Jacek Olender, Ma gorzata Stachowicz, Justyna Szota, Pawe

Jacek Olender, Ma gorzata Stachowicz, Justyna Szota, Pawe

&ARMACEUTYCZNY0RZEGL’D.AUKOWY††
%.$/4%,).!*!+/#%,4%2!0%549#:.9
72!+5*%,)4!'25"%'/
*ACEK/LENDER
-AŒGORZATA3TACHOWICZ
*USTYNA3ZOTA
0AWEŒ.OGAJ
%WA.OGAJ
0RZEMYSŒAW"ESSER
5RSZULA-AZUREK
+ATEDRAI:AKŒAD"IOLOGII-OLEKULARNEJgL’SKI5NIWERSYTET-EDYCZNY
:AKŒAD!NALIZY)NSTRUMENTALNEJ+ATEDRA!NALIZY)NSTRUMENTALNEJgL’SKI5NIWERSYTET-EDYCZNY
+ATEDRAI:AKŒAD4OKSYKOLOGIIgL’SKI5NIWERSYTET-EDYCZNY
.:/:0OLIKLINIKA$OKTORA"ESSERA
Streszczenie
Rodzina endotelin składa się z trzech zbliżonych budową do siebie peptydów: endoteliny 1-3 (EDN 1-3), kodowanych przez trzy różne geny, wykazujące różne powinowactwo do receptorów EDNRA – aktywujące kaskady prowadząc do proliferacji, indukcji angiogenezy
i i inwazji nowotworu oraz EDNRB, którego aktywacja
prowadzi do apoptozy komórek nowotworowych.
Celem przedstawionej pracy było porównanie aktywności transkrypcyjnej genów, które kodują endoteliny1-3,
jej receptory oraz ocenę, który z analizowanych genów
może stanowić cel terapeutyczny w raku jelita grubego.
Materiałem do badań były wycinki jelita grubego ocenione na podstawie badania histopatologicznego jako
prawidłowe oraz wycinki zmienione nowotworowo
w stadium zaawansowania klinicznego1-4 i stopniu złośliwości histopatologicznej G2. Profil ekspresji genów
wyznaczano techniką mikromacierzy oligonukleotydowych HGU 133A (Affymetrix)
Otrzymane wyniki wskazują, 3- krotny wzrost ekspresji
genu kodującego receptor dla endoteliny typu A, oraz
ok. 4 razy wyciszenie aktywności transkrypcyjnej genu
endoteliny 3 w wycinkach raka jelita grubego w porównaniu do tkanki prawidłowej.
Słowa kluczowe:
EDN1, EDN2, EDN3, , EDNRA, EDNRB, rak jelita
grubego
'‚–|ª-J®RylR
Endoteliny (EDN) są to trzy zbliżone do siebie budową
peptydy, kodowane przez trzy różne geny, wykazujące różne powinowactwo do swoich receptorów. /1, 2, 3/ Należą
do peptydów powodujących skurcz naczyń krwionośnych,
uczestniczących w modulacji mitogenezy, angiogenezy,
apoptozy, inwazji miejscowej raka oraz w przerzutach nowotworu /4/. Badania lat dziewięćdziesiątych wykazały
obecność podwyższonych poziomów endotelin w rakach
w tym także w raku jelita grubego. Odkryto, że komórki raka
jelita grubego produkują i wydzielają endotelinę (EDN-1).
Potwierdzenie uzyskano wykazując wyższą aktywność
proliferacyjną endoteliny-1 w hodowlach komórek nowo-
Summary
The family of endothelin consists of three peptides
which structures are similar. Endothelin – 1 (ET-1),
ET-2, ET-3 are coded by three different genes which
have different relationship to EDNRA and EDNRB receptors. ET–1, ET-2 and ET-3 activate cellular signaling
cascades leading to proliferation, apoptosis and cancer
invasion via EDNRA receptor. The activation of EDNRB leads to apoptosis of cancer cells.
The aim of the study was to compare the transcription
activity of genes coding ET–1, ET-2, ET-3, EDNRA,
EDNRB. It was analyzed which from investigated genes
may be a therapeutic factor in colon cancer.
