Skrypt do części prowadzonej przez Zakład Biologii Molekularnej

Skrypt do części prowadzonej przez Zakład Biologii Molekularnej

BIOLOGIA MOLEKULARNA
Oczyszczanie rekombinowanego enzymu z komórek Escherichia coli.
Ćwiczenie ma na celu oczyszczenie rekombinowanego enzymu – β-galaktozydazy. Enzym ten zmodyfikowano przez dodanie
dwóch peptydów: na N-końcu cząsteczki dodano peptyd składający się z 6 reszt histydynowych (6xHis), a na C-końcu –
epitop HA (YPYDVPDYA). Tak zmodyfikowany enzym wyrażano w komórkach bakterii E. coli BL21(DE3). Obecność peptydu
6xHis umożliwi oczyszczenie rekombinowanego białka metodą chromatografii powinowactwa do immobilizowanego metalu
przy zastosowaniu złoża zawierającego kationy Ni2+ (tzw. złoże niklowe). Epitop HA będzie wykorzystany do identyfikacji
immunologicznej izolowanego białka.
Ćwiczenie polega na: i) wyizolowaniu rekombinowanej β-galaktozydazy z otrzymanego lizatu bakteryjnego przy
zastosowaniu złoża niklowego; ii) oznaczeniu aktywności enzymatycznej β-galaktozydazy w lizatach bakteryjnych i frakcjach
chromatograficznych; iii) rozdziale wybranych prób metodą elektroforezy w żelu poliakrylamidowym z SDS (SDS-PAGE);
iv) wybarwieniu rozdzielonych białek błękitem Coomassie R-250, barwnikiem fluorescencyjnym (SYPRO orange) i srebrem;
v) immunologicznym potwierdzeniu obecności rekombinowanej β-galaktozydazy w rozdzielonych próbach przy użyciu
przeciwciał rozpoznających epitop HA.
2.
W czasie inkubacji lizatu z Ni-NTA agarozą rozpocząć przygotowywanie żelu poliakrylamidowego (opis na str. 2)
3.
4.
5.
6.
7.
Skrypt i DODATKOWE MATERIAŁY do ćwiczeń można znaleźć na stronie:
www.biol.uw.edu.pl/zbm
Plan pracy:
Dzień 1:
Izolacja rekombinowanej β-galaktozydazy przy zastosowaniu złoża niklowego (Ni-NTA agarozy); oznaczenie
aktywności enzymatycznej β-galaktozydazy; przygotowanie żelu poliakrylamidowego do elektroforezy białek.
Dzień 2:
Elektroforeza białek; barwienie żelu błękitem Coomassie R-250. Elektrotransfer białek na błonę PVDF.
Dzień 3:
Odbarwianie żelu po barwieniu błękitem Coomassie R-250. Barwienie żeli SYPRO orange i srebrem; barwienie
błony PVDF.
Dzień 4:
Identyfikacja rekombinowanej β-galaktozydazy metodą immunoblottingu.
Ćwiczenie jest wykonywane w czterech zespołach kilkuosobowych !!!
DZIEŃ 1:
CZĘŚĆ 1: Izolacja β-galaktozydazy
Materiał biologiczny:
1.
Zamrożony klarowny lizat bakterii E. coli (BL21/DE3), transformowanych wektorem niosącym gen
β-galaktozydazy i indukowanych 1 mM IPTG (przez 4 godz. w temperaturze 37°C)
2.
Zamrożony klarowny lizat kontrolny bakterii E. coli (BL21/DE3), transformowanych wektorem niosącym gen
β-galaktozydazy, bez indukcji IPTG
Oba lizaty otrzymano poprzez otwarcie komórek metodą sonikacji w buforze lizującym (patrz poniżej) i odwirowanie.
Odczynniki:
1.
50% (v/v) zawiesina Ni-NTA agarozy w buforze lizującym (50 mM NaH2PO4, pH 8.0, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol)
2.
Bufor do płukania (50 mM NaH2PO4, pH 8.0, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol)
3.
Bufor do elucji (50 mM NaH2PO4, pH 8.0, 300 mM NaCl, 250 mM imidazol)
4.
