Kometa_DNA instrukcja obsługi Kucharczyk[...]

KOMETA DNA
Zestaw do elektroforezy horyzontalnej typu „Commet assay”
(na 10 lub 20 preparatów)
Instrukcja Obsługi
Numer katalogowy: 134-190 (10 preparatów)
134-196 (20 preparatów)
Aby uzyskać pomoc techniczną 22 668 71 47
Spis treści
1. Informacje ogólne
1.1
1.2
1.3
1.4
3
Wprowadzenie
Skład Zestawu Kometa DNA
Specyfikacja techniczna
Zasady bezpiecznego użytkowania
2. Użytkowanie Zestawu Kometa DNA
2.1
2.2
2.3
2.4
Przygotowanie mikrożeli
Liza i trawienie proteinazą K
Elektroforeza alkaliczna i barwienie bromkiem etydyny
Zakończenie elektroforezy
3
3
4
4
5
5
5
5
6
3. Odczynniki i przygotowanie roztworów
7
4. Konserwacja aparatu
9
5. Diagnozowanie i usuwanie problemów
10
6. Akcesoria i wyposażenie dodatkowe
13
7. Warunki gwarancji
14
8.1
Formularz naprawy gwarancyjnej
8. Wsparcie techniczne
15
14
2
1. Informacje ogólne
1.1 Wprowadzenie
Serdecznie dziękujemy za zakup Zestawu do elektroforezy horyzontalnej typu
„Commet assay” – Kometa DNA. Zestaw Kometa DNA umożliwia przeprowadzenie
horyzontalnej elektroforezy pojedynczych komórek (SCGE, z ang. single cell gel
electrophoresis) na szkiełkach podstawowych.
W trakcie analizy komórki po inkubacji z badana substancją są zatapiane w agarozie i
lizowane a następnie w czasie elektroforezy zdegradowane fragmenty DNA wypływają z
komórek a ilość zdegradowanych fragmentów DNA jest miarą genotoksyczności badanej
substancji i umożliwia ocenę stopnia uszkodzeń DNA w komórce. Dzięki zastosowaniu
najnowszej generacji ceramiki w wymiennikach ciepła, w pojemniku do inkubacji oraz w
komorze elektroforetycznej, Zestaw Kometa DNA zapewnia wysoką powtarzalność
analiz. Zestaw Kometa DNA wymaga zastosowania zewnętrznego przepływowego
układu stabilizacji temperatury cieczy chłodzącej przepływającej przez ceramiczne
wymienniki ciepła. Polecamy dedykowanych do tych celów, w pełni cyfrowy przepływowy
System do stabilizacji temperatury LCOOL System (nr kat 130-102), który zapewnia 0,1°C
poziom stabilizacji temperatury cieczy chłodzącej i ponad 400 W mocy ogniw
termodynamicznych Peltier’a. Dodatkowo, przenoszenie szkiełek podstawowych z
preparatami za pomocą dedykowanego wkładu zmniejsza prawdopodobieństwo
uszkodzenia preparatów mini żeli, przyspiesza pracę oraz podnosi powtarzalność
wyników. Niezależny zbiornik do inkubacji preparatów przed elektroforezą pozwala na
równoległe przygotowanie kolejnej partii prób do analizy, co znacznie zwiększa wydajność
systemu. Po wymianie wkładu typu Commet assay na stoliki i grzebienie do horyzontalnej
elektroforezy agarozowej DNA/RNA, Zestaw Kometa DNA może być wykorzystany jako
klasyczny aparat do elektroforezy horyzontalnej z wydajnym chłodzeniem żelu.
Metoda Comet Assay znajduje szerokie zastosowanie w:
- cytologii, biochemii kwasów nukleinowych, immunologii
- farmakologii
- medycynie (onkologii, diagnostyce DNA)
- ochronie środowiska (monitorowanie występowania czynników fizycznych i chemicznych
uszkadzających DNA)
- przemyśle spożywczym, kosmetycznym, chemicznym (kontrola genotoksyczności
nowych substancji chemicznych wprowadzanych do bezpośredniego otoczenia człowieka
oraz stopnia napromieniowania żywności w procesie sterylizacji radiacyjnej)
1.2 Skład Zestawu Kometa DNA
1. Komora do elektroforezy horyzontalnej z ceramicznym wymiennikiem ciepła
1 szt.
2. Wkład do wylewania i barwienia 10 lub 20 preparatów na szkiełkach mikroskopowych
1 szt.