Material of researchers was fragments of tumor colonic
tissue in clinical stages from 1 to 4 (according to TNM
classification). The Histologic Grade was from G1 to
G4. There were histologically normal tissues of patients
with colon cancer, which were a control in the study.
The expression profile of investigated genes assayed
with oligonucleotide microarray technique (HG-U133A,
Affymetrix).
The received results showed threefold increase of EDNRA expression, and fourfold decrease of ET-3 expression in colon cancer tissue compared with normal tissue.
Key words:
EDN1, EDN2, EDN3, , EDNRA, EDNRB, colon cancer
tworowych /5, 6/. Plejotropowość endotelin związana jest
z aktywacją różnych kaskad sygnałowych. Aktywacja receptora EDNR A mającego kilkunastokrotnie większe powinowactwo do EDN-1 niż do EDN-3 najczęściej jest łączona ze
wzrostem aktywności proliferacyjnej komórek, podczas gdy
z apoptozą najczęściej łączona jest aktywacja EDNRB nie wykazującego zróżnicowanego powinowactwa do entotelin /3/.
-˜p-J¬Ÿ˜¬ay-t|ªRŸlyJ¥p|ª-yRŸ
‚–®R®ŸRyJ| Rqly¬Ÿ
Receptory endotelin należą do nadrodziny receptorów
związanych z białkiem G. Połączenie endoteliny z receptorem EDNRA uaktywnia białko Gq które aktywuje fosfo-
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
- R–l-t¬ŸlŸuR |J¬
Aktywność transkrypcyjną genów kodujących endoteliny i ich receptory wyznaczano w wycinkach raka jelita grubego i wycinkach jelita prawidłowego, ocenianych na podstawie analizy histopatologicznej. Na pobranie wycinków
otrzymano zgodę Komisji Biotycznej Ślaskiej Akademii
Medycznej (obecnie Ślaskiego Uniwersytetu Medycznego)
w Katowicach.
Wycinki tkanek pobierano po uzyskaniu świadomej
zgody pacjentów, którzy zapoznani zostali z celem badania. Około 100-150 mg tkanki ucierano w ciekłym
azocie, a następnie homogenizowano przy użyciu homogenizatora Polytron® (Kinematyka AG, Szwajcaria) i ekstrahowano całkowity RNA z zastosowaniem
odczynnika TRIzol® (Invitrogen Life Technologies,
Kalifornia, USA) zgodnie z protokołem producenta.
Otrzymany ekstrakt trawiono DNazą I i oczyszczano
na kolumienkach zestawu RNeasy Mini Kit firmy Qiagen. Ilość i jakość RNA oceniano spektrofotometrycznie
przy użyciu spektrofotometru GeneQuant II (Pharmacia
Biotech) (wynik pomiaru absorbancji równy jest jeden
dla RNA o stężeniu 40μg/ml), oraz poprzez analizę
¬Aly-Ÿ ‡Ÿ -˜p-J¬Ÿ ˜¬ay-t|ªRŸ -p ¬ª|ª-yRŸ ‚|Ÿ ‚|tÔA®Ryl¥Ÿ w 1% żelu agarozowym (ryc.2). Profil ekspresji genów
–RAR‚ |–-ŸJq-ŸRyJ| Rqly¬ŸŸlŸŸ®ŸRyJ| RqlyԟŸGŸ kodujących endoteliny i ich receptory wyznaczano me¤Ÿq¥7Ÿ¡GŸ¥A®R˜ ylA®ÔARŸªŸ–Ra¥q-AolŸ-p ¬ªy|²AlŸ7l|k todą mikromacierzy HGU 133A (Affymetrix), oligonukleotydowych, zgodnie z z zaleceniami Affymetrix
