Me(CGCGCG)2. - Instytut Chemii Bioorganicznej

Me(CGCGCG)2. - Instytut Chemii Bioorganicznej

Mariusz Popenda
ZASTOSOWANIE METOD
MAGNETYCZNEGO REZONANSU JĄDROWEGO
ORAZ MODELOWANIA MOLEKULARNEGO
W ANALIZIE STRUKTURALNEJ RNA.
Pracę wykonano w Instytucie Chemii Bioorganicznej
Polskiej Akademii Nauk w Poznaniu.
Promotor pracy: Prof. dr hab. Ryszard W. Adamiak
Praca została przedstawiona
Radzie Instytutu Chemii Bioorganicznej
Polskiej Akademii Nauk w Poznaniu
celem uzyskania stopnia
doktora nauk chemicznych.
Poznań, czerwiec 1998
Panu Prof. dr hab. Ryszardowi W. Adamiakowi
serdecznie dziękuję za wskazanie interesującego
tematu niniejszej pracy, wszechstronną pomoc i
okazaną życzliwość w trakcie jej realizacji.
Składam serdeczne podziękowania Panu dr P.
Sowińskiemu za współpracę w eksperymentach NMR,
oraz Pani dr E. Białej i Panu dr J. Mileckiemu za
syntezę związków, które były przedmiotem moich
badań.
Pragnę podziękować koleżankom z Pracowni NMR
za pomoc podczas wykonywania niniejszej pracy.
SPIS TREŚCI
I.
CEL PRACY. ...........................................................................................................................................................
1
II.
CZĘŚĆ LITERATUROWA. ......................................................................................................................
3
II.1.
II.2.
II.3.
II.4.
Wprowadzenie. ........................................................................................................................................
Budowa RNA. ..........................................................................................................................................
Metody spektroskopii NMR w analizie strukturalnej RNA. ...............................
Analiza elementów strukturalnych RNA metodami NMR. .................................
II.4.1. Konformacja rybozy. .....................................................................................................
II.4.2. Konformacja syn i anti. ................................................................................................
II.4.3. Kąty rotacji łańcucha fosforocukrowego i ich analiza metodami
NMR. .........................................................................................................................................
Metody przypisań sygnałów rezonansowych NMR fragmentów RNA. ....
Generowanie i udokładnianie struktur. ................................................................................
II.6.1. Metody chemii kwantowej. ......................................................................................
II.6.2. Metody dynamiki molekularnej i generowania więzów
strukturalnych. ....................................................................................................................
II.6.3. Kryteria precyzji i dokładności wyznaczonych struktur. ..................
Geometria dupleksów RNA - parametry helikalne. ...................................................
II.7.1. Lokalny układ współrzędnych. ..............................................................................
II.7.2. Lokalne parametry helikalne między parami zasad (Inter - Base
Pair Parameters). .............................................................................................................
II.7.3. Globalne parametry helikalne dla pary zasad względem osi
dupleksu (Global Base Pair - Axis Parameters). ....................................
II.7.4. Lokalne parametry helikalne między zasadami (Base - Base
Parameters). .........................................................................................................................
II.7.5. Program CURVES 5.11. .............................................................................................
II.7.6. Struktura dupleksów. .....................................................................................................
3
9
12
16
16
26
III. OMÓWIENIE WYNIKÓW BADAŃ WŁASNYCH. .........................................................
54
III.1. Część eksperymentalna. ...................................................................................................................
III.1.1. Opis próbek r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2. ..............................
III.1.2. Stosowane techniki spektroskopii 1H, 13C, 31P oraz 29Si NMR. ..
III.1.2.A. Widma NMR blokowanych monomerów. .......................
III.1.2.B. Widma NMR dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-OMe(CGCGCG)2. ...................................................................................
III.1.3. Metody stosowane w analizie fragmentów strukturalnych
dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2. ..................................
III.1.4. Metody stosowane przy generowaniu i udokładnianiu struktur
dupleksów. .............................................................................................................................
III.2. Analiza NMR substratów i półproduktów w syntezie chemicznej RNA. .
III.3. Analiza widm 1H NMR dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-OMe(CGCGCG)2 w D2O. ...................................................................................................................
III.3.1. Analiza widm jednowymiarowych 1H NMR. ............................................
54
54
54
54
II.5.
II.6.
II.7.
28
32
37
37
37
44
46
46
47
48
49
50
51
55
57
58
59
65
65
III.4.
III.5.
III.6.
III.7.
III.8.
III.9.
III.10
.
III.3.2. Analiza widm dwuwymiarowych 1H NMR. ...............................................
III.3.3. Stereospecyficzne przypisania sygnałów H5' i H5''. .............................
Analiza sygnałów 1H NMR wymienialnych protonów dupleksów
r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2 w H2O/D2O. ....................................................
III.4.1. Metodyka. ...............................................................................................................................
III.4.2. Identyfikacja sygnałów rezonansowych wymienialnych
protonów dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2. .........
Pomiary temperaturowe dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-OMe(CGCGCG)2. .....................................................................................................................................
III.5.1. Analiza temperaturowa sygnałów NMR niewymienialnych
protonów. ................................................................................................................................
III.5.2. Analiza temperaturowa sygnałów NMR wymienialnych
protonów. ................................................................................................................................
Analiza widm 31P NMR dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-OMe(CGCGCG)2. .....................................................................................................................................
Analiza widm 13C NMR dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-OMe(CGCGCG)2. .....................................................................................................................................
Analiza konformacji r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2 w oparciu o
wartości wicynalnych sprzężeń skalarnych i wielkości NOE. ...........................
III.8.1. Pomiar wartości stałych sprzężeń skalarnych. ..........................................
III.8.2. Pomiar wielkości efektów Overhausera (NOE). ......................................
III.8.3. Analiza konformacji pierścieni cukrowych. ................................................
III.8.3.A. Analiza konformacyjna w oparciu o wartości
sprzężeń skalarnych. .........................................................................
III.8.3.B. Analiza w oparciu o wartości NOE. .....................................
III.8.4. Analiza kątów torsyjnych wokół wiązań N-glikozydowych
reszt nukleotydowych r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2. ......
III.8.5. Analiza kątów torsyjnych w łańcuchach fosforoestrowych. ..........
Udokładnione
struktury
dupleksów
r(CGCGCG)2
i
2'-OMe(CGCGCG)2. .....................................................................................................................................
III.9.1. Opis metody udokładniania struktur. ................................................................
III.9.2. Struktury początkowe. ..................................................................................................
III.9.3. Uściślenie więzów odległościowych metodą IRMA (I etap
udokładniania struktur). ..............................................................................................
III.9.4. Restryktywna dynamika molekularna (II etap udokładniania
struktur). ..................................................................................................................................
III.9.5. Analiza struktur przestrzeni konformacyjnej i końcowych
struktur dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2. .............
III.9.6. Efekt 2'-O-metylacji. ......................................................................................................
Porównanie struktur 2'-O-Me(CGCGCG)2 w roztworze i w krysztale. .....
68
79
82
82
83
90
90
95
97
100
106
106
109
111
111
112
116
119
123
123
125
126
129
133
138
139
IV. PODSUMOWANIE. ..........................................................................................................................................
145
V.
148
LITERATURA. ......................................................................................................................................................
Aneks 1
Aneks 2
Aneks 3
Oznaczenie skrótów.
Spis publikacji i komunikatów.
Odbitki prac, związanych z przedstawioną dysertacją.
I. CEL PRACY.
Poznanie struktury funkcjonalnie ważnych cząsteczek kwasów rybonukleinowych
(RNA) jest istotne dla wyjaśnienia procesu zawijania się łańcuchów RNA, ich właściwości
katalitycznych i specyficznych oddziaływań z białkami1. Spektroskopia jądrowego rezonansu
magnetycznego (NMR) jest jedyną metodą spektralną, która umożliwia pełne poznanie
przestrzennej struktury i dynamiki domen RNA i ich kompleksów z białkami w roztworze.
Metody NMR uzupełniają w ten sposób krystalografię rentgenowską. W wyniku
wprowadzenia dwu- i wielowymiarowych technik NMR2-4, nowych metod obliczeniowych
oraz nowoczesnych metod chemicznej5,6 i enzymatycznej syntezy RNA4,7 wraz z izotopowym
znakowaniem8, dokładność obecnie uzyskiwanych struktur jest porównywalna do wyników
otrzymywanych na drodze badań rentgenowskich w krysztale.
Pomimo szybkiego rozwoju badań strukturalnych RNA metodami NMR, struktury
krótkich dupleksów RNA zawierających alternatywne pary zasad CG, które są częstym
motywem natywnych cząsteczek RNA, nie zostały do tej pory ustalone. Przeprowadzone w
1984 roku badania porównawcze pomiędzy strukturami r(CGCGCG)2 i d(CGCGCG)29,10
metodami wysokorozdzielczej spektroskopii NMR wykazały istotne różnice spektralne
pomiędzy dwiema formami prawoskrętnych dupleksów, które cząsteczki te tworzą w
roztworach wodnych przy małym stężeniu soli. Jednakże w przypadku r(CGCGCG)2, pełnego
określenia struktury nie dokonano. Z powodu silnego, typowego dla cząsteczek RNA,
nakładania się pasm rezonansowych rybozy2,3,11 w widmach protonowych NMR, które
dodatkowo spotęgowane jest przez występowanie powtarzającego się motywu CG, nie
zidentyfikowano większości sygnałów rezonansowych (H3', H4', H5' i H5'') tego dupleksu.
Badania prowadzone przez Pracownię Chemii Strukturalnej Kwasów Nukleinowych
Instytutu Chemii Bioorganicznej PAN, kierowaną przez prof. dr hab. Ryszarda W. Adamiaka
związane są z interesującymi właściwościami strukturalnymi dupleksów RNA zawierających
alternatywne pary CG. Przy dużych stężeniach soli, dupleksy poli[r(CG)]12 oraz
r(CGCGCG)213 przechodzą w nietypową, lewoskrętną strukturę tzw. Z-RNA. Wolna kinetyka
przejść z A- do Z-RNA, w obecności 6 M stężenia nadchloranu sodu, obserwowana
metodami NMR, pozwoliła dokładnie opisać właściwości spektralne lewoskrętnej formy14.
Prowadzone obecnie badania r(CGCGCG)2 wykazały, że przejścia z A- do Z-RNA są
również wymuszane w warunkach wysokich ciśnień15. Przejście nie jest natomiast
obserwowane w przypadku modyfikowanego dupleksu 2'-O-Me(CGCGCG)216. Różnice te
skłoniły naszą Pracownię do przeprowadzenia szczegółowych badań NMR dla form
prawoskrętnych obu dupleksów RNA17-19. Jednocześnie rozwiązano z rozdzielczością 1.3 Å,
największą z odnotowanych w polu badań RNA, strukturę dupleksu 2'-O-Me(CGCGCG)2 w
krysztale20.
Głównym celem moich badań było wyznaczenie struktur dupleksów: r(CGCGCG)2
i 2'-O-Me(CGCGCG)2 w roztworze, o małym stężeniu soli, a więc w warunkach istnienia
form prawoskrętnych typu A-RNA, metodami NMR oraz komputerowego modelowania
molekularnego. Istotnym celem było porównanie struktur dupleksu 2'-OMe(CGCGCG)2 w roztworze i krysztale oraz określenie wpływu 2'-O-metylowania na
strukturę i hydratację RNA. Ponadto celem mojej pracy było także adaptowanie i
rozwinięcie w naszej Pracowni nowych metod eksperymentalnych 1H, 13C, 31P NMR,
analizy widm i protokołu udokładniania struktur.
1
Wyniki moich badań znalazły odzwierciedlenie w poniżej cytowanych publikacjach
(odbitki - Aneks 3.). Spis wszystkich komunikatów oraz publikacji, których jestem
współautorem zamieszczony jest na końcu pracy (Aneks 2.)
1. E.Biała, J.Milecki, A.Kowalewski, M.Popenda, W.Z.Antkowiak, R.W.Adamiak,
"Z-RNA. The synthesis of 2'-O-[13C]methyl- and 5-methyl-analogs of ribo-CGCGCG",
Acta Biochim. Pol., 40 (4), 521-530 (1993).
2. J.Milecki, M.Popenda, R.W.Adamiak, "1H NMR analysis of isomeric 2' (3')-Otrialkylsilyl and 2' (3')-O-methyl ribonucleosides", Pol.J.Chem. 68, 275-280 (1994).
3. M.Popenda, J.Milecki, E.Biała, R.W.Adamiak, "The solution NMR structure of 2'-Omethyl-CGCGCG RNA duplex", Nucleosides&Nucleotides 14 (3-5), 283-284 (1995).
4. M.Popenda, E.Biała, J.Milecki, R.W.Adamiak, "Solution structure of RNA duplexes
containg alternating CG base pairs: NMR study of r(CGCGCG)2 and 2'-OMe(CGCGCG) 2 under low salt conditions", Nucl.Acids.Res. 25 (22), 4589-4598 (1997).
5. D.A.Adamiak, J.Milecki, M.Popenda, R.W.Adamiak, Z.Dauter, W.R.Rypniewski
"Crystal structure of 2'-O-Me(CGCGCG)2, an RNA duplex at 1.30 Å resolution.
Hydration pattern of 2'-O-methylated RNA", Nucl.Acids.Res. 25 (22), 4599-4607
(1997).
2
II. CZĘŚĆ LITERATUROWA.
II.1. Wprowadzenie.
Cząsteczki kwasów rybonukleinowych (RNA) są biopolimerami, które w komórce pełnią
różnorodne funkcje biologiczne. Jedną z nich jest udział w biosyntezie białek. W złożonym
procesie ekspresji genów, ze względu na funkcje biologiczne, wyodrębniono trzy
podstawowe rodzaje kwasów rybonukleinowych:
*
*
*
informacyjny (matrycowy) RNA - mRNA,
transportujący (transferowy) RNA - tRNA,
rybosomalny RNA - rRNA.
Najliczniejszą i najbardziej heterogenną grupę stanowią cząsteczki mRNA o znacznie
zróżnicowanej wielkości. Masa największych z nich dochodzi do 1000 kD, a ich struktury
stabilizowane są drogą kompleksowania z białkami. Informacyjne RNA są syntetyzowane na
matrycach kwasów dezoksyrybonukleinowych (DNA) w procesie transkrypcji według
komplementarności zasad i przenoszą informację genetyczną do rybosomów, gdzie następnie,
na podstawie ich sekwencji syntetyzowane są białka w procesie zwanym translacją. Badania
strukturalne wykazują, że cząsteczki mRNA są długimi łańcuchami, które w wielu miejscach
ulegają zagięciu tworząc różnorodne formy przestrzenne. Dokładna ich struktura na poziomie
atomowym jest mało znana. Cząsteczki mRNA ulegają szybkiej degradacji i stanowią
zaledwie 5% całkowitej masy kwasów rybonukleinowych zawartych w komórkach różnych
organizmów.
Rys.1. Trzeciorzędowa struktura fenyloalaninowego tRNA w dwóch wzajemnie prostopadłych rzutach.
3
Struktury transferowych RNA są najlepiej poznane. Cząsteczki tRNA po modyfikacjach
pierwotnego transkryptu, tzw. dojrzałe cząsteczki tRNA, zawierają ok. 75 reszt
nukleozydowych (25 kD). Charakterystyczną cechą ich budowy jest duża zawartość
modyfikowanych i hipermodyfikowanych nukleozydów. Wszystkie znane sekwencje tRNA
można przedstawić w formie "liścia koniczyny"233, gdzie ponad połowa nukleozydów jest
zaangażowana w tworzeniu regionów dwuniciowych. Badania rentgenowskie określiły
dokładnie kształt cząsteczek tRNA, który zbliżony jest do litery L. Trzeciorzędowa struktura
fenyloalaninowego tRNA z drożdży przedstawiona jest na rysunku (rys. 1).
Występujące w cytoplazmie transferowe tRNA przyłączają na 3' końcu charakterystyczne
dla siebie aminokwasy. Aktywowane w ten sposób cząsteczki aminoacylo-tRNA migrują do
rybosomów, gdzie rozpoznają komplementarne do swoich trzech zasad pętli antykodonowej
sekwencje informacyjnego RNA. Po przekazaniu aminokwasu do syntetyzowanego białka,
cząsteczki tRNA uwalniają się od rybosomu i mogą być ponownie aktywowane.
Rybosomalne RNA są aktywnymi składnikami budowy rybosomów. Ze względu na ich
właściwości sedymentacyjne wyróżnia się trzy (w komórkach prokariotycznych) lub cztery
(w komórkach eukariotycznych) rodzaje rRNA. Najmniejsze jednostki zwane 5S rRNA
zawierają ok. 120 reszt nukleotydowych (30 kD). Większe, np. 23S rRNA i 28S rRNA
zawierają tysiące reszt nukleotydowych. Dokładna struktura rRNA oraz ich rola w tworzeniu
rybosomów i w syntezie białek jest intensywnie badana.
Niewielka część cząsteczek RNA znajduje się jądrach komórkowych. Są to przeważnie
pierwotne transkrypty syntetyzowane przez polimerazę RNA zależną od DNA, które po
modyfikacjach, jako dojrzałe cząsteczki przechodzą do cytoplazmy. Pewna grupa RNA
występująca w jądrach komórkowych inicjuje syntezę potomnych cząsteczek DNA tworząc
chwilowe struktury hybrydowe DNA:RNA zwane od nazwiska odkrywcy fragmentami
Okazaki. Obecność RNA stwierdzona została także w mitochondriach, gdzie łańcuchy RNA
wbudowane są do DNA i pełnią funkcje swoistego materiału genetycznego.
W związku z walką z chorobami nowotworowymi i AIDS (ang. acquired immunodeficency
syndrome), obiektami szczególnie zintensyfikowanych badań stały się genomowe RNA
wirusów i retrowirusów. Duże znaczenie mają badania nad możliwością wykorzystania tzw.
technologii "antysensowej", w której stosuje się zmodyfikowane łańcuchy kwasów
nukleinowych specyficznie oddziaływujące z wirusowym RNA lub z mRNA niepożądanego
genu, uniemożliwiając tym samym jego translację do szkodliwych dla organizmu białek.
Badania konformacyjne RNA i ich oddziaływań z białkami i innymi związkami w różnych
środowiskach chemicznych mają istotne znaczenie w wyjaśnieniu ich biologicznych funkcji
oraz przy tzw. racjonalnym projektowaniu leków. Na podstawie badań rentgenowskich,
dokładnie poznane zostały struktury krystaliczne kilku cząsteczek tRNA21-28, krótkich
dupleksów RNA29-41, dupleksów hybrydowych, fragmentów Okazaki i struktur
chimerycznych RNA-DNA42-55, rybozymów56-61, oraz kompleksów RNA z białkami62-75.
Głównym ograniczeniem tych badań są trudności wynikające z otrzymania monokryształów o
odpowiednich właściwościach dyfrakcyjnych. Ograniczenia te, z oczywistych względów, nie
występują w przypadku badań strukturalnych w roztworze metodami spektroskopii
magnetycznego rezonansu jądrowego (NMR). Ponadto, stosując odpowiednio buforowane
roztwory wodne, można zapewnić in vitro środowisko najbardziej zbliżone do warunków
natywnych w komórce. W porównaniu do innych metod spektralnych (UV-VIS,
fluorescencja, spektroskopia IR i Ramana, EPR), które dają cząstkowe informacje
strukturalne, metody NMR są jedynymi, które umożliwiają pełne i precyzyjne określenie
struktury z dokładnością na poziomie atomowym. Wspomagane metodami modelowania
4
komputerowego, pozwalają wyznaczyć współrzędne x, y, z atomów oraz określić dynamikę
badanych RNA w roztworze.
W analizie strukturalnej NMR bazuje się głównie na informacjach uzyskanych z
następujących pomiarów:
*
*
*
*
*
czasów relaksacji T1 (spin-sieć) i T2 (spin-spin),
przesunięć chemicznych 1H/13C/15N/31P,
homo i heteronuklearnych sprzężeń skalarnych (3JHH, nJCH, nJPH),
homonuklearnych efektów Overhausera (NOE) między protonami,
kształtu i wielkości sygnałów rezonansowych.
Relacje pomiędzy danymi eksperymentalnymi, a elementami strukturalnymi
są
wykorzystywane przy określaniu tzw. więzów strukturalnych (ang. restraints, constraints), na
podstawie których generowane są modele rzeczywistych struktur. Wartości kątów torsyjnych
wyprowadza się ze stałych sprzężeń, odległości między protonami (w Å) z ilościowej analizy
NOE. Zastosowanie metod komputerowej symulacji dynamiki molekularnej rMD (ang.
restrain molecular dynamics) z wykorzystaniem dostępnych z eksperymentów NMR więzów,
pozwalają dodatkowo określić stabilność poszczególnych fragmentów badanej cząsteczki.
W celu otrzymania udokładnionych struktur (ang. refined structures) RNA w roztworze, w
pierwszym etapie identyfikowane są sygnały rezonansowe protonów, a także innych jąder
magnetycznych jak 13C, 15N, 31P. W tym celu stosowane są różne, specyficzne techniki
spektroskopii NMR76-83, w oparciu o które dokonywane są przypisania sygnałów
rezonansowych84-93. Ważną rolę odgrywają metody związane z matematyczną obróbką
sygnałów swobodnej precesji (FID)94, które uzyskujemy w trakcie eksperymentów NMR oraz
metody analityczne stosowane przy wyznaczaniu sprzężeń spinowo-spinowych i wielkości
efektów Overhausera. Parametry te odgrywają istotną rolę przy wyznaczaniu więzów
strukturalnych. Programy symulujące widma dwuwymiarowe95 przy określonych parametrach
eksperymentalnych zwiększają dokładność pomiarów. W końcowym etapie badań
generowane są struktury, które najlepiej odpowiadają danym eksperymentalnym. Obecnie
stosowane są różne algorytmy oparte na analizie macierzy odległości międzyprotonowych
(Distance Geometry) lub dynamice molekularnej96-100. Dokładność struktur krótkich RNA (do
40 nukleozydów), szczególnie sztywnych fragmentów RNA jest porównywalna do wyników
otrzymywanych z analizy rentgenowskiej w krysztale. Wybór strategii badań metodami NMR
zależy w dużym stopniu od wielkości, sekwencji, struktur i trwałości badanych cząsteczek
RNA. Badania krótkich oligomerów RNA (do kilkunastu nukleozydów) oparte są głównie na
homonuklearnych, dwuwymiarowych widmach protonowych (1H NMR) wykonanych na
próbkach o naturalnym składzie izotopowym. Do określenia większych struktur wykonywane
są dodatkowe widma, w tym również wielowymiarowe widma 3D- i 4D-NMR, których
technika otrzymywania oparta jest na heteronuklearne sprzężenia skalarne protonów z
jądrami 13C i 15N. Wymaga to stosowania odpowiednio znakowanych cząsteczek, które
otrzymywane są na drodze enzymatycznej i chemicznej syntezy4,77-80.
Głównym ograniczeniem metod spektroskopii NMR wysokiej zdolności rozdzielczej w
badaniach strukturalnych jest wielkość cząsteczek RNA. Największe rozwiązane struktury
RNA metodami NMR i modelowania komputerowego mają masę ok. 15 kD i zawierają do 40
reszt nukleotydowych. Wzrost wielkości badanych cząsteczek powoduje zwiększenie liczby
nachodzących na siebie sygnałów rezonansowych. Drugim niekorzystnym czynnikiem jest
skrócenie czasów relaksacji T2, co powoduje znaczne poszerzenie sygnałów rezonansowych.
Naturalna szerokość protonowych linii rezonansowych dużych w znaczeniu spektroskopii
NMR cząsteczek (spełniających warunek c>>1) wynosi od kilku do kilkunastu Hz. Wraz
ze wzrostem masy, szerokość linii rezonansowych wzrasta, co powoduje zanik subtelnej
5
struktury sygnałów i zmniejszenie ich intensywności. Zastosowanie wzbogaconych próbek
RNA izotopami 13C i 15N, znacznie ułatwia analizę złożonych widm NMR.
Struktury dupleksów i kwadrupleksów zawierające sekwencje RNA otrzymane metodami
NMR, znajdujące się w bazie danych Protein Data Bank (PDB) (stan do 31. XII. 1997).
Ilość
Identyfikator
Sekwencja, opis
Sruktur
104D
[r(CGCG)-d(TATACGCG)]2. Wzajemnie komplementarna, chimeryczna struktura 1
hybrydowa. Centralny fragment DNA ma formę typu B-DNA. Regiony hybrydowe
posiadają formę bardziej zbliżoną do typu A-RNA niż do B-DNA101-105.
124D
d(GTCACATG):r(CAUPGUGAC). Hybrydowy dupleks DNA:RNA o strukturze typu 1
H, która jest pośrednia pomiędzy formą A-RNA i B-DNA106-107.
157D
r(CGCGAAUUAGCG)2 Dupleks A-RNA zawierający parę G:A.
1
169D
r(GCG)-d(TATACCC):d(GGGTATACGC). Dupleks DNA zawierający hybrydowy 1
fragment RNA:DNA. Region hybrydowy RNA:DNA ma strukturę typu H, natomiast
region DNA:DNA strukturę zbliżoną do formy B-DNA103,106.
176D
NH2-P-(GPN-APN-APN-CPN-TPN-CPN)-COOH:r(GAGUUC). Kompleks PNA z 1
RNA o strukturze prawoskrętnej helisy zbliżonej do A-RNA108.
1AC3
d(CGCGT-TSP-TCP-TCGCG):r(GCGCAAAACGCG).
Hybrydowy
dupleks 8
DNA:RNA zawierający 3'-tio-tymidynę-5'-fosforan (TSP) i 5'-metylotymidynę (TCP).
Pośrednia struktura typu H pomiędzy formą A-RNA a B-DNA109.
1AL5
r(CGCAAAUUUGCG)2. Wzajemnie komplementarny 12-mer o strukturze A- 12
RNA110,111.
1DHH
d(GG)-r(AGAU)-d(GAC):d(GTCATCTCC). Dupleks DNA zawierający wewnętrzny 1
region hybrydowy RNA:DNA112.
1DRN
d(GGAGA)-r(UGAC):d(GTCATCTCC). Dupleks DNA zawierający region 1
hybrydowy RNA:DNA o strukturze łączącej formę B-DNA z formą hybrydową
H112,113.
1ELH
r(UUGCCUGGCGGC):r(AACUGCCAGGCAU). Struktura helisy I 5S rRNA E. Coli 6
zawierająca pary G:U i wolne zasady na końcach dupleksu114.
1GTC
r(GCCA)-d(CTGC):d(GCAGTGGC). Dupleks DNA zawierający region hybrydowy 11
RNA:DNA z przejściem strukturalnym między formą hybrydową a formą BDNA104,105.
30
1GUC
r(GAGGUCUC)2. Dupleks zawierający tandem nietypowych par G:U115.
1
1MIS
r(GCGGACGC) 2. Dupleks zawierający tandem nietypowych par G:A116.
1
1MWG r(GGCAGGCC)2. Dupleks zawierający tandem nietypowych par G:A117.
1NAO
r(GGAGAUGAC):2'-O-Me(GUC)-d(ATCT)-2'-O-Me(CC). Struktura dupleksu RNA z 1
2'-O-metylowanym RNA. W części centralnej występuje hybrydowy segment
RNA:DNA113.
1NXR
r(GAGGACUG):d(CAGTCCTC). Hybryd RNA:DNA o strukturze pośredniej między 18
formą A-RNA i B-DNA118.
1OKA
r(CCCA)-d(AATGA):d(TCATTTGGG). Fragment struktury Okazaki zawierający 7
hybrydowy region RNA:DNA. Struktura z przejściem pomiędzy helisą typu
hybrydowego a helisą B-DNA102.
1PBL
2'-OMe-(CGCGCG)2. Wzajemnie komplementarny dupleks z naprzemiennymi 1
parami CG. [Aneks 3]19
1PBM
r(CGCGCG)2. Wzajemnie komplementarny dupleks RNA z naprzemiennymi 1
parami CG. [Aneks 3]19.
30
1QES
r(GGAUGUCC)2. Dupleks zawierający tandem nietypowych par G:U119.
30
1QET
r(GGAGUUCC) 2. Dupleks zawierający tandem nietypowych par G:U119.
1
1RAU
[r(UGGGGU)]4. Kwadrupleks zawierający kwartety guanozynowe i urydynowe120.
1
1YFV
r(GGCGAGCC)2. Dupleks zawierający tandem nietypowych par G:A121.
219D
d(GCTATA-APS-TGG):r(CCAUUUAUAGA). Modyfikowany hybryd DNA:RNA o 1
strukturze pośredniej między formą A-RNA i B-DNA. W łańcuchu DNA pomiędzy A6
i T7 grupa fosforowa zastąpiona jest grupą fosforotiolową (APS)122,123.
Tabela 1.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
6
Struktury RNA zawierające jednoniciowe fragmenty (pętle, wybrzuszenia) otrzymane metodami
NMR, znajdujące się w bazie danych Protein Data Bank (PDB) (stan do 31. XII. 1997).
Ilość
Identyfikator
Sekwencja, opis
Sruktur
13
1AFX
r(GGUGUGAACACC), Struktura RNA z pętlą UGAA124.
1AJF
r(GACAGGGGAAACUUUGUC). Struktura typu szpilki do włosów zawierająca pętlę 1
GAAA i dwie nietypowe pary G:U125.
1AJL
r(GGUAAUAAGCUC):r(GAGUACC). Dwuniciowa struktura intronu grupy I 1
1AJT
zawierająca pięcionukleotydowe wybrzuszenie126,127.
1ANR
r(GGCAGAUCUGAGCCUGGGAGCUCUCUGCC), Struktura elementu regulatoro- 20
wego HIV 1 TAR rozpoznawanego przez białko TAT128-130.
1AQO
r(GGAGUGCUUCAACAGUGCUUGGACGCUCC), Struktura elementu regulatoro- 15
wego IRON177.
1ATO
r(GGCACCUCCUCGCGGUGCC). Struktura typu szpilki do włosów centralnej pętli 10
HDV antygenomowego rybozymu131.
1ATV
r(GGGACCAGAAGGUCCCG). Struktura typu szpilki do włosów z pętlą AGAA.
4
1ATW. r(GCUCCAGAUGGAGCG). Struktura typu szpilki do włosów z pętlą AGAU
3
1EBQ
r(GGUGGGCGCAGCUUCGGCUGCGGUACCAC) Struktura zmutowanego elementu 5
5
1EBR
HIV 1 TAR132.
5
1EBS
1HLX
r(GGGAUAACUUCGGUUGUCCC). Struktura intronu RNA grupy I typu szpilki do 20
włosów z pętlą UUCG i nietypową parą U:G133,134.
1IKD
r(GGGGCUCUUCGGAGCUCCACCA). Struktura RNA z pętlą UUCG, nietypową 30
parą U:G i akceptorowym, jednoniciowym łańcuchem ACCA135.
1KAJ
r(GGCGCAGUGGGCUAGCGCCACUCAAAAGCCCG), Struktura pseudowęzła 1
RNA136,137
1KIS
r(GAGCCCUGGGAGGCUC):r(GCUGUUCCCAGACAGC). Fragment RNA ludzkiego wirusa HIV-2 TAR178 , o strukturach typu dwóch szpilek do włosów. połączonych
ze sobą poprzez wiązania wodorowe pomiędzy zasadami znajdującymi się w pętlach.
1KPD
r(GGCGCAGUGGGCUAGCGCCACUCAAAGGCCCG), Struktura pseudowęzła 1
RNA136,138
1RHT
r(GGGACUGACGAUCACGCAGUCUAU). Struktura RNA typu szpilki do włosów 1
zawierająca pętlę AUCA, adeninowe wybrzuszenie i nietypową parę G:U139.
1RNG
r(GGCGCUUGCGUC). Struktura zawierająca pętlę CUUG i nietypową parę G:U140,141. 5
1RNK
r(GGCGCAGUGGGCUAGCGCCACUCAAAAGGCCCAU), Struktura pseudowęzła 1
RNA137,142
1SCL
r(GGGUGCUCAGUACGAGAGGAACCGCACCC), Struktura fragmentu rRNA 6
zawierająca pary puryna:puryna, oraz parę A:U o nietypowym schemacie wiązań
wodorowych, czteronukleotydową pętlę GAGA i guanozynowe wybrzuszenie143.
1SLO
r(UUACCCAAGUUUGAGGUAA). Struktura RNA typu szpilki do włosów 1
16
1SLP
zawierająca pętlę AGUU i adeninowe wybrzuszenie144,145.
1TFN
r(GGGACUGACGAUCACGCAGUCUAU). Struktura RNA typu szpilki do włosów 1
zawierająca pętlę AUCA i adeninowe wybrzuszenie139.
1TLR
r(GGCCUAAGACUUCGGUUAUGGCC). Struktura typu szpilki do włosów 20
zawierająca pętlę GAAA146.
1
1U2A
r(GGUCAGUGUAACAACUGACC). Struktura pętli IIA snRNA179.
1
2U2A
15
1UUU
r(GGCGUACGUUUCGUACGCC). Struktura pętli CGUUUCG180.
1VOP
r(GACUGGGGCGGUC). Struktura fragmentu 23S rRNA zawierająca siedmio- 33
nukleotydową pętlę UGGGGCG147.
10
1ZIF
r(GGGCGAAAGCCU). Struktura z pętlą GAAA i z nietypową parą G:U148,149.
10
1ZIG
r(GGGCGAGAGCCU). Struktura z pętlą GAGA i z nietypową parą G:U148.
10
1ZIH
r(GGGCGCAAGCCU). Struktura z pętlą GCAA i z nietypową parą G:U148.
Tabela 2.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
7
Szybki rozwój metod syntezy RNA, ich oczyszczania oraz technik NMR i programów
obliczeniowych wpływa na coraz większą liczbę identyfikowanych struktur. Pierwsze
struktury RNA w roztworze otrzymane metodami NMR w latach 80-tych opierały się głównie
na analizie sygnałów korelacyjnych dwuwymiarowych widm typu COSY i NOESY. Metody
modelowania komputerowego w badaniach strukturalnych powszechnie wprowadzone
zostały dopiero w ostatnich latach. Obecnie znanych jest ponad 50 struktur RNA (dupleksy
RNA, hybrydy RNA/DNA, struktury typu szpilka do włosów, kompleksy z białkami),
których współrzędne atomów otrzymane zostały drogą modelowania molekularnego na
podstawie analizy widm NMR (Tabela 1-3).
Struktury kompleksów RNA otrzymane metodami NMR, znajdujące się w bazie danych
Protein Data Bank (PDB) (stan do 31. XII. 1997).
Ilość
Identyfikator
Sekwencja, opis
Sruktur
1AJU
r(GGCCAGAUUGAGCCUGGGAGCUCUCUGGCC). Struktura fragmentu ludzkiego 20
wirusa HIV-2 TAR w kompleksie z argininą128,130,150-153.
1AKX
r(GGCCAGAUUGAGCCUGGGAGCUCUCUGGCC). Struktura fragmentu ludzkiego 1
wirusa HIV-2 TAR w kompleksie z argininą128,130,150-153.
1AMO r(GGGUUGGGAAGAAACUGUGGCACUUCGGUGCCAGCAACCC). Aptamer w 8
kompleksie z monofosforanem adenozyny176,173,174.
1ARJ
r(GGCAGAUCUGAGCCUGGGAGCUCUCUGCC). Struktura elementu HIV-1 TAR 20
w kompleksie z argininą128-130,153,154.
1BIV
r(GGCUCGUGUAGCUCAUUAGCUCCGAGCC). Struktura elementu HIV-1 TAR w 5
kompleksie z białkiem TAT (17 aminokwasów)155.
1EHT
r(GGCGAUACCAGCCGAAAGGCCCUUGGCAGCGUC). Struktura aptameru z 10
pętlą GAAA w kompleksie z theofiliną156,157.
1ETF
r(UUGCCUGGCGGC):r(AACUGCCAGGCAU). Struktura fragmentu ludzkiego 1
wirusa HIV-1 w kompleksie z peptydem REV (23 aminokwasów)158-161.
1ETG
r(GGUCUGGGCGCAGCGCAAGCUGACGGUACAGGCC. Struktura elementu REV 19
(PRE) RNA z peptydem regulatorowym REV (23 aminokwasów)158-161.
1FMN
r(GGCGUGUAGGAUAUGCUUCGGCAGAAGGACACGCC). Struktura aptameru 5
w kompleksie z mononukleotydem flawiny162,163.
1KOC
r(AGAAGGAGUGU):r(ACGGUUAGGUCGCU). Struktura aptameru w kompleksie z 1
argininą164,165.
1KOD
r(AGAAGGAGUGU):r(ACGGUUAGGUCGCU). Struktura aptameru w kompleksie z 1
cirtulliną164,165.
1MNB r(GGCUCGUGUAGCUCAUUAGCUCCGAGCC). Kompleks fragmentu białka TAT 1
(14 aminokwasów) z BIV TAR RNA166.
1NUM r(GGCAGAGUCCUUCGGGACAUUGCACCUGCC). Kompleks regulatorowego 25
elementu ludzkiego U1A pre-mRNA z białkiem U1A (101 aminokwasów)167-170.
1PBR
r(GGCGUCACACCUUCGGGUGAAGUCGCC). Struktura fragmentu 16S rRNA w 1
kompleksie z paromomycyną171.
1RAW r(GGGAAGGGAAGAAACUGCGGCUUCGGCCGGCUUCCC). Struktura aptameru 10
w kompleksie z monofosforanem adenozyny172,173.
1TOB
r(GGCACGAGGUUUAGCUACACUCGUGCC). Struktura aptameru w kompleksie z 7
tobramycyną163.
1ULL
r(GGCUGGACUCGUACUUCGGUACUGGAGAAACAGCC). Struktura kompleksu 7
aptameru RNA z białkiem HIV-1 REV 175
Tabela 3.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
8
II.2. Budowa RNA.
Kwas rybonukleinowy (RNA) jest polimerem zbudowanym z jednostek
rybonukleotydowych, które są ufosforylowanymi nukleozydami. Każdy nukleozyd składa się
z zasady organicznej (pochodnej puryny albo pirymidyny) oraz z D-rybofuranozy.
Podstawowymi zasadami organicznymi w cząsteczkach RNA są: adenina, guanina, cytozyna i
uracyl. Wzory strukturalne tych zasad oraz sposób ich numeracji przedstawiono poniżej.
NH2
N
7
8
9
N
H
5
4
6
3
N
NH2
O
N
7
8
9
N
H
1N
2
5
4
Adenina
6
3
N
1NH
2
5
NH2
Guanina
4
O
N
3
2
5
6 1
O
N
H
Cytozyna
4
3NH
2
6 1
N
H
Uracyl
O
Rys. 2. Wzory strukturalne: adeniny (Ade), guaniny (Gua), cytozyny (Cyt), uracylu (Ura).
W każdej jednostce nukleozydowej zasada połączona jest z D-rybofuranozą wiązaniem
N-glikozydowym. W wiązaniu tym, anomeryczny węgiel C1' pierścienia rybozy przyjmuje
zawsze konfigurację , co schematycznie uwidoczniają wzory strukturalne guanozyny i
cytydyny (rys. 3.).
NH2
O
N
OH
H
H
H
H
OH
N
O
H
HO
H
NH
H
N
NH2
H
H
H
H
H
H
O
N
O
HO
OH
N
H
H
OH
Rys. 3. Wzory strukturalne guanozyny i cytydyny.
W łańcuchu RNA rybonukleozydy połączone są ze sobą przez wiązania
5',3'-fosforodiestrowe. Każda grupa fosforodiestrowa niesie ładunek ujemny, który może być
zobojętniony różnymi kationami. Przykład kwasu rybonukleinowego o sekwencji AGUC
przedstawiono na rysunku 4. Zgodnie z konwencją, kolejność zasad w łańcuchach
polinukleotydowych zapisywana jest w kierunku 5' => 3'. W tej konwencji, pierwszy
nukleotyd (A) ma wolną grupę 5'-OH, natomiast ostatni (C) posiada wolny system 2',3'-cis
diolowy. Struktura pierwszorzędowa kwasów nukleinowych (sekwencja) określa kolejność
występowania zasad w łańcuchu polinukleotydowym. Zwykle jest ustalana w procesie
zwanym sekwencjonowaniem w oparciu o specyficzne trawienie enzymami, chromatografię i
elektroforezę analityczną oraz na podstawie badań fizycznych np. techniką spektrometrii
masowej. Wyznaczenie sekwencji zasad jest pierwszym etapem badań strukturalnych kwasów
nukleinowych.
W wyniku zwijania się łańcuchów RNA (ang. folding), jego fragmenty mogą oddziaływać
między sobą tworząc struktury dwuniciowe. Wiązania wodorowe pomiędzy guanozyną i
cytydyną (para G:C) oraz między adeniną i urydyną (para A:U) wg. propozycji WatsonaCricka (rys. 5.) są głównymi czynnikami powstawania podwójnego heliksu.
Charakterystyczne ułożenie zasad w parach typu Watsona-Cricka nie jest jednak jedynym,
9
jakie może występować między oddziaływującymi zasadami A i U oraz G i C. Jednym z
nieklasycznych oddziaływań jest oddziaływanie typu Hoogsteena, które występuje w
strukturze 29-nukleotydowego fragmentu 28S rRNA143 pomiędzy zasadami A i U. Ponadto, w
strukturze tej zaobserwowano kilka nietypowych oddziaływań wodorowych pomiędzy
zasadami purynowymi. Występowanie pojedynczych par zasad typu G:A116,117,121 i
G:U115,119,133-138,148,149 stwierdzono w kilkunastu strukturach RNA otrzymanych przy pomocy
metod spektroskopii NMR.
koniec 5'
NH2
N
OH
H
N
H
H
H
O
N
O
H
H
O
OH
N
H
H
O
N
P
O
-O
H
H
N
O
H
O
-O
NH
H
H
H
O
OH
NH2
N
H
O
H
P
NH
O
H
H
H
H
O
N
O
H
H
O
OH
H
NH2
H
O
P
-O
N
O
H
H
H
H
H
O
N
O
H
H
OH
HO
koniec 3'
Rys. 4. Wzór strukturalny r(AGUC).
H
H
N
N
H
N
Ryboza
N
H
O
H
H
N
H
N
N
N
H
O
Ryboza
Ryboza
H
O
N
H
N
H
N
H
H
N
N
N
N
H
O
Ryboza
H
Rys. 5. Schemat wiązań wodorowych typu Watsona-Cricka w parach zasad A:U i G:C..
10
Występowanie dwuniciowych odcinków oraz sposób zawijania się łańcucha
polirybonukleotydowego determinuje strukturę drugorzędową. Różne motywy struktury
drugorzędowej RNA przedstawiono poniżej (rys. 6).
Rys. 6.
Motywy drugorzędowej struktury RNA90: [A.] dupleks, [B.] pętla typu szpilki do włosów (ang.
hairpin loop), [C.] jednonukleotydowe wybrzuszenie (ang. single-base bulge), [D.]
wielonukleotydowe wybrzuszenie (ang. multiple-base bulge), [E.] symetryczna pętla wewnętrzna 2:2,
[F.] asymetryczna pętla wewnętrzna 3:2, [G.] pętla z nietypową parą zasad, w której nie występują
wiązania wodorowe (ang. mismatch loop) [H.] trójczłonowy styk (ang. three-stem junction), [I.]
czteroczłonowy styk, [J] pseudowęzeł. Wszystkie zasady tworzące pary zasad typu Watsona-Cricka
są zacienione, natomiast regiony jednoniciowe są białe.
Typowe, dwuniciowe fragmenty RNA tworzą prawoskrętną helisę typu A-RNA i są
bardzo stabilne. W przeciwieństwie do nich, jednoniciowe odcinki wykazują większą
dynamikę i są często aktywnymi miejscami selektywnego wiązania jonów magnezu oraz
tworzenia kompleksów z białkami.
Dla małych cząsteczek RNA, regiony dwuniciowe w drugorzędowej strukturze mogą być
badane metodami NMR w oparciu o analizę sygnałów rezonansowych wymienialnych
protonów. Uczestniczące w wiązaniach wodorowych protony iminowe (zasad U,G) i
aminowe (zasad A,C,G) wolno wymieniają się z wodą dając stosunkowo wąskie sygnały,
silnie przesunięte w stronę niższego pola4.
Dalszym etapem badań strukturalnych jest określenie trzeciorzędowej struktury, która
definiuje sposób aranżacji jednoniciowych i dwuniciowych fragmentów RNA w przestrzeni.
Struktura trzeciorzędowa zależy od konformacji poszczególnych jednostek nukleotydowych
opisanych przez:
 pofałdowanie pierścienia rybozy,
 kąt torsyjny wokół wiązania N-glikozydowego,
 kąty torsyjne wokół pojedyńczych wiązań ugrupowania fosforocukrowego
tworzącego szkielet (ang. backbone) RNA.
Wykorzystywane przy określaniu struktury trzeciorzędowej RNA zależności pomiędzy
danymi otrzymywanymi z badań NMR (wartości stałych sprzężeń spin-spin i przesunięcia
chemiczne oraz wielkości NOE) a konformacją pierścieni cukrowych i kątami torsyjnymi
podane są w rozdziale II.4. Szczegółowy opis struktury dupleksów RNA przedstawiłem w
rozdziale II.7.
11
II.3. Metody spektroskopii NMR w analizie strukturalnej RNA.
Korelacyjna spektroskopia NMR umożliwia pełne przypisanie sygnałów rezonansowych
oraz dostarcza najwięcej informacji strukturalnych o badanych cząsteczkach RNA.
Wykorzystując dodatkowe stopnie swobody standardowych widm jednowymiarowych,
obecne stosowane wieloimpulsowe techniki korelacyjnej spektroskopii NMR dają widma w
dwóch (2D-NMR) lub w kilku wymiarach (3D-, 4D-NMR)81-83. Widma te przedstawiają
absorpcję fal elektromagnetycznych badanej próbki, znajdującej się w silnym polu
magnetycznym w funkcji dwóch lub więcej częstotliwości. Położenie każdego sygnału, w
zależności od liczby wymiarów, określane jest przez n współrzędnych.
Dwuwymiarowe widma korelacyjne NMR są klasyfikowane ze względu na rodzaje
oddziaływań między rezonującymi jądrami. W zależności od metody, każde oddziaływanie
skalarne (przez wiązania kowalencyjne) lub dipolowe (przestrzenne) między spinami jest
reprezentowane przez sygnał korelacyjny. Współrzędne (1, 2) sygnału w widmie 2DNMR odpowiadają częstotliwościom rezonansowym sprzęgających się jąder. Intensywność
sygnałów korelacyjnych zależy od wielkości oddziaływań. Klasyfikacja różnych technik
dwuwymiarowej spektroskopii korelacyjnej NMR, najczęściej stosowanych w analizie RNA,
przedstawiona jest poniżej (rys. 7).
Widma korelacyjne 2D-NMR
Oddziaływania skalarne
homo-nuklearne
COSY
DQF-COSY
E.COSY
P.E.COSY
R-COSY
DR-COSY
TOCSY
HCCH
Oddziaływania dipolowe
homo-nuklearne
hetero-nuklearne
HETCOR
COLOC
HMQC
HSQC
NOESY
ROESY
hetero-nuklearne
HOESY
Rys. 7. Podział eksperymentów 2D-NMR.
Pierwszym eksperymentem dwuwymiarowym w spektroskopii NMR był eksperyment
COSY181,182 (ang. COrrelation SpectroscopY), wykonany i opisany przez R. R. Ernsta i
współpracowników w roku 1976. Sekwencja impulsowa (rys. 8.) stosowana w tej metodzie
składa się z dwóch impulsów /2, po których zbierany jest sygnał zaniku swobodnej precesji.
Odstęp czasu t1 pomiędzy impulsami (evolution time) zmienia się po każdej serii spójnych
rejestracji. Po zebraniu wszystkich sygnałów i przeprowadzeniu podwójnej transformacji
Fouriera otrzymuje się widmo, w którym sprzęgające się poprzez wiązania chemiczne pary
protonów dają sygnały korelacyjne (ang. cross-peaks).
W widmach COSY dla cząsteczek RNA (wykonanych w D2O) można się spodziewać
sygnałów korelacyjnych, związanych z dwuspinowym układem protonów zasad
pirymidynowych H5-H6 oraz sygnałów rybozy: H1'-H2', H2'-H3', H3'-H4', H4'-H5', H4'-H5''
12
i H5'-H5'' (rys. 9). Ze względu na dużą wartość stałej sprzężenia 3JH5H6 (ok. 7.5 Hz), sygnały
korelacyjne H5-H6 są na ogół dobrze widoczne. Występują one w charakterystycznym tylko
dla siebie obszarze spektralnym. Ich ilość jest równa liczbie zasad pirymidynowych w
łańcuchu RNA.
W specyficznym regionie spektralnym widm 2D-COSY występują również sygnały
H1'-H2' rybozy. Jednakże w strukturach dupleksów typu A-RNA, sprzężenia 3JH1'H2' są słabe i
w związku z tym przeniesienie magnetyzacji między protonami H1' i H2' jest mało
efektywne. Przy szerokościach linii rezonansowych większych niż 2, sprzężenia skalarne
n
JHH nie są obserwowane.
Pozostałe sygnały korelacyjne protonów rybozy grupują się w wąskim obszarze
spektralnym w pobliżu głównej przekątnej widma 2D-COSY. Ze względu na silne nakładanie
się tych sygnałów, analiza spektralna tego regionu jest najtrudniejsza.
COSY
_

