CandiSelect 63746 - Bio-Rad

CandiSelect™ 4
63746
Chromogenne podłoże agarowe do wybiórczej izolacji grzybów drożdżopodobnych, bezpośredniej
identyfikacji Candida albicans i wstępnej identyfikacji Candida tropicalis, Candida glabrata i Candida
krusei.
1- ZASTOSOWANIE
3- ZASADY PROCEDURY
CandiSelect™ 4 jest chromogennym podłożem
agarowym stosowanym do:
• Wybiórczej izolacji drożdżaków.
• Bezpośredniej identyfikacji Candida albicans poprzez
wykrywanie specyficznej aktywności enzymatycznej w
wyniku czego powstają kolonie zabarwione na kolor
różowy do fioletowego.
• Wstępnej identyfikacji Candida tropicalis, Candida
glabrata i Candida krusei na podstawie turkusowej
barwy i morfologii kolonii.
• Wykrywania
mieszanych
hodowli
grzybów
drożdżopodobnych.
Podłoże
CandiSelect™
4
zawiera
substraty
chromogenne, które reagują z enzymami wydzielanymi
przez komórki drożdży, co skutkuje powstaniem kolonii o
różnym zabarwieniu. Enzymy te są gatunkowo swoiste,
co umożliwia identyfikację organizmów do poziomu
gatunku na podstawie ich barwy i charakterystyki kolonii.1
2- STRESZCZENIE I OBJAŚNIENIA
Częstość
występowania
inwazyjnych
zakażeń
grzybiczych rosła w ciągu dwóch ostatnich dziesięcioleci
w sposób stały. Ostatnie postępy w zakresie interwencji
medycznych i chirurgicznych oraz rosnąca populacja
pacjentów z obniżoną odpornością, przyczyniły się do
zróżnicowania i wydłużenia listy ludzkich patogenów
grzybiczych. Powszechnie przyjmuje się, że gatunki
Candida są częstą przyczyną zakażeń szpitalnych, z
którymi
związana
jest
znacząca
chorobowość,
śmiertelność i podwyższone koszty ochrony zdrowia.1
Candida albicans jest najczęściej występującym
gatunkiem Candida, który związany jest z tymi
zakażeniami,
jednakże
rośnie
częstotliwość
występowania gatunków innych niż albicans, takich jak
Candida glabrata i Candida krusei. Ponadto zakażenia
powodowane przez te ostatnie gatunki różnią się pod
względem wrażliwości na środki przeciwgrzybiczne.
Według
ostatnio
opublikowanych
wytycznych
dotyczących terapii kandydoz, przed wdrożeniem
odpowiedniego leczenia konieczna jest szybka i dokładna
2
diagnoza zakażenia.
CandiSelect™
4
jest
wybiórczym
podłożem
chromogennym
przeznaczonym
do
identyfikacji
C. albicans i wstępnej identyfikacji głównych patogenów
drożdżopodobnych: C. glabrata, C. tropicalis i C. krusei.
Kolonie C. albicans mają barwę różową do fioletowej.
Kolonie C. tropicalis są intensywnie turkusowe, sferyczne
gładkie. Kolonie C. glabrata są bladoturkusowe, płaskie i
lśniące, gładkie, występują najczęściej w postaci wzoru
zwanego „rybim okiem” (kolonie turkusowe z
ciemniejszym środkiem). Kolonie C. krusei są turkusowoniebieskie o charakterystycznym szorstkim wyglądzie,
suche i z nieregularnym brzegiem.
Identyfikacja Candida albicans oparta jest na wykrywaniu
za pomocą chromogennego substratu zawartego w
podłożu, swoistej dla gatunku aktywności enzymatycznej
heksozoaminidazy, co powoduje różowe do fioletowego
zabarwienie kolonii.