3. Zbiornik do inkubacji i barwienia
1 szt.
4. Stolik do wylewania żelu agarozowego
2 szt.
5. Grzebienie
2 lub 4 szt.
6. Uchwyty do grzebieni
2 lub 4 szt.
7. Pokrywa
1 szt.
8. Kabel zasilający
1 szt.
9. Węże w otulinie termoizolacyjnej
2 szt.
1.3 Specyfikacja techniczna
Korpus komory elektroforetycznej
Pokrywa
PERSPEX PMMA
PERSPEX PMMA
3
Wymiennik ciepła
Wkład do wylewania preparatów
Stolik do żelu agarozowego
Kable zasilające
poliacetal, szkło ceramiczne
PERSPEX PMMA
PERSPEX PMMA
plecionka miedziana w izolacji
silikonowej
węże grubościankowe w izolacji
spieniony EPDM
drut platynowy
tarflen, gr. 1 mm, 20 studzienek
Węże w otulinie termoizolacyjnej, 1 m
Elektrody
Grzebień
Wymiary aparatu (d x sz x w)
Maksymalne napięcie (V)
Waga
330mm x 250mm x 81mm
1000 V
1,2 kg
1.4 Zasady bezpiecznego użytkowania
Prosimy o uważne zapoznanie się z instrukcją obsługi oraz zasadami bezpiecznego
użytkowania aparatu.
1. Aparat Kometa DNA jest obsługiwany przez zewnętrzny zasilacz i może być
potencjalnym źródłem śmiertelnego napięcia.
2. Zasilacz aparatu (nie wchodzący w skład Zestawu Kometa DNA), powinien zostać
podłączony do uziemienia.
3. Zasilanie aparatu jest podłączone przez pokrywę z kablami zasilającymi. Przed każdym
zdjęciem pokrywy aparatu należy pamiętać o wyłączeniu zasilania zasilacza
elektroforetycznego. Nie podłączać aparatu bez pokrywy.
4. Aparat Kometa DNA powinien być obsługiwany wyłącznie przez przeszkolony personel.
5. Aparat Kometa DNA należy używać wyłącznie zgodnie z jego przeznaczeniem.
6. Należy używać wyłącznie dedykowanych akcesoriów. Stosowanie elementów z innych,
niekompatybilnych aparatów może spowodować jego uszkodzenie i utratę ochrony
gwarancyjnej.
7. Aparat Kometa DNA jest wykonany z tworzywa PERSPEX PMMA, który może ulec
uszkodzeniu pod wpływem działania rozpuszczalników organicznych. Do mycia aparatu
należy stosować wyłącznie łagodne detergenty i wodę dejonizowaną.
8. W procedurze Commet Assay używany jest silnie toksyczny, kancerogenny bromek
etydyny, dlatego należy zawsze używać środków ochrony osobistej (rękawiczki, fartuch) i
zachować szczególną ostrożność.
Urządzenie jest zgodne z ustawowymi wytycznymi bezpieczeństwa Unii Europejskiej:
73/23/EEC Dyrektywa Niskonapięciowa
4
2. Użytkowanie Zestawu Kometa DNA
2.1 Przygotowanie mikrożeli (metoda wg. Singh et al., Mutation Research 1997)
1. Umieścić szkiełka podstawowe we wkładzie do inkubacji, a ten w komorze do inkubacji.
2. Podłączyć komorę do inkubacji z układem chłodzącym (rekomendujemy Przepływowy
System Stabilizacji Temperatury LCOOL, nr. kat. 130-102). Ustawić temperaturę 4°C.
3. Na schłodzone szkiełka podstawowe wylać 100 µl 0,5% agarozy w buforze PBS,
zawierającym 5 mg/ml proteinazy K. Agarozy należy pozostawić do wyschnięcia w
temperaturze pokojowej przez około 30 min. Aby zapewnić dobrą adhezję żelu do
szkiełka.
4. Komórki zwirować a pelet zawiesić w 75 µl 0,5 % agarozy w PBS o temperaturze około
45 °C.
5. 30 µl agarozy nanieść pipetą na schłodzone szkiełka i niezwłocznie przykryć szkiełkiem
podstawowym.
6. Umieścić szkiełka w komorze do inkubacji w temp. 4 °C.
7. Górne szkiełka usunąć po upływie mniej niż 1 min i pokryć szkiełka 200 µl roztworu
agarozy zawierającej proteinazę K. Nakryć niezwłocznie szkiełkiem podstawowym.