_

_

2
2
A
DQF-COSY
2
t1
t2
B
D
NOESY
_ 
_

2
1
2
2
B
C
_

2
t2
t1
A
_

R
3
A
D
_

2
2
t1
m
t2
B
C
D
Rys. 8. Sekwencje impulsów stosowane w dwuwymiarowych eksperymentach COSY, DQF-COSY i NOESY.
Skala czasowa nie jest zachowana. Poszczególne etapy cyklu eksperymentalnego oznaczono jako: Aokres przygotowawczy (preparation period), B - okres ewolucji (evolution period), C - okres
mieszania (mixing period), D - okres akwizycji danych (aquisition period). W schematach sekwencji
oznaczono: t1- czas ewolucji, t2 - czas akwizycji, m - czas mieszania. W podstawowym,
czterostopniowym cyklu fazowym sekwencji DQF-COSY, fazy impulsów są następujące: 1 (x x x x),
2 (x x x x),3 (x y -x -y) i detektora R (x -y -x y) .
H
H
ZASADA
5'
4'
H
O
H
3'
O
Rys. 9.
O
NH2
O
H
2'
H
1'
H
H
OH
5
6
4
1
H
3N
2
N
RYBOZA
O
H
5
6
4
1
3 NH
2
N
O
RYBOZA
Sprzężenia skalarne pomiędzy protonami występujące w RNA.
Widma COSY mogą być rejestrowane w trybie amplitudowym (ang. magnitude mode) lub
mocy (ang. power mode). Tryby te charakteryzują się tym, że linie rezonansowe mają bardzo
szerokie podstawy i w związku z tym subtelna (multipletowa) struktura sygnałów jest słabo
widoczna. Ponadto bardzo silne i szerokie sygnały diagonalne (w tym również sygnał od
HOD) zasłaniają blisko leżące sygnały korelacyjne. Różnorodne modyfikacje zastosowane w
sekwencji impulsowej COSY w znacznym stopniu wyeliminowały te wady. Najlepszą
modyfikacją dla badań RNA okazała się sekwencja DQF-COSY184-186 (ang. Double Quantum
Filtered COrrelation SpectroscopY). Sekwencja różni się od eksperymentu COSY
dodatkowym impulsem /2 (rys. 8). Cykliczna zmiana faz impulsów pozwala wyeliminować
13
jednokwantowe koherencje. Położenia sygnałów korelacyjnych w widmach DQF-COSY są
takie same, jak w widmach COSY, jednakże silna redukcja sygnałów diagonalnych pozwala
badać korelacje między protonami, których różnice przesunięć chemicznych są bardzo małe
(rzędu setnych części p.p.m.). Ponadto zastosowanie fazoczułej metody TPPI187 (ang. Time
Proportional Phase Incrementation) lub metody States'a188 (hipercomplex), przy dużej
rozdzielczości widm, umożliwiają analizę struktury subtelnej sygnałów i układów spinowych.
Wyznaczanie stałych sprzężeń na podstawie sygnałów korelacyjnych widm DQF-COSY
opisane jest w rozdz. II.4.1.
Rozszerzoną modyfikację sekwencji impulsowej zastosowano w technice E.COSY189,190
(ang. Extensive COrelation Spectroscopy). Technika ta bazuje na połączeniu dwukwantowej
filtracji DQF (ang. Double Quantum Filtered) z trójkwantową TQF191 (ang. Triple Quantum
Filtered), w wyniku czego znacznie upraszcza się subtelna struktura sygnałów korelacyjnych
w stosunku do analogicznych sygnałów otrzymanych z eksperymentów DQF-COSY. Ta
redukcja ułatwia analizę stałych sprzężeń w złożonych układach spinowych oraz pozwala na
ich dokładniejszy pomiar. Pewną wadą tego eksperymentu jest mniejsza intensywność
sygnałów. Uproszczoną techniką E.COSY jest P.E.COSY192 (ang. Primitive E.COSY). Obie te
metody, w analizie strukturalnej RNA są stosowane jako alternatywne techniki w stosunku do
DQF-COSY.
W analizie bardzo złożonych widm stosowane są eksperymenty typu X-Filter COSY193,194.
W widmach otrzymywanych tą techniką obserwowane są tylko sygnały korelacyjne między
wybranymi protonami, które bezpośrednio związane są z heteroatomami. W analizie RNA
wykorzystywane są filtry 13C określonych atomów pierścieni rybozy. Techniki te stosowane
są dla związków izotopowo znakowanych i dają możliwość redukowania sygnałów
korelacyjnych. Sterowana redukcja sygnałów korelacyjnych, poprzez zastosowanie
odpowiednich warunków eksperymentalnych, umożliwia analizę złożonych widm z
nakładającymi się pasmami spektralnymi. Inne techniki, takie jak: DQ-COSY (ang. Double
Quantum COrrelation SpectroscopY), MQ-COSY185-197 (ang. Multi-Quantum COrrelation
SpectroscopY) i MQF-COSY198,199 (ang. Multi Quantum Filtered COrrelation SpectroscopY),
z-COSY200-202 są rzadziej stosowane w analizie strukturalnej RNA.
Osobną grupą metod homonuklearnej spektroskopii korelacyjnej NMR stanowią techniki
R.COSY203,204 (ang. Relayed COrrelation SpectroscopY), DR.COSY203,204 (ang. Double
Relayed COrrelation SpectroscopY), TOCSY205-208 (ang. Total COrrelation SpectroscopY).
Otrzymane tymi technikami widma, oprócz sygnałów korelacyjnych typowych dla COSY,
zawierają dodatkowe sygnały. Są to sygnały korelacyjne par protonów, które pośrednio
sprzężone są ze sobą poprzez jeden proton (R.COSY), dwa protony (DR.COSY) lub wiele
sprzężonych ze sobą protonów (TOCSY). Widma te mają szerokie zastosowanie w analizie
strukturalnej DNA. Niezależnie od konformacji cukru, pozwalają one skorelować
przesunięcia chemiczne protonów H1' z przesunięciami chemicznymi pozostałych protonów
dezoksyrybozy dla każdej jednostki monomerycznej DNA. W przypadku RNA, identyfikacja
tymi technikami całego układu spinowego pierścieni cukrowych jest możliwa tylko wówczas,
gdy sprzężenia 3JH1'H2' są wystarczająco duże dla skutecznego przeniesienia magnetyzacji
pomiędzy protonami anomerycznymi a pozostałymi protonami rybozy. Taka sytuacja
zachodzi tylko w przypadku konformacji South lub East rybozy. W typowych dla RNA
konformacjach North, przeniesienie magnetyzacji pomiędzy H1' a pozostałymi protonami jest
bardzo słabe. Dlatego też, wprowadzono nowe techniki, które bazują na heteronuklearnych
sprzężeniach skalarnych. W technikach typu HCCH, magnetyzacja z protonu H1' jest
przenoszona na H2' "okrężną drogą" poprzez sprzężenia 1JC1'H1', 1JC1'C2' i 1JC2'H2'. Ponieważ
wartości tych stałych sprzężeń są kilkadziesiąt razy większe niż sprzężeń 3JH1'H2', efekt
przekazywania magnetyzacji jest bardzo silny. Struktura widma HCCH jest podobna do widm
14
typu COSY, intensywniejsze są jednak sygnały korelacyjne. W widmach HCCH, niezależnie
od wielkości wicynalnych sprzężeń 3JHH, sygnały korelacyjne dla protonów związanych ze
sobą mostkiem dwuwęglowym będą zawsze rejestrowane. Zastosowanie sekwencji
impulsowej eksperymentu HCCH w połączeniu z sekwencjami R.COSY, DR.COSY lub
TOCSY daje możliwość pełnej identyfikacji układów spinowych związanych z pierścieniami
cukrowymi. Metoda HCCH, która wykorzystuje sprzężenia skalarne 1JCC wymaga jednak
całkowitego wzbogacenia odpowiednich węgli izotopem 13C. Sekwencja impulsowa HCCH
stosowana jest w eksperymentach 2D i 3D-NMR typu HCCH-COSY210,
HCCH-TOCSY211,212, HCCH-E.COSY214, HCC-TOCSY-CCH-E.COSY215, które służą do
przypisań sygnałów rezonansowych protonów dłuższych cząsteczek RNA.
Jedną z najważniejszych technik stosowanych w analizie strukturalnej RNA jest
2D-NOESY216 (ang. Nuclear Overhauser Enhancement SpectroscopY). Eksperyment ten
opracowany został przez J. Jeenera w 1979 roku. Sekwencja impulsowa 2D-NOESY (rys. 8.)
składa się z trzech impulsów /2, po których zbierany jest w czasie t2 sygnał zaniku
swobodnej precesji FID (ang. Free Induction Decay). Interwał czasowy t1 pomiędzy dwoma
pierwszymi impulsami, zwany czasem ewolucji, każdorazowo jest powiększany o stałą
wartość dla kolejnych, powtarzających się sekwencji impulsowych, natomiast odstęp czasu
pomiędzy drugim i trzecim impulsem jest stały w trakcie całego eksperymentu. Nosi on
nazwę czasu wymiany m. W tym czasie zachodzi wymiana podłużnej magnetyzacji między
spinami i od długości trwania tego okresu zależy intensywność sygnałów korelacyjnych w
widmach 2D NOESY.
W oryginalnej pracy Jeenera, metoda NOESY przedstawiona została jako dwuwymiarowa
spektroskopia wymiany (ang. 2D exchange spectroscopy). Eksperyment NOESY rejestruje
oprócz sygnałów NOE, które związane są z wzajemną relaksacją oddziałujących dipolowo
protonów, także sygnały wywołane zmianami otoczenia chemicznego protonów. Mogą one
wynikać z wymiany chemicznej, przejść konformacyjnych lub innych procesów
chemicznych, które zachodzą wolno w sensie skali czasowej NMR. Dla małych cząsteczek (o
masie cząsteczkowej do 0.5 kD), które posiadają krótkie czasy korelacji c , sygnały
korelacyjne związane z NOE są dodatnie, natomiast sygnały diagonalne i sygnały pochodzące
z wolnej wymiany otoczenia chemicznego są ujemne. Przy długich czasach korelacji,
typowych dla dużych molekuł (o masie cząsteczkowej powyżej 2 kD), znak efektu NOE jest
ujemny i sygnały korelacyjne w widmach 2D-NOESY są w tej samej fazie, co sygnały
diagonalne i sygnały z wymiany. Analiza intensywności tych sygnałów w zależności od m
pozwala obliczyć szybkość wzajemnej relaksacji (relaksacji krzyżowej) i określić odległości
pomiędzy przestrzennie sprzężonymi dipolowo protonami. W przypadku sygnałów
korelacyjnych iminowych i aminowych protonów, intensywność sygnałów korelacyjnych
zależy także od szybkości wymiany chemicznej.
W zakresie czasów korelacji c w przybliżeniu równych odwrotności częstotliwości
Larmora (oc  1) , efekt NOE może nie być obserwowany. Dla roztworów o małej lepkości,
w tym zakresie c znajdują się cząsteczki, których masa wynosi od ok. 0,5 do 2 kDa. W tych
przypadkach efekt Overhausera w układzie rotacyjnym (tzw. efekt ROE) związany z
przeniesieniem poprzecznej magnetyzacji jest często silniejszy od efektu NOE. Technika
ROESY217-219 (ang. Rotating Frame Overhauser Effect SpectroscopY), która rejestruje efekty
ROE, jest stosowana w analizie hydratacji i szybkości wymiany protonów aminowych
kwasów nukleinowych.
Odmienną grupą eksperymentów NMR są techniki oparte na heteronuklearnych
sprzężeniach skalarnych. Heteronuklearne widma korelacyjne wykorzystywane są przy
identyfikacji sygnałów rezonansowych 31P, 13C, 15N oraz sprzężonych z nimi protonów. Są to
15
techniki typu HETCOR220 (ang. HETeronuclear CORrelation spectroscopy), COLOC221,222
(ang. COrrelated spectroscopy for LOng range Coupling) wykonywane przy normalnej
detekcji nastawionej na częstotliwość rezonansową heteroatomu, oraz metody odwrotnej
detekcji typu HMQC223-225 (ang. Heteronuclear Multiple Quantum Coherence) i HSQC223,226
(ang. Heteronuclear Single Quantum Coherence), w których detektor nastawiony jest na
częstotliwość protonu. Techniki z odwrotną detekcją są znacznie czulsze i wykorzystywane
są do korelacji przesunięć chemicznych protonów i jąder 13C, 15N. Zastosowanie podwójnej
sekwencji INEPT (ang. Intensitive Nuclei Enhanced by PolarisaTion) w technice HSQC
jeszcze bardziej zwiększa czułość tej metody, co umożliwia badanie korelacji za pomocą
przesunięć chemicznych sygnałów cząsteczek RNA, o naturalnym składzie izotopowym.
Sekwencje HMQC i HSQC wykorzystane są wraz z sekwencją NOESY w eksperymentach
trójwymiarowych typu NOESY-HSQC i NOESY-HMQC227-229. Techniki te umożliwiają
lepsze rozdzielenie sygnałów NOE pomiędzy protonami przez wykorzystanie dodatkowego
wymiaru związanego z przesunięciami chemicznymi 13C lub 15N.
Techniki korelacyjne HOESY230 (ang. Heteronuclear Overhauser Effect SpectroscopY) w
analizie dużych w sensie NMR cząsteczek, nie są stosowane ze względu na bardzo słabe
efekty Overhausera zachodzące pomiędzy 31P, 13C, 15N a protonami. Efekt ten występuje
natomiast pomiędzy jądrami fluoru 19F a 1H, których intensywność jest podobna, jak w
układach protonowych. Stąd też, techniki HOESY miały zastosowanie w analizie
strukturalnej tylko tych cząsteczek RNA, które znakowane były atomami fluoru231,232.
II.4. Analiza elementów strukturalnych RNA metodami NMR.
II.4.1. Konformacja rybozy
Pierścień cukrowy utworzony przez atomy węgla C1', C2', C3', C4' i tlenu O4' przyjmuje
konformację półkrzesła (konformacja skręcona T, ang. twist) lub koperty (E, ang. envelope)233
(rys. 10). Konformacja typu E występuje wówczas, gdy cztery spośród wyżej wymienionych
atomów leżą w jednej płaszczyźnie, a piąty znajduje się poza nią. Jeżeli atom wychylony z
płaszczyzny pierścienia leży po tej samej stronie co atom C5' reszty cukrowej, to jego pozycję
określa się jako endo, w przeciwnym przypadku mówimy o pozycji egzo. Ze względu na to,
że każdy spośród pięciu atomów pierścienia może być wychylony z płaszczyzny pierścienia
rybozy w kierunku endo lub egzo, istnieje 10 możliwych konformacji typu E (koperty) oraz
10 konformacji skręconych T (półkrzesła).
Rys. 10. Konformacja rybozy typu półkrzesła
C 3'
C 2'
T (C2'-egzo,C3'-endo) i typu koperty
C 2'
E (C2'-endo).
Geometria pofałdowania cukru opisana jest przez pięć endocyklicznych kątów torsyjnych
i, których definicje podano poniżej (rys. 11).
16
2
O
1
3
Symbol
4
0
0
1
2
3
4
Kąt torsyjny
C1'-C2'-C3'-C4'
C2'-C3'-C4'-O4'
C3'-C4'-O4'-C1'
C4'-O4'-C1'-C2'
O4'-C1'-C2'-C3'
Rys. 11. Definicja kątów endocyklicznych rybozy.
North
South
Rys. 12.
Koło pseudorotacji, na którym zaznaczone zostały zakresy wartości kątów fazowych P dla
najbardziej energetycznie uprzywilejowanych konformacji C3'-endo i C2'-endo. Na schematach
pięcioczłonowych pierścieni cukrowych zaznaczono znaki endocyklicznych kątów vi .
Rozwinięcia kątów torsyjnych i w szeregi Fouriera dają trzy współczynniki amplitudowe
i dwa fazowe234. Uwzględniając symetrię pięcioczłonowych pierścieni (równe kąty i długości
wiązań chemicznych), trzy współczynniki Fouriera zerują się, niezależnie od pofałdowania
17
cukru. Pozostałe dwa parametry oznaczone przez P i , wg. teorii Altony i
Sundaralingama235,236, jednoznacznie określają geometrię pofałdowania rybozy. Pierwszy z
nich, zwany kątem fazowym pseudorotacji P, opisuje typ konformacji cukru i zdefiniowany
jest wzorem:
tan( P ) 
(4  1 )  (3  0 )
2  2  [sin(36 o )  sin( 72 0 )]
(1)
Wszystkie konformacje E (koperty) i T (półkrzesła) rybozy mogą być uszeregowane
według wartości kąta fazowego pseudorotacji P. To uszeregowanie przedstawione jest na tzw.
kole pseudorotacji (rys. 12), na którym zaznaczono zakresy parametru P dla najbardziej
energetycznie uprzywilejowanych konformacji N ( ang. North) i S (ang. South). Typowe dla
RNA konformacje rybozy C3'-endo znajdują się w regionie North, natomiast C2'-endo,
będąca w zakresie konformacji South jest charakterystyczna dla pierścieni cukrowych w
DNA.
Drugi parametr  wg. teorii Altony i Sundaralingama, opisuje amplitudę pofałdowania
cukru i wyrażony jest:

0
cos( P )
.
(2)
Dla większości znanych struktur rybozy kąt  przyjmuje wartości w zakresie od 30o do 50o .
Parametry P i określające konformacje rybozy w cząsteczkach RNA można wyznaczyć
na podstawie analizy:
*
*
homonuklearnych sprzężeń skalarnych (3JH1'H2', 3JH2'H3' i 3JH3'H4')237-240,
* heteronuklearnych sprzężeń skalarnych nJCH241-243,
wielkości NOE pomiędzy protonami w obrębie pierścienia cukrowego244,245.
Wartości wicynalnych stałych sprzężeń 3JHH w układach H-C-C-H silnie zależą od kąta
torsyjnego  (rys. 13) oraz od elektroujemności i podstawników S1, S2, S3, S4 .
HA
HB
HA

S3
S2
HB
S3
S1
S2
S4
S1
S4
Rys. 13.
Kąt torsyjny  w łańcuchu H-C-C-H rybozy.
Zależność ta opisana jest uogólnionym równaniem Karplusa246,247:
3
JHH  A 1  cos 2 ( ) + A 2  cos( ) + A 3 + i i  [A 4  A 5  cos 2 (i  A 6 | i |)], (3)
18
gdzie sumowanie przebiega po wszystkich podstawnikach układu H-C-C-H, a wartość i
wynosi +1 lub -1, w zależności od orientacji podstawników246,247. Parametry Ai w równaniu
(3) wyznaczone są eksperymentalnie. Uwzględniając wpływ podstawników w pozycji  na
wartość sprzężenia 3JHH, elektroujemność i w równaniu (3) oblicza się według wzoru:
i  i   j A 7   j ,
(4)
gdzie i i  j są wartościami elektroujemności atomów odpowiednio w pozycjach  i
wg. skali Hugginsa248, a sumowanie przebiega po wszystkich atomach j w pozycjach 
związanych bezpośrednio z i-tym atomem w pozycji . Wartości parametrów w równaniach
(3) i (4) podane są w tabeli 4.
Tabela 4. Wartości parametrów Ai w uogólnionym równaniu Karplusa246,247.
Fragment
CH2CH
CHCH
A1
13.22
13.24
A2
-0.99
-0.91
A3
0
0
A4
0.87
0.53
A5
-2.46
-2.41
A6
19.9o
15.5o
A7
0.0
0.19
3
JH1'H2'
3
JH2'H3'
3
JH3'H4'
10
8
6
4
2
0
-9
27
63
99
135
171
207
243
279
315
351
o
Kąt pseudorotacji P [ ]
Rys. 14.
Zależność wartości stałych sprzężeń 3JH1'H2', 3JH2'H3' i 3JH3'H4' od kąta fazowego pseudorotacji P wg.
uogólnionego równania Karplusa dla  = 40o.
Kąty torsyjne 1'2' , 2'3' i 3'4' w pierścieniu -D-rybozy można wyrazić za pomocą
parametrów pofałdowania pierścienia cukru P i :
1'2' = 123.3o + 1.102 cos(P-144o)
2'3' = 0.2o + 1.090 cos(P)
3'4' = -124.9o + 1.095 cos(P+144o)
19
(5)
Z równań (3), (4), (5) wynikają zależności funkcyjne stałych sprzężeń 3JH1'H2', 3JH2'H3' i 3JH3'H4'
od kąta fazowego pseudorotacji, P i amplitudy pofałdowania pierścienia cukru, . Wykresy
tych funkcji dla wartości  = 40o przedstawione są na rysunku 14.
Z powyższych zależności wynika, że stałe sprzężenia 3JH1'H2' i 3JH3'H4' są bardzo czułym
wykładnikiem konformacji rybozy. Dla czystych konformerów North, typowych dla
dwuniciowych struktur A-RNA, sprzężenia 3JH1'H2' są bardzo małe (poniżej 3 Hz), natomiast
wartości stałych sprzężenia 3JH3'H4' są duże ( ponad 7 Hz). Odwrotna zależność obserwowana
jest dla czystych konformerów South. W przypadku istnienia szybkich przejść pomiędzy
konformacjami North i South (rys. 15) oba sprzężenia 3JH1'H2', 3JH3'H4' uśredniają się i ich
wartości znajdują się najczęściej w zakresie od 3 do 7 Hz. Przejścia tego typu zachodzą w
niestabilnych konformacyjnie jednoniciowych fragmentach RNA oraz na końcach układów
dwuniciowych w procesie topnienia dupleksów.
C5'
C3'
C5'
N
O4'
C2'
O4'
C1'
C2'
Rys. 15.
N
C3'
Przejścia pomiędzy konformacją typu N (C2'-egzo,C3'-endo) i typu S (C3'-egzo, C2'-endo) rybozy
W takich przypadkach analizę dynamiki molekularnej rybozy przeprowadza się za pomocą
modelu dwustanowego N i S, który zakłada istnienie dwóch konformacji North i South o
różnych stężeniach molowych249,250. W stanie równowagi konformacji North i South, każda
eksperymentalna wartość sprzężenia 3JHH jest liniowo zależna od ich wartości dla
indywidualnych konformerów oraz populacji stanów. Zależność tą można wyrazić wzorem:
Jexp = xN JN + (1- xN) JS,
(6)
gdzie xN oznacza molową frakcję konformeru North. Uwzględniając wzory (3), (4), (5) i (6)
można dopasować parametry PN,  i PS, S, opisujące konformacje North i South oraz
molową frakcję xN tak, aby obliczone dla nich teoretyczne wartości sprzężeń 3JHH najmniej
różniły się od danych eksperymentalnych.
Optymalizacja parametrów PN,  i PS, S dokonywana jest metodą Marquardta przy
użyciu programu PSEUROT249,250. W analizie konformacyjnej rybozy w modelu
dwustanowym (North, South), dopasowywanie pięciu parametrów do trzech
eksperymentalnych wartości sprzężeń: 3JH1'H2', 3JH2'H3' i 3JH3'H4', daje serie wyników, wśród
których znaczna część może nie odpowiadać wartościom rzeczywistym. Aby tego uniknąć,
często amplitudy pofałdowania rybozy  i S są ustalane w określonym zakresie lub też
eliminowane są te wszystkie możliwe rozwiązania, które dają nietypowe konformacje.
20
10
5
-10
0
H2
'
-5
H3'
0
-5
5
10
-10
10
8
6
JH1'H2'
JH2'H3'
3
JH1'H2'
3
-2
JH2'H3'
0
3
2
3
Częstotliwość w Hz.
H2'
4
-4
3
-6
3
-8
3
JH2'H3'
JH3'H4'
3
JH2'H3'
JH3'H4'
-10
-10
Rys. 16
-8
-6
-4
-2
0
2
H3'
Częstotliwość w Hz.
4
6
8
10
Pomiar wartości stałych sprzężeń skalarnych przedstawiony na symulowanym sygnale
korelacyjnym H3'-H2' widma DQF-COSY{31P}.
W złożonych widmach RNA, pomiar indywidualnych sprzężeń skalarnych: 3JH1'H2', 3JH2'H3'
i JH3'H4' dokonywany jest na podstawie analizy struktury sygnałów korelacyjnych H1'-H2',
H2'-H3', H3'-H4', H4'-H5', H4'-H5'' wysokorozdzielczych, fazoczułych widm
dwuwymiarowych DQF-COSY lub E.COSY251-253. Na rysunku 16 przedstawiono
przykładowy sygnał korelacyjny H3'-H2' widma DQF-COSY{31P} dla rybozy w układzie
słabo sprzężonych spinów (ang. weak coupling system), symulowany za pomocą programów
SPHINX/LINSHA254. Aktywne sprzężenia (w tym przypadku 3JH2'H3') są obliczane na
podstawie różnic częstotliwości linii rezonansowych, które znajdują się w przeciwnych
3
21
fazach, natomiast pasywne sprzężenia (w tym przypadku 3JH1'H2' po stronie H2' i 3JH3'H4' po
stronie H3') są wyznaczane z różnic częstotliwości rezonansowych linii znajdujących się w tej
samej fazie. Na strukturę sygnału korelacyjnego istotny wpływ mają nie tylko wartości
odpowiednich sprzężeń skalarnych, ale także szerokości linii rezonansowych i rozdzielczość
komputerowa widma95. Stosując symulację komputerową można uzyskać dużą dokładność
pomiarową wartości sprzężeń skalarnych rzędu  0.5 Hz dla stosunkowo krótkich
oligomerów.
Aby wyznaczyć wartości stałych sprzężeń spin-spin, widma DQF-COSY lub E.COSY
muszą być wykonane z bardzo wysoką rozdzielczością (poniżej 1Hz/punkt). W celu
uzyskania dokładnych wartości sprzężeń, widma są przetworzone specjalnymi technikami, w
których wykorzystywane są różne funkcje ważące podczas apodyzacji sygnałów swobodnej
precesji. Otrzymane sygnały, po transformacji Fouriera, z zastosowaniem funkcji ważących
mogą być znacznie zwężone. Dodatkowe wykorzystanie metody filling zero przy obróbce
danych zwiększa rozdzielczość widm.
W ostatnich latach wprowadza się nowe metody obróbki widm oparte na analizie
maksymalnej entropii (MEM, ang. Maximum Entropy Method)255,256 lub największego
prawdopodobieństwa (MLM, ang. Maximum Likelihood Method)257,258. Metody te powodują
wielokrotne zwężenia linii rezonansowych oraz poprawiają stosunek sygnału do szumów.
Zwężenie linii rezonansowych podczas obróbki widm w istotny sposób zwiększa dokładność
pomiaru wartości stałych sprzężeń skalarnych. Wpływ szerokości pasm na amplitudy sygnałów oraz na separacje składowych linii rezonansowych pokazany jest na rysunkach 17 - 20.
Regularność struktury protonowych sygnałów korelacyjnych jest zaburzona w tzw. silnie
sprzężonych układach spinowych (ang. strong coupling system), które często występują w
RNA. Program SPHINX pozwala je analizować poprzez symulację widm dwuwymiarowych
dla danej sekwencji impulsowej i dla dowolnego układu spinowego. Obliczone za pomocą
tego programu częstotliwości i intensywności wszystkich przejść rezonansowych z
hamiltonianu spinowego są następnie przetwarzane za pomocą programu LINSHA, który
uwzględnia naturalną szerokość linii rezonansowych, rozdzielczość widm w obu wymiarach
oraz stosowaną funkcję ważącą podczas apodyzacji. Końcowym wynikiem programu
LINSHA jest dwuwymiarowa macierz, reprezentująca strukturę sygnału korelacyjnego.
Dla dłuższych oligomerów RNA, pomiar sprzężeń skalarnych może być ograniczony, ze
względu na silne nakładanie się sygnałów rezonansowych H2', H3', H4', H5' i H5'', które
znajdują się w wąskim zakresie spektralnym od 3,8 do 4,8 p.p.m. Znaczne poszerzenie linii
rezonansowych (do kilkunastu Hz), wynikające z krótkich czasów relaksacji T2
charakterystycznych dla dużych cząsteczek, powoduje zanik struktury subtelnej sygnałów
rezonansowych. W tych przypadkach łatwiej wyznaczyć (z szerokości pasma) sumy sprzężeń:
H1', H2' i H3', które dla rybozy są zdefiniowane następująco:
H1' = 3JH1'H2'
H2' = 3JH1'H2' + 3JH2'H3'
H3' = 3JH2'H3' + 3JH3'H4'.
3
(7)
Rozwiązując układ równań (7) otrzymywane są indywidualne stałe sprzężenia 3JH1'H2',
JH2'H3' i 3JH3'H4', równe:
3
JH1'H2' = H1'
JH2'H3' = H2' - H1'
3
JH3'H4' = H3' + H1' - H2'.
3
22
(8)
A
względna
w yso kość sygnału.

3J
HH
1,0
0,8
0,6
d
0,4
0,2
0,0
-0,2
-0,4
d
-0,6
-0,8
-1,0
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
5
Częstotliw ość [Hz]
B.
względna
wysokość sygnału.
2,0
1,8

1,6
1,4
3
JHH
1,2
1,0
0,8
0,6
d
0,4
0,2
0,0
-5
-4
-3
-2
-1
0
1
2
3
4
5
Częstotliwość [Hz]
Rys. 17.
Wpływ szerokości linii na separację składowych dubletu znajdującyh się w przeciwnych fazach (A)
i w tych samych fazach (B). W pierwszym przypadku, separacja linii  jest większa od wartości
sprzężenia skalarnego, w drugim przypadku mniejsza.
23
linie dubletu o przeciwnej fazie.
linie dubletu w tej samej fazie.
2,0
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0,0
Rys. 18.
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
Stosunek wartości sprzężeń JHH do separacji linii dubletu () w zależności od stosunku tych
sprzężeń do szerokości linii d. Jeżeli JHH :d jest mniejszy od 0.58, wtedy linie znajdujące się w tej
samej fazie zlewają się.
linie dubletu o przeciwnej fazie.
linie dubletu w tej samej fazie.
1000
100
10
1
0,1
0,0
Rys. 19.
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
Wykres, przedstawiający błąd pomiaru stałych sprzężeń na podstawie separacji linii dubletu (),
jeżeli nie są uwzględniane szerokości linii spektralnych. W obliczeniach przyjęto krzywe Lorentza z
szerokością połówkową d = 2 Hz (rys. 16).
24
linie dubletu o przeciwnej fazie.
linie dubletu w tej samej fazie.
2,0
1,8
1,6
1,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0,0
Rys. 20.
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
Wykres przedstawiający względną, maksymalną amplitudę w zależności od sprzężenia JHH. W
obliczeniach przyjęto krzywe Lorentza z szerokością połówkową d = 2 Hz (rys. 16).
Heteronuklearne sprzężenia nJCH mogą dostarczyć dodatkowych informacji strukturalnych
dotyczących konformacji rybozy i kątów torsyjnych łańcucha fosforocukrowego342,343. Jest 6
różnych stałych sprzężeń 3JCH, które określają konformację rybozy (3JC1'H3', 3JC1'H4', 3JC2'H4',
3
JC3'H1', 3JC4'H1', 3JC4'H2'). Informacje o konformacji cukru dają także heteronuklearne,
geminalne stałe sprzężenia 2JCH. Z teoretycznych i eksperymentalnych danych wynika
zależność znaku tych stałych sprzężeń od konformacji rybozy4.
Wartości heteronuklearnych stałych sprzężeń poprzez dwa i trzy wiązania w
oligonukleotydach mogą być zmierzone na podstawie modyfikowanych widm E.COSY typu
HCCH-E.COSY, wykonanych dla próbek z przynajmniej 30% wzbogaceniem izotopem 13C.
Dla próbek całkowicie wzbogaconych izotopem 13C, informacje dotyczące tych sprzężeń
można uzyskać z protonowych widm typu NOESY lub TOCSY, poprzez analizę zmian
szerokości sygnałów korelacyjnych spowodowanych odsprzęganiem częstotliwością
rezonansową węgla.
Heteronuklearne sprzężenia 1JCH poprzez jedno wiązanie są również wskaźnikami
konformacji rybozy. Ze względu na dużą wartość stałych 1JCH (140-180 Hz), mogą one być
mierzone na podstawie widm HSQC, wykonanych na próbkach o naturalnym składzie
izotopowym.
Całkowicie niezależna metoda badania konformacji rybozy w łańcuchach RNA opiera się
na analizie intensywności efektów NOE pomiędzy protonami H1' a H2', H3' i H4'.
Międzyprotonowe odległości dH1'H2', dH1'H3' i dH1'H4' zależą od konformacji rybozy (rys. 21) i
mogą być wyznaczane na podstawie intensywności efektów Overhausera. W pierwszym
25
przybliżeniu można przyjąć, że wartości NOE są:
 bardzo silne i silne dla międzyprotonowych odległości mniejszych niż 2.5 Å,
 średnie dla odległości od 2.5 Å do 3.5 Å,
 słabe dla odległości od 3.5 Å do 4.5 Å,
 bardzo słabe dla odległości od 4.5 Å do 5.5 Å,
oraz praktycznie niemierzalne dla odległości większych niż 5.5 Å.
dH1'-H2'
dH2'-H3'
4,2
dH3'-H4'
4,0
Odległość dHH [A]
3,8
3,6
3,4
3,2
3,0
2,8
2,6
2,4
-9
27
63
99
135
171
207
243
o
279
315
351
Kąt pseudorotacji P [ ]
Rys. 21. Intranukleotydowe odległości dH1'H2', dH1'H3', dH1'H4' w funkcji kąta pseudorotacji P.
II.4.2. Konformacja syn i anti.
Konformacja syn i anti określa położenie heterocyklicznej reszty zasadowej względem
pierścienia cukrowego (rys. 22) i opisana jest przez kąt , zdefiniowany jako kąt torsyjny
O4'-C1'-N9-C4 (dla nukleozydów purynowych) lub O4'-C1'-N1-C2 (dla nukleozydów
pirymidynowych)233. Konformacja syn nukleozydu występuje wówczas, gdy karbonylowa
grupa na atomie C2 pirymidyny, bądź atom N3 układu purynowego, leży nad pierścieniem
cukrowym. W przeciwnym przypadku, gdy nad pierścieniem rybozy znajduje się atom C6
pirymidyny lub odpowiednio w nukleozydach purynowych atom C8, mówimy o konformacji
anti. Dla jednostek rybonukleotydowych RNA preferowane są konformacje anti.
Stan równowagi konformacyjnej syn/anti można określić na podstawie analizy:




wielkości NOE pomiędzy protonem H6/H8 a protonem H1',
wielkości NOE pomiędzy protonem H6/H8 a protonami H2'/H3'/H4'
wielkości NOE pomiędzy protonem H2 a protonami rybozy,
wartości stałych sprzężeń: 3JC2H1', 3JC4H1' (pirymidynowych nukleozydów) i 3JC4H1',
3
JC8H1' (purynowych nukleozydów),
 wartości stałych sprzężeń: 3JC2C2', 3JC4C2' ( pirymidynowych nukleozydów) i 3JC4C2',
3
JC8C2' (purynowych nukleozydów).
 przesunięć chemicznych sygnałów 1H, 13C, 15N.
26
A.
B.
urydyna w konformacji anti
urydyna w konformacji syn
C.
adenozyna w konformacji anti
Rys. 22.
adenozyna w konformacji syn
Zakres kątów  dla konformacji anti i syn oraz sposób ich wyznaczania dla pirymidynowych
nukleozydów [A]. Urydyna w konformacji anti i syn [B], adenozyna w konformacji anti i syn [C].
Odległości między protonami H8/H6 zasad a anomerycznym protonem H1' zależą
wyłącznie od kąta torsyjnego wokół wiązania N-glikozydowego. Szybkość wzajemnej
relaksacji (krzyżowej), wyznaczona na podstawie NOE, jest wielkością, która umożliwia
wyznaczenie konformacji syn/anti nukleozydu. Odległości pomiędzy H8/H6 a H1' (patrz
rozdz. III.8.4.), w zależności od kąta , wahają się od 2,5 do 4 Å. Odległościom tym
odpowiadają stosunkowo silne sygnały NOE dla konformacji syn oraz słabe sygnały dla
konformacji anti.
Niezależna metoda w ustalaniu konformacji syn/anti polega na analizie szybkości
relaksacji krzyżowej pomiędzy protonami H6/H8 a H2'/H3'/H4'. Odległości między tymi
protonami zależą jednak nie tylko od kąta torsyjnego wokół wiązania N-glikozydowego, ale
również od pofałdowania rybozy11,239,240,244 (rozdz. III.8.4.). Dlatego też, w celu wyznaczenia
kąta torsyjnego wokół wiązania N-glikozydowego należy wcześniej ustalić konformację
rybozy. W przypadku adenozyny, dodatkowymi parametrami, określającymi konformacje
syn/anti, mogą być wielkości efektów NOE pomiędzy protonem H2 a protonami rybozy H1',
H2' i H3'.
27
Kąty  można także określić z wicynalnych stałych sprzężeń 3JH1'C8/C6 i 3JC1'H8/H64. Pomiar
tych sprzężeń może być dokonany na podstawie analizy widm HMQC-TOCSY lub
HCCH-E.COSY259. Ze względu na małą, naturalną zawartość magnetycznego jądra 13C,
niewielkie wzbogacenie próbki tym izotopem, znacznie poprawia intensywność sygnałów i
dokładność pomiarów. Również wartości sprzężeń 3JC2C2', 3JC4C2' (dla pirymidynowych
nukleotydów) oraz 3JC4C2', 3JC8C2' (dla purynowych nukleotydów) mogą mieć zastosowanie
przy wyznaczeniu kątów wokół wiązania N-glikozydowego. W tym przypadku, pomiar może
być dokonany jednak tylko wówczas, gdy odpowiednie atomy węgla są całkowicie
wzbogacone izotopem 13C.
Indukowane przez sąsiednie grupy atomów, momenty magnetyczne wnoszą wkład do
wartości przesunięć chemicznych. W cząsteczkach kwasów nukleinowych, szczególnie silne
ekranowanie jąder rybozy przez prądy pierścieniowe zasad mogą spowodować istotne zmiany
przesunięć chemicznych protonów H1', H2' i H3'4. W nietypowych dla RNA konformacjach
syn, obserwowane były niezwykłe przesunięcia sygnałów H1' w kierunku niższych częstości i
jednoczesne przesunięcia w odwrotnym kierunku, sygnałów H3'. Występowanie sygnałów
NMR protonów rybozy w nietypowych dla nich zakresach, może świadczyć o dużych
zmianach konformacyjnych związanych z rybozą i kątem . Pewnym wskaźnikiem
konformacji wokół wiązań N-glikozydowych mogą być także różnice przesunięć
chemicznych sygnałów pochodzących od jąder atomów C2' i C3'260.
II.4.3.
Kąty rotacji łańcucha fosforocukrowego i ich analiza metodami
NMR.
Konformację łańcucha polinukleotydowego można opisać za pomocą sześciu kątów
torsyjnych: , , , , , , charakteryzujących rotacje wokół pojedynczych wiązań łańcucha
fosforocukrowego261,262 (rys. 23).
Symbol Kąt torsyjny 
O3'n-1- Pn-1-O5'-C5'

Pn-1-O5'-C5'-C4'

O5'-C5'-C4'-C3'

C5'-C4'-C3'-O3'

C4'-C3'-O3'-P.

