SDS-PAGE LAEMMLI ELEKTROFOREZA Wylewanie żeli

SDS-PAGE LAEMMLI ELEKTROFOREZA
Wyciąg z kart charakterystyki substancji niebezpiecznych
• Akrylamid/bisakrylamid – T
• Temed – C, F
• SDS – Xn
• APS – O, Xn
• EDTA – Xi
• Merkaptoetanol – T, N
Wylewanie żeli
ODCZYNNIKI:
- AA: 30% akrylamid, 0.8% bisakrylamid
- bufor do żelu rozdzielającego: 1 M Tris-HCl, pH 8.8
- bufor do żelu zagęszczającego: 1 M Tris-HCl, pH 6.8
- 20% siarczan dodecylu sodu (SDS)
- 1% SDS
- 10% nadsiarczan amonu (APS)
- N,N,N’,N’- tetrametyloetylenodiamina (Temed)
- bufor do próbek (2x stężony): 132 mM Tris-HCl pH 6.8, 20% glicerol, 10% 2-merkaptoetanol, 4% SDS, 2 mM EDTA
- bufor do naczyń elektrodowych: 25 mM Tris, 192 mM glicyna, 0.1% SDS, pH 8.3
- 0,02% błękit bromofenolowy
- zestaw wysokomasowych białek wzorcowych do elektroforezy (HMW) zawierający:
miozynę (205 kDa), -galaktozydazę (116 kDa), fosforylazę b (97,4 kDa), albuminę
surowicy wołu (66 kDa), albuminę jaja kurzego (45 kDa), anhydrazę węglanową (29 kDa)
W CELU PRZYGOTOWANIA 12 ML 8% ŻELU ROZDZIELAJĄCEGO ODPIPETOWAĆ:
roztwór AA
1 M Tris-HCl, pH 8.8
20% SDS
H2O dejonizowana
3.20 ml
4.50 ml
60 l
4.25 ml
Temed
10% APS
24 l
60 l
W CELU PRZYGOTOWANIA 4 ML 4.5% ŻELU ZAGĘSZCZAJĄCEGO ODPIPETOWAĆ:
roztwór AA
1 M Tris-HCl, pH 6.8
20% SDS
H2O dejonizowana
0.60 ml
0.49 ml
20 l
2.88 ml
Temed
10% APS
10 l
24 l
Przygotowanie próbek
Oznaczyć stężenia białka w próbce (lizat komórkowy) metodą Bradford. Z próbki
odpipetować 15 g białka do osobnego eppendorfa, dodać odpowiednią objętość 2x
stężonego buforu do próbek oraz 0.5 l roztworu błękitu bromofenolowego, zwirować i
gotować 8-10 min w temperaturze 100 C. Po gotowaniu próbkę zwirować i przenieść do
studzienki w żelu zagęszczającym przy użyciu strzykawki Hamilton.
WARUNKI PRĄDOWE: 100 V na wejście próbki w żel zagęszczający (ok. 10 min)
180 V na rozdział (ok. 60 min)
Elektroforezę prowadzić do wyjścia błękitu bromofenolowego z żelu rozdzielającego.
Barwienie żelu po elektroforezie
Żel zanurzyć w wybarwiaczu (10% kwas octowy, 25% metanol, 65% woda 3 x dest. 0.1%
CBBG-250) i pozostawić na 30 min na wytrząsarce kołyskowej. Następnie usunąć
wybarwiacz i żel zalać odbarwiaczem (10% kwas octowy, 25% metanol, 65% woda 3 x
dest.). Całość pozostawić na wytrząsarce, aż do uzyskania bezbarwnego tła.
Opracowanie wyników
WYZNACZANIE WZGLĘDNYCH MAS CZĄSTECZKOWYCH BIAŁEK:
- wykreślić krzywą kalibracyjną zależności log m.cz. białek standardowych od współczynnika
Rf tj. względnej ruchliwości elektroforetycznej wyznaczonej ze stosunku drogi przebytej
przez dane białko do drogi przebytej przez błękit bromofenolowy.
- obliczyć wartości Rf dla białek badanych i z wykresu kalibracyjnego odczytać względne
masy cząsteczkowe tych białek.
Krzywa kalibracyjna
Białka standardowe:
miozyna
-galaktozydaza
fosforylaza b
albumina surowicy wołu
albumina jaja kurzego
anhydraza węglanowa
M.cz. (kDa)
log M.cz.
Rf
205
116
97,4
66
45
29
Elektroforetyczne wyznaczanie względnych mas cząsteczkowych
Nr prążka
M.cz. (kDa)
log M.cz.
Rf
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Literatura:
1. „Techniki badań fizjologicznych” (red. A. Lityńska, M.H. Lewandowski), str. 102 - 106