100 mM PMSF (fluorek fenylometylosulfonylu)
5.
Bufor Laemmli’ego 5x (0.325 M Tris-HCl, pH 6.8, 10 % (w/v) SDS, 50 % (w/v) glicerol, 10 % (v/v) β-merkaptoetanol,
0.05 % (w/v) błękit bromofenolowy)
Złoże odwirować przez 2 minuty w mikrowirówce (4 000 rpm), supernatant zebrać i zachować do dalszych analiz
(probówka nr 2). Przy zbieraniu supernatantu uważać, żeby nie zaciągnąć złoża do końcówki pipety (lepiej zostawić
niewielką ilość buforu nad złożem).
Osad przepłukać 3 x 1 ml buforu do płukania. Za każdym razem zawartość probówki kilkakrotnie wytrząsnąć w ręku i
odwirować j.w. Supernatant po pierwszym płukaniu zebrać i zachować do dalszych analiz (probówka nr 3).
Supernatant po pozostałych płukaniach można wylać.
Związane ze złożem białko eluować 5 x 80 µl buforu do elucji. Za każdym razem zawartość probówki kilkakrotnie
wytrząsnąć w ręku i odwirować j.w. Zebrać supernatant po każdej elucji (probówki nr 4 – 8).
Probówkę, w której pozostało złoże po zakończonej elucji, podpisać nr 9.
Przygotować próbki do elektroforezy: z probówek 0 – 8 pobrać po 40 µl, z probówki 9 pobrać 10 µl i przenieść do
nowych probówek podpisanych odpowiednio 0E – 9E. (UWAGA: w probówce 9 powinno pozostać jeszcze 10 µl
zawiesiny do testu ONPG. Jeśli objętość jest mniejsza, to przed pobraniem próby na elektroforezę, do złoża dodać kilka
mikrolitrów buforu do elucji). Do probówek 0E – 8E dodać po 10 µl buforu Laemmli’ego 5x, a do probówki 9E dodać
30 µl wody i 10 µl buforu Laemmli’ego 5x . Przygotowane próby przechowywać w temp. –20oC.
CZĘŚĆ 2: Oznaczanie aktywności enzymatycznej β-galaktozydazy (test ONPG)
Odczynniki:
1.
Bufor reakcyjny (60mM NaH2PO4, 40mM Na2HPO4, 10mM KCl, 1mM MgSO4, pH7.0)
2.
0.4% (w/v) ONPG (o-nitrofenylo-β-D-galaktopiranozyd) w 50 mM Tris-HCl, pH 8.0
3.
1 M Na2CO3
Wykonanie:
1. Dziesięć nowych probówek typu Eppendorf podpisać nr 0A – 9A i umieścić w statywie. Do wszystkich probówek
odpipetować po 400 µl buforu reakcyjnego. Pozostawić przez przynajmniej 5 min. w temperaturze pokojowej.
2. Do probówek z buforem dodać po 10 µl frakcji przygotowanych w Części 1. ćwiczenia (tzn. z probówki 0 dodać 10 µl
do 0A, z 1 – do 1A itd.).
3. Test wykonuje się dodając do każdej z probówek po 160 µl roztworu ONPG. Reakcję zatrzymuje się po 2 min. dodając
200 µl 1 M Na2CO3. Ze względu na dużą liczbę próbek, test wykonać najpierw dla pierwszych pięciu (0A – 4A) i dopiero
po zakończeniu reakcji – dla pozostałych (5A – 9A). Test wykonać w następujący sposób: dodać ONPG do probówki 0A
i włączyć stoper, po 20 sek. dodać ONPG do 1A, po kolejnych 20 sek. (czyli po 40 sek. od włączenia stopera) dodać
ONPG do 2A itd. Po upływie 2 min., dodać Na2CO3 do probówki 0A; po 2 min. 20 sek., dodać Na2CO3 do 1A, po 2 min.
40 sek., dodać Na2CO3 do 2A itd. Analogicznie, test przeprowadzić dla prób 5A – 9A.