C4'-C3'-O3'-P-O5' n+1

Rys. 23. Schematyczne przedstawienie kątów torsyjnych w łańcuchu fosforocukrowym RNA.
28
Kąty torsyjne  i  mogą być wyznaczone metodami NMR na podstawie analizy
przesunięć chemicznych sygnałów 31P263-265. W prawoskrętnych strukturach dupleksów
A-RNA oba kąty  i  oscylują wokół wartości 290o. Dla tych konformacji, przesunięcia
chemiczne sygnałów 31P znajdują się w wąskim zakresie spektralnym od -4 do -5 p.p.m.
względem sygnału wzorca, 85% kwasu fosforowego. W nietypowych konformacjach trans,
zarówno dla kątów  oraz  sygnały rezonansowe 31P przesunięte są w stronę niższych
częstotliwości. Konformacje trans występują w strukturach lewoskrętnych dupleksów
Z-RNA. Stąd rozrzut sygnałów w widmach 31P NMR dla tych form RNA jest znacznie
większy niż w przypadku widm wykonanych dla dupleksów A-RNA14. Duży wpływ na
przesunięcia chemiczne 31P mają także inne czynniki takie, jak kationy, które neutralizują
ładunek grup fosforanowych. Dlatego też wyznaczanie więzów torsyjnych dla kątów  i , na
podstawie przesunięć chemicznych 31P obarczone jest szerokim zakresem niepewności4.
A
gauche+
trans
gauche+
trans
gauche-
B
gauche-
C
trans
Rys. 24.
gauche-
Rzuty Newmana wzdłuż wiązań C5'-O5' (A), C4'-C5' (B), O3'-C3' (C) dla różnych konformacji
łańcucha fosforocukrowego.
29
Kąt  określa przestrzenną orientację podstawnika przy atomie C5' względem pierścienia
rybozy. Możliwe są trzy konformacje, oznaczone jako gauche+ (+), trans (t) i gauche- (-) (rys.
24A). W strukturach typu A-RNA występuje konformacja t, w której sprzężenia 3JPH5' i
3
JPH5'' są małe, poniżej 5 Hz (rys. 25). W pozostałych konformacjach + i -, jedno z tych
sprzężeń przyjmuje duże wartości, około 10 Hz. W celu ustalenia konformacji + i -, na
podstawie wartości sprzężeń skalarnych 3JPH5' i 3JPH5'', należy rozróżnić sygnały pochodzące
od protonów H5' i H5''. Stereospecyficzne przypisanie sygnałów H5' i H5'' dokonywane jest
na podstawie analizy znaków wartości geminalnych stałych sprzężeń 2JC4'H5' i 2JC4'H5'', przy
określonej konformacji wokół kąta 4. Analiza wartości stałych sprzężeń 3JPC4' może
dostarczyć dodatkowych informacji, dotyczących konformacji wokół kąta  (rys. 24A, rys.
25). Wyznaczenie wartości tych stałych sprzężeń wymaga jednak znakowania cząsteczek
RNA izotopem 13C.
25
JP-H5'
3
JP-H5''
3
20
JP-C4'
15
3
J [ H z]
3
10
5
0
0
50
100
150
200
250
300
350
Kąt torsyjny 
Rys. 25. Wykresy zależności stałych sprzężeń 3JPH5', 3JPH5'' i 3JPC4' od kątów .
Wartości kątów  są ustalane na podstawie stałych sprzężeń: 3JH4'H5' i 3JH4'H5''. W typowych
dla prawoskrętnych struktur helikalnych konformacjach gauche+ (+) (rys. 24B), obie stałe
sprzężenia są małe. W dwóch pozostałych konformacjach trans (t) i gauche- (-), jedna z
wymienionych wyżej stałych sprzężeń ma wartość około 10 Hz (rys. 26). Dodatkowych
informacji, dotyczących kątów  dostarczają stałe sprzężenia heteronuklearnego 3JC3'H5' i
3
JC3'H5'', które można wyznaczyć z widm NMR dla znakowanych izotopem 13C próbek RNA.
Następny kąt  w łańcuchu fosforocukrowym (rys. 23) ściśle związany jest z konformacją
rybozy. Istnieje geometryczna zależność pomiędzy kątem  a endocyklicznym kątem 0
pierścienia cukrowego (rys. 11). Analiza konformacji rybozy przedstawiona została w
rozdziale II.4.1. Konformacji North (C3'-endo) odpowiada kąt  około 85o, natomiast
konformacji South (C2'-endo) = 160o.
30
14
3
3
12
JH4'H5'
JH4'-H5''
3
J [ H z]
10
8
6
4
2
0
-2
0
50
100
150
200
250
300
350
Kąt torsyjny 
Rys. 26. Wykresy zależności stałych sprzężeń 3JH4'H5', 3JH4'H5'' od kątów .
25
3
JC2'-P
3
JC4'-P
15
3
J [ H z]
20
JH3'-P
3
10
5
0
0
50
100
150
200
250
300
350
Kąt torsyjny 
Rys. 27. Wykresy zależności stałych sprzężeń 3JH3'P, 3JC4'P i 3JC4'P od kątów .
Kolejny kąt  (rys. 23) wyznaczany jest w oparciu o heteronuklearne stałe sprzężenia
31
pomiędzy fosforem a protonem H3' na podstawie uproszczonego równania Karplusa247:
3
JPH  A  cos 2 ( )  B  cos( )  C ,
(9)
gdzie parametry A, B i C są określane empirycznie266. Z wykresu funkcji stałej sprzężenia
JPH3' (rys. 27) wynika, że dla wartości sprzężeń mniejszych niż 10 Hz mogą istnieć aż cztery
różne zakresy kątów . Liczbę możliwych zakresów dla danej wartości 3JPH, można
zredukować na podstawie ustaleń stereochemicznych. Redukcję kątów  dają również
dodatkowe pomiary stałych sprzężeń 3JC4'P i 3JC2'P. Pomiar wartości tych sprzężeń wymaga
jednak znakowania próbek RNA izotopem 13C.
3
II.5. Metody przypisań sygnałów rezonansowych NMR fragmentów RNA.
Podstawowym celem analizy widm 1H NMR jest identyfikacja sygnałów i przypisanie ich
poszczególnym protonom badanej cząsteczki. Przypisania (ang. assignments) dokonywane są
głównie na podstawie wartości przesunięć chemicznych oraz obserwowanych sygnałów
korelacyjnych dwu- i wielowymiarowych widm NMR, będących wynikiem oddziaływań
skalarnych i dipolowych. W pierwszym etapie analizy spektralnej przeprowadzana jest
identyfikacja sygnałów, ze względu na typ protonu, a następnie dokonywane jest pełne
przypisanie sygnałów, które uwzględnia pozycje protonów zajmowanych w strukturze RNA.
NH2 *
NH*
H2
H8
H6
H5
H1'
H2',H3',H4',H5',H5''
16
14
12
10
8
6
4
Przesunięcia chemiczne 1H (p.p.m.).
Rys. 28. Zakresy przesunięć chemicznych sygnałów 1H NMR dla oligorybonukleotydów.
Metoda oszacowania przesunięć chemicznych protonów dla RNA o dowolnej sekwencji,
na podstawie równań z eksperymentalnie wyprowadzonymi addytywnymi parametrami,
32
przedstawiona była przez Artera i Schmidta267. Charakterystyczne zakresy występowania
sygnałów rezonansowych 1H NMR w widmach niemodyfikowanych cząsteczek RNA
przedstawione zostały na rysunku 28. W nietypowych strukturach RNA, efekty ekranowania
przez pierścienie zasad oraz czynniki steryczne mogą powodować znaczne różnice pomiędzy
obliczonymi a rzeczywistymi wartościami przesunięć chemicznych. W ekstremalnych
przypadkach obserwowane były sygnały, które wykraczają poza charakterystyczne dla
danego protonu zakresy4.
W widmach 1H NMR oligorybonukleotydów sygnały rezonansowe są zgrupowane w
trzech następujących zakresach spektralnych:
 6,5 - 8,5 p.p.m.
 5,25 - 6,25 p.p.m.
 3,8 - 5,2 p.p.m.
sygna³y protonów H2 adenozyn, H6 pirymidyn, H8 puryn,
sygnały protonów H5 pirymidyn i protonów anomerycznych H1',
sygnały protonów rybozy H2', H3', H4', H5' i H5''.
Sygnały pochodzące od protonów iminowych (9 - 15 p.p.m.) i aminowych (6,5 - 9 p.p.m.)
są obserwowane w widmach wykonanych w H2O tylko wówczas, gdy wymiana tych
protonów z wodą jest bardzo wolna. Z analizy sygnałów wymienialnych protonów
wyprowadzana jest sieć możliwych wiązań wodorowych. Protony hydroksylowe, ze względu
na ich właściwości hydratacyjne i szybką wymianę z wodą, nie dają na ogół oddzielnych
sygnałów.
NH2
5'
H
N
O
H
H
H
H
O
-O
O
N
O
H
H
O
OH
H
O
N
P
O
H
H
N
O
H
NH
H
H
H
O
OH
NH2
N
H
NH2
O
3'
-O
H
P
O
Rys. 29.
H
H
H
H
N
O
N
O
H
H
O
OH
H
Ścieżki przekazywania magnetyzacji poprzez oddziaływania dipolowe H8/H6-H1'/H2'.
Internukleotydowe oddziaływania zaznaczone zostały przerywanymi liniami, natomiast
intranukleotydowe liniami ciągłymi.
33
Wybór metod analizy i technik eksperymentalnych, stosowanych przy identyfikacji
sygnałów zależy od wielkości i struktury badanych RNA. Wydzielić można dwie zasadnicze
strategie oparte na:
 metodzie sekwencyjnych przypisań dla próbek o naturalnym składzie
izotopowym10,11,
 analizie homo- i heteronuklearnych sprzężeń skalarnych dla próbek o 100%
wzbogaceniu izotopami 13C i 15N3,4,268.
Pierwsza metoda stosowana jest głównie w badaniach strukturalnych krótkich dupleksów i
opiera się na analizie inter- (sekwencyjnych) i intranukleotydowych sygnałów korelacyjnych
widm 2D-NOESY. W dwuniciowych strukturach helikalnych, protony H6/H8 każdej reszty
nukleotydowej oddziaływują przestrzennie z własnym protonem H1', dając
intranukleotydowy sygnał korelacyjny NOE, oraz oddziaływują z protonem H1' sąsiadującej
po stronie 5' jednostki nukleotydowej w sekwencji RNA (internukleotydowy, sekwencyjny
sygnał NOE) (rys. 29).
H
5'
N
N
H
N
H
O
H
N
N
Ryboza
3'
N
H
N
H
H
O
Ryboza
H
H
H
N
N
H
O
H
N
N
N
N
3'
Ryboza
N
O
H
H
Ryboza
5'
N
H
Rys. 30.
Oddziaływania dipolowe dla wymienialnych protonów. Internukleotydowe oddziaływania
zaznaczone zostały przerywanymi liniami, natomiast intranukleotydowe liniami ciągłymi.
Oddziałujące ze sobą dipolowo protony H1' i H6/H8 wyznaczają ścieżkę przekazywania
magnetyzacji, która przebiega wzdłuż całego łańcucha od protonu H1' pierwszej zasady.
Droga przekazywania magnetyzacji między protonami H1' i H6/H8 ma swoje
odzwierciedlenie w położeniu sygnałów korelacyjnych w widmach 2D-NOESY, w
charakterystycznym regionie spektralnym H6/H8-H1'. Łącząc w odpowiedniej kolejności
sygnały intra- i internukleotydowe protonów H1' i H6/H8 wyznaczana jest tzw. ścieżka
NOE11 H1'(i)-H8/H6(i)-H1'(i+1), która jednoznacznie umożliwia określenie częstotliwości
rezonansowych wszystkich tych protonów znajdujących się w cząsteczce RNA. Przypisania
sygnałów pozostałych protonów zasad i pierścieni cukrowych dokonywane są w kolejnym
etapie analizy widm NMR, na podstawie analizy pozostałych sygnałów korelacyjnych widm
2D-NOESY, znajdujących się w innych regionach spektralnych (ścieżki H2'(i)-H6/H8(i)H2'(i+1), H3'(i)-H6/H8(i)-H3'(i+1), H1'(i)-H2'(i)-H1'(i+1)) lub też wykorzystując widma, w których
zaznaczone są intranukleotydowe sprzężenia skalarne pomiędzy protonami. Metoda
przypisań sygnałów rezonansowych, bazująca na oddziaływaniach skalarnych w łańcuchu
P(i-1)-H4'(i)-H3'(i)-P(i)269-271 jest rzadko stosowana, ze względu na wąski zakres przesunięć
34
A. Korelacja pomiędzy sygnałami protonów zasad
eksperyment:
HCCCH
H
HNCCH
H
HNCCCH
O
N
H
N
H
N
H
N
O
H
H
H
N
N
N
N
H
N
H
N
N
HNCCCH
H
NH2
N
ryboza
ryboza
H
O
N
H
O
N
ryboza
ryboza
B. Korelacja między sygnałami H1' i H8/H6.
eksperyment:
HCNCH
HCNCH
H
H
N
O
H
N
N
O
H
H
H
N
NH
H
H
H
O
H
H
O
OH
H
O
NH2
N
H
H
O
N
O
H
H
O
OH
H
C. Korelacja pomiędzy sygnałami protonów rybozy
eksperyment: HCCH-COSY
O
O
Zasada
H
H
H
HCCH-R.COSY
H
H
O
OH
H
H
O
Zasada
H
H
O
HCCH-TOCSY(z filtracją CH2)
O
H
H
O
OH
Zasada
H
H
O
H
O
H
H
HCCH-TOCSY(z selekcją CH2)
Zasada
O
H
H
H
O
OH
H
H
H
H
O
OH
H
D. Korelacja pomiędzy sygnałami protonów rybozy a sygnałami rezonansowymi 31P.
eksperyment:
HCP
O
H
O
H
H
H
H
OH
H
N
O
O
O
P
O
O
H
H
H
H
Rys. 31.
H
H
OH
O
Drogi przenoszenia magnetyzacji (zaznaczone strzałkami) w różnych eksperymentach NMR dla
całkowicie wzbogaconych izotopem 13C i 15N cząsteczek RNA, które są wykorzystywane przy
identyfikacji sygnałów rezonansowych. Przypisanie sygnałów NMR odbywa się w czterech etapach
[A, B, C, D]. Sygnały korelacyjne obserwowane są dla atomów, które na rysunku zaznaczone są
pogrubioną czcionką.
35
chemicznych sygnałów jąder atomów 31P oraz trudności, związanych z analizą sygnałów
korelacyjnych H3'-H4', które znajdują się w silnie zagęszczonym regionie spektralnym.
Przypisania sygnałów wymienialnych protonów RNA dla próbek o naturalnym składzie
izotopowym dokonywany są na podstawie efektów NOE11 (rys. 30).
Druga strategia identyfikacji sygnałów rezonansowych 1H NMR jest stosowana w analizie
strukturalnej większych cząsteczek RNA z mniej stabilnymi fragmentami jednoniciowymi
typu pętli lub wybrzuszeń. Przypisania dokonywane są głównie na podstawie homo- i
heterojądrowych sprzężeń skalarnych w oparciu o nowe techniki spektroskopii 2D-272, 3D- i
4D-NMR3,4,82, które wykorzystują dwa, trzy i cztery kanały różnej częstotliwości
rezonansowej. Eksperymenty te wymagają jednakże całkowitego wzbogacenia badanych
próbek izotopami 13C i 15N. Przeniesienie magnetyzacji odbywa się wyłącznie poprzez
sprzężenia skalarne. Przypisania sygnałów rezonansowych dokonywane są w kilku etapach na
podstawie korelacyjnych, heteronuklearnych widm NMR. Sygnały korelacyjne dla protonów
zasad otrzymywane są z eksperymentów HCCCH, HNCCH i HNCCCH273. Następnie, na
podstawie eksperymentów HCNH274 lub HCNCH85,275, otrzymuje się korelacje pomiędzy
protonami H1' i H6/H8. Korelacja pomiędzy protonami rybozy dokonywana jest za pomocą
eksperymentów HCCH-COSY210,211,213,214, HCCH-R.COSY, HCCH-TOCSY z filtracją grup
metylenowych i HCCH-TOCSY z wyselekcjonowanymi grupami metylenowymi77,91. W
końcowym etapie przypisań sygnałów rezonansowych badana jest korelacja pomiędzy
sygnałami jąder atomów 31P a protonami rybozy za pomocą metod HCP88,89 lub HCPCH276.
Ogólny schemat analizy sygnałów rezonansowych dla całkowicie wzbogaconych izotopami
13
C i 15N próbek w oparciu o sprzężenia skalarne przedstawiony jest na rysunku 31.
1
H
1
H
1
H
1
H
1
H
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Numeracja nukleozydów w sekwencji RNA.
Rys. 32. Schemat maskowania sygnałów w metodzie "okienek protonowych". Jasną
linią zaznaczone są fragmenty RNA, w których wszystkie protony podstawione
są deuterem, ciemną linią zaznaczone są niedeuterowane fragmenty RNA
("okienka protonowe").
Trudności w identyfikacji silnie nachodzących na siebie sygnałów rezonansowych
zmuszają badaczy do poszukiwania nowych rozwiązań. Opracowane w ostatnich latach
36
metody selektywnego wzbogacania izotopami 13C, 15N, a także 2H, mogą znacznie ułatwić
identyfikację sygnałów i jednocześnie zwiększyć dokładność pomiarów. Szczególnie
interesująca jest metoda tzw. "okienek protonowych"277-280. W tej metodzie, wszystkie
protony, poza krótkim fragmentem łańcucha RNA, są całkowicie zastąpione deuterem. W
widmach protonowych, podstawienie deuterowe maskuje znaczną część sygnałów.
Przesuwając "protonowe okienko" wzdłuż sekwencji (rys. 32) można uzyskać pełne dane
dotyczące częstotliwości rezonansowych wszystkich protonów cząsteczki RNA i
oddziaływań, jakie między nimi zachodzą.
Zmodyfikowana koncepcja "okienek protonowych" polega na całkowitym zdeuterowaniu
tylko pozycji przy atomach C2', C4' i C5' rybozy. Efektem takiego zdeuterowania jest
wydłużenie czasów relaksacji T2 dla protonów H1' i H4' oraz zlikwidowanie sprzężeń
skalarnych H1'-H2', H4'-H3', H4'-H5', H4'-H5''. W wyniku otrzymywane są bardzo wąskie
sygnały rezonansowe protonów H1' i H4', co w znacznym stopniu ułatwia analizę złożonych
widm NMR. Dodatkowe wzbogacenie w "okienkach protonowych", jąder atomów węgla i
azotu izotopami 13C i 15N może rozszerzyć zakres badań do znacznie większych niż obecnie
analizowanych cząsteczek RNA.
II.6. Generowanie i udokładnianie struktur.
II.6.1. Metody chemii kwantowej.
Głównym celem stosowanych metod chemii kwantowej jest pełny opis struktury
cząsteczki zawarty w równaniu Schrödingera. Jednakże ścisłe jego rozwiązanie,
uwzględniające wszystkie oddziaływania oraz energie kinetyczne elektronów i jąder jest
niemożliwe nawet dla bardzo małych cząsteczek. Stąd wprowadzane są różnego typu
założenia upraszczające zagadnienie. Jedno z nich, tzw. przybliżenie Borna-Oppenheimera,
które polega na rozłożeniu pełnego operatora Hamiltona cząsteczki na dwie składowe:
elektronową i jądrową281. Daje to układ równań, z których jedno opisuje ruch elektronów w
układzie nieruchomych jąder (równanie elektronowe), a drugie ruch jąder przy zadanej
energii ekwipotencjalnej (równanie jądrowe).
Do rozwiązania równania elektronowego stosowane są metody ab initio wykorzystane w
programie Gaussian-94282 oraz metody pół-empiryczne MNDO, MINDO281, AMPAC,
MOPAC283. Metody te pozwalają stosunkowo dokładnie określić strukturę elektronową i
wynikające z niej właściwości chemiczne cząsteczki. Jednakże moc obliczeniowa obecnie
stosowanych komputerów jest zbyt mała, aby metody te bezpośrednio zastosować do dużych
molekuł. Niemniej, wyniki uzyskane dla małych cząsteczek są bardzo istotne z punktu
widzenia badań strukturalnych RNA. Z funkcji gęstości elektronowej nukleotydów i ich
fragmentów można wyliczyć teoretyczne wartości przesunięć chemicznych i sprzężeń
spinowo-spinowych oraz ustalić ich konformacyjne zależności (równania Karplusa). Ponadto,
obliczone dla różnych układów powierzchnie ekwipotencjalne są wykorzystywane do
parametryzacji potencjału, stosowanego w metodach mechaniki molekularnej284,285.
Drugie równanie otrzymywane w przybliżeniu Borna-Oppenheimera, opisuje ruch jąder,
na które działa potencjał pochodzący od elektronów. Rozwiązanie równania jądrowego jest
istotne, jeżeli chcemy znać kształt molekuły i jego zmiany zachodzące w czasie. Można je
rozwiązywać metodami kwantowymi, czym zajmuje się dynamika kwantowa, jednakże jądra
są na tyle dużymi obiektami, że efekty kwantowe mogą być pominięte i równanie jądrowe
można zastąpić klasycznym równaniem ruchu Newtona. Równanie to i jego rozwiązanie dla
37
układu jąder atomowych cząsteczek jest podstawą dynamiki molekularnej MD (ang.
Molecular Dynamics)286,287.
II.6.2. Metody dynamiki
strukturalnych.
molekularnej
i
generowania
więzów
Mechanika molekularna (MM), skupia się głównie na znalezieniu geometrii i energii
molekuł, równowagowych struktur, stanów przejściowych oraz częstotliwości drgań
harmonicznych. Wyznaczenie struktury i dynamiki cząsteczki RNA metodą MD (ang.
Molecular Dynamics) sprowadza się do rozwiązania równania ruchu Newtona w określonym
polu potencjalnym, przy zadanych warunkach początkowych. Warunki te zdefiniowane są
przez podanie współrzędnych wszystkich atomów cząsteczki i ich początkowych prędkości.
Ze względu na warunki brzegowe można wyodrębnić dwie strategie. W pierwszej,
współrzędne atomów struktur początkowych wyprowadzane są metodą DG288,289 (ang.
Distance Geometry) lub generowane są metodą przypadkowych kątów torsyjnych. Ta
strategia stosowana jest najczęściej w badaniach dużych cząsteczek RNA, gdzie wstępna
analiza NMR nie pozwala na określenie typu struktury. Również zastosowana jest w
badaniach dupleksów, które zawierają wewnętrzne pętle lub nietypowe pary zasad o
niesprecyzowanych wiązaniach wodorowych. W drugiej opcji, struktury początkowe
wyprowadzane są z form kanonicznych drogą ograniczonej randomizacji. Jest ona stosowana
głównie w badaniach regularnych dupleksów RNA.
Początkowe prędkości atomów są generowane automatycznie w inicjującej fazie obliczeń i
dla zadanej temperatury przyjmują rozkład Maxwella-Boltzmanna. Całkowanie równania
ruchu Newtona wykonywane jest numerycznie z odstępem czasowym 1-2 fs, z
wykorzystaniem metody SHAKE290. Zależnie od potrzeb, zakres czasu symulowanej
dynamiki obejmuje od kilkunastu pikosekund do 1 nanosekundy. W każdym cyklu
iteracyjnym obliczane są prędkości wszystkich atomów, a następnie skalowane w celu
osiągnięcia określonej temperatury. Otrzymywane w trakcie dynamiki struktury są następnie
analizowane pod względem zmian konformacyjnych i energii potencjalnej. Końcowym
etapem obliczeń jest minimalizacja energii metodą mechaniki molekularnej MM. W
zależności od wielkości badanego RNA i liczby stosowanych więzów, obliczenia powtarzane
są kilkanaście lub kilkadziesiąt razy, przy różnych warunkach początkowych. Wszystkie
struktury są następnie analizowane ze względu na stereochemię i zgodność z danymi
eksperymentalnymi. Po dokonaniu selekcji wg określonych kryteriów, końcowy zbiór
struktur określa przestrzeń konformacyjną291-293 (ang. conformational space, hyperspace),
która jest rozwiązaniem struktury RNA metodami NMR.
W metodach mechaniki molekularnej stosowane są różne pola siłowe (ang. forcefield) jak:
ECEPP294,295, UNICEPP296, MM2284, GROMOS297, CHARMM298, AMBER299,300, CVFF,
CFF91301, które opisane są potencjałem V, zależnym od współrzędnych wszystkich jąder
atomowych cząsteczki. Ogólnie, potencjał cząsteczkowy można zapisać w postaci:
V  VBOND  V ANGLE  VTORS .  VVDV  VEL.  VEXP.
(10)
Poszczególne składniki określają energie potencjalne, które związane są ze strukturą
wiązań kowalencyjnych cząsteczki (VBOND, VANGLE, VTORS.) oraz z oddziaływaniami między
atomami typu Van der Waalsa (VVDV) i elektrostatycznymi (VEL.). Ostatni człon (VEXP.) jest
energią potencjalną par jąder, na które nałożono więzy strukturalne ograniczające ich ruch,
wyprowadzone na podstawie danych eksperymentalnych. W niektórych stosowanych polach
siłowych należących do tzw. drugiej generacji, liczba składników potencjału może być
38
większa. Np. w polu CFF91 dochodzą dodatkowe człony energii potencjalnej, które związane
są ze sprzężeniami pomiędzy długością wiązań kowalencyjnych, kątów płaskich i torsyjnych
w cząsteczce.
Funkcje opisujące poszczególne składowe potencjału mają różną postać matematyczną, od
prostych funkcji kwadratowych aż po funkcje typu Morse'a, szeregów Fouriera, potencjału
Lennarda-Jonesa itp. Parametryzacja tych funkcji jest wynikiem ekstrapolacji danych
eksperymentalnych i obliczeń kwantowo-mechanicznych dla małych cząsteczek, a jej celem
jest opis całych klas molekuł z możliwie jak największą dokładnością.
Pole AMBER, które stosowałem w wyznaczeniu struktur dupleksów r(CGCGCG)2 i
2'-O-Me(CGCGCG)2, jest dostosowane głównie do badań kwasów nukleinowych. Energia
potencjalna cząsteczki w tym polu wynosi:
V
K
( b  b0 ) 2   K (   0 ) 2   K  [1  cos( n   0 )] 
bonds
tors.
.
 angl



 
b
VBOND
V ANGLE
VTORS .
  Cij rij12  Dij rij 6   qi q j / rij  VEXP.
i, j
i, j



 

VVDV
(11)
VEL .
Stosowane w równaniu (11) stałe siłowe Kb, K, K, oraz parametry b0, 0, i 0 określają
odpowiednio długości wiązań chemicznych, kąty między wiązaniami i kąty torsyjne dla
idealnej struktury w stanie równowagi. Parametry Cij i Dij zdefiniowane są przez funkcję
potencjału Lennarda-Jonesa. Potencjał ten określa oddziaływania Van der Waalsa między
atomami, których odległość między jądrami wynosi rij. W składniku energii elektrostatycznej
VEL.,  oznacza stałą dielektryczną, a qi - ładunki elektryczne jąder atomowych. Standardowe
ładunki q dla pola AMBER 4.0 w programie DISCOVER 95302 podane są na rysunku 33.
Ostatni człon VEXP. potencjału pola AMBER (11) określa energię, będącą efektem
nałożonych eksperymentalnych więzów strukturalnych i ma postać:
exp.
exp.
exp.
V EXP.  V NOE
 VTORS
.  V J  COUPL ,
(12)
gdzie:
exp.
VNOE
exp.
VTORS
.
V Jexp.
 COUPL.
 K NOE1 ( rij  rmin ) 2 gdy
rij  rmin