Szkiełko usunąć po upływie mniej niż 1 min.
2.2 Liza i trawienie proteinazą K
1. Szkiełka wraz z wkładem do inkubacji umieścić w zbiorniku do inkubacji i poddać
komórki lizie w zimnym roztworze lizującym.
2. Podłączyć komorę do inkubacji z układem chłodzącym (rekomendujemy Przepływowy
System Stabilizacji Temperatury LCOOL, nr. kat. 130-102). Ustawić temperaturę 4°C.
3. Po 15 min inkubacji w roztworze lizującym wymienić bufor na nowy, nie zawierający
Tritonu X 100 p pH 7,5.
4. Po 15 min inkubacji zmienić temperaturę na 37 °C i kontynuować inkubację przez 2
godziny.
Parametrami kluczowymi dla wydajności i powtarzalności trawienia jest stężenie
proteinazy K, czas i temperatura trawienia.
2.3 Elektroforeza alkaliczna i barwienie bromkiem etydyny
1. Po wykonaniu lizy komórek wkład do inkubacji ze znajdującymi się w nim komórkami
wyjąć ze zbiornika do inkubacji i umieścić w komorze do elektroforezy horyzontalnej.
2. Wlać do komory bufor elektrodowy tak aby poziom buforu znajdował się 0,5 cm ponad
powierzchnią żelu.
3. Po 20 min inkubacji rozpocząć elektroforezę przy natężeniu pola elektrycznego 0,4 V/cm
lub przy stałej mocy i dobranej V x h. Elektroforezę przeprowadzić w temperaturze 4 °C.
5
4. Po 60 min elektroforezy wyjąć wkład do inkubacji z aparatu i umieścić w zbiorniku do
inkubacji w buforze neutralizującym na 30 min. Następnie odwodnić żel (30 min w 99%
EtOH, 30 min w 70% EtOH) i wysuszyć.
5. Żele barwić w roztworze EtBr (1 µg/ml). Obecnie coraz częściej wykorzystuje się
barwienie DNA solami srebra lub barwnikami fluorescencyjnymi.
6. Po barwieniu EtBr żele oglądać w świetle UV (312 nm).
2.4 Zakończenie elektroforezy
1. Po zakończeniu elektroforezy wyłączyć zasilacz i odłączyć przewody elektryczne od
korpusu aparatu. Wyłączyć układ chłodzący.
2. Wkład do inkubacji, komorę do inkubacji oraz komorę do elektroforezy przepłukać wodą
destylowaną.
6
3. Odczynniki i przygotowanie roztworów
UWAGA!!!
Wszystkie roztwory powinny być przygotowane z użyciem wysokiej czystości wody
- destylowanej lub dejonizowanej a następnie przefiltrowane.
1. PBS (bez jonów Ca i Mg)
Przygotować roztwór zgodnie z zaleceniami producenta. Ustalić pH na 7,4. Roztwór
przefiltrować i przechowywać w temp pokojowej lub 4°C.
2. Roztwór lizujący
146,1 g
37,2 g
1, 2 g
2,5 M NaCl
100 mM EDTA
10 mM Trizma base
Dodać reagenty do około 750 ml wody destylowanej i delikatnie mieszać. Następnie dodać
około 8 g NaOH i pozostawić mieszaninę na mieszadle do całkowitego rozpuszczenia
(około 20 min). Ustalić pH roztworu na 10 używając stężonego roztworu HCl lub NaOH.
Dopełnić wodą do 1 L. Przechowywać w temperaturze pokojowej.
Bezpośrednio przez użyciem (do 30 min) dodać do porcji buforu lizującego 1% Triton X 100
oraz 10% DMSO i schłodzić.
UWAGA!!!
DMSO jest dodawane do roztworu lizującego aby zneutralizować wolne rodniki
generowane przez żelazo uwalniane z hemoglobiny z komórek krwi lub tkanek
zwierzęcych. Nie jest konieczne jego użycie w sytuacji analizy innych preparatów
lub gdy liza będzie przeprowadzana bardzo krótko.
3. Alkaliczny bufor elektrodowy
Roztwory macierzyste (przechowywane nie dłużej niż 2 tygodnie):
10 N NaOH (200 g/500 ml wody dejonizowanej)
200 mM EDTA (14,89 g/200 ml wody dejonizowanej
1x bufor elektrodowy jest przygotowywany z roztworów macierzystych:
30 ml
10 N NaOH
5 ml
200 mM EDTA
Dopełnić do 1 L wodą dejonizowaną
Bezpośrednio przed użyciem buforu zmierzyć pH i upewnić się, że ph > 13.
