destylację frakcyjną (rektyfikację).
Wybór
operacji
jednostkowych
rozdzielania
i
oczyszczania
mieszanin
rozpuszczalników organicznych, zwłaszcza w przypadku mieszanin rozpuszczalników
pochodzących z operacji technologicznych realizowanych w sposób ciągły, zawsze powinien
opierać się na ekonomicznej analizie i bilansie kosztów nowych i odzyskanych
rozpuszczalników, ceny sprzedaży mieszanin odpadowych, jako nośników energii spalania,
kosztów ewentualnego zlecenia odzysku / utylizacji, kosztów własnych oczyszczania i
odzysku. Koniecznie trzeba też uwzględniać wpływ stosowanych operacji na środowisko, np.,
ich energochłonność, emisje oparów i ciepła, zużycie wody i innych mediów
technologicznych, czyli tzw. koszty środowiskowe.
13
Rozpuszczalniki organiczne odzyskiwane w związku ze stosowaniem chromatografii
cieczowej, tak w skali analitycznej, jak preparatywnej, albo procesowej, w zależności od
rodzaju układu, który jest wykorzystywany, można podzielić, na co najmniej trzy grupy.
(I) Do pierwszej można zaklasyfikować ciecze polarne, tj: metanol (MeOH).
acetonitryl (AcCN), propan-2-ol (IPA), jako rozpuszczalniki stanowiące organiczne składniki
eluentu wykorzystywane w odwróconych układach faz (RP), albo w warunkach
oddziaływań hydrofilowych (HILIC), w mieszaninie z wodą lub rozcieńczonymi
roztworami buforowymi o pH w zakresie 2 do ok. 9;
(II) W skład drugiej wchodzą rozpuszczalniki używane w normalnych układach faz
(NP), o niskich lub śladowych zawartościach wody: n-heksan (n-C6), n-heptan (n-C7), eter
t-butylowo - metylowy (MTBE), chloroform, dichlorometan (DCM), octan etylu (AcOEt) lub
metylu (AcOMe), tetrahydrofuran (THF), 1,4-dioksan, bezwodny kwas octowy, formamid,
dimetyloformamid;
(III) THF i DCM są najczęściej stosowanymi składnikami w chromatografii
wykluczania (GPC-SEC) w warunkach liofilowy.
4. Wykonanie ćwiczenia
4.1 Oznaczanie wybranych białek w frakcjach eluatów zebranych podczas
wcześniejszych ćwiczeń
Do kontroli jakości zostanie zastosowana wysokosprawna chromatografia cieczowa w
odwróconych układach faz (RP-HPLC) z detektorem UV-DAD.
Do oznaczeń ilościowych zostanie zastosowana metoda krzywej kalibracyjnej.
Materiały i Aparatura
- Wzorce białek (α-laktoalbuminy, bLG, BSA),
- eluenty – Acetonitryl, metanol, woda demineralizowana, odpowiednie sole do
przygotowania buforów, np buforu fosforanowego o pH 5,8, Na2SO4,
- probówki i fiolki szklane, pipeta automatyczna, strzykawka do HPLC z płaską igłą i tłokiem
z PTFE, naczynie na ścieki;
Aparatura
14
Aparaty chromatograficzne typu HPLC: pompa, dozownik zaworowy, kolumna typu Phenyl,
120 x 4,6 mm, 3µm. detektor UV-VIS lub UV typu DAD, integrator albo komputerowy
system rejestracji i przetwarzania danych.
Warunki rozdzielania i detekcji
W trakcie analiz roztworów wzorcowych białek (otrzymanych od prowadzącego) jak i
próbki analizowanej frakcji warunki prowadzenia rozdzieleń powinny być stale i nie
zmienne.
Skład
eluentu:
Dobierają
Studenci
na
podstawie
wiedzy zgromadzonej
podczas
wcześniejszych ćwiczeń.
Natężenie przepływu fazy ruchomej powinno wynosić 1ml/min., temperatura pokojowa,
objętość próbki dozowanej do kolumny: 50 μl.
Sposób wykonania:
Warunki rozdzielania, i detekcji.
1) Zaprogramować skład eluentu: j.w. ☺
2) Ustabilizować warunki rozdzielania (stabilna linia podstawowa detektora RI oraz
detektora UV-VIS typu DAD, powierzchnia sorpcyjna kolumny „zrównoważona” ze
stosowanym eluentem).