0
gdy rmin  rij  rmax
 
2
K
rij  rmax
 NOE 2 ( rij  rmax ) gdy
(12a)
 K TORS 1 ( ij   min ) 2 gdy
 ij   min

gdy  min   ij   max
0
 
2
K
 ij   max
 TORS 2 ( ij   max ) gdy
(12b)
 K J  COUPL1 ( J ij  J min ) 2 gdy
J ij  J min

 
0
gdy J min  J ij  J max
2
K
J ij  J max
 J  COUPL 2 ( J ij  J max ) gdy
39
(12c)
.0,351
0,329.
.-0,834
5'
0,935
.
0,153.
0,279.
0,008.
.0,180
0,185
.
0,098.
0,008.
.-0,860
.-0,576
.-0,404
0,859
.
.-0,508
.-0,187
-0,343
.
0,100
.
.
0,061
.0,007
.
0,117
0,008
.
0,303.
.
0,054
.0,101
.
-0.458
-0,547
.
-0,509
.
0,324.
-0,847
.
.
-0,509
.
1,385
.
-0,847
0,008.
0,008.
0,061
.
.-0.060
.0.339
.
-0,042
-0,343
0,303.
-0,508
.
.
0,008
.0.871
.
-0.709
.
.
0,007
0.336
.
-0.729
.0,266
0,046.
.0,180
0,100
.
0.690
.
-0,543
.
.0.391
.
-0.778
0.325
.
0,117
.
0,054
.
.0,101
-0,547
.
.0,324
.
0,306
3'
Rys. 33. Ładunki elektrostatyczne w polu AMBER (Discover 9,5 firmy MSI) dla dinukleotydu CG.
Potencjał VNOEexp. opisuje siły reakcji na więzy nałożone na odległości międzyprotonowe,
które zostały określone na podstawie ilościowych pomiarów intensywności sygnałów
korelacyjnych widm 2D-NOESY. Stałe siłowe KNOE1 i KNOE2 przyjmują wartości w zakresie
od 10 do 50 kcal.A-2.mol-1. Wielkości rmin i rmax określają dolne i górne granice przedziałów,
w których siły reakcji więzów nie występują. Szerokości tych przedziałów zależą od błędu
pomiarowego wyznaczonych eksperymentalnie odległości atomów. Im większa jest
niepewność pomiarowa tym szersze są zakresy wyznaczone przez rmin i rmax.
Drugi składnik równania (12) VTORS.exp. związany jest z reakcją na więzy nałożone na kąty
torsyjne, które wprowadzone zostały na podstawie analizy wicynalnych sprzężeń skalarnych.
Potencjał ten opisany jest przez stałe siłowe KTORS1 i KTORS2, które przyjmują najczęściej
wartości w zakresie od 10 do 50 kcal.rad-2.mol-1 oraz parametry min i max, będące dolnymi i
40
górnymi granicami określającymi tolerancję wyznaczonych eksperymentalnie kątów
torsyjnych. Zakres przedziału (min, max) zależy od wielkości błędów pomiarowych przy
wyznaczaniu wartości stałych sprzężeń spinowo-spinowych oraz od niepewności parametrów
w równaniu Karplusa.
Ostatni składnik VJ-COUPL.exp. dotyczy energii potencjalnej związanej z reakcją na
specyficzne więzy nałożone również, jak poprzednio, na kąty torsyjne. Więzy te stosowane są
tylko wtedy, gdy odpowiednim wartościom stałych sprzężeń spinowo-spinowych odpowiada
kilka zakresów kątów torsyjnych.
Metoda dynamiki molekularnej, która uwzględnia więzy jako dodatkowe warunki
wynikające z danych eksperymentalnych NMR, ograniczające dowolność zmiany
współrzędnych atomowych cząsteczki, jest podstawową metodą obliczeniową i nosi nazwę
rMD302 (ang. restrained Molecular Dynamics). Liczba nałożonych na strukturę więzów oraz
stosowane w wyrażeniu VEXP wartości stałych siłowych i zakresy tolerancji więzów decydują
o precyzji uzyskanych struktur końcowych metodami NMR. W celu otrzymania dokładnych,
zbieżnych wyników należy nałożyć kilkanaście więzów na jedną jednostkę nukleotydową w
cząsteczce RNA.
W badaniach strukturalnych biomolekuł, stosowanych jest kilka metod wyznaczania
więzów na odległości międzyprotonowe, oparte na analizie integracji (objętości) sygnałów
korelacyjnych widm 2D-NOESY. Najprostsza z nich (metoda półilościowa)4 polega na
wyznaczaniu zakresów odległości międzyprotonowych na podstawie porównywania
wielkości NOE do określonych wzorców (np. H5-H6, H1'-H3'). W metodzie tej, niezależnie
od objętości (integracji) sygnałów, dolne granice rmin odległości między dwoma protonami są
zawsze równe sumie ich promieni Van der Waalsa (1,8 Å). Górne granice rmax są
zróżnicowane i wynoszą 2,5 lub 3 Å dla par protonów o silnych sygnałach NOE
(porównywalnych do sygnałów H5-H6 pirymidyn); 3,5 lub 4 Å dla par protonów, których
sygnały korelacyjne NOE mają objętość zbliżoną do sygnałów odniesienia H1'-H3' oraz 5 Å
dla pozostałych par o słabych sygnałach NOE. Metodę tą można stosować, jeżeli widma
2D-NOESY wykonane zostały dla stosunkowo krótkich czasów mieszania m, gdzie wpływ
tzw. zjawiska dyfuzji spinów303 na intensywności NOE jest mały. Jedną z możliwych opcji
jest wprowadzenie dodatkowych więzów na te pary protonów, których sygnały korelacyjne
NOE nie są obserwowane. W tych przypadkach, można wprowadzić jednostronne więzy
posiadające tylko dolne granice rmin o wartościach 5 Å.
Znacznie dokładniejsza metoda ISPA (ang. Isolated Spin Pair Approximation) polega na
pomiarze objętości sygnałów korelacyjnych widm 2D-NOESY i porównaniu ich z
wartościami dla sygnałów wzorca np. H5-H6 pirymidyn (dH5H6 = 2,45 Å). Międzyprotonowe
odległości dij otrzymuje się ze wzoru:
d ij  (
Awz 16
) d wz ,
Aij
(13)
gdzie Awz i Aij są objętościami sygnałów wzorca i odpowiedniego sygnału NOE dla pary
protonów i-j; a dwz jest odległością między protonami pary odniesienia (np. dla H5-H6 dwz =
2,45 Å). Dokonując analizy statystycznej obejmującej różne wzorce, pochodzące np. z
integracji sygnałów H5-H6 wszystkich pirymidyn znajdujących się w sekwencji RNA oraz
mierząc objętości sygnałów po obu stronach przekątnej widm 2D-NOESY, wykonanych przy
różnych czasach mieszania m, wyznaczane są dla poszczególnych par protonów granice
błędów pomiarowych rmin i rmax. Główną wadą tej metody jest nieuwzględnienie w
obliczeniach wpływu tzw. zjąwiska dyfuzji spinów i ruchów intramolekularnych303-305 na
41
wielkości efektów NOE. Dyfuzja spinów występuje w układach wielospinowych303, w
których istnieje cała sieć oddziaływań dipolowych i jej wpływ na intensywności NOE są tym
większe im dłuższe są czasy mieszania m stosowane w eksperymentach NOESY.
Powszechnie przyjmuje się, że efekt dyfuzji spinów może być pomijany, jeżeli eksperymenty
2D-NOESY zostały wykonane z krótkimi czasami mieszania, m mniejszymi od 50 ms. Z
drugiej strony, stosowanie krótkich czasów mieszania ogranicza dokładność integracji
sygnałów NOE ze względu bardzo wysoki poziom szumów w stosunku do sygnałów
korelacyjnych widm NOESY.
Rozwinięciem metody ISPA jest metoda tzw. początkowego wzrostu intensywności
sygnału NOE (ang. NOE build-up intensities)303. Na podstawie serii widm 2D-NOESY, dla
danej pary protonów analizowane są zmiany intensywności NOE w funkcji czasu mieszania
m. Do punktów pomiarowych dopasowywana jest funkcja, a następnie obliczana jest jej
pochodna w punkcie początkowym m = 0. Wartość tej pochodnej odpowiada szybkości
wzajemnej (krzyżowej) relaksacji Rij między dwoma protonami. Odległości między
protonami dij, oblicza się następnie ze wzoru:
Rwz 16
d ij  (
) d wz ,
Rij
(14)
Metoda początkowego wzrostu intensywności sygnałów NOE eliminuje wpływ dyfuzji
spinów na wyznaczane wartości dij. Niestety, metoda ta jest bardzo czasochłonna, co
związane jest z koniecznością wykonania całej długiej serii widm 2D-NOESY, w tym kilku
widm z bardzo krótkimi czasami mieszania, m w zakresie od 10 do 60 ms.
Powyższych wad pozbawiona jest metoda RMA306 (ang. Relaxation Matrix Approach),
która znacznie skraca czas pomiarowy, przy jednoczesnym wzroście dokładności
wyznaczanych odległości międzyprotonowych. Wpływ dyfuzji spinów na intensywności
sygnałów NOE jest eliminowany przez analizę pełnej macierzy relaksacyjnej Rij dla
wszystkich par protonów badanej cząsteczki. Metoda ta stosowana jest w programach
MADRIGRAS/CORMA307, FIRM308, IRMA309. Dodatkowym atutem tej metody jest
uwzględnienie ruchów intramolekularnych na wartości efektów NOE. Schemat blokowy
programu IRMA (Iterative Relaxation Matrix Approach) przedstawiony został na rysunku 34.
W każdym cyklu IRMA obliczane są tzw. czynniki R311, które określają różnice między
wyliczonymi z modelu a eksperymentalnymi objętościami sygnałów korelacyjnych widm
2D-NOSY. Następnie, hybrydowa macierz utworzona z eksprymentalnych i teoretycznych
wartości NOE poddawana jest odwrotnej transformacji, w wyniku której otrzymywane są
nowe, udokładnione więzy odległościowe. Przeprowadzana w każdym cyklu krótka dynamika
molekularna rMD daje każdorazowo nową udokładnioną strukturę. Program jest przerywany
wówczas, gdy dalsze cykle obliczeniowe nie prowadzą do większych zmian czynników R.
42
Seria widm
2D-NOESY
dla różnych m
Struktura
początkowa
Macierz odległości
między protonami
Dij (model)
Udokładniona
struktura
Macierz szybkości
wzajemnej relaksacji
Rij (model)
Macierz objętości
sygnałów NOE
Aij (exp.)
Macierz objętości
sygnałów NOE
Aij (model)
Udokładnianie
struktury metodą
rMD
Skalowanie i kalibracja
sygnałów oraz obliczenie
czynników R (R- faktorów)
Macierz hybrydowa objętosci
sygnałów NOE
Aij (model + exp.)
Udokładnione więzy
na odległości
między protonami
Odwrotna
transformacja
Uśredniona macierz szybkości
wzajemnej relaksacji
< Rij >
Macierz szybkości wzajemnej
relaksacji Rij (model + exp.)
dla różnych m
Rys. 34. Schemat blokowy programu IRMA (firmy MSI ).
Rozszerzeniem restryktywnej dynamiki molekularnej (rMD) jest opracowana przez
Nilges'a metoda symulowanego wyżarzania SA310 (ang. Simulated Annealing), która po raz
pierwszy zastosowana była do wyznaczenia struktury białka. W przeciwieństwie do typowego
protokołu dynamiki molekularnej, stosowany w metodzie SA potencjał (11) zmienia się w
czasie. Liniowym zmianom ulegają wszystkie stałe siłowe w wyrażeniach VEXP., VBOND,
VANGLE, VTORS oraz parametry określające oddziaływania międzyatomowe. Wspólną cechą
stosowanych protokołów SA jest zmniejszenie wszystkich sił działających na jądra w
pierwszym etapie obliczeń (etap próbkowania). W wyniku tego, atomy osiągają bardzo
wysoką średnią energię kinetyczną, która odpowiada temperaturze bezwzględnej rzędu
tysięca stopni Kelvina. To pozwala pokonywać przez układ wysokie bariery energii
potencjalnej. W następnych etapach (zwijanie, porządkowanie), w określonej kolejności
zwiększane są liniowo poszczególne oddziaływania. Jako pierwsze, standardowe wartości
osiągają oddziaływania związane z więzami strukturalnymi. To prowadzi do zwinięcia
struktury, które jest zgodne z danymi eksperymentalnymi. Następnie, zwiększane są
oddziaływania odzwierciedlające strukturę wiązań kowalencyjnych a na samym końcu
oddziaływania międzyatomowe Van der Waalsa i elektrostatyczne. Ostatnim etapem
protokołu metody SA jest chłodzenie i minimalizacja energii. Wykresy względnych zmian
parametrów poszczególnych składowych energii potencjalnej w przykładowym protokole SA
przedstawione są na rysunku 35. Metoda SA pozwala przebadać znacznie większy obszar
przestrzeni konformacyjnej oraz osiągnąć lepszą zbieżność z danymi eksperymentalnymi,
43
niezależnie od przyjętych struktur początkowych. Metoda SA stosowana jest przede
wszystkim w tych przypadkach, gdzie wstępna analiza NMR nie pozwala określić typu
strukturalnego badanej cząsteczki RNA. Dotyczy to szczególnie dużych struktur RNA oraz
dupleksów zawierających nietypowe pary zasad.
Faza 1
Próbkowanie
(Sampling)
1000oK
Faza 2
Zawijanie
(Folding)
1000oK
Współczynnik.1
skalujący.
Faza 3
Faza 4
Faza 5
Porządkowanie
Chłodzenie
Minima(Regularisation)
(Cooling)
lizacja.
1000oK
1000oK 300oK
0,1
0,01
Skalowane oddziaływania
VEXP.
VBOND, VANGLE, VTORS
VVDW, VEL.
0,001
0,0001
0
10
20
30
40
50
60
70
Czas symulacji [ps]
Rys.35. Diagram przedstawiający skalowanie stałych siłowych w metodzie SA.
II.6.3. Kryteria precyzji i dokładności wyznaczonych struktur.
Istotnym etapem badań jest analiza struktur zawartych w przestrzeni konformacyjnej. Jej
celem jest wyselekcjonowanie struktur, które najlepiej zgadzają się z danymi
eksperymentalnymi NMR oraz odpowiadają warunkom stereochemicznym. Analiza
statystyczna naruszonych więzów (ang. violations) jest stosowana przy selekcji struktur
końcowych. Jeżeli istnieją odległości między protonami, które przekraczają o ponad 1 Å
zakres stosowanych dla nich więzów, to struktury w których to ma miejsce należy odrzucić.
Także struktury posiadające liczne niedopasowane więzy o wartościach ponad 0,5 Å muszą
być również wyeliminowane.
Przy określeniu precyzji struktur wyjściowych stosowane są różne ogólne parametry takie,
jak czynniki R i JRMS. Kilka różnych czynników R311 zaproponowanych zostało wzorując się
na analogicznych parametrach stosowanych w badaniach krystalograficznych. Parametry te
określają różnice pomiędzy eksperymentalnymi a teoretycznymi wartościami NOE, które
obliczane są metodą RMA. Jednym z najczęściej stosowanych jest czynnik R opisany
wzorem:
44
 (( A
exp. 1/ 6
ij
i, j
R
)
 ( Aijteor . )1/ 6 ) 2
( A
(15)
exp. 1/ 6
ij
)
i, j
gdzie Aexp. i Ateor. są eksperymentalnymi i teoretycznymi objętościami sygnałów
korelacyjnych NOE, a sumowanie przebiega po wszystkich parach, dla których efekt ten
został zmierzony.
Drugi parametr, JRMS wyrażony wzorem:
1
N
J RMS 
J
exp.
ij
 J ijteor .
i, j

2
(16)
określa odchylenie standardowe obliczonych teoretycznie wartości sprzężeń spinowospinowych. Sumowanie przebiega po wszystkich kątach torsyjnych, które zostały
wyznaczone z wartości wicynalnych sprzężeń skalarnych.
Inne kryteria, stosowane przy selekcji struktur, związane są z warunkami
stereochemicznymi. Stosowane są różne parametry, które określają różnice długości wiązań
chemicznych, kątów między wiązaniami, katów torsyjnych pomiędzy idealnymi a
rzeczywistymi strukturami, otrzymywanymi z modelowania molekularnego.
Zbieżność struktur przestrzeni konformacyjnej określana jest za pomocą średniej wartości
RMSD. Dla dwóch porównywanych struktur parametr ten wynosi:
RMSD 
1
N
N
 ( x
i 1
i
 xi ' )2  ( yi  yi ' )2  ( z i  z i ' )2  ,
(17)
gdzie xi, yi, zi są współrzędnymi i-tego atomu pierwszej struktury, xi', yi', zi' współrzędnymi
tego samego atomu dla drugiej struktury. Sumowanie przebiega po wszystkich atomach
cząsteczki. Parametr RMSD obliczany jest po superpozycji struktur. Na rysunku 36
przedstawiono przykładowo różną zbieżność struktur RNA, otrzymanych z obliczeń przy
wykorzystaniu zmiennej liczby więzów odległościowych312.
4,0 Å
Rys. 36.
1,8 Å
1,0 Å
0,9 Å
0,85 Å
Zbieżność struktur pętli 20-meru RNA otrzymanych z obliczeń, dokonanych przy różnej ilości
więzów strukturalnych. Pod strukturami podana jest średnia wartość RMSD.
45
Od kilku lat prowadzona jest dyskusja, dotycząca dokładności i precyzji struktur
wyznaczonych metodami NMR. Te dwa terminy są wyraźnie rozróżniane. Precyzję można
określić na podstawie wyżej opisanych parametrów (czynniki R, JRMS, RMSD) i statystyki
naruszonych więzów strukturalnych. Dokładność jest znacznie trudniej określić. Jej miarą jest
zgodność między obliczonymi a rzeczywistymi strukturami. Ponieważ spektroskopia NMR
jest, jak dotąd, jedyną metodą pozwalającą wyznaczyć strukturę w roztworze, dlatego
otrzymywane wyniki nie mogą być porównywane z innymi strukturami. Porównanie ze
strukturami krystalograficznymi również nie może być miarą dokładności, gdyż sieć
oddziaływań w ciele stałym może być całkiem inna niż w roztworze. Różnice te mogą być
znaczne, zwłaszcza dla kwasów nukleinowych, o czym świadczy fakt, że około 40%
dupleksów DNA krystalizuje w formie A-DNA, natomiast tych struktur, jak dotychczas, nie
stwierdzono w roztworze.
II.7. Geometria dupleksów RNA - parametry helikalne.
Dwuniciowe fragmenty helikalne są podstawowymi elementami strukturalnymi RNA.
Występują one we wszystkich typach cząsteczek RNA. Ich struktury opisane są za pomocą
kilkunastu parametrów helikalnych. W starszych pracach stosowano szereg metod
obliczeniowych, parametryzujących helikalne struktury łańcuchów oligonukleotydowych w
oparciu o różne założenia, które nie były ze sobą spójne. W celu ich znormalizowania, w
1988 roku wprowadzona została konwencja (Cambridge convention)313, zatwierdzona przez
IUPAC. Parametry helikalne mo¿na podzieliæ na trzy grupy:



lokalne parametry między parami zasad (ang. Inter - Base Pair Parameters)
globalne parametry dla pary zasad względem osi helisy (ang. Global Pair - Axis
Parameters)
lokalne parametry między zasadami (ang. Base - Base Parameters).
Parametry te obliczane są względem lokalnych układów odniesienia wyznaczonych dla
każdej pary nukleotydów lub względem osi helisy.
II.7.1 Lokalny układ współrzędnych.
Zgodnie z przyjętą konwencją, początek każdego lokalnego układu odniesienia znajduje
się w połowie odcinka wyznaczonego przez atom C6 pirymidyny i atom C8 puryny. Oś y
układu skierowana jest wzdłuż tego odcinka w stronę pierwszego łańcucha nukleotydowego,
który zawsze, zgodnie z umową, zawiera nukleotydy oznaczone numerami od 1 do n w
kierunku 5' ═> 3' (rys. 37). W przypadku istnienia modyfikowanych nukleotydów lub
nietypowych par zasad, środek i oś y lokalnego układu określa się według tzw.
hipotetycznych atomów C6* i C8*, czyli według położeń atomów C6 i C8, jeżeli nietypowe
pary zastąpione byłyby normalną parą złożoną z pirymidyny i puryny. Oś x układu lokalnego
jest prostopadła do osi y i leży na uśrednionej płaszczyźnie, określonej przez atomy
heterocyklicznych pierścieni zasad. Kierunek osi x jest prostopadły do płaszczyzny rysunku,
jeżeli dupleks zorientowany jest małą bruzdą do obserwatora. Trzecia oś z jest prostopadła do
46
dwóch pozostałych i razem z nimi tworzy prawoskrętny, ortogonalny układ współrzędnych.
Lokalne układy odniesienia dla pierwszych dwóch par zasad dupleksu schematycznie
przedstawione zostały na rysunku (rys. 37).
Rys. 37. Schemat układów lokalnych dla pierwszych dwóch par zasad dupleksu.
II.7.2. Lokalne parametry helikalne między parami zasad (Inter - Base
Pair Parameters).
Lokalne parametry helikalne opisują transformację układu odniesienia i-tej pary zasad na
układ następnej pary dupleksu, w wyniku której, oba lokalne układy reprezentujące położenia
sąsiednich par zasad będą się nakładały. Transformacja ta jest rozłożona na trzy przesunięcia
(translacje) oraz trzy niezależne obroty wokół osi lokalnych x, y, z. Ogólnie, transformacja
opisana jest przez sześć niezależnych parametrów helikalnych (rys. 38). Nazwy tych
parametrów oraz ich aktualne i wcześniej obowiązujące symbole przedstawione zostały w
tabeli 5. Zgodnie z przyjętą umową, parametry translacyjne oznaczone są zawsze literami
alfabetu łacińskiego, natomiast parametry rotacyjne opatrzone są symbolami greckimi.
Dodatnie i ujemne wartości parametrów translacyjnych wyznaczone są przez odpowiadające
im kierunki osi układu, natomiast parametrów rotacyjnych - przez regułę prawoskrętnej
śruby. Zgodnie z tą regułą i przyjętymi kierunkami osi układu lokalnego, dodatni parametr
Twist jest dla prawoskrętnych dupleksów. Dodatni parametr Roll występuje wówczas, gdy
sąsiednie pary zasad są rozwarte w stronę małej bruzdy, natomiast dodatni Tilt jest wtedy,
gdy to rozwarcie zachodzi w stronę pierwszego łańcucha.
47
Parametry translacyjne.
Rise Dz
Slide Dy
Shift Dx
Parametry rotacyjne.
Twist 
Roll 
Tilt 
Rys. 38. Lokalne (translacyjne i rotacyjne) parametry helikalne pomiędzy parami zasad (Inter - Base Pair
Parameters).
Tabela 5. Lokalne parametry helikalne pomiędzy parami zasad (Inter - Base Pair Parameters).
Rodzaj
transformacji.
Translacja
Translacja
Kierunek
Nazwa
Symbol
Stare symbole
z
y
Rise
Slide
Dz
Dy
Translacja
Rotacja
x
z
Shift
Twist
Dx
Rw,Zsh,h,d,dz
Si,Ysh,Ydd,dx,
Ss,Xsh,Xdd,dy

t, Wdg,,,w
Rotacja
y
Roll

Rotacja
x
Tilt

Rwd,,w,R
Twd,t,w,T,
II.7.3. Globalne parametry helikalne dla pary zasad względem osi
dupleksu (Global Base Pair - Axis Parameters).
Globalne parametry helikalne opisują położenie indywidualnych par zasad względem
układu odniesienia, związanego z osią główną dupleksu. Dwa parametry  (Tip) i 
(Inclination) określają kąty rotacji par zasad względem krótszej osi x i dłuższej osi y układu
odniesienia. Pozostałe dwa parametry dx (x-Displacement) i dy (y-Displacement) opisują
odległość pary zasad od osi helisy w kierunku x i y (rys. 39). Całkowita odległość środka
pary zasad od globalnej osi dupleksu jest pierwiastkiem sumy kwadratów dwóch wyżej
wymienionych parametrów translacyjnych. Nazwy parametrów helikalnych tej grupy oraz ich
symbole podane są w tabeli 6.
48
Parametry translacyjne.
y-Displacement dy
x-Displacement dx
Parametry rotacyjne.
Tip 
Układ współrzędnych
Inclination 
Rys. 39. Globalne (translacyjne i rotacyjne) parametry helikalne dla pary zasad względem
osi helisy (Global Base Pair - Axis Parameters).
Tabela 6.
Globalne parametry helikalne dla pary zasad względem osi helisy (Global Base Pair Axis Parameters).
Rodzaj
transformacji.
Translacja
Translacja
Rotacja
Rotacja
Odległość od
osi globalnej
Kierunek
Nazwa
Symbol
Stare symbole
y
x
y
x
y-Displacement
x-Displacement
Tip
Inclination
dy
dx


TL
Da 
( dx )2  ( dy )2
D,d
II.7.4. Lokalne parametry helikalne między zasadami (Base - Base
Parameters).
Lokalne parametry między zasadami określają wzajemne położenie heterocyklicznych
pierścieni zasad. Podobnie jak w grupie pierwszej, wyróżniane są trzy niezależne parametry
translacyjne w kierunkach osi x, y i z oraz trzy niezależne parametry rotacyjne określające
obroty wokół tych osi (rys. 40). Nazwy tych parametrów oraz symbole zestawiono w tabeli 7.
49
Parametry translacyjne.
Stagger Sz
Stretch Sy
Shear Sx
Parametry rotacyjne.
Opening 
Propeller twist 
Buckle 
Rys. 40. Lokalne (translacyjne i rotacyjne) parametry zasad (Base - Base Parameters).
Tabela 7. Lokalne parametry helikalne między zasadami (Base - Base Parameters).
Rodzaj
transformacji.
Translacja
Translacja
Translacja
Rotacja
Rotacja
Rotacja
Kierunek
Nazwa
Symbol
Stare symbole
z
y
x
z
y
Stagger
Stretch
Shear
Opening
Propeller twist
Sz
Sy
Sx


Pr,Tw,Pro,TW,p.
x
Buckle

II.7.5. Program CURVES 5.11.
W oparciu o konwencję Cambridge, kilka zespołów badawczych opracowało różne
programy obliczeniowe wykorzystujące bibliotekę HELIB314, w której zawarte są
podstawowe algorytmy dotyczące parametryzacji struktur helikalnych. Stosowany w mojej
pracy program CURVES 5.11 jest jednym z tych programów. Został opracowany przez R.
Lavery'ego i H. Sklenara315. Program, dzięki możliwości definiowania lokalnych układów
związanych z każdą pojedynczą zasadą, może obliczać parametry helikalne dla pojedynczych
nici z osobna i uśredniać je dla struktur wieloniciowych (dupleksów, trypleksów i
kwadrupleksów). Ponadto, program oblicza standardowe parametry, określające
pofałdowanie pierścieni cukrowych, kąty wokół wiązań N-glikozydowych oraz kąty torsyjne
50
łańcuchów fosforocukrowych, a także wylicza średnie szerokości i głębokości bruzd w
dupleksach. Obliczenia parametrów dokonywane są na podstawie współrzędnych atomowych
cząsteczki.
II.7.6. Struktura dupleksów.
Niektóre parametry strukturalne opisujące właściwości konformacyjne różnych typów
helis przedstawiono w tabeli 8. Główne różnice pomiędzy podstawowymi dwiema formami
natywnymi A-RNA i B-DNA (rys. 41.) polegają na:



odmiennej konformacji cukru,
innym przesunięciu zasad (x-Displ) oraz ich orientacji (Inclination) względem osi
dupleksu,
różnicy w ukształtowaniu małych i dużych bruzd.
Tabela 8.
Właściwości konformacyjne dwuniciowych struktur A-RNA, B-DNA i Z-DNA.
Parametry strukturalne
Skrętność
Typ parowania zasad
Konformacja reszty cukrowej
A-RNAa)
B-DNAa)
Z-DNAb)
prawa
Watsona-Cricka
C3'-endo
P = 14o
anti
 = 194o
prawa
Watsona-Cricka
C2'-endo
P = 154o
anti
 = 262o
330o
136o
31o
144o
219o
200o
33,8 Å
lewa
Watsona-Cricka
C2'-endo dla dC
C3'-endo dla dG
 = 206o anti dla dC.
 = 59o syn dla dG
dC
dG
220o
52o
223o
179o
o
51
186o
o
138
95o
o
263
256o
o
82
295o
45 Å
10
12
36o
3,38 Å
-4o
~ 0,0 Å
-11o dla dC -49o dla dG
3,7 Å
-7o
~ 0,0
11,7 Å
8,5 Å
2,0 Å
13,8 Å
5,7 Å
7,5 Å
8,8 Å
3,7 Å
Kąt wokół wiązania N-glikozydowego
Kąty torsyjne
298o
(O3' - P - O5' - C5')
180o
(P. - O5' - C5' - C4')
47o
(O5' - C5' - C4' - C3')
83o
(C5' - C4' - C3' - O3')
208o
(C4' - C3' - O3' - P)
286o
(C3' - O3' - P - O5')
Skok helisy (wysokość jednego
30.9 Å
skrętu)
Liczba nukleotydów na jeden
11
skręt
Parametry helikalne
33o
 (Twist)
Dz (Rise)
2.81 Å
19o
 (Inclination)
dx (x-Displacement)
-4,8 Å
Duża bruzda
szerokość
2,7 Å
głębokość
13,5 Å
Mała bruzda
szerokość
11,0 Å
głębokość
2,8 Å
a)
na podstawie badań dyfrakcyjnych włókien RNA i DNA233,317.
b)
dla struktury poli[d(GC)]316.
51
A-RNA
Rys. 41.
B-DNA
Z-DNA
Struktury dupleksów A-RNA, B-DNA i Z-DNA na przykładzie modeli 16-merów o sekwencjach
r(CG)8,, d(CG)8 i d(CG)8.
W dupleksach A-RNA (rys. 41), pierścienie cukrowe występują w konformacjach typu
North (C3'-endo), natomiast w B-DNA przyjmują strukturę typu South (C2'-endo). Te różnice
w konformacjach cukru wymuszają zmiany orientacji pierścieni zasad względem osi
dupleksów. W strukturze A-RNA, heterocykliczne pierścienie zasad leżą pod kątem do osi
helisy i są znacznie od niej odsunięte o około 4 Å. W wyniku takiej orientacji tworzy się
wewnętrzny kanał, który biegnie wzdłuż osi dupleksu A-RNA. W przypadku B-DNA, oś
dupleksu przechodzi przez sparowane zasady, które leżą prawie prostopadle do niej. W
wyniku innej orientacji zasad w obu dupleksach, średnica helisy A-RNA jest większa niż
B-DNA. Ponadto, na jeden skręt helisy w strukturze B-DNA przypada tylko 10 zasad,
natomiast w A-RNA 11 zasad. Skok helisy A-RNA jest nieznacznie mniejszy niż w
przypadku B-DNA i wynosi 33 Å, natomiast w DNA 34 Å.
Istotną różnicą obu form A-RNA i B-DNA jest wielkość tzw. dwóch bruzd (rowków),
które występują na powierzchni dupleksów i owijają się spiralnie wokół podłużnej osi.
Bruzdy te przebiegają równolegle do łańcucha fosforodiestrowego. W przypadku podwójnego
heliksu typu B-DNA jedna z bruzd, o szerokości ok. 12 Å, nazywana jest większą druga zaś, o
szerokości ok. 6 Å - mniejszą. W strukturze A-RNA, duża bruzda jest wąska i głęboka,
natomiast mała bruzda, szeroka i płytka (rys. 42).
W warunkach dużego stężenia soli, dla cząsteczek RNA i DNA z powtarzającymi się
parami CG, zachodzi przejście z prawoskrętnych struktur typu A-RNA (lub B-DNA) do
52
struktur lewoskrętnych Z-RNA (Z-DNA) (rys. 41). Właściwości konformacyjne lewoskrętnej
formy Z-DNA przedstawione zostały w tabeli 8.
 mała bruzda
 duża bruzda
 mała bruzda
B-DNA
Rys. 42.
Duża i mała bruzda w strukturach
sekwencjach r(CG)8, i d(CG)8.
A-RNA
dupleksów A-RNA, B-DNA na przykładzie 16-merów o
53
III. OMÓWIENIE WYNIKÓW BADAŃ WŁASNYCH
III.1. Część eksperymentalna.
III.1.1. Opis próbek r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2.
Dupleksy r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2 otrzymane zostały przez dr E. Białą i
dr J. Mileckiego. Heksamer r(CGCGCG)2 był syntetyzowany metodą fosfotriestrową w
roztworze318. Modyfikowany oligomer otrzymano drogą zautomatyzowanej syntezy
chemicznej na podłożu stałym stosując metodę fosforynoamidową17. Jednostki nukleozydowe
potrzebne w syntezie 2'-O-Me(CGCGCG)2 otrzymane zostały przez metylowanie grupy
2'-hydroksylowej odpowiednio blokowanych nukleozydów diazometanem wobec SnCl2 i
późniejszy rozdział chromatograficzny izomerów. W przypadku guanozyny, izomery
rozdzielano poprzez 5',3'-O-disililową pochodną. Dodatkowo otrzymano jednostkę
2'-O-metylocytydyny znaczoną 13C na grupie metylowej przez metylowanie wzbogaconym
izotopowo jodkiem metylu 5',3'-O-disililowej pochodnej cytydyny17. Ogółem uzyskano 100
jednostek O.D. r(CGCGCG)2 i 150 jednostek O.D. 2'-O-Me(CGCGCG)2 o naturalnym
składzie izotopowym oraz 20 jednostek O.D. modyfikowanego dupleksu z znakowanymi
grupami 2'-O-metylowymi reszt cytydynowych C1 (100% wzbogacenia) i C3 (50%
wzbogacenia).
Oligorybonukleotydy były trzykrotnie liofilizowane z buforem D2O (99,8%) zawierającym
150 mM NaCl, 10 mM fosforanu sodu i 1 mM EDTA, a następnie rozpuszczone w D2O
(99,98%, 0,6 ml). Końcowe stężenie badanych próbek wynosiło 2 mM dla r(CGCGCG)2 i 3
mM dla 2'-O-Me(CGCGCG)2. W celu analizy sygnałów wymienialnych protonów, po
wykonaniu wszystkich widm 1H, 31P i 13C NMR w D2O, próbki były ponownie liofilizowane,
a następnie rozpuszczone w H2O/D2O w stosunku 9:1 przy pH 6,5. W celu uzyskania
poprawnej asocjacji w strukturach dupleksów, przed każdą serią pomiarową w D2O i
H2O/D2O, próbki były grzane do temperatury 95oC i powoli chłodzone w czasie 6 godzin do
temperatury pokojowej.
III.1.2. Stosowane techniki spektroskopii 1H, 13C, 31P oraz 29Si NMR.
III.1.2.A.Widma NMR blokowanych monomerów.
Wszystkie widma blokowanych nukleozydów otrzymane zostały na spektrometrze Varian
UNITY 300 w temp. 22oC w DMSO-d6 lub w CDCl3 i przetwarzane za pomocą programu
VNMR(Varian) na stacji roboczej SparcStation 1+ firmy Sun Microsystem.
Jednowymiarowe widma 1H NMR wykonane zostały przy szerokości spektralnej (ang.
spectral width) sw = 4,2 kHz, czasie akwizycji (ang. acquisition time) at = 3,9 s. W celu
uzyskania lepszego stosunku sygnałów do szumów, akumulowanych było 128 spójnych
rejestracji (ang. scans, transitions) sygnałów swobodnej precesji (ang. FIDs). Sygnały te
zawierały 16K (1K=1024) zespolonych punktów pomiarowych (ang. complex points).
Końcowa rozdzielczość (ang. digital resolution) widm wynosiła 0,25 Hz/punkt.
W dwuwymiarowych eksperymentach COSY182 stosowano sekwencję impulsów d1-/2t1-/2-t2. Zastosowano 8-stopniowy cykl fazowy w celu rozdzielenia ujemnych i dodatnich
modulacji częstotliwości w kierunku F1 i usunięcia kwadraturowych odbić (ang. quadrature
images)319 . Szerokość spektralna w obu kierunkach wynosiła 4204 Hz, czas akwizycji at =
0,24 s, czas d1, potrzebny na relaksację układu (ang. relaxation delay) wynosił 2 s. Każdy
sygnał swobodnej precesji był sumą 32 spójnych rejestracji i składał się z 1K zespolonych
54
punktów pomiarowych. Ogółem zebrano 256 sygnałów dla różnych, liniowo zmieniających
się czasów ewolucji (ang. evolution time) t1. W celu uzyskania lepszej rozdzielczości w
kierunku t1 zastosowałem metodę dokładania zer (ang. filling zero) do interferogramów
otrzymanych po pierwszej transformacji Fouriera (FT). W efekcie tego, końcowa
dwuwymiarowa macierz zawierała 1K x 1K punktów rzeczywistych (ang. real points).
Komputerowa rozdzielczość widm wynosiła 4,1 Hz/punkt w obu kierunkach częstotliwości
F1 i F2. W celu usunięcia szumów ciągnących się wzdłuż kierunku F1 (ang. f1 noise), widma
były symetryzowane.
Widma 29Si NMR zebrane były przy częstotliwości 59,6 MHz. W eksperymentach
zastosowano 30o impuls częstotliwości radiowej (rf). Szerokość spektralna (sw) wynosiła
8156 Hz, czas akwizycji at = 2,0 s, czas oczekiwania d1 = 3 s. Końcowe sygnały swobodnej
precesji były sumą około 12 000 spójnych rejestracji (ang. scans) i zawierały 16K
zespolonych punktów pomiarowych. W czasie zbierania danych, w drugim kanale
częstotliwości, włączona była sekwencja WALTZ320 w celu zlikwidowania
heteronuklearnych sprzężeń jąder atomów krzemu z protonami. Rozdzielczość widm
wynosiła 0,5 Hz/punkt.
III.1.2.B. Widma NMR dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2.
Widma dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2 wykonane były na spektrometrze
Varian UNITY+ 500 w Pracowni NMR Politechniki Gdańskiej kierowanej przez
dr P. Sowińskiego oraz w naszej Pracowni, na spektrometrze Varian UNITY 300. Wszystkie
zebrane dane eksperymentalne przetwarzałem za pomocą programu FELIX/NMRchitect
(Molecular Simulation) na stacji roboczej SGI Iris Indigo 2 oraz wykorzystując program
VNMR(Varian) na stacji SparcStation 1+.
Jednowymiarowe widma 1H NMR (500 MHz, D2O) wykonane zostały przy szerokości
spektralnej sw = 3,7 kHz, czasie akwizycji at = 4,4 s, czasie oczekiwania d1 = 2 s w temp. 30,
45 i 60oC. W okresie przygotowawczym (oczekiwania) d1, sygnał HOD był naświetlany
(małą mocą) pojedynczą częstotliwością rezonansową. Eksperymenty były wykonywane z
włączonym i wyłączonym generatorem częstotliwości rezonansowej jąder 31P. Końcowe
sygnały w domenie czasu zawierały 16K zespolonych punktów pomiarowych, które zebrane
zostały w 64 spójnych rejestracjach. W trakcie obróbki danych, resztkowy sygnał HOD
usuwałem metodą liniowej ekstrapolacji LP321. Przed transformacją Fouriera stosowałem
apodyzację sygnałów sinusoidalną funkcją przesuniętą w fazie o 20o. Dzięki temu
otrzymywałem znaczne zwężenie wszystkich linii spektralnych. Po transformacji FT
przeprowadzałem korektę linii bazowej za pomocą funkcji wielomianowej. Końcowa
rozdzielczość widm wynosiła 0,22 Hz/punkt i 0,11 Hz/punkt, w zależności od metody filling
zero.
Jednowymiarowe widma 1H NMR (500 MHz, 90% H2O/10% D2O) dla dupleksów
r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2 wykonane zostały przy szerokości spektralnej sw = 5,8
kHz, czasie akwizycji at = 2,8 s i czasie oczekiwania d1 = 2 s, w temperaturach -3, 0 i 10oC.
Sygnały swobodnej precesji były zebrane z 64 spójnych rejestracji i zawierały 16K
zespolonych punktów pomiarowych. Silny sygnał wody był tłumiony w trakcie eksperymentu
za pomocą gradientowych impulsów metodą WATERGATE322. W trakcie obróbki danych,
nie całkowicie wygaszony sygnał wody usuwałem metodą LP321. W celu zwiększenia
rozdzielczości zastosowałem metodę filling zero. Końcowa rozdzielczość widm wynosiła
0,18 Hz/punkt. W temperaturach -3 i 0 oC wykonane zostały dodatkowe eksperymenty, w
których sygnał wody tłumiony był metodą nasyceniową (ang. presaturation) lub metodą jump
and return323. W tych eksperymentach, częstotliwość generatora ustawiona była na rezonans
HOD. Szerokość spektralna wynosiła około 10 kHz, czas akwizycji at = 1,6 s, czas
55
oczekiwania d1 = 2 s. Końcowa rozdzielczość widm po zastosowaniu metody filling zero
wynosiła 0,63 Hz/punkt.
Jednowymiarowe widma 1H NMR (300 MHz, D2O) wykonałem dla szerokości spektralnej
sw = 2,6 kHz, z czasem akwizycji at = 3,2 s i z czasem oczekiwania d1 = 2 s, w zakresie
temperatur od 0o do 95oC, z odstępem 5oC. Każdy sygnał swobodnej precesji zawierał 8K
zespolonych punktów pomiarowych zebranych z 64 spójnych rejestracji. Po transformacji FT
i zastosowaniu metody filling zero, końcowa rozdzielczość widm wynosiła 0,16 Hz/punkt. W
tym samym zakresie temperatur, dla obu dupleksów wykonałem widma w H2O/D2O. Do
wygaszenia silnego sygnału rozpuszczalnika zastosowałem metodę jump and return323.
Dwuwymiarowe, fazoczułe widma NOESY216 (500 MHz, D2O) dupleksów r(CGCGCG)2 i
2'-O-Me(CGCGCG)2 wykonane były metodą States'a188 w temp. 30oC. Zastosowano
standardową sekwencję impulsów d1-/2-t1-/2-m-/2-t2 z 16-stopniowym cyklem fazowym
dla trzech czasów mieszania (ang. mixing times) m = 80, 150 i 300 ms. W trakcie akwizycji
danych włączony był generator odsprzęgający częstotliwością rezonansową jąder 31P.
Akumulowane z 32 przebiegów sygnały swobodnej precesji zawierały 1K zespolonych
punktów pomiarowych. Dla każdego widma 2D-NOESY zebrano 512 zespolonych sygnałów
swobodnej precesji dla różnych wartości czasów ewolucji t1. Szerokość spektralna w obu
kierunkach wynosiła około 3,7 kHz , czas akwizycji at = 0,28 s, czas oczekiwania d1 = 2,5 s.
W okresie mieszania i akwizycji danych włączony był generator odsprzęgający
częstotliwością rezonansową 31P. W czasie obróbki danych, resztkowy sygnał HOD
usuwałem metodą LP321. W obu kierunkach t1 i t2 zastosowałem apodyzację funkcjami
sinusoidalnymi przesuniętymi w fazie. Po pierwszej transformacji FT, dokonywałem korekty
linii bazowych za pomocą
funkcji wielomianowej. Przed drugą transformacją FT
324
zastosowałem metodę Ottinga w celu zminimalizowania szumów ciągnących się wzdłuż t1.
Stosując metodę filling zero, końcowa dwuwymiarowa macierz zawierała 1K x 1K
elementów. Rozdzielczość widm wynosiła 3,6 Hz/punkt w obu kierunkach.
Sekwencję impulsową d1-/2-t1-/2-m-/2-t2 z 16-stopniowym cyklem fazowym
zastosowałem również w fazoczułych eksperymentach 2D-NOESY wykonanych przy
częstotliwości 300 MHz w temperaturze 22oC. Dla każdego dupleksu wykonałem 7 widm z
czasami mieszania m = 20, 50, 100, 150, 200, 300 i 500 ms. Szerokość spektralna wynosiła
2,6 kHz , czas akwizycji at = 0,4 s, czas oczekiwania d1 = 2,5 sek. Akumulowane z 128
przebiegów sygnały zawierały 1K zespolonych punktów pomiarowych. Dla każdego widma
2D-NOESY zebrano 512 zespolonych sygnałów swobodnej precesji dla różnych czasów t1.
Po obróbce danych pomiarowych, końcowa macierz zawierała 1K x 1K elementów.
Rozdzielczość widm wynosiła 2,5 Hz/punkt w obu kierunkach. Dodatkowo wykonałem
widma ROESY z czasem m = 200 ms. Pozostałe parametry akwizycyjne oraz stosowane
metody obróbki tych widm były takie same jak w przypadku widm 2D-NOESY.
Dwuwymiarowe, fazoczułe widma NOESY (500 MHz, 90% H2O/10% D2O) dupleksów
r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2 wykonane były metodą States'a w temperaturach 0 i
10oC, z czasem mieszania m = 200 ms. W trakcie eksperymentów zebranych zostało 4K
zespolonych punktów pomiarowych w kierunku t2 i 360 zespolonych punktów w kierunku
t1. Sygnał wody tłumiony był sekwencją gradientowych impulsów zastosowaną w metodzie
WATERGATE322. Szerokość spektralna w obu kierunkach wynosiła ok. 3,7 kHz, czas
akwizycji at = 2,5 s, czas oczekiwania d1 = 2,5 s. W czasie obróbki danych, w domenie czasu,
sygnał wody usuwałem przez dekonwolucję i liniową ekstrapolację321. Stosując metodę filling
zero, końcowa dwuwymiarowa macierz zawierała 1K x 1K elementów. Korektę linii bazowej
widm przeprowadziłem przez jej aproksymację funkcją wielomianową. Końcowa
rozdzielczość wynosiła 1,4 Hz/punkt w kierunku F2 i 5,7 Hz/punkt w kierunku F1.
56
Wysokorozdzielcze, dwuwymiarowe, fazoczułe widma DQF-COSY185 (500 MHz, D2O)
wykonane zostały metodą States'a188, z szerokopasmowym odsprzęganiem częstotliwością
31
P oraz bez odsprzęgania, w temp. 30oC. W celu uzyskania bardzo dużej rozdzielczości,
szerokość spektralna w obu kierunkach była zawężona do zakresów występowania jedynie
sygnałów rezonansowych protonów H1'/H5 oraz H2'/H3'/H4'/H5'/H5''/O-Me (sw = 1,5 kHz).
W dwóch blokach zebrano po 980 sygnałów, które zawierały 2K punktów pomiarowych.
Każdy z tych sygnałów był sumą 48 spójnych przebiegów. W czasie oczekiwania d1 = 2 s,
włączony był generator naświetlający resztkowy sygnał HOD. Czas akwizycji wynosił 1,4 s.
Przy obróbce danych stosowałem potęgową, sinusoidalną funkcję ważącą przesuniętą w fazie
o /8. Stosowana w metodzie filling zero różna ilość zer dokładanych do sygnałów
swobodnej precesji i interferogramów dawała dla każdego eksperymentu dwie końcowe
macierze o wymiarach 4K x 4K i 2K x 8K. Komputerowa rozdzielczość widm w kierunku F2
wynosiła, w zależności od stosowanej metody filling zero, odpowiednio 0,8 i 0,4 Hz/punkt,
natomiast w kierunku F1 0,8 i 1,6 Hz/punkt.
Dwuwymiarowe, fazoczułe widma DQF-COSY185 (300 MHz, D2O) obejmujące cały
zakres spektralny badanych dupleksów wykonałem w temp. 22oC metodę States'a188.
Szerokość spektralna w obu kierunkach wynosiła sw = 2,6 Hz, czas akwizycji at = 0,8 s, czas
oczekiwania d1 = 2 s. W czasie d1 naświetlany był sygnał HOD. Zebranych zostało 2K
zespolonych punktów pomiarowych w kierunku t2 oraz 512 zespolonych punktów w
kierunku t1. W trakcie obróbki danych stosowałem metodę filling zero i apodyzację widm w
obu kierunkach. Końcowa macierz zawierała 2K x 2K punktów. Komputerowa rozdzielczość
widm wynosiła 1,3 Hz/punkt w obu kierunkach.
Wszystkie widma 31P NMR wykonałem na spektrometrze Varian UNITY 300 przy
częstotliwości 121,4 MHz. Rozdzielczość komputerowa widm jednowymiarowych wynosiła
0,9 Hz/punkt. Dwuwymiarowe, 31P-1H J-rozdzielcze widma (ang. J-resolved) wykonane
zostały techniką opisaną przez Gorensteina325. Rozdzielczość widm w kierunku osi
przesunięć chemicznych protonów wynosiła 1,0 Hz/punkt, natomiast w kierunku osi sprzężeń
skalarnych 31P-1H 0,4 Hz/punkt. Dwuwymiarowe, heteronuklearne widma korelacyjne 31P-1H
wykonane zostały techniką COLOC222. Rozdzielczość widm w kierunku osi przesunięć
chemicznych protonów wynosiła 4,5 Hz/punkt, natomiast w kierunku osi przesunięć
chemicznych sygnałów 31P 2,5 Hz/punkt.
Jednowymiarowe widma 13C NMR dupleksów wykonane zostały przy częstotliwości
rezonansowej 75,4 MHz. Końcowe widma otrzymane zostały po około 150 tys. spójnych
rejestracjach, które przed transformacją Fouriera były apodyzowane funkcjami
eksponencjalnymi. Rozdzielczość widm wynosiła 8,0 Hz/punkt.
Dwuwymiarowe widma korelacyjne 13C-1H NMR dupleksów r(CGCGCG)2 i
2'-O-Me(CGCGCG)2 wykonane zostały metodą odwrotnej detekcji przy częstotliwościach
rezonansowych 500 MHz dla protonów i 125,7 MHz dla jąder atomów węgla. Rozdzielczość
widm HSQC i HMQC223 wynosiła 3,9 Hz/punkt w kierunku osi przesunięć chemicznych
protonów i 12,0 Hz/punkt w kierunku osi przesunięć chemicznych 13C.
III.1.3. Metody stosowane w analizie fragmentów
dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2.
strukturalnych
Analizę konformacji pierścieni cukrowych reszt nukleotydowych dupleksów
r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2 przeprowadziłem za pomocą programu PSEUROT
6.2249,250 na podstawie wartości stałych sprzężeń 3JH1'H2', 3JH2'H3' i 3JH3'H4' wyznaczonych z
57
wysokorozdzielczych widm fazoczułych DQF-COSY (500 MHz), szerokopasmowo
odsprzęganych częstotliwością rezonansową 31P. W celu uzyskania jak najwyższej
dokładności wartości tych sprzężeń, odpowiednie sygnały korelacyjne były optymalizowane
funkcjami Lorentza przy użyciu programu FELIX, a następnie symulowane za pomocą
programów SPHINX/LINSHA254 (patrz rozdz. II.4.1.). Dodatkową analizę konformacji
pierścieni rybozy przeprowadziłem na podstawie intensywności sygnałów korelacyjnych
H1'-H2', H1'-H3', H1'-H3' widm 2D-NOESY (500 MHz, m = 80, 150 ms).
Analizę kątów torsyjnych , wokół wiązań N-glikozydowych, przeprowadziłem na
podstawie integracji sygnałów korelacyjnych protonów H6/H8-H1'/H2'/H3' widm 2DNOESY (500 MHz, m = 80, 150 ms), odsprzęganych częstotliwością rezonansową 31P. W
celu uzyskania dokładnych integracji, odpowiednie sygnały były optymalizowane funkcjami
Lorentza. W analizie kątów  wykorzystałem modele cytydyn i guanozyn o różnych
konformacjach pierścieni rybozy (parametr pseudorotacji P zmieniał się od 0o do 360o co 9o,
amplituda pofałdowania  = 30, 35, 40, 45 i 50o) i różnym kącie  (zmieniającym się od -180
do +180o co 10o). Modele te wygenerowane zostały za pomocą minimalizacji energii w polu
siłowym AMBER zawartym w programie DISCOVER (rozdz. II.6.2.). W celu uzyskania
odpowiednich konformacji pierścieni rybozy, wprowadzone były więzy torsyjne na kąty i
(patrz rozdz. II.4.1.). Z pomiarów odległości między protonami przeprowadzonych na
modelach, otrzymałem zależności funkcjne dH6/H8-H1', dH6/H8-H2' i dH6/H8-H3' (patrz. rozdz. III.3)
od kątów pseudorotacji P i kątów . Funkcje te były wykorzystane w dalszym etapie badań
do ustalenia konformacji syn/anti reszt nukleotydowych dupleksów.
Analizę kątów torsyjnych wokół wiązań szkieletu fosforocukrowego przeprowadziłem na
podstawie sprzężeń skalarnych 3JH4'H5', 3JH4'H5'', 3JH5'P , 3JH5''P i 3JPH3'. Wartości sprzężeń
protonów z jądrami 31P badane były na podstawie:
31
 sprzężonych widm P NMR,
 metod J-spektroskopii,
 analizy zmian struktury sygnałów korelacyjnych otrzymanych z wysokorozdzielczych
widm DQF-COSY (500 MHz) z odsprzęganiem i bez odsprzęgania częstotliwością
rezonansową 31P.
Analizę wiązań wodorowych przeprowadziłem na podstawie jedno- i dwuwymiarowych
widm protonowych wykonanych w H2O/D2O.
Temperatury topnienia dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2 wyznaczyłem z
krzywych topnienia, otrzymanych z analizy przesunięć chemicznych protonów H6/H8 i
protonów grup 2'-O-metylowych dla zakresu temperatur 0-95 oC.
III.1.4. Metody stosowane przy generowaniu i udokładnianiu struktur
dupleksów.
Charakterystyczne cechy widm NMR r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2 takie, jak:
3
 bardzo małe wartości stałych sprzężeń JH1'H2',
 silne internukleotydowe efekty NOE pomiędzy protonami H2' i H6/H8,
 wartości przesunięć chemicznych grup iminowych
jednoznacznie wskazywały na typ strukturalny dupleksów, który można było zaklasyfikować
do rodziny A-RNA. Stąd, jako struktury początkowe przyjąłem różne modele prawoskrętnych
form dupleksów, które wygenerowane zostały za pomocą modułu Builder zawartym w
58
pakiecie programowym Insight II (firmy MSI). Zbiory zawierające 15 prawoskrętnych
struktur r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2 o różnych stopniu skręcenia (7, 9, 11, 13 i 15
par zasad na jeden skręt helisy) i różnych odległościach między parami zasad (parametr rise =
2,5, 2,8 i 3,1) oraz struktura kanoniczna A-RNA stanowiły 16 modeli wyjściowych, które
były następnie udokładniane za pomocą algorytmów IRMA i rMD (rozdz. II.6.), zawartych w
programach NMRchitect i DISCOVER. W procesie udokładniania wykorzystane były więzy
odległościowe, które otrzymane zostały z analizy sygnałów korelacyjnych widm 2D-NOESY
(500 MHz, m = 80 i 150 ms) oraz więzy torsyjne wyprowadzone z wartości wicynalnych
sprzężeń skalarnych. Zgodność końcowych struktur z danymi NMR badana była za pomocą
czynników R i parametru Jrms (patrz rozdz. II.6.). Zbieżność struktur otrzymanych po
zastosowaniu metody IRMA oraz końcowych struktur z trejektorji rMD badana była na
podstawie parametru RMSD. Analizę konformacyjną struktur dupleksów przeprowadziłem
za pomocą programu CURVES 5.11 (patrz rozdz. II.7.).
III.2. Analiza NMR substratów i półproduktów w syntezie
chemicznej RNA.
Podstawowym problemem w syntezie chemicznej RNA jest odpowiednie zablokowanie
grupy 2'-hydroksylowej. W naszej Pracowni, najczęściej stosowaną grupą ochronną jest grupa
t-butylodimetylosililowa (tBDMSi) lub grupa triizopropylosililowa (TiPSi). Moim celem, na
tym etapie badań, było rozróżnienie 2'(3')-O-alkilosililowych izomerów 5'-Odimetoksytrytylo-N-blokowanych rybonukleozydów na podstawie widm NMR. Izomery
2'(3')-O-alkilosililowe powstają w trakcie syntezy i ich rozdział oraz identyfikacja ma istotne
znaczenie w dalszej preparatyce chemicznej RNA. Związki te decydują o kierunku łączenia
3'-5' lub 2'-5' reszt nukleotydowych. W przypadku syntezy 2'-O-Me(CGCGCG)2, bardzo
ważne znaczenie miało także rozróżnienie 2'(3')-O-metylowych izomerów blokowanych
nukleozydów.
Aglikon
1
2
3
4
5
6
6
DMTr O
B = N -benzoiloadenyl-9-yl
6
B = N -fenoksyacetyloadenyl-9-yl
H
B = N2-isobutyryloguaninyl-9-yl
H
B = N2-fenoksyacetyloguaninyl-9-yl
B = N4-benzoilocytozyn-1-yl
R2O
B = uracyl-1-yl
B
O
H
O R1
H
a
b
c
d
e
f
Izomer
R1
CH3
H
tBDMSi
H
TiPSi
H
R2
H
CH3
H
tBDMSi
H
TiPSi
Rys. 43. Ogólny wzór strukturalny blokowanych rybonukleozydów.
Ogólny wzór strukturalny 2'(3')-O-alkilosililowych i 2'(3')-O-metylowych izomerów
analizowanych 5'-O-dimetoksytrytylo-N-blokowanych rybonukleozydów przedstawiony
został na rysunku 43. Egzoaminowe funkcje heterocyklicznych zasad blokowane były grupą
benzoilową ( dla C w pozycji N 4 i dla A w pozycji N 6 ), fenoksyacetylową (dla A w pozycji
N6 i G w pozycji N 2) oraz grupą izobutyrylową (dla G w pozycji N 2). Wszystkie widma 1H i
29
Si NMR tych związków, które analizowałem, wykonane zostały na spektrometrze Varian
UNITY 300. Jednowymiarowe widma 1H NMR oraz dwuwymiarowe COSY wykonywane
59
były dla rozdzielonych i oczyszczonych izomerów. Widma 29Si NMR otrzymano dla
rozdzielonych izomerów i dla mieszanin.
Podstawowym kryterium, które pozwala rozróżnić widma izomerów 2' oraz 3' jest
obecność wicynalnych sprzężeń spinowo-spinowych pomiędzy protonami hydroksylowymi a
protonami pierścienia rybofuranozowego. W przypadku 3'-O-blokowanych izomerów są to
sprzężenia z protonami H2', natomiast w drugim izomerze z protonami H3'. W wyniku tych
różnych sprzężeń, w zależności od izomeru, w widmach COSY obserwowane są sygnały
korelacyjne H2'-2'OH bądź H3'-3'OH. Fragmenty widm COSY dwóch izomerów z
zaznaczonymi powyższymi sygnałami przedstawione zostały na rysunkach 44 i 45.
Niestety, ta prosta metoda rozróżniania izomerów nie zawsze jest skuteczna. Ze względu
na szeroko rozumianą wymianę otoczenia chemicznego protonów grup 2'(3')hydroksylowych, ich sygnały rezonansowe często ulegają znacznemu poszerzeniu. Przy