Detekcja aktywności enzymatycznej fosfatazy za pomocą
drugiego substratu zawartego w podłożu, pozwala na
wstępną identyfikację Candida tropicalis, Candida
glabrata i Candida krusei, w oparciu o turkusowe
zabarwienie kolonii w połączeniu z typową morfologią
każdego
gatunku.
Dodatek
chloramfenikolu
i
gentamycyny
hamuje
wzrost
większości
flory
towarzyszącej.
4- ODCZYNNIKI
Opakowanie 20 płytek Petriego (90 mm) (CANDI 4) –
Nr katalogowy 63746
CandiSelect™ 4 jest podłożem wybiórczym gotowym do
użytku.
Przybliżony skład podłoża (g/L)
Mieszanina peptonów
Glukoza
Substraty chromogeniczne
Chloramfenikol + gentamycyna
Agar
8
5
0,2
0,5
13
5- OSTRZEŻENIA I ŚRODKI OSTROŻNOŚCI
Wyrób do diagnostyki in vitro.
We wszystkich procedurach należy stosować techniki
aseptyczne i środki ostrożności odpowiednie dla
zagrożeń mikrobiologicznych. Zużyte płytki, pojemniki na
próbki i inne potencjalnie skażone materiały muszą
zostać wysterylizowane lub usunięte zgodnie z
określonymi procedurami laboratoryjnymi.
Wszystkie próbki ludzkie należy traktować jako zdolne do
przeniesienia choroba zakaźnej, w tym wirusów zapalenia
wątroby oraz HIV i stosować uniwersalne środki
ostrożności oraz przestrzegać odpowiednich zaleceń.3-7
Karta charakterystyki substancji niebezpiecznej (MSDS)
dostępna jest na życzenie (lub na stronie bio-rad.com).
1
Przedłużona ekspozycja podłoża CandiSelect™ 4 na
działanie światła, może prowadzić do zredukowanego
odzysku bakterii z próbek i/lub zabarwienia organizmów
kontrolnych oraz izolatów pochodzących od pacjenta.
Tak jak w przypadku innych podłoży chromogennych,
bardzo ważny jest dobrze wykonany posiew redukcyjny,
umożliwiający uzyskanie dobrze izolowanych kolonii,
wykazujących typową morfologię i zabarwienie.
6- INSTRUKCJE DOTYCZĄCE PRZECHOWYWANIA
Inkubacja:
• Inkubować odwróconą (agarem do góry) płytkę w
temperaturze 35-37°C przez 24 do 48 godzin. (przy
braku wzrostu przedłużyć okres inkubacji do
72 godzin). Nie inkubować w cieplarce CO2.
• Gatunki
należące
do
rodzajów
Cryptococcus
i Geotrichum rosną szybciej w temperaturze 30°C niż
37°C. Jeśli podejrzewa się zakażenie Cryptococcus
neoformans, zaleca się równoczesne inokulowanie
drugiej płytki, która inkubowana będzie w temperaturze
30°C.
Płytki przechowywać w temperaturze 2-8°C, chronić
przed dostępem światła.
Do momentu użycia, płytki należy przechowywać w
oryginalnym rękawie i kartonie. Każdorazowo po wyjęciu
płytek należy zamykać opakowanie. Płytki należy zużyć
przed terminem przydatności podanym na etykiecie i
nadrukowanym na płytce. Minimalizować ekspozycję na
działanie światła przed i w trakcie inkubacji, ponieważ
może ono zniszczyć substraty chromogenne zawarte w
podłożu.
7- POGORSZENIE JAKOŚCI PRODUKTU
Podłoże powinno być delikatnie opalizujące, o barwie
bardzo jasnobursztynowej. Jeśli płytki agarowe z
podłożem CandiSelect™ 4 są niebieskawe, ich
właściwości nie są optymalne. Płytek nie należy używać
jeśli widoczne są przerośnięcia, wysuszenia, pęknięcia
lub jakiekolwiek inne oznaki pogorszenia jakości.