3) Po ustabilizowaniu warunków rozdzielania wprowadzić do pętli zaworu 50µl próbki w
położenie ”load” zaworu. Po stwierdzeniu gotowości systemu rejestracji i
przetwarzania danych (komunikat „waiting for injection” w przypadku stosowania
komputerowego systemu rejestracji i przetwarzania danych), wprowadzić próbkę do
kolumny („zadozować – „wstrzyknąć” próbkę, przekręcić zawór w pozycję „inject”).
Obserwować przebieg rozdzielania, kontrolować prawidłowość pracy aparatu,
zanotować warunki rozdzielania i detekcji oraz naszkicować schemat aparatu, a także
wyjaśnić z prowadzącym ewentualne wątpliwości.
4) Po zarejestrowaniu chromatogramu, odczytać wartość czasu retencji i powierzchnie
poszczególnych pików z detektora UV-VIS (typ DAD) dla poszczególnych roztworów
kalibracyjnych dla długości fali 280 nm.
5) W identycznych jak wcześniej warunkach, które stosowano podczas wzorcowania i w
taki sam sposób, wykonać analizę próbki frakcji o nieznanym stężeniu wybranego
białka
15
6) Zarejestrować
chromatogram
i
odczytać
powierzchnię
piku
oznaczanej
substancji w analizowanej próbce frakcji
7) Na postawie uzyskanej krzywej kalibracyjnej wyznaczyć zawartość białka w próbce
wyrażoną w mg/L.
4.2 Oznaczanie laktozy w frakcjach eluatów zebranych podczas wcześniejszych
ćwiczeń
Do kontroli jakości zostanie zastosowana chromatografia oddziaływań hydrofilowych
(HILIC) z detektorem refraktometrycznym (RID).
Kolumna typu NH2, eluent Acetonitryl:Woda w proporcji zaproponowanej przez Studentów.
Pozostała aparatura i sposób wykonania jako opisano w pkt. 4.1.
Do oznaczeń ilościowych zostanie zastosowana metoda krzywej kalibracyjnej.
4.3. Kontrola jakości frakcji eluatów zebranych podczas rozdzielania ekstraktu z
trawy
Do kontroli jakości zostanie zastosowana cienkowarstwowa chromatografia cieczowa w
układzie faz normalnych z detekcją w świetle widzialnym (VIS) oraz UV.
Sposób wykonania:
Warunki rozdzielania, i detekcji.
1) Płytkę z żelem krzemionkowym wysuszyć w suszarce w temp. 110˚C
2) Ocenić wizualnie frakcję, która będzie analizowana i jeśli zostanie uznane za
konieczne, zatężyć ją poprzez odparowanie w strumieniu azotu.
3) Przygotować eluent składający się z dwóch składników z listy: heksan, izomeryzat,
izopropanol, dioksan, tetrahydrofuran, aceton w proporcji zaproponowanej przez
Studentów ☺
4) Na linii startu umieścić na płytce 10 µL roztworu badanej frakcji oraz obok 10 µL
plamkę „surowego” ekstraktu z trawy (próbka „wzorcowa”)
5) Dokonać rozwinięcia chromatogramu na płytce.
6) Wyznaczyć wartości współczynnika opóźnienia dla plamek roztworu wzorcowego i
surowego ekstraktu dla światła widzialnego i UV
7) Przedyskutować wyniki.
16
4.4 Część demonstracyjna - otrzymanie czystych substancji z zastosowaniem
rotacyjnej wyparki obrotowej i odzysk eluentów z zastosowaniem destylacji z
kolumną rektyfikacyjną
Część pokazowa będzie się składała z omówienia zasady działania dwóch stanowisk – do
odparowania pod obniżonym ciśnieniem w skali laboratoryjnej i wielkolaboratoryjnej oraz do
odzysku eluentów.
5. Wymagania do sprawdzianu
Szczegółowy wykaz zagadnień podano w harmonogramie ćwiczeń laboratoryjnych.