4. Obserwować pojawienie się żółtej barwy. Zanotować wynik testu w tabeli poniżej. Intensywność pojawiającego się
zabarwienia oznaczyć symbolami: +++, ++, + oraz –.
Nr
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
Wykonanie:
Doświadczenie prowadzić używając schłodzonych buforów i przechowując próbki w lodzie.
Bezpośrednio przed użyciem przygotować małe porcje buforów do płukania (4 ml) i do elucji
(0.5 ml) uzupełnione PMSF do stężenia 1 mM.
1.
1
Pozostałą część lizatu bakterii indukowanych IPTG dodać do probówki, w której znajduje się 60 µl zawiesiny Ni-NTA
agarozy w buforze lizującym. Zamkniętą probówkę umieścić poziomo w pojemniku z lodem na kołysce laboratoryjnej i
mieszać przez 45 min.
Lizat kontrolny podpisać nr 0 i zachować do dalszych analiz. Lizat bakterii indukowanych IPTG (400 µl) odwirować
przez 1 min. w mikrowirówce (12 000 rpm), pobrać 100 µl do probówki typu Eppendorf oznaczonej nr 1 i zachować do
dalszych analiz.
5.
Etap oczyszczania
Lizat kontrolny
Lizat bakterii z indukcją β-galaktozydazy
Supernatant po wiązaniu lizatu do złoża
Płukanie złoża (pierwsza frakcja)
Elucja ze złoża (frakcja 1)
Elucja ze złoża (frakcja 2)
Elucja ze złoża (frakcja 3)
Elucja ze złoża (frakcja 4)
Elucja ze złoża (frakcja 5)
Wynik testu ONPG
Zawiesina złoża po elucji
Pozostałą część prób 0 – 9 pozostawić w temperaturze –20oC (do następnych ćwiczeń)
BIOLOGIA MOLEKULARNA
2
DZIEŃ 2:
CZĘŚĆ 3.1: Elektroforeza białek w żelu poliakrylamidowym zawierającym SDS (SDS-PAGE) – przygotowanie żeli
CZĘŚĆ 3.2: Elektroforeza białek w żelu poliakrylamidowym zawierającym SDS (SDS-PAGE) c.d. – rozdział białek
Odczynniki:
1.
Mieszanina monomerów (30 % (w/v) akrylamid, 0.8 % (w/v) N,N'-metylenobisakrylamid)
2.
1.5 M Tris-HCl, pH 8.8
3.
0.625 M Tris-HCl, pH 6.8
4.
1 % (w/v) SDS (dodecylosiarczan sodu)
5.
10 % (w/v) APS (nadsiarczan amonu)
6.
TEMED (N,N,N',N'-tetrametylenodiamina)
7.
Bufor do elektroforezy, pH 8.3 (0.025 M Tris, 0.192 M glicyna, 0.1 % (w/v) SDS)
UWAGA: W trakcie ćwiczenia zostanie przeprowadzony rozdział elektroforetyczny w sumie na sześciu żelach na całą grupę.
Trzy żele zostaną zabarwione: jeden błękitem brylantowym Coomassie R-250, drugi – SYPRO orange a trzeci – srebrem; trzy
pozostałe żele zostaną poddane elektrotransferowi. Każdy zespół rozdziela swoje próbki przynajmniej na jednym żelu, a dwa
zespoły na dwóch żelach.
Na każdym z żeli rozdzielane będą następujące próbki:
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Akrylamid przed polimeryzacją jest silnie trujący. Nigdy nie pipetować ustami. Wszystkie czynności z akrylamidem
wykonywać tylko w rękawiczkach.
Wykonanie:
1.
Złożyć ze sobą dwie bardzo czyste (przetarte dodatkowo etanolem) i suche płytki szklane przedzielone szarymi
przekładkami. Jedna z płytek powinna być ustawiona wcięciem ku górze, zaś druga z płytek, dwoma zaokrąglonymi
rogami na dół. Wokół tej drugiej powinna być owinięta pomarańczowa uszczelka zgrubieniem do środka (między
płytki). Krawędzie górne płytek powinny być na tej samej wysokości, ale przekładki i uszczelka mogą wystawać
powyżej górnych krawędzi płytek. Tak przygotowany komplet szybek ustabilizować czterema dużymi białymi klamrami
(dwie na dole i po jednej na każdym boku). Między szybki włożyć biały grzebyk z 10 ząbkami. Zaznaczyć markerem na
szybce punkt ok. 3 mm poniżej dolnej krawędzi ząbków grzebyka. Delikatnie wyciągnąć grzebyk.