4. Bufor neutralizujący
48,5 g
do 800 ml
Tris base
woda dejonizowana
Ustalić pH 7,5 z użyciem 6 N HCl. Dopełnić wodą dejonizowaną do 1 L. Przechowywać w
temp pokojowej.
5. Roztwór barwiący z bromkiem etydyny
EtBr (10x roztwór macierzysty, 20 µg/ml)
10 mg
EtBr
50 ml
woda dejonizowana
7
Do użycia rozcieńczyć roztwór 10x.
UWAGA!!!
Bromek etydyny jest silnie toksycznym i kancerogennym odczynnikiem dlatego
należy zachować szczególną ostrożność oraz zawsze stosować środki ochrony
osobistej (rękawiczki, fartuch).
Przechowywać w temperaturze pokojowej.
Użycie: Bezpośrednio przed użyciem dodać 50 µl β-mercaptoetanolu do 950 µl buforu
obciążającego. Próbki należy rozcieńczyć buforem obciążającym w stosunku 1:2 i zdenaturować w
temperaturze 95°C prze 4 minut.
8
4. Konserwacja aparatu
Korpus aparatu, wkład do inkubacji, komora do inkubacji oraz pokrywa są wykonane z
materiału PERSPEX PMMA. Materiał typu PERSPEX PMMA jest podatny na uszkodzenia
pod wpływem stężonych rozpuszczalników organicznych, w szczególności alkoholi. Do
mycia aparatu należy używać łagodnych detergentów i wody dejonizowanej.
Elementy aparatu oraz szkło laboratoryjne używane do barwienia roztworem EtBr myć
indywidualnie i przechowywać w oznaczonym miejscu.
9
5. Diagnozowanie i usuwanie problemów
Problem
1. Zawiesina komórek w
roztworze agarozy nie
przywiera do szkiełka
2. Agaroza na szkiełkach
zawiera bąbelki
powietrza
3. Komórki kontroli
negatywnej wykazują
obecność dużego
uszkodzenia DNA
(większość DNA w
ogonie)
Możliwa przyczyna
a. Za gorący bufor
elektrodowy
Rozwiązanie
a. Sprawdź temperaturę
buforu.
b. Przed
przygotowaniem
próbek, komórki
nie zostały
przepłukane i
pozostałości
medium
wzrostowego są
obecne w
roztworze
b. Usuń pozostałości medium
przez przygotowaniem
komórek.
c. Roztwór agarozy ma
zbyt małe stężenie
c. Zawieś komórki w roztworze
agarozy o 2 % wyższym
d. Agaroza nie została
do końca
rozpuszczona przez
przygotowaniem
zawiesiny
d. Upewnij się, że agaroza się
rozpuściła całkowicie zanim
dodasz komórki
a. Wprowadzono
powietrze podczas
przygotowywania
próbki
a. Unikaj nadmiernego
pipetowania i mieszania
próbki w roztworze
agarozy
b. Zbyt chłodny
roztwór agarozy
podczas
przygotowywania
próbki
b. Przechowuj agarozy w 37
°C a po wyjęciu szybko
nawarstwiaj na szkiełko
a. Uszkodzenie
komórki podczas
procedury
przygotowywania
a. Sprawdź morfologię
komórek przed
przygotowaniem
preparatów
c. Podgrzej szkiełko do 37 °C
przed nałożeniem
agarozy.
b. Ostrożnie przygotowywuj
komórki do analizy aby nie
spowodować ich
uszkodzenia
c. Upewnij się, że bufor
elektrodowy ma
temperaturę poniżej 20 °C.