8- POBIERANIE I OBRÓBKA PRÓBEK
Próbki należy pobierać i postępować z nimi według
standardowych procedur mikrobiologii klinicznej. Jeśli
próbki będą opracowywane w późniejszym terminie,
należy zastosować odpowiednie podłoże transportowe.
9- PROCEDURA
Dostarczany materiał:
• Płytki agarowe z podłożem Bio-Rad CandiSelect™ 4.
Wymagane materiały, które nie wchodzą w skład
zestawu
• Cieplarka, 35-37°C
• Materiały laboratoryjne wymagane do przeprowadzenia
tej procedury
Opcjonalne materiały, które nie wchodzą w skład
zestawu
• Uzupełniające podłoże hodowlane
• Organizmy kontrolne
Procedura badania
Przed użyciem doprowadzić podłoże CandiSelect™ 4 do
temperatury pokojowej. Nie używać, jeśli na powierzchni
agaru znajduje się nadmiar wilgoci.
Inokulacja:
• Próbki kliniczne wysiewać bezpośrednio na podłoże
CandiSelect™ 4,
wykorzystując
konwencjonalne
techniki izolacji. W przypadku próbek pobranych na
wymazówkę najpierw potrzeć wacikiem jedną czwartą
płytki, a następnie użyć ezy do izolacji. Należy
stosować się do obowiązujących zaleceń dotyczących
prawidłowego przechowywania próbek biologicznych.7
• Na podłoże CandiSelect™ 4 można wysiewać także
kolonie grzybów drożdżopodobnych, które wyizolowano
wcześniej na innej pożywce.
10- WYNIKI
Odczyt/interpretacja:
Odczytać wyniki z płytek i zidentyfikować drożdże na
podstawie barwy i morfologii kolonii. Optymalny wzrost i
najbardziej specyficzna morfologia pojawiają się po około
48 godzinach.
1) Bezpośrednia identyfikacja Candida albicans
Kolonie barwy różowej do fioletowej (dodatnia aktywność
heksozoaminidazy) wskazują na obecność Candida
albicans.
Kolonie o białej powierzchni i barwie różowej do fioletowej
na spodzie kolonii (widocznej po odwróceniu płytki)
należy identyfikować jako Candida albicans.
Po okresie inkubacji wynoszącym 48 godzin możliwe jest
zaobserwowanie rozchodzenia się barwy wokół kolonii i
można zauważyć fiołkoworóżową obwódkę.
2) Identyfikacja wstępna
Zabarwione na niebiesko kolonie wykazują aktywność
fosfatazy.
• Intensywnie turkusowe, jednolicie zabarwione kolonie,
o wypukłej, gładkiej powierzchni (S): identyfikacja
wstępna: Candida tropicalis.
Po okresie inkubacji wynoszącym 48 godzin barwa
turkusowa jest intensywna, a wokół kolonii
zaobserwować można turkusowe halo.
• Kolonie jasnoturkusowe, płaskie, lśniące gładkie (S) i
rosnące najczęściej w formie zwanej „rybim okiem”
(kolonie turkusowe z ciemniejszym środkiem): wstępna
identyfikacja: Candida glabrata.
• Kolonie
duże,
turkusowoniebieskie,
o
charakterystycznej szorstkiej powierzchni (R), suche i z
nieregularnym zarysem: wstępna identyfikacja Candida
krusei.
3) Testy uzupełniające
• Po okresie inkubacji wynoszącym 48 godzin kolonie,
które są białe lub jasnoniebieskie (i nie mają typowej
morfologii) powinny zostać poddane identyfikacji za
pomocą metod konwencjonalnych.
• Konwencjonalne
testy do identyfikacji, takie jak
lateksowe testy aglutynacji lub analiza cech
biochemicznych, morfologicznych i metabolicznych (np.
Bio-Rad AuxaColor™ 2) i badanie wrażliwości na leki
przeciwgrzybiczne (np. Bio-Rad Fungitest™) można
przeprowadzić bezpośrednio z użyciem kolonii
wyizolowanych na podłożu CandiSelect™ 4.