2.
Przygotować żel 10% mieszając ze sobą roztwory wg kolejności w tabeli poniżej. TEMED zawsze dodawać tuż przed
wylaniem żelu.
Roztwór
Mieszanina monomerów
Woda dejonizowana
1.5 M Tris-HCl, pH 8.8
0.625 M Tris-HCl, pH 6.8
1 % SDS
10 % APS
TEMED
3.
4.
5.
6.
Odczynniki
1.
Bufor do elektroforezy, pH 8.3 (0.025 M Tris, 0.192 M glicyna, 0.1 % (w/v) SDS)
2.
Mieszanina białek wzorcowych w buforze Laemmli'ego 1x (UWAGA: w żelu 10 % małe białka wzorcowe nie zostaną
rozdzielone i będą migrowały razem z barwnikiem):
Białko wzorcowe
miozyna
β-galaktozydazy
fosforylaza b
albumina
owoalbumina
anhydraza węglanowa
inhibitor trypsyny
lizozym
aprotynina
Żel 10 % Żel 4 %
2.00 ml
0.20 ml
1.90 ml
0.90 ml
1.50 ml
0.30 ml
0.60 ml
0.15 ml
40 µl
20 µl
5 µl
5 µl
Mieszaninę wlać między płytki szklane ustawione na bibule aż do poziomu zaznaczonego uprzednio na szybce. Na
powierzchnię roztworu ostrożnie nawarstwić wodę na wysokość ok. 1 cm. Tak przygotowany żel rozdzielający
pozostawić do spolimeryzowania (powinna pojawić się wyraźna granica między spolimeryzowanym żelem a warstwą
wody).
Pod koniec polimeryzacji żelu rozdzielającego przygotować 4 % żel zagęszczający mieszając ze sobą roztwory wg
kolejności w tabeli powyżej.
Zlać wodę znad żelu rozdzielającego. Mieszaninę żelu 4% nawarstwić na żel rozdzielający do krawędzi szybki z
wcięciem. Wsunąć grzebień i tak przygotowany żel zatężający pozostawić do spolimeryzowania (około 15 minut w
temperaturze pokojowej).
Ostrożnie wyciągnąć grzebyk i zalać kieszonki w żelu buforem do elektroforezy. Trzymając szybki, zdjąć klamry i
delikatnie wyciągnąć gumową uszczelkę. Cały żel owinąć ręcznikiem papierowym nasączonym wodą dejonizowaną, a
następnie szczelnie folią, spiąć metalowymi klamrami i pozostawić w lodówce do następnych ćwiczeń.
Mieszanina białek wzorcowych
Lizat kontrolny (0E)
Lizat bakterii z indukcją β-galaktozydazy (1E)
Supernatant po wiązaniu lizatu do złoża (2E)
Płukanie złoża (pierwsza frakcja) (3E)
Elucja ze złoża
frakcje o największej aktywności
Elucja ze złoża
β-galaktozydazy, na podstawie
Elucja ze złoża
testu ONPG (4E – 8E)
Elucja ze złoża
Zawiesina złoża po elucji (9E)
3.
4.
5.
Masa cząsteczkowa (Da)
200 000
116 250
97 400
66 200
45 000
31 000
21 500
14 400
6 500
Roztwór do barwienia żelu błękitem brylantowym Coomassie R-250 (CBB R-250), do wielokrotnego użycia (0.2 % (w/v)
CBB R-250 w roztworze woda : metanol : kwas octowy 5:5:1)
7.5% (v/v) kwas octowy
5% (v/) kwas octowy/ 50% (v/v) metanol
Wykonanie
1.
Z żelu przygotowanego na poprzednich zajęciach odpiąć klamry i odwinąć folię.