q|alA®yRoŸp|u}–Rp
Gene Expression Analisys Technical Manual. Sygnały
lipazę C typu β (PLC β), katalizującą hydrolizę fosfaty- fluorescencji na płytkach odpowiadające 22283 mRNA
dyloinozytoli do diacyloglicerolu (DAG) powodującego odczytano w skanerze GeneArray (Agilent). Raporty
aktywację kinaz białkowych i trifosforanu inozytolu analiz wygenerowano w programie Affymetrix Data Mi(IP3) powodującego otwarcie kanałów wapniowych. ning Tool. Analizę absolutną i porównawczą wykonaBiałko Gq może aktywować alternatywną kaskadę sy- no przy użyciu oprogramowania Affymetrix GeneChip
gnałową poprzez aktywację kinazy tyrozynowej (PTK), Analysis Suite 5.0. Otrzymane wyniki normalizowano
kinazy proteinowej (RAF-1), kinazy MEK i kinazy w programie RMA Express. Zmiany aktywności transMAPK. Inna kaskada sygnałowa również aktywowana krypcyjnej genów w tkance nowotworowej w odniesieprzez receptor EDNRA rozpoczyna się od kinazy PI3K niu do kontroli, oceniano w programie Microsoft Excel
aktywowanej poprzez białko Gq a następnie: Akt. oraz i SAM (significance analysis of microarrays),
mTOR - centralny regulator syntezy protein. Ponadto
PTK może fosforylować tyrozyny w białkach cytosz- '¬ylpl
kieletu jak paxillina. (ryc.1) EDNRA może również
uaktywniać fosfolipazę A2 uwalniającą z fosfolipidów
Analizę profilu ekspresji genów kodujących endoteliny
błonowych kwas arachidonowy który przekształcony i ich receptory w wycinkach jelita prawidłowego i gruczozostaje pod wpływem cyklooksygenaz (COX1,COX2) lakoraka, rozpoczęto od porównania raportów wygenerowaw prostaglandyny/4/.
nych w programie Microarray Suite Affymetrix bezpośredCelem pracy było porównanie aktywności transkrypcyj- nio po odczycie sygnałów fluorescencji na mikromacierzy,
nej genów kodujących endotelinę i jej receptory w wycin- zgodnie z zaleceniami producenta płytek – firmy Affymekach gruczolakoraka i jelita ocenionego na podstawie anali- trix („Technical Manual GeneChip Expression Analysis”).
zy histopatologicznej jako prawidłowe.
Następnie zaakceptowane do analizy porównawczej wyniki
znormalizowano w programie RMA Express, w celu wyrównania zróżnicowanych wartości tła oraz szumu,
zmniejszającego prawdopodobieństwo poprawnej
interpretacji wyników.
Porównanie aktywności transkrypcyjnej
analizowanych genów w jelicie prawidłowym
(grupa kontrolna) i tkance nowotworowej (grupa badana), rozpoczęto od wyznaczenia stop¬Aly-Ÿ¤‡Ÿ7–-®ŸRqRp –|\|–Ra–-u¥Ÿ‚–®RJ˜ -ªl-oÔARa|Ÿª¬ylpŸ-y-ql®¬Ÿo-k nia zróżnicowania sygnałów fluorescencji
p|²Al|ªRoŸRp˜ –-p }ªŸA-tp|ªl Ra|ŸŸ®Ÿª¬Alyp}ªŸoRql -Ÿ‚–-ªlJt|ªRa|Ÿ pomiędzy grupą kontrolną i badaną, na podstawie współczynnika SLR (signal log ratio),