2
•
Uwaga: Bio-Rad AuxaColor™ 2 i Bio-Rad Fungitest™
nie są dostępne w USA.
11- KONTROLA JAKOŚCI PRZEZ UŻYTKOWNIKA
Przed użyciem należy sprawdzić płytki pod kątem
przerośnięcia lub pogorszenia jakości (patrz Punkt 7
powyżej). Jakość płytek można kontrolować z użyciem
organizmów, o których wiadomo, że wykazują
specyficzne reakcje. Zalecane szczepy to:
Szczep
kontrolny
C. albicans
ATCC 24433
C. glabrata
ATCC 66032
C. tropicalis
ATCC 750
C. krusei
ATCC 14243
C. parapsilosis
ATCC 90018
S. aureus
ATCC 25923
E. coli
ATCC 25922
Wyniki spodziewane na podłożu
CandiSelect™ 4 po 48 h inkubacji
Kolonie różowe do fioletowych
Kolonie gładkie, lśniące, turkusowe,
często z ciemniejszym środkiem
Kolonie gładkie, sferyczne, turkusowe
Szorstkie, turkusowe kolonie, często z
nieregularnym zarysem
Kolonie białe do lekko niebieskawych
Brak wzrostu
Brak wzrostu
Badanie kontroli jakości należy wykonać zgodnie z
wytycznymi lub wymaganiami miejscowych, stanowych
i/lub regulacji krajowych bądź też zaleceniami organizacji
akredytacyjnych
oraz
wewnątrzlaboratoryjnymi
procedurami kontroli jakości. Rekomendacje dotyczące
procedur kontroli jakości znaleźć można w wytycznych
CLSI oraz przepisach CLIA.
12- OGRANICZENIA PROCEDURY
•
•
•
•
•
•
Szczepy Candida dubliniensis wykazują aktywność
heksozoaminidazy i mają na niniejszym podłożu
zabarwienie różowe do fioletowego, jednakże gatunki te
izolowane są w bardzo rzadkich przypadkach.
Rzadkie szczepy Candida albicans rosną w formie
bialych kolonii po 48 godzinach inkubacji.
Niektóre złożone próbki (plwocin, materiały tchawiczooskrzelowe, kał) wysiane bezpośrednio na płytki, mogą
zabarwić podłoże na niebiesko. Materiały takie należy
rozsiać bardzo bliskimi pociągnięciami ezy w sposób
redukcyjny, tak aby uzyskać pojedyncze kolonie
oddzielone od miejsca wysiewu próbki.
Niektóre szczepy Candida parapsilosis, Candida kefyr
i Candida lusitaniae o silniejszej aktywności fosfatazy
mogą dawać kolonie jasnoturkusowe po inkubacji przez
48 godzin.
Niektóre wybredne szczepy drożdży mają specjalne
wymagania
metaboliczne
(czynniki
wzrostu,
temperatura inkubacji, itd.) i nie rosną na tym podłożu.
CandiSelect™ 4 umożliwia wstępną identyfikację
Candida tropicalis, Candida glabrata i Candida krusei.
W celu uzyskania ostatecznej diagnozy zalecane jest
potwierdzenie
identyfikacji
metodami
konwencjonalnymi.
13- WARTOŚCI SPODZIEWANE
Gatunki z rodzaju Candida są najczęstszymi czynnikami
etiologicznymi inwazyjnych zakażeń grzybiczych.
Jedna z form inwazyjnej kandydozy, kandydemia, stanowi
czwartą spośród najczęstszych zakażeń krwi u pacjentów
w USA. Ankieta przeprowadzona przez CDC wykazała,
że kandydemia występuje u 8 z każdych 100 000 osób
rocznie. Wśród osób zagrożonych kandydemią wymienia
się noworodki o niskiej masie urodzeniowej, pacjentów po
zabiegach chirurgicznych i pacjentów z obniżoną
8
odpornością.