2.
Umieścić żel w aparacie (szybką z wcięciem do środka aparatu), szybki umocować w aparacie małymi białymi klamrami.
Wlać bufor do elektroforezy do dolnego i górnego zbiornika. Kieszonki w żelu przepłukać buforem do elektroforezy.
3.
Próby do elektroforezy (wybrane zgodnie z tabelą powyżej) zawierające bufor Laemmli'ego ogrzewać przez 3 minuty w
100oC a następnie zwirować przez kilkanaście sekund w mikrowirówce.
4.
Do kieszonek w żelu nanieść po 20 µl przygotowanych prób.
5.
Włączyć chłodzenie aparatu do elektroforezy (lekko odkręcić kran) i podłączyć aparat do zasilacza (elektroda ujemna
od strony kieszonek, elektroda dodatnia od dolnej krawędzi żelu).
6.
Elektroforezę prowadzić przy napięciu około 110 V do czasu przesunięcia się barwnika do dolnej krawędzi żelu (około 1
– 1.5 godz.).
7.
Wyjąć szybki z żelem z aparatu, wyciągnąć przekładki i rozłożyć szybki (delikatnie podważając jedną z nich). Obciąć
warstwę żelu zagęszczającego (z kieszonkami).
BIOLOGIA MOLEKULARNA
8.
Dalsze postępowanie zależy od tego, czy żel będzie barwiony, czy poddawany elektrotransferowi. Elektrotransfer
wykonać bezpośrednio po zakończeniu elektroforezy, postępując zgodnie z opisem części 4 ćwiczenia. Z żelami
przeznaczonymi do barwienia postępować zgodnie z opisem poniżej:
7.
8.
Barwienie błękitem Coomassie R-250: żel umieścić w naczyniu z roztworem do barwienia i barwić przez przynajmniej 20
min. Po zabarwieniu, żel pozostawić do następnych zajęć w naczyniu z 7.5 % kwasem octowym, aby odpłukać nadmiar
barwnika. Opary kwasu octowego są trujące. Nigdy nie pipetować ustami stężonego kwasu. Odbarwianie żelu
prowadzić pod włączonym wyciągiem chemicznym.
Barwienie SYPRO orange: żel umieścić w naczyniu z 7.5% kwasem octowym i pozostawić do następnych zajęć.
Barwienie srebrem: żel umieścić w naczyniu z 5% kwasem octowym/ 50% metanolem i pozostawić do następnych zajęć
(utrwalanie żelu).
CZĘŚĆ 4.1: Elektrotransfer białek na błonę PVDF -metoda pół-sucha (ang. semi-dry)
UWAGA: w czasie ćwiczenia wykonany zostanie elektrotransfer białek z trzech żeli
Odczynniki i materiały:
1. Bufor do elektrotransferu (0.025 M Tris, 0.192 M glicyna, 10% metanol, pH 8.3)
2. 100% metanol
3. Błona PVDF (polidifluorek winylidenu)
4. Bibuła Whatman 3MM
Wykonanie:
Aby uniknąć zanieczyszczenia błony, pracować w czystych rękawiczkach.
Kiedy to możliwe, błonę przenosić używając pęsety.
Błona PVDF bardzo łatwo wysycha.
Od momentu aktywacji w metanolu unikać pozostawiania błony poza roztworem.
1.
2.
3.
4.
Żel po zakończonej elektroforezie namoczyć w buforze do elektrotransferu, mieszając na kołysce laboratoryjnej przez
ok. 10 min .
Z błony PVDF wyciąć jeden prostokąt o wymiarach 5 x 8 cm.
Z bibuły Whatman 3MM wyciąć osiem prostokątów o wymiarach 5 x 8 cm.
Błonę PVDF aktywować przez zanurzenie na 10 sekund w 100% metanolu (w plastikowym pudełku), przepłukać w
wodzie destylowanej, a następnie namoczyć przez około 2-3 minuty w buforze do elektrotransferu. Przygotowane
kawałki bibuły Whatman 3MM również namoczyć w buforze do elektrotransferu przez około 2-3 minuty.
kaseta górna: elektroda (-)
bibuła Whatman 3MM – 4 warstwy
żel
błona PVDF
bibuła Whatman 3MM – 4 warstwy
kaseta dolna - elektroda (+)
5.