szerokościach linii spektralnych znacznie przekraczających wartości stałych sprzężeń,
dubletowa struktura sygnałów 2'(3')-OH zanika. W takich przypadkach, sygnały korelacyjne
H2'-2'OH oraz H3'-3'OH nie są widoczne. Dlatego też należało znaleźć dodatkowe kryteria,
które pozwalałyby rozróżnić widma dwóch izomerów. Opublikowane wyniki naszej pracy
dotyczącej analizy widm 1H i 29Si NMR dostarczają nowych argumentów na rozróżnienie
2'(3')-O-alkilosililowych oraz 2'(3')-O-metylowych izomerów 5'-O-dimetoksytrytylo-Nblokowanych rybonukleozydów 326.
Tabela 9.
Przesunięcia chemiczne 1H NMR (CDCl3, p.p.m.)
rybonukleozydów o strukturze wskazanej na rysunku 43.
protonów
rybozy
blokowanych
Nukleozyd
H1'
H2'
H3'
H4'
H5'
H5"
OCH3
1a
1b
6.20
6.04
4.46
4.94
4.53
4.11
4.23
4.33
3.54
3.49
3.43
3.33
3.58
3.48
3a
3b
5.88
5.72
4.64
5.19
4.53
4.07
4.19
4.20
3.50
3.55
3.20
3.07
3.63
3.48
5a
5b
6.04
5.97
3.81
4.45
4.47
4.02
4.05
4.32
3.63
3.58
3.56
3.42
3.75
3.45
6a
6b
5.97
5.93
3.79
4.36
4.43
3.97
4.00
4.20
3.57
3.55
3.52
3.39
3.64
3.44
1c
1d
6.11
6.08
5.03
4.78
4.37
4.61
4.29
4.20
3.55
3.53
3.40
3.21
-
2c*
2d*
6.06
6.01
4.88
4.90
4.29
4.51
4.14
4.07
3.34
3.34
3.15
3.15
-
3c
3d
5.72
5.72
5.33
4.88
4.34
4.47
4.23
4.09
3.60
3.54
3.03
3.07
-
3e*
3f*
5.94
5.82
4.75
4.68
4.22
4.28
4.10
4.02
3.23
3.29
3.23
3.19
-
4c*
4d*
5.92
5.77
4.64
4.62
4.18
4.25
4.10
4.00
3.32
3.40
3.22
3.30
-
5c
5d
5.94
6.07
4.32
4.18
4.39
4.38
4.11
4.19
3.61
3.70
3.54
3.34
-
6c
6d
5.96
5.97
4.36
4.17
4.35
4.39
4.11
4.07
3.53
3.60
3.48
3.32
-
* - w DMSO-d6
60
Rys. 44.
Fragment widma COSY [CDCl3, 300 MHz] 2'-O-alkilosililowego izomeru N-blokowanej adenozyny (zwi¹zek 1c, rys. 43) przedstawiający obszar sygnałów
rezonansowych protonów rybozy. Na widmie przedstawiono metodę identyfikowania sygnałów rezonansowych rybozy. Występowanie sygnału korelacyjnego
H3'-3'OH jednoznacznie wskazuje na izomer 2'. Proton H3' oddziaływuje skalarnie z trzema protonami H2', H4' i 3'-OH. Blokada grupy 2'-OH zmniejsza
liczbę sprzężeń skalarnych protonów H2' do dwóch: H1'-H2' i H2'-H3'.
61
Rys. 45.
Fragment widma COSY [CDCl3, 300 MHz] 3'-O-alkilosililowego izomeru N-blokowanej adenozyny (związek 1d, rys. 43) przedstawiający obszar sygnałów
rezonansowych protonów rybozy. Na widmie przedstawiono metodę identyfikowania sygnałów rezonansowych rybozy. Występowanie sygnału korelacyjnego
H2'-2'OH jednoznacznie wskazuje na izomer 3'. Proton H2' oddziaływuje skalarnie z trzema protonami H1', H3' i 2'-OH. Blokada grupy 3'-OH zmniejsza
liczbę sprzężeń skalarnych protonów H3' do dwóch: H2'-H3' i H3'-H4'.
62
Przypisania sygnałów 1H NMR 2'(3')-O-alkilosililowych i 2'(3')-O-metylowych izomerów
5'-O-dimetoksytrytylo-N-blokowanych rybonukleozydów dokonałem na podstawie analizy
widm COSY. Przesunięcia chemiczne protonów pierścieni cukrowych względem
wewnętrznego wzorca TMS podane są w tabeli 9. Zgodnie z regułą Remina i Shugara327
przyjąłem, że prochiralne protony H5'' (pro-R) są bardziej przesłaniane od prochiralnych
protonów H5' (pro-S). Sprzężenia spinowo-spinowe (Tabela 10) wyznaczyłem na podstawie
widm jednowymiarowych. W przypadku silnie sprzężonych układów spinowych,
przesunięcia chemiczne i wartości stałych sprzężeń były sprawdzane przez symulację widm
oraz porównanie ich z widmami eksperymentalnymi.
Przesunięcia chemiczne sygnałów protonów H2' izomerów 2'-O-tBDMSi, badanych w
roztworach CDCl3, są o 0.14 do 0.45 p.p.m. większe w porównaniu do analogicznych
protonowych sygnałów dla izomerów 3'-O-tBDMSi. Efekt ten może być wynikiem zarówno
różnych podstawników w pozycjach 2' i 3' jak również zmian konformacyjnych pierścieni
rybozy.
Z analizy sprzężeń skalarnych wynika, że dla purynowych nukleozydów wartości stałych
sprzężeń 3JH1'H2' są na ogół większe od analogicznych danych dla pirymidynowych,
blokowanych monomerów. Fakt ten może świadczyć o pewnej zależności konformacji
pierścieni cukrów badanych rybonukleozydów od rodzaju zasady. Z eksperymentalnych
danych wynika, że równowaga pierścieni cukrowych purynowych nukleozydów jest silnie
przesunięta w stronę konformacji South, podczas gdy pirymidynowe nukleozydy mają
przeważającą konformację typu North.
Tabela 10. Wartości sprzężeń skalarnych 3JHH (CDCl3,  0,25 Hz) protonów rybozy blokowanych
rybonukleozydów o strukturze wskazanej na rysunku 43.
Nukleozyd
J1'2'
J2'3'
J3'4'
J4'5'
J4'5''
J5'5''
J2'OH
J3'OH
1a
1b
1c
1d
3.9
5.6
5.6
4.9
5.1
5.4
5.0
5.2
~5.0
3.4
3.5
4.1
3.2
4.6
3.0
3.4
4.3
4.0
3.9
3.9
10.6
10.5
10.7
10.6
5.6
6.3
6.0
3.9
-
3a
3b
3c
3d
6.3
7.1
7.6
6.4
5.5
5.7
5.2
5.9
4.3
2.1
1.2
3.2
3.5
2.8
1.7
2.0
3.7
3.1
2.7
3.4
11.6
10.8
10.7
10.7
6.6
?
5.0
1.0
-
5a
5b
5c
5d
<1.0
2.6
1.2
2.7
*
4.8
4.5
5.4
9.2
6.4
7.6
5.9
2.2
2.9
2.1
2.5
2.6
2.9
2.4
2.9
11.4
11.0
11.3
11.0
?
?
?
9.3
-
6a
6b
6c
6d
1.4
4.2
2.9
4.2
5.3
5.1
*
5.1
8.0
5.0
*
5.1
2.0
2.8
2.5
2.4
2.5
2.7
2.5
2.7
11.1
10.9
*
11.0
?
?
?
5.4
-
? - szeroki sygnał,
* - nieoznaczony sygnał.
63
Dodatkowych argumentów, które pozwalają na rozróżnienie izomerów 2' i 3' dostarcza
analiza przesunięć chemicznych sygnałów 1H i 29Si NMR grupy ochronnej tBDMSi (Tabela
11). Dla 2'-O-alkilosililowych izomerów purynowych, sygnały protonów nierównocennych
chemicznie dwóch grup metylowych są przesunięte w stronę niższych częstotliwości i
oddzielone są od siebie o 0,15-0,20 p.p.m. Dla drugich izomerów, te same sygnały metylowe
są znacznie słabiej rozseparowane ( < 0.1 p.p.m.) i posiadają większe wartości przesunięć
chemicznych. W przypadku blokowanych 2'(3')-O-alkilosililowych pirymidynowych
rybonukleozydów sytuacja jest odwrotna.
Przesunięcia chemiczne sygnałów 29Si NMR grup t-butylodimetylosililowych (tBDMSi)
wynoszą podnad 25 p.p.m. dla wszystkich badanych 2'-O-izomerów, natomiast w przypadku
3'-O-izomerów są one poniżej tej wartości. Mimo, że różnica przesunięć chemicznych 29Si
między izomerami 2'(3')-O-alkilosililowymi jest niewielka i wynosi ok. 1 p.p.m., to wartości
29Si są bardzo stabilne i zależą głównie od miejsca położenia grupy ochronnej. Dlatego też
analiza wartości przesunięć chemicznych sygnałów 29Si może dostarczyć dodatkowych
argumentów identyfikujących izomery.
Innym sposobem identyfikowania izomerów jest analiza widm O-acetylowanych
pochodnych. Ze względu na zmianę otoczenia chemicznego oraz struktury elektronowej
cząsteczki, acetylowanie powoduje bardzo silne przesunięcie w stronę wyższych
częstotliwości sygnału najbliższego protonu. Analizując widma 2'(3')-O-metylowych
izomerów, można było zaobserwować podobny efekt w przypadku zastąpienia grupy OH
grupą O-metylową. Sygnały H2' dla 2'-O-metylowanych pochodnych są przesunięte w stronę
wyższych wartości przesunięć chemicznych w porównaniu do sygnałów H2' 3'-Ometylowych izomerów. To przesunięcie wynosi ok. 0,5 p.p.m. Sygnały H3' dla 2'-Ometylowanych pochodnych, z tego samego względu, są przesunięte w stronę niższych
wartości przesunięć chemicznych w stosunku do analogicznych sygnałów H3' drugiego
izomeru.
Tabela 11.
Przesunięcia chemiczne 1H i 29Si NMR (CDCl3, p.p.m.) grup tBDMSi blokowanych
rybonukleozydów o strukturze wskazanej na rysunku 43.
Nukleozyd
protony
krzem
tBu
Me' Si
Me" Si
 Me Si
1c
1d
0.844
0.895
-0.002
0.098
-0.146
0.019
0.144
0.079
25.62
24.68
3c
3d
0.853
0.861
0.043
0.038
-0.173
-0.058
0.216
0.096
25.32
24.41
5c
5d
0.940
0.825
0.326
0.048
0.208
-0.075
0.116
0.125
25.83
23.99
6c
6d
0.928
0.853
0.190
0.064
0.163
-0.040
0.027
0.104
25.63
24.62
64
III.3. Analiza widm 1H NMR dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-OMe(CGCGCG) 2 w D2O.
III.3.1. Analiza widm jednowymiarowych 1H NMR.
Jednowymiarowe widma 1H NMR dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2 w D2O
wykonane w temperaturze 30o przedstawione są na rysunku 46. Wszystkie sygnały znajdują
się w zakresie przesunięć chemicznych 3.5-8.1 p.p.m. Wyróżniającą cechą widm
modyfikowanego heksameru jest występowanie sześciu wysokich, stosunkowo wąskich
singletów pochodzących od protonów grup 2'-O-metylowych, które znajdują się w dolnym
zakresie przesunięć chemicznych (3.5-3.9 p.p.m.).
HOD
r(CGCGCG)2
| | |
| |
|
+
+
+
8.0
|| |
+ +
+
7.5
7.0
6.5
6.0
6 protonów
5.5
5.0
4.5
9 protonów
H6/H8
4.0
ppm
30 protonów
H5/H1'
H2'/H3'/H4'/H5'/H5''
2'-O-Me
2'-OMe(CGCGCG)2
HOD
|
|
+
||
| ||
||
+ +
8.0
++
+
7.5
7.0
6 protonów
6.5
6.0
5.5
9 protonów
H6/H8
Rys. 46.
H5/H1'
1
31
5.0
4.5
4.0
ppm
48 protonów
H2'/H3'/H4'/H5'/H5''/(O-Me)
Widma H{ P} NMR dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2 w D2O [500 MHz, 30oC].
Sygnał HOD redukowany był w domenie czasu metodą liniowej ekstrapolacji LP321. Dla każdego
widma, przed transformacją Fouriera sygnał swobodnej precesji apodyzowano funkcją sinusoidalną
przesuniętą w fazie o 20o w celu uzyskania wąskich sygnałów rezonansowych. Po FT
przeprowadzono korektę linii bazowej za pomocą funkcji wielomianowej. W widmach zaznaczone są
dublety pochodzące od protonów H6 i H5 trzech cytydyn C1, C3 i C5 (+) oraz sygnały H8 i H1' (|).
Pod widmami zaznaczono zakresy występowania sygnałów absorpcyjnych oraz podano liczbę
protonów, których sygnały rezonansowe znajdują się w danym regionie.
65
Brak sygnałów o wartościach przesunięć chemicznych mniejszych niż 3,8 p.p.m. odróżnia
widma RNA od DNA. W widmach kwasów dezoksyrybonukleinowych sygnały protonów
H2', H2'' i grup metylowych reszt tyminowych znajdują się poza tym zakresem, w obszarze o
mniejszej częstotliwości rezonansowej. Obecna w strukturach RNA elektroujemna grupa
hydroksylowa w pozycji C2' powoduje przesunięcie sygnału H2' w kierunku pasm
rezonansowych H3', H4', H5' i H5''. W efekcie zmian ekranowania protonów dochodzi do
silnego zagęszczenia sygnałów w widmach RNA w obszarze spektralnym 3,8-5,2 p.p.m.
Analiza tego obszaru widm 1H NMR cząsteczek RNA jest najtrudniejsza.
Jak dotąd nie dokonano jednoznacznych przypisań wszystkich sygnałów 1H NMR
dupleksu r(CGCGCG)2, a tym samym nie została ustalona dokładnie jego struktura. Obecność
powtarzającego się motywu strukturalnego sparowanych zasad (CG) powoduje dodatkowe
zagęszczenie sygnałów rezonansowych. Zakładając regularną strukturę typu A-RNA, różnice
ekranowania jąder magnetycznych atomów reszt C3 i C5 stają się minimalne. Podobna
sytuacja, przy tym samym założeniu, odnosi się również do jednostek nukleotydowych G2 i
G4.
Z danych literaturowych9,10 wynika, że w sposób jednoznaczny zidentyfikowano tylko
pasma protonów H1', H2' oraz protonów zasad heksameru r(CGCGCG)2. Dotychczas nie
przeprowadzono żadnych badań strukturalnych dupleksów, w których wszystkie pozycje
2'-OH są blokowane grupami 2'-O-metylowymi. Jak wynika z badań 1H NMR substratów
stosowanych w syntezie badanych RNA (rozdz. III.2.) oraz z wcześniejszych prac
dotyczących monomerów326, obecność 2'-O-metylowej grupy powoduje silne przesunięcie
sygnału H2' w kierunku niższych częstotliwości. Wstępna analiza widm 1H NMR
r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2 wykazała, że zmiany ekranowania protonów pod
wpływem metylowania są korzystne ze względu na rozseparowanie sygnałów rezonansowych
w silnie zagęszczonym regionie spektralnym protonów rybozy H2'/H3'/H4'/H5'/H5''. Dlatego
analizę spektralną 2'-O-Me(CGCGCG)2 przeprowadziłem w pierwszej kolejności. Jednakże w
celu porównania obu struktur, opis badań i ich wyników przedstawiłem równolegle.
W widmach 1H NMR sygnały rezonansowe obu heksamerów koncentrują się w trzech
charakterystycznych dla RNA zakresach spektralnych (rys. 46). Pasma protonów zasad
H6/H8 oraz H5/H1' znajdują się w dwóch regionach 7,5-8,1 p.p.m. i 5,2-6,1 p.p.m. W tych
zakresach sygnały rezonansowe są stosunkowo dobrze rozdzielone. Z analizy
jednowymiarowych widm można było wydzielić dublety protonów H5 i H6 cytydyn C1, C3,
C5, które mają charakterystyczne stałe sprzężenia 3JH6H5 = 7,5 Hz. Na widmach zaznaczone
są one krzyżykiem (rys. 46). Charakterystyczne, nierównomierne rozmieszczenie sygnałów
H5 i H6 w widmach 1H NMR obu dupleksów RNA można wytłumaczyć wpływem prądów
pierścieniowych elektronów. W przypadku cytydyn C3 i C5, efekt stereochemiczny
związany jest z dwoma heterocyklicznymi pierścieniami sąsiednich guanozyn, znajdujących
się zarówno po stronie 3' i 5'. Protony H5 i H6 krańcowej cytydyny C1 znajdują się
natomiast tylko w jednym stożku przesłaniania przez sąsiednią zasadę G2. Stąd sygnały te są
bardziej przesunięte w kierunku większych wartości przesunięć chemicznych niż analogiczne
pasma cytydyn C3 i C5.
Rozmieszczenie sygnałów H8 guanozyn G2, G4 i G6, które znajdują się w obszarze
dużych częstotliwości, jest podobne. Proton jednej reszty guanozynowej jest bardziej
odsłaniany od dwóch pozostałych protonów H8, których sygnały rezonansowe położone są
bardzo blisko siebie. Wszystkie sygnały H8 mają postać singletową (rys. 46). Zakładając
analogiczny, jak w przypadku cytydyn efekt stereochemiczny, odseparowany sygnał H8
przypisałem wstępnie terminalnej guanozynie G6. Takie przypisanie nie zgadzało się jednak
z danymi Haasnoota dla dupleksu r(CGCGCG)29,10 i nie zostało potwierdzone w trakcie
66
dalszej analizy widm badanych związków. Z przeprowadzonych analiz widm 1H NMR i 13C
NMR wynika, że efekt przesłaniana jąder guanozyn przez pierścienie sąsiednich zasad nie
jest tak silny, jak w przypadku cytydyn.
Sygnały H1' znajdują się w środkowym obszarze widm 1H NMR w zakresie 5,2 - 6,1
p.p.m. (rys. 46). W temperaturze 30 oC, pasma protonów anomerycznych są singletami z
wyjątkiem jednego, który wykazuje niewielkie rozszczepienie z stałą sprzężenia o wartości
ok. 2 Hz. Brak charakterystycznego rozszczepienia sygnałów H1' jest wynikiem małych
wartości stałych sprzężeń spinowo-spinowych 3JH1'H2'. Z uwagi na stosunkowo długie czasy
relaksacji T2 oraz wąskie linie spektralne, sprzężenia te nie mogą być większe niż 3 Hz.
Bardziej szczegółowa analiza sprzężeń skalarnych przedstawiona jest w rozdziale III.8.1.
Singletowa postać sygnałów H1' wskazuje na konformację North pierścieni cukrowych.
Forma ta występuje w strukturach typu A-RNA. Obserwowane małe rozszczepienie jednego
sygnału H1' może oznaczać istnienie pewnej nieznacznej domieszki konformacji South, która
znajduje się w równowadze termodynamicznej z konformacją North. Zjawisko to najczęściej
zachodzi na terminalnych resztach nukleotydowych i związane jest z topnieniem końców
dupleksów. Jak wykazała dalsza analiza widm, w obu badanych strukturach, rozszczepiony
sygnał protnu H1' pochodzi tylko od końcowej reszty G6. Efekt topnienia dupleksów na
końcu C1 nie jest obserwowany. Fakt ten potwierdza moją wcześniejszą obserwację, z której
wynika, że w blokowanych nukleozydach purynowych cukry mają większą tendencję do
przyjmowania konformacji South niż w jednostkach pirymidynowych (patrz. rozdz. III.2.).
W widmie 1H NMR dupleksu r(CGCGCG)2 (rys. 46), w wąskim obszarze spektralnym
3,5 - 4,8 p.p.m. występuje bardzo silne skupisko sygnałów absorpcyjnych
H2'/H3'/H4'/H5'/H5'' pochodzących od 30 protonów. W widmach dupleksu
2'-O-Me(CGCGCG)2, w pobliżu tego obszaru, pojawiają się dodatkowe pasma singletowe,
które wyróżniają się szczególnie dużą intensywnością. Zostały one zinterpretowane jako
sygnały pochodzące od protonów grup 2'-O-metylowych, z uwagi na kształt sygnałów oraz
obszar występowania. Sygnały te, oczywiście nie występują w protonowych widmach NMR
macierzystego dupleksu r(CGCGCG)2 (rys. 46). Duża amplituda sygnałów protonów grup
2'-O-metylowych ułatwia ich detekcję metodami jądrowego rezonansu magnetycznego.
Sygnały absorpcyjne protonów tych grup można było zarejestrować już przy bardzo małych
stężeniach próbki, rzędu 0,1 mM. Zastosowanie nierównomiernego wzbogacenia izotopem
13
C grup 2'-O-metylowych w pozycjach C3 (50%) i C5 (100%) umożliwiło mi jednoznaczne
przypisanie dwóch sygnałów, pochodzących od tych reszt nukleotydowych, na podstawie ich
integracji. Przypisania wszystkich sygnałów dokonałem na podstawie dwuwymiarowych
widm NOESY, wykonanych dla próbek o naturalnym składzie izotopowym.
W multiprotonowym paśmie absorpcyjnym protonów H2', H3', H4', H5', H5'' występuje
niepożądany sygnał rezonansowy niezdeuterowanej całkowicie wody, którego niekorzystny
wpływ minimalizowałem przez odpowiedni dobór temperatury roztworu. W widmach 1H
NMR wykonanych w temperaturze 30 oC, pasmo HOD znajduje się poza sygnałami (w
przypadku macierzystego RNA) lub pomiędzy sygnałami pierścieni cukrowych (dla
metylowanego dupleksu). Najwęższe linie spektralne i najkorzystniejsze z punktu widzenia
analizy widm dupleksów obserwowałem w temperaturach 40 - 45 oC. Niestety, w tym
zakresie temperatur, pasmo HOD przesłaniało znaczną część sygnałów rezonansowych
rybozy. W temperaturach niższych niż 22 oC, sygnał HOD znajdował się poza zakresem
H2'/H3'/H4'/H5'/H5''/(O-Me). Jednakże, wraz ze spadkiem temperatury zwiększała się
lepkość roztworu, w wyniku czego wszystkie sygnały rezonansowe niekorzystnie poszerzały
się.
67
III.3.2. Analiza widm dwuwymiarowych 1H NMR.
Zastosowanie metod dwuwymiarowej spektroskopii NMR do badań strukturalnych obu
dupleksów pozwoliło mi dokonać identyfikacji wszystkich sygnałów rezonansowych, których
przypisanie było niemożliwe za pomocą eksperymentów jednowymiarowych.
Pierwszy etap analizy dwuwymiarowych widm 1H NMR obejmował obszar H6/H8H5/H1', w którym sygnały korelacyjne są najlepiej rozdzielone. W widmach DQF-COSY dla
każdego dupleksu w tym regionie obserwowałem trzy, spodziewane ze względu na duże
wartości sprzężeń skalarnych, sygnały korelacyjne H6-H5 cytydyn C1, C3 i C5 (rys. 47).
Przy tych samych częstotliwościach rezonansowych, w wyniku bardzo silnego efektu NOE
pomiędzy protonami H6 i H5 (odległość dH5H6 = 2,45 Å), odpowiednie sygnały korelacyjne o
dużej intensywności występują także w widmach 2D-NOESY (rys. 48, 49, 50).
We fragmentach widm 2D-NOESY (rys. 49, 50) obejmujących obszar H8/H6-H5/H1'
widocznych jest także kilka słabszych sygnałów NOE pochodzących od protonów H6/H8H1'. W oparciu o analizę tych sygnałów wyznaczyłem tzw. "ścieżkę NOE" (ang. path) H1'(iintra- i
1)-H6/H8(i)-H1'(i), która łączy na przemian, w odpowiedniej kolejności, sygnały
internukleotydowe. Ścieżka zaczyna się od intranukleotydowego sygnału H1'(1)-H6(1)
cytydyny C1 i kończy się na sygnale H1'(6)-H8(6) ostatniej reszty G6. Nieprzerwany ciąg tych
sygnałów świadczy o dużej stabilności struktury helikalnej obu dupleksów.
Zoptymalizowane fragmenty widm 2D-NOESY (rys. 49, 50) otrzymałem w wyniku
aproksymacji wszystkich sygnałów korelacyjnych funkcjami Lorentza. Umożliwiły one
dokonanie dokładnych integracji sygnałów, nawet w tych obszarach spektralnych, w których
występowało silne zagęszczenie pasm rezonansowych. Objętości sygnałów odniesione
zostały do uśrednionych wartości wszystkich sygnałów wzorcowych H5-H6 (rys. 51). Z
analizy integracji wynika, że sygnały intranukleotydowe H6/H8(i)-H1'(i) są na ogół większe od
internukleotydowych H6/H8(i)-H1'(i-1). Wynika to z różnic odległości między tymi protonami
w strukturze A-RNA.
W widmach 2D-NOESY obserwowane są również słabe internukleotydowe wzmocnienia
NOE dla protonów H8(i)-H5(i+1), a także sekwencyjne sygnały H6/H8(i)-H6/H8(i+1). Te ostatnie
sygnały znajdują się w pobliżu linii diagonalnej widm 2D-NOESY w zakresie dużych
przesunięć chemicznych (rys. 48). Ich obecność jest dodatkowym potwierdzeniem silnych
oddziaływań warstwowych między zasadami w obu badanych dupleksach.
Sygnały protonów H2' badanych oligomerów r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(GCGCG)2
przypisałem głównie na podstawie szczegółowej analizy widm 2D-NOESY. Możliwość
wykorzystania widm DQF-COSY dla wyznaczenia sygnałów protonów H2' była bardzo
ograniczona ze względu zbyt małą intensywność sygnałów H1'-H2'. W obszarze H5/H1'H2'/H3'/H4'/H5'/H5''/(O-Me) widm DQF-COSY obserwowałem tylko jeden wyraźny sygnał
korelacyjny pochodzący od protonów H1'-H2' guanozyny G6 (rys. 47). Sygnały korelacyjne
protonów H1'-H2' dla pozostałych reszt nukleotydowych, ze względu na małe wicynalne
sprzężenia spinowo-spinowe, były silnie zredukowane. Zidentyfikowane na podstawie widm
dwuwymiarowych pasmo H2' G6 dupleksu 2'-O-Me(CGCGCG)2 znajduje się w obszarze
występowania sygnałów protonów grup 2'-O-metylowych i jest silnie przesunięte o 0,2 p.p.m.
w kierunku niższych częstotliwości rezonansowych w stosunku do analogicznego sygnału
niemodyfikowanego heksameru.
Przypisanie sygnałów protonów H2' pozostałych reszt nukleotydowych przeprowadziłem
na podstawie sygnałów NOE pomiędzy protonami H1'(i)-H2'(i) oraz H6/H8(i)-H2'(i-1) z widm
2D-NOESY. Najsilniejsze sygnały w obszarze H5/H1'-H2'/H3'/H4'/H5'/H5''/(O-Me) (rys. 52,
53) związane są z silnymi intranukleotydowymi oddziaływaniami dipolowymi pomiędzy
68
r(CGCGCG)2
2'-O-Me(CGCGCG)2
F2
(ppm)
F2
(ppm)
3
4.0
4.0
4.5
4.5
5.0
3
5.0
2
2
5.5
5.5
6.0
6.0
H1'-H2'
6.5
6.5
7.0
7.0
1
7.5
C5
7.5
7.0
6.5
6.0
C3
8.0
C1
8.0
1
7.5
C5
C3
8.0
H1'-H2'
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
C1
8.0
F1 (ppm)
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
F1 (ppm)
Rys. 47. Fazoczułe widma DQF - COSY dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2 w D2O [300 MHz, 30oC] .
Na widmach zaznaczono regiony:
1. - H6/H8-H1'/H5
(zaznaczono sygnały H6-H5 cytydyn C1, C3 i C5)
2. - H1'/H5-H2'/H3'/H4'/H5'/H5''/(O-Me)
(zaznaczono sygnał H1'-H2' guanozyny G6)
3. - diagonalny H2'/H3'/H4'/H5'/H5''/(O-Me)
69
3.5
2'-O-Me(CGCGCG)
r(CGCGCG)
Rys. 48. Fazoczułe widma 2D -NOESY (m = 150 ms) dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2 w D2O [500 MHz, 30oC] odsprzęgane częstotliwością rezonansową
31
P. Na widmach zaznaczono regiony:
1. - H6/H8-H1'/H5
2. - H6/H8-H2'/H3'/H4'/H5'/H5''/(O-Me)
3. - H1'/H5-H2'/H3'/H4'/H5'/H5''/(O-Me)
70
a)
b)
Rys. 49. Region H1'/H5-H6/H8 widma 2D-NOESY ( m=150 ms ) dupleksu r(CGCGCG)2 w D2O [500 MHz,
30oC].
a)
Widmo przedstawione w postaci mapy poziomicowej, na którym zaznaczono ścieżkę
H6/H8(i)H1'(i)-H6/H8(i+1) utworzoną przez intranukleotydowe (opisane numerem i nazwą
reszty nukleotydowej) i internukleotydowe sygnały korelacyjne H6/H8-H1'. Silne sygnały
intranukleotydowe H5-H6 zostały obramowane. Nad widmem 2D-NOESY oraz po lewej
stronie naniesiono jednowymiarowe widma 1H NMR.
b)
Zoptymalizowane widmo funkcjami
przedstawione w formie przestrzennej.
71
lorentzowskimi
za
pomocą
programu
FELIX
a)
b)
Rys. 50. Region H1'/H5-H6/H8 widma 2D-NOESY ( m=150 ms ) dupleksu 2'-O-Me(CGCGCG)2 w D2O
[500 MHz, 30oC].
a)
Widmo przedstawione w postaci mapy poziomicowej, na którym zaznaczono ścieżkę
H6/H8(i)H1'(i)-H6/H8(i+1) utworzoną przez intranukleotydowe (opisane numerem i nazwą
reszty nukleotydowej) i internukleotydowe sygnały korelacyjne H6/H8-H1'. Silne sygnały
intranukleotydowe H5-H6 zostały obramowane. Nad widmem 2D-NOESY oraz po lewej
stronie naniesiono jednowymiarowe widma 1H NMR.
b)
Zoptymalizowane widmo funkcjami
przedstawione w formie przestrzennej.
72
lorentzowskimi
za
pomocą
programu
FELIX
A.
B.
NH2
koniec 5'
Względne objętości (integracja) sygnałów korelacyjnych
widm 2D-NOESY (m = 150 ms), które znajdują się w
regionie H6/H8-H5/H1' dla dupleksów:
1. r(CGCGCG)2 (R = H)
2. 2'-O-Me(CGCGCG) 2 (R = CH3)
H
H
O
Sygnał NOE
H6(C1)-H1'(C1)
H1'(C1)-H8(G2)
H8(G2)-H1'(G2)
H1'(G2)-H6(C3)
H6(C3)-H1'(C3)
H1'(C3)-H8(G4)
H8(G4)-H1'(G4)
H1'(G4)-H6(C5)
H6(C5)-H1'(C5)
H1'(C5)-H8(G6)
H8(G6)-H1'(G6)
R=H
0.145
0.045
0.094
0.042
0.092
0.049
0.100
0.044
0.117
0.051
0.169
Objętość
R = CH3
0.137
0.044
0.111
0.064
0.108
0.037
0.091
0.050
0.114
0.036
0.092
H
H
H
-O
N
OH
O
N
O
H
H
O
OR
H
O
N
P
O
N
O
H
NH
H
H
H
H
H
O
OR
H
NH2
O
-O
H
P
O
N
H
H
H
1.054
0.905
1.041
0.030
0.037
0.025
0.994
1.001
1.005
0.025
0.018
0.024
O
N
O
H
H
H
O
OR
H
O
O
O
N
P
N
O
H
NH
H
O
H
H
H
H
O
OR
NH2
N
H
NH2
O
H5(C1)-H6(C1)
H5(C3)-H6(C3)
H5(C5)-H6(C5)
H5(C3)-H8(G2)
H5(C5)-H8(G4)
H5(C5)-H8(G6)
NH2
N
-O
H
P
O
N
H
H
H
O
N
O
H
H
H
O
OR
H
O
O
O
N
P
O
H
koniec 3'
NH
H
H
H
N
O
H
HO
H
N
NH2
H
OR
Rys. 51. Względne objętości sygnałów korelacyjnych w widmach 2D-NOESY (rys. 49, 50) dupleksów
r(CGCGCG)2 (R=H) i 2'-O-Me(CGCGCG)2 (R=CH3) dla czasu mieszania m = 150 ms (A).
Schemat oddziaływań dipolowych odpowiadających tym sygnałom (B).
73
a)
b)
Rys. 52. Fragment widma 2D-NOESY [m = 150 ms, 500 MHz, 30oC] dupleksu r(CGCGCG)2 w D2O
obejmujący region H5/H1'-H2'/H3'/H4'/H5'/H5'' przedstawiony w formie mapy konturowej (a), gdzie
zaznaczono sygnały korelacyjne H1'-H2' (oznaczone prostokątami) oraz linie w kierunku D1 (wzdłuż
przesunięć chemicznych H1') wyznaczające przekroje (ang. slides) widma 2D-NOESY, na podstawie
których przypisane zostały sygnały protonów H2'. Na przekrojach uszeregowanych wg. wartości H1'
zaznaczono położenia sygnałów H2', H3', H4' ( b).
74
a)
b)
Rys. 53. Fragment widma 2D-NOESY [m = 150 ms, 500 MHz, 30oC] dupleksu 2'-O-Me(CGCGCG)2 w D2O
obejmujący region H5/H1'-H2'/H3'/H4'/H5'/H5''/O-Me przedstawiony w formie mapy poziomicowej
(a), gdzie zaznaczono sygnały korelacyjne H1'-H2' (oznaczone prostokątami), ścieżkę sygnałów NOE