1. Zakres wiadomości objęty niniejszą instrukcją
2. Rozdział 11, 13 [*]
3. Podstawy następujących operacji: odparowanie próżniowe, destylacja i rektyfikacja
(odzysk organicznych składników eluentu), ekstrakcja ciecz – ciecz (przeniesienie
składników hydrofobowych z hydrofilowego eluatu do lotnej cieczy organicznej,
dotyczy lipidów, średnio polarnych metabolitów roślinnych oraz hydrofobowych
białek i peptydów), liofilizacja (otrzymanie mikrokrystalicznej postaci białka z
roztworu w wodzie). Bardziej szczegółowe informacje w specjalistycznej literaturze
inżynierii bio-procesowej (np. poz. 12-14 literatury uzupełniającej) oraz w
instrukcjach z przedmiotu Techniki Rozdzielania (dla Technologii Chemicznej) [***]
4. Przykłady zastosowań wymienione w [***]
6. Literatura
Literatura podstawowa
* M. Kamiński (ed.) Chromatografia Cieczowa, CEEAM, Gdańsk, 2004;
** M. Kamiński, Problemy stosowania kolumnowej chromatografii cieczowej, jako metody
(techniki) otrzymywania substancji, rozprawa habilitacyjna, Gdańsk 1991;
*** A) M. Trznadel, M. Kamiński, Instrukcja do ćwiczenia 3A Destylacja / Rektyfikacja dla
Technologii Chemicznej II rok, dostępna on-line na stronie domowej katedry:
http://www.pg.gda.pl/chem/Katedry/Inzynieria/images/data/mk/dydaktyka/tr2/3A.pdf
B) M. Trznadel, M. Kamiński, Instrukcja do ćwiczenia 2B Ekstrakcja ciecz-ciecz dla
Technologii Chemicznej II rok, dostępna on-line na stronie domowej katedry:
17
http://www.pg.gda.pl/chem/Katedry/Inzynieria/images/data/mk/dydaktyka/tr4/cwiczenie2
B.pdf
C) A. Zygler, M. Janicka, Ł. Heda, M. Kamiński, Instrukcja do ćwiczenia 2A Techniki
wzbogacenia i prekoncetracji. Membrany stałe i odparowanie próżniowe dla
Technologii Chemicznej II rok, dostępna on-line na stronie domowej katedry:
http://www.pg.gda.pl/chem/Katedry/Inzynieria/images/data/mk/dydaktyka/tr2/cw2.pdf
D) A. Zygler, M. Janicka, M. Kamiński, Instrukcja do ćwiczenia 5B Odparowanie
próżniowe rozpuszczalnika/ eluentu, krystalizacja w warunkach różnej temperatury
dla Technologii Chemicznej II rok, dostępna on-line na stronie domowej katedry:
http://www.pg.gda.pl/chem/Katedry/Inzynieria/images/data/mk/dydaktyka/tr4/cwiczenie5
B.pdf
E) Zygler, M. Janicka, M. Kamiński, Instrukcja do ćwiczenia 5C Suszenie w warunkach
ciśnienia atmosferycznego / suszenie próżniowe / liofilizacja dla Technologii
Chemicznej II rok, dostępna on-line na stronie domowej katedry:
http://www.pg.gda.pl/chem/Katedry/Inzynieria/images/data/mk/dydaktyka/tr4/cwiczenie5
C.pdf`
**** B. K. Głód (ed.), Postępy chromatografii i innych technik i technologii rozdzielania,
Wyd. Akademii Podlaskiej, Siedlce, 2010 – Strony 57-70 (A. Bylina, M. Kamiński,
Preparatywna chromatografia cieczowa, podstawowe zasady efektywnego stosowania,
elementy preparatyki),
Literatura dodatkowa
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
R. Ven (ed), “Encyklopedia of Separation Technology”, vol. 1 i 2, J. Wiley, 19997;
Z. Witkiewicz, “Podstawy chromatografii”, WNT-W-wa, wyd. 2000 lub 2005;
K. Hostettman, A. Morston, „Preparative Chromatography Techniques Applications”, Springer Verlag,
1998;
J. Cazes (ed) „Encyclopedia of Chromatography”, Marcel Dekker, New York, 2001.,
A.S. Grandison, M.J. Lewis, “Separation processes in the food and biotechnology industries. Principles and
applications”, Woodhead Publishing Limitted, Cambridge, England, 1996.,
M. Aguilar, J.L.v Cortina, “Solvent extraction and liquid membranes”, CRC Press, London, 2008.,
M. Berek, M. Dressler, M. Kubin, K. Marcinka, „Chromatografia żelowa“, PWN, Warszawa, 1989;
A.S. Grandison (ed), M.J. Lewis (ed), „Separation processes in the Food and Biotechnology Industries” –
Principlea and Applications, Woodhead Publ. Ltd, Cambridge England;
O. Mikes, “HPLC of Biopolimers and Biooligomers”, Elsevier, Amsterdam, 1989;
J. Weiss, “Handbook of ion chromatography” vol 1,2, Wiley-VCH 2004;
R. Rautenbach, “Procesy membranowe”, WNT-W-wa, wyd. 1996;
M. Serwiński, Operacje jednostkowe w inżynierii chemicznej, WNT, Warszawa, dowolne wydanie,
(podręcznik zawiera zasady ogólne i najważniejsze pojęcia dotyczące inżynierii technik rozdzielania).