6.
Ułożyć transfer (tzw. kanapkę - z ang. sandwich) wg instrukcji producenta urządzenia Trans- Blot®Turbo™Transfer
System (BIO-RAD). Na środku dna kasety do transferu umieścić (zgodnie ze schematem) cztery warstwy bibuły
Whatman 3MM, które zostały uprzednio namoczone w buforze do elektrotransferu. Na nich ułożyć namoczoną
błonę PVDF, żel i kolejne cztery warstwy bibuły Whatman 3MM. Układając poszczególne warstwy zwrócić uwagę, aby
nie było między nimi bąbelków powietrza. W razie potrzeby usunąć je wałkując „kanapkę” przy użyciu dołączonej do
urządzenia rolki. Kasetę zamknąć i umieścić w aparacie. UWAGA: jeśli używamy obu kaset do transferu, to w każdej
musi być taka sama liczba żeli,co oznacza w naszym przypadku, że nie można w jednej kasecie umieścić dwóch żeli, a
w drugiej jednego.
Z menu wybrać program 112_10%BM (25V, 0.8A, 15 minut, constant A) wybierając po kolei:
List;
User-defined;
112_10%BM;
3
Run (A, B lub A i B) w zależności od tego, w jakim położeniu umieściliśmy kasetę z ułożoną „kanapką” i przeprowadzić
transfer.
Po zakończeniu elektrotransferu wyjąć błonę PVDF z kasety i ołówkiem zaznaczyć stronę, na której znajdują się białka
(strona, która przylegała do żelu).
Bibułowe przekładki wyrzucić, a kasetę umyć czystą wodą i pozostawić do wyschnięcia. Błonę pozostawić na czystej
bibule do wyschnięcia, zawinąć w folię spożywczą i przechować w lodówce do następnych zajęć.
DZIEŃ 3:
CZĘŚĆ 3.3: Elektroforeza białek w żelu poliakrylamidowym zawierającym SDS (SDS-PAGE) c.d. – barwienie żeli
Odczynniki:
1.
7.5% (v/v) kwas octowy
2.
7.5% (v/v) kwas octowy z 0.05% (w/v) SDS
3.
Roztwór do barwienia SYPRO orange: 5 µl SYPRO orange w 25 ml 7.5% roztworu kwasu octowego, przygotowywany na
świeżo)
4.
Roztwory do barwienia srebrem:
o
50% (v/v) metanol
o
0.02% (w/v) Na2S2O3 (rozcieńczyć 500 µl 2% (w/v) Na2S2O3 w 50 ml wody dejonizowanej)
o
0.15% (w/v) AgNO 3 (rozcieńczyć 2.5 ml 20x stężonego AgNO 3 w 50 ml wody dejonizowanej)
o
roztwór wywołujący (rozcieńczyć 20 µl 37% formaldehydu w 50 ml 2% (w/v) Na2CO3)
Wykonanie:
Barwienie błękitem Coomassie R-250: W celu lepszego odbarwienia żelu kontynuować płukanie w 7.5% kwasie octowym na
gorąco (około 60 – 80oC). Opary kwasu octowego są trujące. Nigdy nie pipetować ustami stężonego kwasu.
Odbarwianie żelu prowadzić pod włączonym wyciągiem chemicznym.
Barwienie SYPRO orange: żel namoczyć (mieszając na kołysce laboratoryjnej) przez 30 min. w 7.5% kwasie octowym z 0.05%
SDS a następnie przełożyć do naczynia z roztworem do barwienia. Naczynie przykryć folią aluminiową, aby odciąć
dostęp światła do barwnika i zabezpieczyć żel przed odkładaniem się kurzu. Barwić przez 30 min, mieszając delikatnie
na kołysce laboratoryjnej. Opcjonalnie, po zabarwieniu, usunąć nadmiar roztworu barwiącego płucząc żel przez
dokładnie 30 sek. w 7.5% kwasie octowym (wydłużenie odbarwiania może obniżyć czułość barwienia). Zarejestrować
obraz białek wybarwionych fluorescencyjnie SYPRO orange przy użyciu kamery ChemiDoc XRS.