14- CHARAKTERYSTYKA TESTU
Do oceny działania podłoża zastosowano trzy metody. W
badaniach tych, identyfikację potwierdzono metodami
referencyjnymi, które obejmowały: wytwarzanie „germ
tubes”,
mikro-fermentację,
mikroskopową
ocenę
morfologii, wytwarzanie chlamydospor na podłożu ryżagar-Tween, szybkie testy do identyfikacji i testy
asymilacji.
1) W badaniu prospektywnym badano 1034 próbek
klinicznych pochodzących z układu oddechowego,
moczowo-płciowego, rejonu ucho-nos-gardło i innych.
Zidentyfikowano 347 izolatów Candida; 46 z nich
pochodziło
z
22
próbek
zawierających
wiele
mikroorganizmów.
Próbki zawierające jeden mikroorganizm:
•
•
Bezpośrednia identyfikacja Candida albicans (spośród
235 zidentyfikowanych izolatów).
Czułość podłoża CandiSelect™ 4 wynosi 29,4%
i 77,0% odpowiednio po 24 i 48 godzinach.
Swoistość podłoża wynosiła 100%.
Wstępna identyfikacja Candida glabrata (spośród
21 zidentyfikowanych izolatów), Candida tropicalis
(spośród 15 zidentyfikowanych izolatów) i Candida
krusei (spośród 3 zidentyfikowanych izolatów):
‚ 85,7% Candida glabrata zidentyfikowano w ciągu
48 godzin.
‚ 53,3% Candida tropicalis zidentyfikowano w ciągu
48 godzin.
‚ 66,7% izolatów Candida krusei (2 spośród 3 izolatów)
zidentyfikowano w ciągu 48 godzin.
Próbki zawierające wiele mikroorganizmów:
• Identyfikacja bezpośrednia:
W badaniu na 16 próbkach dodatnich pod względem
obecności Candida albicans 100% zidentyfikowano w
ciągu 72 godzin.
Gatunek
Candida
albicans
Liczba
szczepów
16
24
godz.
37,5%
(6/16)
Czułość:
48
godz.
93,8%
(15/16)
72
godz.
100%
(16/16)
3
• Identyfikacja wstępna:
W próbkach zawierających wiele mikroorganizmów 73,3%
izolatów Candida glabrata (15 próbek dodatnich) i 75%
Candida tropicalis (4 próbki dodatnie) zostało
zidentyfikowanych poprawnie w ciągu 48 godzin.
Gatunek
Candida
glabrata
Candida
tropicalis
Liczba
szczepów
24
godz.
15
Nie okr.
4
Nie okr.
Czułość:
48
godz.
73,3%
(11/15)
75%
(3/4)
72
godz.
86,7%
(13/15)
75%
(3/4)
2) W drugim badaniu, 78 organizmów wyizolowanych na
podłożu Sabouraud przesiano na CandiSelect™ 4.
Czułość podłoża CandiSelect™ 4 w przypadku
bezpośredniej identyfikacji Candida albicans i wstępnej
identyfikacji Candida glabrata, Candida tropicalis i
Candida krusei zestawiono w tabeli poniżej:
Gatunek
Candida
albicans
Candida
glabrata
Candida
tropicalis
Candida
krusei
Liczba
izolatów
21
23
14
5
Czułość:
24 godz.
48 godz.
95,2%
100%
(20/21)
(21/21)
91%
Nie okr.
(21/23)
100%
Nie okr.
(14/14)
60%
100%
(3/5)
(5/5)
Wśród pozostałych 15 izolatów: 12 było innymi gatunkami
Candida, a 3 było Candida, które nie mogły zostać
zidentyfikowane do poziomu gatunku za pomocą metod
konwencjonalnych.
3) W trzecim badaniu oceniano wzrost rzadko
izolowanych drożdży i grzybów pleśniowych z użyciem
szczepów
z
kolekcji
labotratoryjnej.