A. Selecki., L. Gradoń „Podstawowe procesy przemysłu chemicznego”, WNT Wa-wa 1985.;
A. Selecki, „Inżynieria chemiczna - Rozdzielanie mieszanin - Metody niekonwencjonalne”, WNT Wa-wa,
1972;
A. Selecki, R. Gawroński, „Inżynieria chemiczna. Podstawy projektowania wybranych procesów
rozdzielania mieszanin”, WNT 1992.
J. Bandrowski, L. Troniewski, „Destylacja i rektyfikacja”, Skrypt Politechniki Śląskiej. Gliwice 1996.,
18
7. Sprawozdanie
Każda grupa przygotowuje odrębne sprawozdanie w formie odręcznego czytelnego
manuskryptu, z odpowiednimi obliczeniami i wykresami oraz naszkicowanymi odręcznie i
poprawnie opisanymi chromatogramami. Każde z pięciu ćwiczeń stanowi odrębną część
sprawozdania końcowego i powinno zawierać następujące części oraz informacje:
- Wprowadzenie - opis operacji przygotowawczych oraz separacyjnych i wykorzystywane
zjawiska fizykochemiczne mające główny / drugorzędny wpływ na osiągane rezultaty
rozdzielania, opis optymalnych warunków i ograniczeń utrudniających / uniemożliwiających
osiągnięcie optymalnych warunków, opinię dotyczącą zalet i wad uwzględnionych operacji i
procesów separacyjnych, a także technik detekcji oraz metod oznaczania;
- Cel ćwiczenia i odpowiedniej jego części;
- Część doświadczalna - opis i warunki eksperymentów wykonanych podczas ćwiczenia, z
podziałem, jak w publikacji naukowej, na:
•
Materiały;
•
Aparatura i wyposażenie;
•
Metodyka i sposób opracowania wyników
Ta część sprawozdania powinna zawierać opis sposobu wykonania obliczeń poszczególnych
parametrów, przykład wykonania obleczeń, przeliczenia jednostek fizycznych oraz przykłady
otrzymanych wartości obliczonych parametrów, po jednym przykładzie dla obliczania
konkretnej wielkości.
- Wyniki i dyskusja, zestawienie wyników w formie rysunków, tabel, fotografii, danych
uzyskanych w rezultacie wykonanych obliczeń itp., wraz z opisem co one przedstawiają i
jakie wnioski z nich wynikają; Należy stosować tabelaryczne przedstawianie danych i
warunków oraz zamieszczać schematy budowy stanowisk laboratoryjnych,
aparatury,
kolumn i sprzętu pomocniczego z odpowiednimi opisami w podpisie pod rysunkami - w
sposób jak najkrótszy, jednak na tyle jednoznaczny, aby można było na tej podstawie
zamieszczonych danych i informacji powtórzyć eksperymenty bez konsultowania się z
19
wykonawcą, tzn., konieczne jest podanie nazw modułów aparatury i sprzętu, typu, modelu,
stopnia czystości odczynników, producenta, stężeń itp. danych.
- Wnioski końcowe - zestawienie wniosków wynikających z całej serii pięciu ćwiczeń,
jednak
bez
powtarzania
wniosków
zamieszczonych
w
poszczególnych
częściach
sprawozdania, natomiast kilka wniosków znajdujących się w różnych częściach sprawozdania
może być podstawą do sformułowania odpowiedniego wniosku końcowego (w tym sensie
powtórzenie jest dopuszczalne);
- Spis literatury - proszę zamieścić w sposób zgodny z zasadami cytowania literatury
stosowanymi w publikacjach naukowych tylko te pozycje, z których rzeczywiście korzystali
autorzy sprawozdania.
Nad przygotowaniem sprawozdania powinna pracować cała grupa wykonująca
ćwiczenie. Na stronie czołowej powinny zostać wpisane czytelnie nazwiska osób
wykonujących ćwiczenie oraz sprawozdanie wraz z podpisami. Podpis oznacza, że
określona osoba brała udział w pracy nad przygotowaniem sprawozdania i współodpowiada za jego treść i zamieszczone wnioski.
20