Barwienie srebrem składa się z serii następujących po sobie inkubacji:
o
płukanie: 10 min. w 50% metanolu, 10 min. w wodzie dejonizowanej
o
uczulanie: 3 min. w 0.02% Na2S2O3
o
płukanie: 1 x 2 min. i 1 x 1 min. w wodzie dejonizowanej. Od tej pory ściśle przestrzegać podanych długości
inkubacji!
o
barwienie srebrem: 30 min. w 0.15% AgNO3
o
płukanie: 1x 2 min. i 1x 1 min. w wodzie dejonizowanej
o
wywołanie: płukać w roztworze wywołującym obserwując pojawianie się prążków białek; gdy intensywność
prążków będzie satysfakcjonująca, zatrzymać reakcję przenosząc żel do 7.5% kwasu octowego
BIOLOGIA MOLEKULARNA
CZĘŚĆ 4.2: Elektrotransfer białek na błonę PVDF c.d. – barwienie błony PVDF
3.
4.
Odczynniki:
1.
100% metanol
2.
Roztwór Ponceau S (0.1% (w/v) Ponceau S w 5% kwasie octowym)
5.
6a.
Wykonanie:
Błonę PVDF z białkami po elektrotransferze aktywować przez zanurzenie na 10 sekund w 100% metanolu (w plastikowym
pudełku) a następnie zabarwić przez 5 min. w roztworze barwnika Ponceau S. Roztwór barwnika zlać ponownie do butelki a
błonę kilkakrotnie intensywnie przepłukać wodą dejonizowaną.
6c.
DZIEŃ 4:
CZĘŚĆ 5: Identyfikacja rekombinowanej β-galaktozydazy metodą immunoblottingu
UWAGA: do identyfikacji rekombinowanej β-galaktozydazy metodą immunoblottingu wykorzystane zostaną przeciwciała
pierwszorzędowe wiążące epitop HA. Identyfikacja zostanie wykonana w trzech wariantach różniących się przeciwciałami
drugorzędowymi i/ lub metodą detekcji użytą do wizualizacji kompleksu antygen-przeciwciało:
Błona nr
Przeciwciało I-rzędowe
1
2
3
mysie IgG anty-HA
Przeciwciało II-rzędowe
anty-mysie IgG z kozy sprzężone z
alkaliczną fosfatazą
anty-mysie IgG z kozy sprzężone z
peroksydazą chrzanową
anty-mysie IgG z kozy sprzężone z
peroksydazą chrzanową
6b.
4
Zlać roztwór przeciwciał i płukać błonę 3x3 min w ok. 50 ml buforu TBST.
Błony zalać ok. 10 ml roztworu przeciwciał drugorzędowych: jedną z błon – roztworem anty-mysich IgG z kozy
sprzężonych z alkaliczną fosfatazą; dwie pozostałe – roztworem anty-mysich IgG z kozy sprzężonych z peroksydazą
chrzanową. Inkubować przez 20 min.
Każdą z błon płukać 3x3 min ok. 50 ml buforu TBST i 1x3 min ok. 50 ml buforu TBS.
Błonę inkubowaną z przeciwciałami sprzężonymi z alkaliczną fosfatazą zalać równomiernie 1 ml substratu dla
alkalicznej fosfatazy i inkubować (bez mieszania!) do momentu pojawienia na błonie się kolorowych prążków.