lŸa–¥A®|q-p|–-p-
&ARMACEUTYCZNY0RZEGL’D.AUKOWY†
¤°```¨˜¨- ¤°U¡zz¨˜¨- ¤°œ°¨«¨- ¤°œ^U¨- ¤Uzz^¨˜¨- ¡
¤

RAR‚ |–ŸŸŸ
yJ| Rqly-Ÿ¡
RAR‚ |–Ÿ
yJ| Rqly-Ÿ¤
yJ| Rqly-Ÿ
'lRq|p–| y|²ÉŸ
®ul-y¬
¤ G¤
k¡G°œ
kGz
m¡Gœ¡
k°G°U
mG°^
-0,23
m1,17
GU
k¤G¤
"R˜ Ÿ"
2.104412
-2.62709
-0.35669
-0.37703
0.29779
0
0
8.5
28.7
52.4
"-7Rq-Ÿ‡Ÿ"–-y˜p–¬‚ ¬Ÿ–}¸ylA¥oÔARŸª¬AlyplŸa–¥A®|q-p|–-p-Ÿ|JŸoRql -Ÿ‚–-ªlJt|ªRa|Ÿ
¤ Ÿ XŸª˜p-®¥oRŸªlRq|p–| y|²ÉŸ®ul-y¬ŸqlA®7¬Ÿp|‚llŸuŸ|p–R²q|yRa|Ÿ –-y˜p–¬‚ ¥ŸªŸ p-yARŸy|ª| ª|–|ªRoŸªŸ‚|–}ªy-yl¥Ÿ
J|Ÿ p-yplŸ‚–-ªlJt|ªRoGŸ R˜ Ÿ"ŸXŸ R˜ Ÿ"Ÿ˜ ¥JRy -Ÿ®Ÿ-y-ql®ÔŸ‚R–u¥ -AolŸ„˜A|–R…ŸXŸ|p–R²q-Ÿ®y-ulRyy|²ÉŸ˜ - ¬˜ ¬A®yԟ‚|–}ªy¬ª-k
y¬AiŸª¬ylp}ªGŸª˜‚}tA®¬yylpŸŸŸ„Œk©-q¥R…ŸŸª˜p-®¥oRŸ†Ÿ‚–-ªJ|‚|J|7lR͘ ª-Ÿ‚–®¬‚-Jp|ª|²AlŸ|7˜R–ª|ª-yRoŸ–}¸ylA¬
określającego logarytm różnicy uśrednionych sygnałów
fluorescencji transkryptu w grupie badanej w porównaniu
do kontroli (tabela 1). Otrzymane wyniki wykazały, istotne różnice aktywności transkrypcyjnej genów receptora dla endoteliny EDNRA oraz endoteliny EDN1, które
w wycinkach raka charakteryzowały się nadekspresją w porównaniu do kontroli, podczas gdy gen EDN3 uległ wyciszeniu (tabela 1).
W dalszym etapie analizy w programie SAM (significance analysis of microarrays) wyznaczono współczynnik
Q, który wskazywał procent prawdopodobieństwa przypadkowości obserwowanych różnic oraz oceniono znamienność statystyczną wyników na podstawie parametru „score” – wyznaczonego testem T studenta z analizą permutacji
(Tabela 1). Ten etap analizy wykazał, że z grupy genów
kodujących endoteliny i ich receptory, do grupy genów
różnicujących można zaliczyć tylko gen receptora EDNRA
i enoteliny EDN3
poszczególnych szlaków dawały efekty w postaci redukcji
wzrostu komórek raka w hodowlach lini komórkowych /9/.
Wydaje się więc, że istnieje potrzeba dokładniejszej analizy
poszczególnych szlaków by móc odpowiedzieć na pytanie
który z mechanizmów odpowiada za progresję i przerzuty
nowotworowe.
Już dziś pojawiają się nieśmiałe próby zastosowania inhibitorów receptora EDNRA w walce z niektórymi nowotworami np. z rakiem prostaty /10/ czy rakiem jajnika /11/.
Warto ustalić które składowe kaskady sygnałowej odpowiadają za angiogenezę, które za przerzuty, które za utrzymanie zdolności przeżycia zmutowanej komórki nowotworowej, a które wreszcie za progresję nowotworu. Są to pytania
na które będziemy chcieli odpowiedzieć, mając możliwości
analizowania poszczególnych etapów kaskad sygnałowych
przez pryzmat aktywności transkrypcyjnej genów.
¬˜p¥˜o-
1.
Koniec lat dziewięćdziesiątych ubiegłego wieku to okres
wzmożonego zainteresowania endoteliną w nowotworach.