d. Skróć czas inkubacji z
proteinazą K
e. Przechowuj komórki na
lodzie do czasu
przygotowania zawiesiny w
roztworze agarozy
4. W kontroli
negatywnej część
DNA jest
uszkodzone i
znajduje się w
ogonie
a. DNA zostało
uszkodzone poprzez
wewnątrzkomórkową
oksydację lub
aktywację
ednonukleaz podczas
procesu
przygotowywania
próbki
a. Upewnij się, że bufor
lizujący był schłodzony
przed użyciem
b. Upewnij się, że roztwór
PBS nie zawiera jonów Ca
i Mg
c. Unikaj nadmiernej
ekspozycji próbek na
światło
d. Dodaj DMSO aby
zneutralizować wolne
rodniki uwalniane z tkanek
5. Duża różnorodność
ogonów DNA
a. Zbyt gorący roztwór
agarozy
a. Dodawaj zawiesinę
komórek do agarozy o
temp 37 °C
6. W kontroli
pozytywnej
(traktowanej H2O2)
brak ogona DNA
a. Nieprawidłowo
przygotowana próbka
a. Upewnij się, że roztwór
H2O2 był świeży
b. Wydłuż czas inkubacji z
H2O2
c. Zwiększ stężenie H2O2
d. Upewnij się, że etap lizy
komórek oraz elektroforezy
został przeprowadzony
prawidłowo
7. W kontroli
pozytywnej są
obecne ogony DNA
ale
niewystarczająco
a. Zdegradowane DNA nie a. Sprawdź parametry buforu
alektrodowego (pH)
migruje efektywnie
podczas elektroforezy
8. Wyniki analiz są
niepowtarzalne
a. Stężenie agarozy jest
różne
a. Uważnie naważaj agarozy
przed przygotowaniem
b. Występują błędy
podczas
przygotowywania
próbek
b. Uważnie przygotuj próbki
11
d.
c. Bufor elektrodowy
nieróznowmiernie
przykrywa szkiełka
c. Upewnij się, że aparat
Kometa DNA jest
wypoziomowany
d. Roztwory są nieświeże
d. Używaj tylko świeżych
roztworów.
12
5. Akcesoria i wyposażenie dodatkowe
Numer katalogowy
Opis produktu
134-191
Wkład 2 x 5 do wylewania, przenoszenia i barwienia 10
preparatów
134-192
Zbiornik do inkubacji i barwienia z wymiennikiem ciepła
134-193
Stolik do wylewania żelu agarozowego
134-194
Uchwyt do grzebienia
134-195
Grzebień, grubość: 1,5 mm/20 studzienek
134-197
Wkład 2 x10 do wylewania, przenoszenia i barwienia 20
preparatów
130-102
LCOOL Przepływowy Układ Stabilizacji Temperatury
13
6. Warunki gwarancji
Krzysztof Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne sp. z o.o. gwarantuje, że dostarczony
Państwu sprzęt został przetestowany i spełnia wszystkie warunki specyfikacji.
Niniejsza gwarancja jest ważna przez 24 miesiące tylko wtedy, gdy produkt i jego funkcje
zostały wykorzystane zgodnie z instrukcją obsługi i przeznaczeniem aparatu.
Producent nie ponosi odpowiedzialności za straty lub szkody wynikające z
nieprawidłowego użytkowania aparatu.
Gwarancji nie podlega sprzęt, który nosi znamiona naprawy przez osoby inne niż
wskazane przez firmę Krzysztof Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne.
Odpowiedzialność producenta jest ograniczona do naprawy lub wymiany urządzenia, lub
zwrotu kosztów zakupu.
Firma Krzysztof Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne zastrzega sobie prawo do zmiany
specyfikacji urządzenia bez wcześniejszego powiadomienia.
Urządzenie powinno być obsługiwane wyłącznie przez osoby przeszkolone.
6.1 Formularz naprawy gwarancyjnej
W przypadku wystąpienia awarii, uprzejmie prosimy o wypełnienie Formularza naprawy
gwarancyjnej dostępnego na kolejnej stronie i skontaktowanie się z firmą Krzysztof
Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne.
Prosimy o zachowanie oryginalnych opakowań aparatu do czasu zakończenia okresu
gwarancyjnego.
7. Wsparcie techniczne
Jeżeli macie Państwo jakieś pytania dotyczące obsługi urządzenia lub dostępności
akcesoriów i sprzętu uzupełniającego prosimy o kontakt z naszą Firmą.
K. Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne sp. z o.o.
ul. Pawińskiego 5a/ blok D
02-106 Warszawa
T 22 668 71 47
F 22 668 71 64
e-mail: [email protected]
14
ZGŁOSZENIE SERWISOWE
Nazwa Instytucji
Adres Instytucji
Osoba zgłaszająca
Dane kontaktowe (tel., e-mail)
DANE URZĄDZENIA
Nazwa
Model / nr katalogowy
Numer seryjny
Opis problemu/uszkodzenia
Oświadczenie
Data
Podpis osoby zgłaszającej
Niniejszym potwierdzam, że przesłane do serwisu urządzenie nie
zawiera substancji chemicznych ani czynników infekcyjnych
szkodliwych dla zdrowia człowieka.