Podłoże
CandiSelect™ 4 umożliwiało wzrost Trichosporon sp.,
Geotrichum
sp.,
Cryptococcus
neoformans,
Scedosporium apiospermum, Rhizopus sp., Fusarium sp.,
Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger i Aspergillus
flavus.
15- PIŚMIENNICTWO
1. Sendid B, Francois N, Standaert A, Dehecq E,
Zerimech F, Camus D, Poulain D. Prospective
evaluation of the new chromogenic medium
CandiSelect 4 for differentiation and presumptive
identification of the major pathogenic Candida
species. J Med Microbiol. 2007 Apr;56(Pt 4):495-9.
2. Pappas PG, Rex JH, Sobel JD, Filler SG, Dismukes
WE, Walsh TJ, Edwards JE, Infectious Diseases
Society of America. Guidelines for treatment of
candidiasis. Clin Infect Dis. 2004 Jan 15;38(2):161-89
3. National Committee for Clinical Laboratory Standards.
2001. Approved Guideline M29-A2. Protection of
laboratory workers from occupationally acquired
infections, 2nd ed. NCCLS, Wayne, Pa.
4. Garner, J.S. 1996. Hospital Infection Control Practices
Advisory Committee, U.S. Department of Health and
Human Services, Centers for Disease Control and
Prevention. Guideline for isolation precautions in
hospitals. Infect. Control Hospital Epidemiol. 17:53-80.
5. U.S. Department of Health and Human Services.
1999. Biosafety in microbiological and biomedical
laboratories, HHS Publication (CDC), 4th ed. U.S.
Government Printing Office, Washington, D.C.
6. Directive 2000/54/EC of the European Parliament and
of the Council of 18 September 2000 on the protection
of workers from risks related to exposure to biological
agents at work (seventh individual directive within the
meaning of Article 16(1) of Directive 89/391/EEC).
Official Journal L262, 17/10/2000, p. 0021-0045.
7. Basic Laboratory Procedures Clinical Bacteriology.
World Health Organization. Geneva. 1991. 1st edition.
8. Invasive
candidiasis
–
CDC
website
http://www.cdc.gov/ncidod/dbmd/diseaseinfo/candidia
sis_inv_g.htm
9. Casal M. and Linares M.J. (1983). Contribution to the
study of the Enzymatic Profiles of Yeast organisms
with Medical Interest. Mycopathologia 81. 155-159.
10. Dalton et Al. (1989). Rapid Identification of Candida
albicans
using
4-methylumbelliferyl-N-Acétyl-ßDGalactosaminide. Diagnostic Microbiology and
Infectious Disease 12. 521-523.
11. Manafi M. et Al. (1991). Fluorogenic and Chromogenic
Substrates
Used
in
Bacterial
Diagnostics.
Microbiological Reviews 55. 335-348.
12. Perry J.L. and Miller G.R. (1987). Umbelliferyl Labeled
Galactosaminide as an Aid in Identification of Candida
albicans. J. Clin. Microbiol. 25. 2424-2425.
13. Sangar V.K., Cortes J.M., Self L.W. (1975). Acid
phosphatase production as an aid in rapid
characterization of Candida species. American
Journal of Medical Technology 41. 327-32.
14. Smith R.F., Blasi D., Dayton S.L. (1973). Phosphatase
activity among Candida species and other yeasts
isolated from clinical material. Applied Microbiology
26. 364-7.
15. Vogel K, Hinnen A. (1990). The yeast phosphatase
system. Molecular Microbiology 4. 2013-7.
Symbol
W trakcie przechowywania płytki należy chronić
przed dostępem światła.
Bio-Rad
3, boulevard Raymond Poincaré
92430 Marnes-la-Coquette France
Tel.: +33 (0) 1 47 95 60 00
Fax: +33 (0) 1 47 41 91 33
04-2008 - 26205 A
4