Zatrzymać reakcję przez dwukrotne szybkie odpłukanie nadmiaru substratu wodą dejonizowaną
Jedną z błon inkubowanych z przeciwciałami sprzężonymi z peroksydazą chrzanową zalać 15 ml substratu dla
peroksydazy chrzanowej w reakcji barwnej i inkubować (z mieszaniem!) do momentu pojawienia na błonie się
kolorowych prążków. Zatrzymać reakcję przez dwukrotne szybkie odpłukanie nadmiaru substratu wodą dejonizowaną
Wizualizacja kompleksów antygen – przeciwciało metodą wzmocnionej chemiluminescencji zostanie wykonana w
ciemni. Drugą z błon inkubowanych z przeciwciałami sprzężonymi z peroksydazą chrzanową zalać 10 ml substratu dla
peroksydazy chrzanowej, inkubować 1 min, następnie zawinąć w folię. Zgasić światło pozostawiając zapalone
oświetlenie czerwone. Przyłożyć kliszę fotograficzną do błony. Po 10 sek. wywołać kliszę inkubując ok. 4 min. w
wywoływaczu a następnie (po odpłukaniu wywoływacza w wodzie dejonizowanej) utrwalić ją przez ok. 4 min. w
utrwalaczu. Odpłukać utrwalacz wodą dejonizowaną i pozostawić kliszę do wyschnięcia. W razie potrzeby wykonać
kolejne ekspozycje kliszy skracając lub wydłużając czas przyłożenia kliszy do błony.
Substrat (metoda detekcji)
BCIP/ NBT (barwny produkt)
DAB/ NiCl2 (barwny produkt)
luminol/ fenole (wzmocniona
chemiluminescencja)
Odczynniki:
1.
100% metanol
2.
TBS (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl)
3.
TBST (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.05% (v/v) Tween-20)
4.
Roztwór blokujący (5% (w/v) odtłuszczone mleko w proszku w buforze TBST)
5.
Mysie IgG anty-HA (1:2000) w roztworze blokującym (przeciwciała pierwszorzędowe)
6.
Anty-mysie IgG z kozy sprzężone z alkaliczną fosfatazą (1:2000) w roztworze blokującym (przeciwciała drugorzędowe)
7.
Anty-mysie IgG z kozy sprzężone z peroksydazą chrzanową (1:2000) w roztworze blokującym (przeciwciała
drugorzędowe)
8.
Substrat dla alkalicznej fosfatazy (z firmy Promega, nr kat. S3841, zawierający: 5-bromo-4-chloro-3-indolilofosforan
[BCIP] i błękit nitrotetrazolowy [NBT])
9.
Substrat dla peroksydazy chrzanowej w reakcji barwnej (0.06% czterochlorek 3,3’-diaminobenzydyny lub 0.06%
diaminobenzydyna [DAB], 0.03% NiCl2, 0.03% H2O2, 50 mM Tris-HCl, pH 7.6). Zmieszać na świeżo 6 mg DAB, 100 µl 3%
NiCl2, 10 µl 30% H2O2, 5 ml 100 mM Tris-HCl, pH 7.6 i dopełnić do 10 ml wodą dejonizowaną.
10. Substrat dla peroksydazy chrzanowej do detekcji metodą wzmocnionej chemiluminescencji (0.225 mM kwas
kumarowy, 1.5 mM luminol, 0.018% H2O2, 100 mM Tris-HCl pH 8.5). Zmieszać na świeżo 25 µl 90 mM kwasu
kumarowego (roztwór w DMSO), 60 µl 250 mM luminolu (roztwór w DMSO), 6 µl 30% H2O2 w 10 ml 100 mM Tris-HCl
pH 8.5
11. Klisze fotograficzne Foton XS
12. Wywoływacz do błon fotograficznych (z firmy Sigma, nr kat. P7042)
13. Utrwalacz do błon fotograficznych (z firmy Foton, nr kat. 10085)
Wykonanie:
1.
Przed ćwiczeniami błony zostały aktywowane przez zanurzenie przez 10 sek. w 100% metanolu i umieszczone w
roztworze blokującym na ok. 1 godz.
2.
Zlać roztwór blokujący, każdą z trzech błon zalać 10 ml roztworu przeciwciał pierwszorzędowych (mysie IgG anty-HA) i
inkubować przez 40 min. Wszystkie inkubacje z przeciwciałami i płukania wykonywać w temperaturze pokojowej
mieszając na kołysce laboratoryjnej. W czasie całej procedury ta strona błony, która przylegała do żelu powinna być
zwrócona do góry.
UWAGA!!!
Prosimy nie pisać na statywach do probówek.