Analizowano sekrecję endoteliny-1 przez komórki kultur
gruczolakoraka jelita grubego. Stwierdzono, że komórki te
produkują i wydzielają endotelinę1 /5, 6, 7/. Wyniki dotyczące EDN1 otrzymane w naszej pracy są dyskusyjne. Biorąc
pod uwagę współczynnik SLR można podkreślić zgodność
wyników z danymi literaturowymi, jednak współczynnik Q
wskazuje aż 52,4% prawdopodobieństwa, że obserwowana
różnica może być przypadkowa a wynik testu T studenta
z analizą permutacji wskazuje brak znamienności statystycznej otrzymanych wyników. Jest to związane z dużym
rozrzutem stężenia mRNA EDN1 w wycinkach jelita (podczas gdy dla innych transkryptów wyniki są porównywalne
w badanych grupach). Obserwacje takie wskazują, że do
oceny aktywności transkrypcyjnej EDN1 wymagana jest
znacznie większa liczba powtórzeń oraz sprawdzenie, jak
zmienia się ekspresja tego genu w zależności od indywidualności osobniczej i od stopnia zaawansowania transformacji
nowotworowej. Z danych literaturowych wynika, że właśnie
endotelina-1 (EDN-1) należy do peptydów, które stymulują
proliferację komórek nowotworowych lub indukują proces
apoptozy. EDN-1 wykazuje działanie mitogenne poprzez
aktywację kaskad sygnałowych. Na chwilę obecną trudno powiedzieć który ze szlaków w kaskadzie sygnałowej
odgrywa najistotniejszą rolę, tym niemniej próby blokady
Piśmiennictwo
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Inoue A, Yanagisawa M, Kimura S et al /1989/: The
human endothelin family: three structurally and pharmacologically distinct isopeptides predicted by three
separate genes. Proc. Natl. Acad. Sci,86,2863-2867.
Inoue A, Yanagisawa M, Takuwa Y et al./1989/ The human
preproendothelin-1 gene. Complete nucleotide sequence and
regulation of expression. J.Biol.Chem.,264,14954-14959.
Karne S, Jayawickreme C.K, Lerener M.R./1993/: Cloning and characterization of an endothelin-3 specific
receptor (ETC receptor) from Xenopus Laevis dermal
melanophores.J.Biol.Chem.,268,19126-19133
Bagnato A, Spinella F, Rosano L/2005/ Emerging role
of the endothelin axis in ovarian tumor progression.Endocr Relat Cancer 12(4):761-772.
Nakayama M, Takahashi K, Hara E et al/1998/ Production and secretion of two vasoactive peptides, endothelin-1 and adrenomeduullin, by a colorectal adenocarcinoma cell line,DLD-1. J Cardiovasc Pharmacol. 31
Suppl 1: 534-536
Asham E, Shankar A, Loizidou M et al. /2001/ Increased endothelin-1 in colorectal cancer and reduction
of tumour growth by ET(A) receptor antagonism. Br J
Cancer.,85(11): 1759-1763
Takahashi k, Totsune K, Kitamuro T et al /2002/ Three
vasoactive peptides, endothelin-1, adrenomedullin
and urotensin-II, in human tumour cell lines of origin:
expression and effects on proliferation. Clin Sci(Lond),
103 Suppl 48: 35S-38S.
COPYRIGHT‚'RUPADR!2+WIECIÊSKIEGO)33.†
8.
Peduto Eberi L, Bovey R, Juillerat-Jeanneret L /2003/
Endothelin-receptor antagonist are proapoptotic and antiproliferative in human colon cancer cells.Br J Cancer
88(5):788-795
9. Grant K, Knowies J, Dawas K et al /2007/ Mechanisms
of endothelin-1 stimulated proliferation in colorectal
cancer lines. Br J Surg 94(1):106-112.
10. Thakkar SG, Choueiri TK, Garcia JA/2006/ Endothelin receptor antagonist: rationale, clinical development,
and role in prostate cancer theraputics. Curr Oncol
Rep.8(2):108-113
11. Rosano L, Di Castro V, Spinella F et al/2007/Combined targeting of endothelin A receptor and epidermal
growth factor in ovarian cancer shows enhanced antitumo activity. Cancer Res. 67(13):6351-6359.
12. Kusuhara M, Yamaguchi K,Nagasaki K et al/1990/ Production of endothelin in human cancer cell lines.Cancer
Res 50(11):3257-61