H1'(i)-(2'-O-Me)(i)-H1'(i+1) (sygnały internukleotydowe opisane nazwą jednostki monomerycznej)
oraz poziome linie w kierunku D1 (wzdłuż przesunięć chemicznych H1') wyznaczające przekroje
(ang. slides) widma 2D-NOESY, na podstawie których przypisane zostały sygnały protonów H2'. Na
przekrojach (b) uszeregowanych wg. wartości H1' zaznaczono położenia sygnałów H2', H3', H4',
(2'-O-Me)(i), 2'-O-Me)(i-1). Resztkowe sygnały z sąsiedniego przekroju dla słabo rozseparowanych
(w temp. 30oC) sygnałów H1'(G4) i H1'(G2) oznaczone są gwiazdkami (*).
75
a)
b)
Rys. 54.
Fragment widma 2D-NOESY [m = 150 ms, 500 MHz, 30oC] dupleksu r(CGCGCG)2 w D2O
obejmujący region H6/H8-H2'/H3'/H4'/H5'/H5''.
a) Widmo przedstawione w formie mapy poziomicowej. Sygnały protonów H6/H8(i)-H5''(i) zostały
obramowane. Strzałkami zaznaczono przesunięcia chemiczne protonów H6/H8 oraz kierunki,
wzdłuż których wykonano przekroje (profile) widm
b) Przekroje (profile) wzdłuż osi D1 dla przesunięć chemicznych protonów H6/H8. Najwyższe
sygnały profili H8(G2), H6(C3), H8(G4), H6(C5), H8(G6) pochodzą od protonów H2'
sąsiadujących po stronie 5' nukleotydów. Dla profilu H6(C1) ekstremum przypada na nakładające
się sygnały intranukleotydowe H2' i H3'. Na profilach zaznaczono położenia sygnałów H5''.
76
a)
b)
Rys. 55. Fragment widma 2D-NOESY [m. = 150 ms, 500 MHz, 30oC] dupleksu 2'-O-Me(CGCGCG)2 w D2O
obejmujący region H6/H8-H2'/H3'/H4'/H5'/H5''.
a) Widmo przedstawione w formie mapy poziomicowej. Sygnały protonów H6/H8(i)-H5''(i) zostały
obramowane. Na widmie zaznaczono ścieżki:
H6/H8(i)-H3'(i)-H6/H8(i+1) [linią przerywaną]
H6/H8(i)-H2'(i)-H6/H68(i+1) [linią ciągłą]
H6/H8(i)-(2'-O-Me)(i)-H6/H8(i+1) [linią kropkowaną].
Strzałkami zaznaczono przesunięcia chemiczne protonów H6/H8 oraz kierunki, wzdłuż których
wykonano przekroje (profile) widm.
b) Przekroje (profile) wzdłuż osi D1 dla przesunięć chemicznych protonów H6/H8. Najwyższe sygnały
profili H8(G2), H6(C3), H8(G4), H6(C5), H8(G6) pochodzą od protonów H2' sąsiadujących po
stronie 5' nukleotydów. Na profilach zaznaczono sygnały protonów H3'(i-1), H2'(i-1),
(2'-O-Me)(i-1) sąsiadujących po stronie 5' reszt nukleotydowych [zaznaczone mniejszą czcionką z
gwiazdką], oraz sygnały intranukleotydowe protonów H3'(i), H2'(i), (2'-O-Me)(i), H5''(i)
77
r(CGCGCG)2
2'-O-Me(CGCGCG)2
Rys. 56. Diagonalny region sygnałów protonów H2'/H3'/H4'/H5'/H5''/(O-Me) w widmach wysokiej zdolności rozdzielczej DQF-COSY dupleksów r(CGCGCG)2 i
2'-O-Me(CGCGCG)2 w D2O [500 MHz, 30oC] wykonanych z odsprzęganiem pasmem częstotliwości rezonansowej 31P.
Na widmach zaznaczono sygnały korelacyjne protonów:
H5'-H5'' (opisane nad główną przekątną widm)
H2'-H3' i H4'-H3' połączone ze sobą linią ciągłą (opisane pod główną przekątną widm).
78
protonami H1'-H2', natomiast w regionie H8/H6-H2'/H3'/H4'/H5'/H5''/(O-Me) są to
internukleotydowe sygnały protonów H6/H8(i)-H2'(i-1) (rys. 54, 55). Bardzo duża
intensywność tych ostatnich sygnałów jest charakterystyczna dla struktur typu A-RNA9,10.
Obserwowane dodatkowe sygnały NOE pomiędzy protonami H5(i)-H2'(i-1) potwierdzały
poprawność przypisań sygnałów H2'.
Przypisania pasm rezonansowych protonów H3', H4', H5', H5'' dokonałem na podstawie
wysokorozdzielczych widm DQF-COSY (rys. 56) w których można było rozróżnić prawie
wszystkie sygnały korelacyjne protonów H2'-H3', H3'-H4', H4'-H5', H4'-H5'', H5'-H5'', ze
względu na ich odmienną strukturę multipletową. Poprawności przypisań sygnałów protonów
H3', H4', H5', H5'' potwierdzają wyniki analiz:
31 1
13
1
 heterojądrowych widm korelacyjnych P- H i C- H, (rozdz. III.6., III.7. )
 przekrojów widm 2D-NOESY wykonanych wzdłuż wartości przesunięć chemicznych
protonów H1' (rys. 52, 53),
 diagonalnego obszaru H2'/H3'/H4'/H5'/H5''/(O-Me) widm 2D-NOESY (przy m = 20
ms i 50 ms) w którym najbardziej intensywne sygnały NOE pochodzą od par protonów
H5'-H5'' (d = 1.76 Å),
 obszaru H8/H6-H2'/H3'/H4'/H5'/H5''/(O-Me) widm 2D-NOESY (rys. 54, 55);
Identyfikację wszystkich sygnałów grup 2'-O-metylowych dokonałem metodą
sekwencyjnych przypisań. W widmach 2D-NOESY sygnały korelacyjne ścieżek NOE H1'(i)(2'-O-Me)(i)-H1'(i+1) i H8/H6(i)-(2'-O-Me)(i)-H8/H6(i+1) przedstawiłem na rysunkach 53 i 55.
Ponadto, w regionie diagonalnym obserwowałem bardzo silne sygnały intranukleotydowe
pomiędzy H2' a protonami grup 2'-O-metylowych.
III.3.3. Stereospecyficzne przypisania sygnałów H5' i H5''.
W tabelach 12, 13 zestawiłem wartości przesunięć chemicznych H wszystkich
niewymienialnych protonów dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2, zmierzone w
temperaturze 30oC względem sygnału wzorca TMA (3,18 p.p.m.). W tabeli 14 przedstawiłem
różnice przesunięć chemicznych protonów wywołane zmianą podstawnika 2'-OH na 2'-O-Me.
Tabela 12. Wartości przesunięć chemicznych  (p.p.m.) dupleksu r(CGCGCG)2 [D2O, 30oC].
Reszta
C1
G2
C3
G4
C5
G6
H8/H6
8.03
7.82
7.72
7.56
7.58
7.61
H5
6.00
5.31
5.25
-
H1'
5.53
5.80
5.55
5.73
5.50
5.85
H2'
4.57
4.59
4.55
4.51
4.34
4.10
H3'
4.58
4.72
4.56
4.56
4.46
4.29
H4'
4.32
4.51
4.45
4.47
4.39
4.23
H5'
4.02
4.52
4.57
4.50
4.53
4.45
H5''
3.93
4.19
4.15
4.12
4.07
4.05
Tabela 13. Wartości przesunięć chemicznych  (p.p.m.) dupleksu 2'-O-Me(CGCGCG)2 [D2O, 30oC].
Reszta
C1
G2
C3
G4
C5
G6
H8/H6
8.08
7.86
7.75
7.60
7.69
7.58
H5
6.05
5.33
5.27
-
H1'
5.76
6.03
5.73
5.95
5.73
5.95
H2'
4.27
4.28
4.32
4.18
4.08
3.78
H3'
4.61
4.76
4.56
4.57
4.50
4.33
79
H4'
4.27
4.47
4.43
4.42
4.36
4.21
H5'
4.03
4.40
4.40
4.35
4.37
4.26
H5''
3.93
4.20
4.15
4.13
4.08
4.06
OCH3
3.69
3.83
3.67
3.78
3.63
3.53
Tabela 14. Różnice przesunięć chemicznych  (p.p.m.) dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-OMe(CGCGCG)2 [D2O, 30oC].
 =  [dla 2'-O-Me(CGCGCG)2] -  [dla r(CGCGCG)2]
Reszta
C1
G2
C3
G4
C5
G6
H8/H6
+0.05
+0.04
+0.03
+0.04
+0,11
-0.03
H5
+0.05
+0.02
+0.02
-
H1'
+0.23
+0.23
+0.18
+0.22
+0.23
+0.10
H2'
-0.30
-0.31
-0.23
-0.33
-0.26
-0.32
H3'
+0.03
+0.04
0.00
+0.01
+0.04
+0.04
H4'
-0.05
-0.04
-0.02
-0.05
-0.03
0.02
H5'
+0.01
-0.12
-0.17
-0.15
-0.16
-0.19
H5''
0.00
+0.01
0.00
+0.01
+0.01
+0.01
Jak wynika z danych tabeli 14, metylowanie grupy 2'-OH dupleksów RNA o
powtarzających się parach zasad CG powoduje charakterystyczne zmiany wartości przesunięć
chemicznych H określonych grup protonów. Największe różnice obserwowałem, zgodnie z
przewidywaniem, dla protonów H1' i H2'. Zmiany częstotliwości rezonansowych pasm
absorpcyjnych protonów H1' i H2', wywołane metylacją grup 2'-OH mogą wynikać zarówno z
efektów sterycznych jak i zmian rozkładu gęstości elektronowej w najbliższym otoczeniu. W
przypadku pasm rezonansowych protonów H2' jest to efekt diamagnetyczny o wartości ok.
0.3 p.p.m. W przeciwieństwie do nich sygnały H1' przesuwają się w kierunku niższego pola.
Ponieważ zmiany wartości przesunięć chemicznych są obserwowane dla wszystkich
sygnałów protonów H1' i H2', dlatego można było wnioskować, że efekt ten ma charakter
intranukleotydowy.
Pewnym zaskoczeniem były duże zmiany w wartościach przesunięcia chemicznego dla
protonów H5'. Należy przypuszczać, że efekty elektronowe związane ze zmianą podstawnika
2'-OH na 2'-O-Me mają tutaj znacznie mniejsze znaczenie niż w przypadku protonów H1' i
H2'. Głównym źródłem zmian wartości przesunięcia chemicznego protonów H5' jest
prawdopodobnie efekt steryczny, wywołany przez grupy 2'-O-metylowe reszt
nukleotydowych sąsiadujących po stronie 5'. Efekt ten nie wpływa na wartość przesunięcia
chemicznego protonu H5' cytydyny C1. Z przeprowadzonych przeze mnie badań
modelowania komputerowego dupleksu 2'-O-Me(CGCGCG)2 wynika, że grupy 2'-Ometylowe są w bliskim otoczeniu protonów H5'. Nie obserwuję natomiast istotnych zmian
częstotliwości 1H NMR protonów H5''. Są one zbyt oddalone od grup 2'-O-metylowych, co
wynika z modelu opartego o dane eksperymentalne NMR (rys. 57). Opisywany efekt był
podstawą stereospecyficznego przypisania sygnałów nierównocennych chemicznie protonów
H5' i H5'' wszystkich, z wyjątkiem cytydyny C1, reszt nukleotydowych. Tego rodzaju
stereospecyficzne przypisania dla H5' i H5'' odnajdujemy w literaturze bardzo rzadko. Dla
cytydyny C1, gdzie efekt ten nie jest obserwowany, stereospecyficzne przypisania protonów
H5' i H5'' dokonałem na podstawie różnicy w intensywnościach intranukleotydowych
sygnałów NOE pomiędzy protonami H3'-H5' i H3'-H5''.
Różnice wartości przesunięć chemicznych macierzystego i modyfikowanego dupleksu dla
pozostałych protonów są mniejsze niż 0.1 p.p.m. (Tabela 14). Bardzo zbliżone do siebie
wartości Hprotonów zasad H8, H5, H6 mogą wskazywać na duże podobieństwo
oddziaływań warstwowych w badanych oligomerach r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2.
80
2'-O-Me
3.61 Å
H5'
2'-O-Me
3.36 Å
H5''
H5'
H5''
Rys. 57.
Fragment modelu dupleksu 2’-O-Me(CGCGCG)2 przedstawiający internukleotydowy kontakt grup
2'-O-metylowych z protonami H5’. Na rysunku podane są odległości pomiędzy protonami H5' a
jądrami atomów węgla grup 2'-O-metylowych.
81
III.4. Analiza sygnałów 1H NMR wymienialnych protonów
dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2 w
H2O/D2O.
III.4.1. Metodyka.
Protony aminowe, iminowe i hydroksylowe dupleksów RNA szybko wymieniają się z
deuterami rozpuszczalnika D2O i stąd ich sygnały rezonansowe w widmie 1H NMR nie są
obserwowane. Ze względu na istotną rolę, jaką odgrywają protony aminowe i iminowe w
strukturach kwasów nukleinowych, ich identyfikacja i przypisania metodami NMR mogą być
prowadzone tylko wówczas, gdy analizowany oligomer rozpuszczony jest w H2O lub w
innych rozpuszczalnikach, które nie zawierają w dużym stężeniu łatwo wymienialnych
deuterów. W swoich badaniach stosowałem roztwór złożony z 90% H2O i 10% D2O.
Istotnym problemem przy wykonywaniu widm w H2O jest bardzo silny sygnał
rozpuszczalnika. Istnieje kilkanaście metod81 redukowania sygnału wody, z których trzy
wybrałem do swoich badań. Są to:
*
*
*
metoda nasycenia sygnału H2O,
metoda "jump & return"323,
metoda "Watergate"322.
Widma dupleksu 2'-O-Me(CGCGCG)2 wykonane tymi metodami w temp 0oC przy
częstotliwości 500 MHz przedstawiłem na rysunku 58.
Rys. 58.
Widma 1H NMR dupleksu 2'-O-Me(CGCGCG)2 w 90% H2O i 10% D2O [500 MHz, 0oC] wykonane
trzema różnymi technikami wygaszania sygnału rozpuszczalnika:
 metodą nasycania sygnału H2O (a)
 metodą "Watergate" (b)
 metodą "jump & return" (c).
Niecałkowicie wygaszony sygnał wody, przed transformacją Fouriera, usuwany był poprzez
dekonwolucję sygnału wody w domenie czasu oraz za pomocą metody LP321.
82
Z analizy tych widm wynika, że najskuteczniejsze wygaszanie, przy jednocześnie
najmniejszych zakłóceniach w okolicy częstotliwości rezonansowej wody dawała metoda
"Watergate". Stosowane w tej metodzie długie impulsy gradientowe powodowały jednak
tłumienie niektórych sygnałów tych protonów, które szybciej ulegają wymianie z wodą. Ten
niekorzystny efekt dotyczył głównie protonów aminowych guanozyn, oraz wszystkich
wymienialnych protonów terminalnych jednostek nukleotydowych badanych dupleksów.
Jeszcze silniejszy efekt tłumienia sygnałów wymienialnych protonów występował, gdy
stosowałem metodę nasyceniową. W przypadku metody "jump & return" zjawisko to nie
występowało. Niestety, ta ostatnia metoda dawała największe dystorsje linii bazowej widm
oraz największe zakłócenia w regionie sygnału rezonansowego wody. Intensywności
sygnałów nie są proporcjonalne do ilości protonów. Stosowana sekwencja "jump & return"
nastawiona była na sygnały iminowe znajdujące się przy ok. 13 p.p.m. Stąd sygnały te są
nieproporcjonalnie silne w porównaniu do pozostałych widocznych w widmie sygnałów
rezonansowych. W pobliżu częstotliwości wody w zakresie 4.5-5.5 p.p.m. wzbudzenie
rezonansu praktycznie nie było obserwowane. Ponadto w metodzie "jump & return", sygnały
o niższych częstotliwościach rezonansowych niż sygnał wody mają fazy odwrócone w
stosunku do sygnałów znajdujących się po przeciwległej stronie widma (rys. 58). To znacznie
utrudniało poprawne sfazowanie sygnałów w trakcie numerycznej obróbki widm. Ponadto
ujemną cechą metody "jump & return", i stosowanej również metody nasyceniowej, była
konieczność nastawienia generatora impulsów rf na wartość rezonansową wody. Należało z
tego powodu stosować bardzo duże zakresy spektralne (sw), co niekorzystnie wpływało na
rozdzielczość widm i czas trwania eksperymentów NMR, zwłaszcza dwuwymiarowych. W
przeciwieństwie do nich, w metodzie gradientowej "Watergate", częstotliwość generatora
impulsów rf mogła być ustawiona poza rezonansem wygaszanego sygnału wody. Dawało to
możliwość zmniejszenia zakresu spektralnego, a tym samym zwiększenie rozdzielczości
dwuwymiarowych widm NMR bez wydłużania czasu trwania eksperymentu.
W związku z powyższym zastosowałem metodę "Watergate" do wygaszania sygnału wody
w dwuwymiarowych eksperymentach typu 2D-NOESY wykonanych dla roztworów
H2O/D2O dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2. Widma wykonane zostały w
temp. 0o i 10oC, przy częstotliwości 500 MHz, z czasem wymiany m = 200 ms.
W eksperymentach jednowymiarowych stosowałem głównie metodę nasyceniową oraz
"jump & return". Eksperymenty te wykonane były na spektrometrze Varian UNITY 300 w
zakresie temperatur od 0oC do 95oC, co 5oC.
III.4.2. Identyfikacja sygnałów rezonansowych wymienialnych protonów
dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2.
Wszystkie obserwowane sygnały rezonansowe pochodzące od protonów iminowych i
aminowych dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2 przypisane zostały na podstawie
sygnałów korelacyjnych widm 2D-NOESY. Widma te przedstawione są na rysunkach 59 62.
Sygnały rezonansowe protonów iminowych guanozyn są najbardziej odsłonięte i znajdują
się przy 13 p.p.m. Wartość ta jest charakterystyczna dla układów sparowanych zasad CG typu
Watsona-Cricka w strukturach prawoskrętnych dupleksów4. Przy braku wiązań wodorowych
lub przy innym układzie parowań zasad, sygnały rezonansowe iminowych protonów
przesunięte są w stronę mniejszych wartości . O istnieniu wiązań wodorowych świadczą
83
również
cytydyn.
Rys. 59.
1.
2.
3.
4.
5.
-
przesunięcia
chemiczne
sygnałów
rezonansowych
protonów
aminowych
Widmo 2D-NOESY (m = 200 ms) dupleksu r(CGCGCG)2 w H2O/D2O [500 MHz, 10oC]. Sygnał
wody był wygaszany metodą Watergate. Na widmie zaznaczono regiony:
NH1 (diagonalny)
NH1-NH4a/H8/H6/NH4b
NH1-H5/H1'
NH1-H2'/H3'/H4'/H5'/H5''
NH4a/H8/H6/NH4b (diagonalny)
6.
7.
8.
9.
84
-
NH4a/H8/H6/NH4b-H5/H1'
NH4a/H8/H6/NH4b-H2'/H3'/H4'/H5'/H5''
H5/H1'- H2'/H3'/H4'/H5'/H5''
H2'/H3'/H4'/H5'/H5''(diagonalny)
Rys. 60.
Widmo 2D-NOESY (m = 200 ms) dupleksu r(CGCGCG)2 w H2O/D2O [500 MHz, 10oC]
przedstawione w formie zblokowanej. Sygnał wody był wygaszany metodą Watergate.
85
Rys. 61.
1.
2.
3.
4.
5.
-
Widmo 2D-NOESY (m = 200 ms) dupleksu 2'-O-Me(CGCGCG)2 w H2O/D2O [500 MHz, 10oC].
Sygnał wody był wygaszany metodą Watergate. Na widmie zaznaczono regiony:
NH1 (diagonalny)
NH1-NH4a/H8/H6/NH4b
NH1-H5/H1'
NH1-H2'/H3'/H4'/H5'/H5''/O-Me
NH4a/H8/H6/NH4b (diagonalny)
6.
7.
8.
9.
86
-
NH4a/H8/H6/NH4b-H5/H1'
NH4a/H8/H6/NH4b-H2'/H3'/H4'/H5'/H5''/O-Me
H5/H1'- H2'/H3'/H4'/H5'/H5''/O-Me
H2'/H3'/H4'/H5'/H5''/O-Me (diagonalny)
Rys. 62.
Widmo 2D-NOESY (m = 200 ms) dupleksu 2'-O-Me(CGCGCG)2 w H2O/D2O [500 MHz, 10oC]
przedstawione w formie zblokowanej. Sygnał wody był wygaszany metodą Watergate.
87
Bardziej odsłonięte protony, zaangażowane w wiązaniach wodorowych, dają pasma
rezonansowe przy 8,5 p.p.m. Sygnały nie związanych protonów aminowych cytydyn są
natomiast przesunięte w górę pola o ok. 1,5 p.p.m. i znajdują się w obszarze bliskim 7 p.p.m.
(rys. 63).
Tabela 15. Intensywności sygnałów korelacyjnych widm 2D-NOESY [H20/D2O, m = 200 ms, 10oC]
wymienialnych protonów dupleksów r(CGCGCG)2 [A] i 2'-O-Me(CGCGCG)2 [B].
lp.
Sygnał
intensywność
A
lp.
Intensywność
B
Region NH1-NH1
1.
Sygnał
A
B
Region NH4a-H6/H8
H1(G2)-H1(G4)
a
++
+
Region NH1-NH4a
17.
H4a(C1)-H6(C1)c
+
+
18.
H4a(C3)-H6(C3)
c
++
+
H4a(C5)-H6(C5)c
++
+
2.
H1(G2)-H4a(C5)a
++++
++++
19.
3.
H1(G4)-H4a(C3)a
++++
++++
Region NH4a-NH4b
4.
H1(G6)-H4a(C1)a
-
++
Region NH1-NH4b
20.
H4a(C1)-H4b(C1)c
++++
++++
21.
H4a(C3)-H4b(C3)c
+++++
+++++
H4a(C5)-H4b(C5)c
+++++
+++++
5.
H1(G2)-H4b(C5)a
+++
+++
22.
6.
H1(G4)-H4b(C3)a
+++
+++
Region NH4a-H5/H1'
7.
a
-
+
H1(G6)-H4b(C1)
Region NH1-H5/H1'
23.
H4a(C1)-H5(C1)c
+++
+++
24.
H4a(C3)-H5(C3)
c
+++
+++
H4a(C5)-H5(C5)c
+++
+++
8.
H1(G2)-H1'(C3)b
+
+
25.
9.
H1(G2)-H1'(G6)a
++
++
Region NH4b-H6/H8
10.
H1(G2)-H5(C5)a
+
+
26.
H4b(C1)-H6(C1)c
+
+
11.
H1(G4)-H1'(C5)b
+
+
27.
H4b(C3)-H6(C3)c
+
+
12.
H1(G4)-H5(C3)
a
+
+
28.
c
+
+
13.
H1(G4)-H1'(G4)a
+
++
Region NH4b-H5/H1'
Region NH1-H2'/H3'/H4'/H5'/H5''/O-Me
H4b(C5)-H6(C5)
29.
H4b(C1)-H5(C1)c
+++
+++
14.
H1(G2)-2'-OMe(C3)b
*
+
30.
H4b(C3)-H5(C3)c
+++
++++
15.
H1(G4)-2'-OMe(G4)a
*
+
31.
H4b(C5)-H5(C5)c
+++
++++
H1(G4)-2'-OMe(C5)b
*
+
sygnały internukleotydowe dwóch naprzeciwległych nici,
b)
sygnały internukleotydowe, sekwencyjne
c)
sygnały intranukleotydowe.
Aminowe protony cytydyn oznaczone zostały symbolami:
N4a - uczestniczące w wiązaniach wodorowych
typu Watsona-Cricka
N4b - nie uczestniczące w wiązaniach wodorowych
typu Watsona-Cricka.
16.
a)
88
Oznaczenia intensywności
brak sygnału
+
bardzo mała
++
mała
+++
średnia
++++ duża
+++++ bardzo duża
*
nie dotyczy
Przypisania sygnałów wymienialnych protonów poszczególnym jednostkom
nukleotydowym dokonałem na podstawie: intranukleotydowych sygnałów korelacyjnych
obserwowanych w widmach 2D-NOESY (pomiędzy protonami aminowymi a protonami H5)
oraz sygnałów pomiędzy protonami iminowymi NH1 guanozyn a protonami NH2 cytydyn w
obrębie sparowanych zasad dwóch naprzeciwległych nici. Ponadto w widmach 2D-NOESY
obserwowałem szereg dodatkowych sygnałów wzajemnej (krzyżowej) relaksacji, które
zestawione zostały w tabeli 15. Wartości przesunięć chemicznych sygnałów rezonansowych
protonów aminowych cytydyn C1, C3, C5 oraz iminowych guanozyn G2, G4, G6
odpowiadające temp. 10oC zestawione zostały w tabeli 16.
Tabela 16. Wartości przesunięć chemicznych 1H (p.p.m., 10oC) sygnałów protonów iminowych i aminowych.
r(CGCGCG)2
2'-O-Me(CGCGCG)2
NH1
NH4a
NH4b
Reszta
NH1
NH4a
NH4b
Reszta
8.31
7.00
8.34
7.02
C1
C1
13.15
12.92
G2
G2
8.49
6.77
8.68
6.79
C3
C3
12.94
12.72
G4
G4
8.40
6.85
8.59
6.85
C5
C5
12.91
13.03
G6
G6
N4a-protony aminowe cytydyn, które uczestniczą w wiązaniach wodorowych typu Watsona-Cricka.
N4b-protony aminowe cytydyn, które nie uczestniczą w wiązaniach wodorowych typu Watsona-Cricka
NH4a
__________
H6/H8
NH4b
___________
sygnały protonów
aminowych guanozyn
Rys. 63.
H5/H1'
_______
__________
sygnały protonów
aminowych guanozyn
Fragment widma 1H-NMR [500 MHz, temp. -3oC], na którym zaznaczono sygnały aminowe NH4a i
NH4b cytydyn C1, C3 i C5. Dolne kreski oznaczają zakres sygnałów aminowych guanozyn,
zanikających w wyższych temperaturach.
Szerokie sygnały absorpcyjne obserwowane w widmach 1H NMR w temp. 0oC i -3oC (rys.
63) prawdopodobnie pochodzą od protonów aminowych guanozyn. Sygnały te nie zostały
przypisane poszczególnym jednostkom w sekwencji RNA, ze względu na szybką wymianę
tych protonów z wodą. W widmach 2D-NOESY wykonanych w temperaturze 0oC metodą
"Watergate" oraz "jump & return", sygnały protonów aminowych guanozyn nie dawały
żadnych korelacji. Całkowity zanik tych sygnałów zachodzi już w temperaturach około 0oC.
89
Brak pasm protonów aminowych guanozyn powyżej temperatury 10oC jest wynikiem
szybkiej wymiany protonów tych grup z wodą i słabszych wiązań wodorowych.
III.5.
Pomiary temperaturowe dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-OMe(CGCGCG)2.
III.5.1. Analiza temperaturowa
protonów.
sygnałów
NMR
niewymienialnych
Zależne od temperatury zmiany przesunięć chemicznych sygnałów NMR protonów RNA
są charakterystyczne dla przejść typu dupleks - kłębek328. Badania przejść konformacyjnych
dla dupleksu r(CGCGCG)29,13 zostały zapoczątkowane w latach 80-tych . Również badania
zmian przesunięć chemicznych sygnałów protonów anomerycznych i protonów zasad, w
zależności od temperatury, prowadzone były w serii DNA dla d(CGCGCG)2330. Wyniki tych
badań wskazują na istotne różnice, jakie obserwowane są w widmach NMR przy przejściu ze
struktur typu A-RNA i B-DNA do form jednoniciowych. Badania temperaturowe dla
2'-O-metylowych RNA za pomocą NMR nie były dotąd prowadzone.
Zmiany przesunięć chemicznych pasm rezonansowych dupleksów r(CGCGCG)2 i
2'-O-Me(CGCGCG)2 analizowałem w zakresie temperatur od 0oC do 95oC, z odstępem 5oC.
Wykresy temperaturowych zależności przesunięć chemicznych 1H sygnałów rezonansowych
protonów H6/H8 obu dupleksów oraz protonów grup 2'-O-metylowych modyfikowanego
oligomeru przedstawione są na rysunkach 64a, 65a i 66a.
Na podstawie analizy zmian przesunięć chemicznych sygnałów protonów H6/H8 i grup
2'-O-metylowych można wydzielić następujące zakresy temperatur:
o
 poniżej 45 C; r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2 występują w formie dupleksów,
o
o
 45 C - 90 C; zachodzi równowaga termodynamiczna pomiędzy formami jedno- i
dwuniciowymi (przejścia typu dupleks - kłębek),
o
 powyżej 90 C; badane heksamery występują w formach jednoniciowych
(nieuporządkowanego kłębka).
W temperaturach poniżej 45oC, zmiany wartości przesunięć chemicznych 1H wraz ze
wzrostem temperatury są nieznaczne. Z wykresów pochodnych krzywych topnienia (rys. 64b,
65b, 66b) wynika, że dla analizowanych sygnałów rezonansowych, zmiany 1H przypadające
na wzrost temperatury o 1oC są na ogół mniejsze niż 0,003 p.p.m. Tak małe wartości są
charakterystyczne dla stabilnych struktur helikalnych. Nieznacznie większe wartości
wykazują jedynie sygnały H6 reszt cytydynowych C1 obu dupleksów, co wynika z większej
swobody konformacyjnej heterocyklicznych pierścieni zasad tych reszt w porównaniu do
pozostałych jednostek nukleotydowych.
Zmiany przesunięć chemicznych protonów 2'-O-metylowych reszt C1, G2, C3, G4, C5 w
przedziale od 0o do 50oC są jeszcze mniejsze niż dla protonów H6 i H8 (poniżej 0.001 p.p.m.
na 1oC, rys. 66b), co wskazuje na małą liczbę stopni swobody tych grup w strukturze
dupleksów. Większą swobodę konformacyjną wykazuje jedynie grupa 2'-O-metylowa
końcowej jednostki nukleotydowej G6. W opisywanym zakresie temperatur, zmiany
przesunięć chemicznych sygnałów rezonansowych protonów powyższej grupy wynoszą
średnio 0,018 p.p.m. na 1oC.
90
A.
8,2
8,1
1H [ppm]
8,0
7,9
7,8
H6(C1)
H8(G2)
H6(C3)
H8(G4)
H6(C5)
H8(G6)
7,7
7,6
7,5
0
20
40
60
80
100
80
100
o
Temperatura [ C]
B.
G4
H6(C1)
H8(G2)
H6(C3)
H8(G4)
H6(C5)
H8(G6)
0,020
0,015
G6
C5
 1H [ppm / C]
0,010
o
G2
0,005
C3
'
0,000
C1
-0,005
-0,010
0
20
40
60
o
Temperatura [ C]
Rys. 64.
Przesunięcia chemiczne protonów H6/H8 dupleksu r(CGCGCG)2 w zależności od temperatury.
A)
B)
Wykresy funkcji przesunięć chemicznych względem temperatury, H6/H8(T).
Wykresy pochodnej funkcji 'H6/H8(T). Strzałkami oznaczono ekstrema funkcji odpowiadające
temperaturom topnienia Tm dla każdej reszty nukleotydowej dupleksu.
91
A.
8,1
8,0
1H [ppm]
7,9
7,8
H6(C1)
H8(G2)
H6(C3)
H8(G4)
H6(C5)
H8(G6)
7,7
7,6
7,5
0
20
40
60
80
100
o
Temperatura [ C]
B.
H6(C1)
H8(G2)
H6(C3)
H8(G4)
H6(C5)
H8(G6)
0,015
0,010
G6
G4 C5
G2
o
'1H [ppm / C]
0,005
C3
0,000
-0,005
C1
-0,010
0
20
40
60
80
100
o
Temperatura [ C]
Rys. 65.
Przesunięcia chemiczne protonów H6/H8 dupleksu 2'-O-Me(CGCGCG)2 w zależności od
temperatury.
A)
B)
Wykresy funkcji przesunięć chemicznych względem temperatury H6/H8(T).
Wykresy pochodnej funkcji 'H6/H8(T). Strzałkami oznaczono ekstrema funkcji,
odpowiadające temperaturom topnienia Tm dla każdej reszty nukleotydowej dupleksu.
92
A.
3,85
2'-O-Me(C1)
2'-O-Me(G2)
2'-O-Me(C3)
2'-O-Me(G4)
2'-O-Me(C5)
2'-O-Me(G6)
3,80
3,75
1H [ppm]
3,70
3,65
3,60
3,55
3,50
3,45
3,40
0
20
40
60
80
100
o
Temperatura [ C]
B.
0,002
0,000
G6
C5
-0,004
o
'1H [ppm / C]
-0,002
-0,006
C3
2'-O-Me(C1)
2'-O-Me(G2)
2'-O-Me(C3)
2'-O-Me(G4)
2'-O-Me(C5)
2'-O-Me(G6)
-0,008
-0,010
-0,012
C1
G4
G2
-0,014
0
20
40
60
80
100
o
Temperatura [ C]
Rys. 66.
Przesunięcia chemiczne protonów grup metylowych dupleksu 2'-O-Me(CGCGCG)2 w zależności
od temperatury.
.
A)
B)
Wykresy funkcji przesunięć chemicznych względem temperatury 2'-O-Me(T).
Wykresy pochodnej funkcji '2'-O-Me(T). Strzałkami oznaczono ekstrema funkcji (temperatury
topnienia Tm dla danej reszty nukleotydowej dupleksu).
93
Szybkie przejścia konformacyjne typu dupleks - kłębek zachodzą w zakresie temperatur od
50 C do 90oC. W tym zakresie temperatur, obserwowane są duże przesunięcia sygnałów
rezonansowych badanych dupleksów. Wszystkie krzywe topnienia (rys. 64a, 65a, 66a)
otrzymane z analizy przesunięć chemicznych sygnałów protonów H6/H8 i protonów grup
2'-O-metylowych mają regularny kształt sigmoidalny. Sygnały rezonansowe protonów H8
wszystkich guanozyn oraz H6 cytydyn C3 i C5 przesuwają się, wraz ze wzrostem
temperatury w stronę wyższych wartości 1H (przesunięcie paramagnetyczne), natomiast
sygnał H6 reszty C1 przesuwa się w stronę przeciwną (przesunięcie diamagnetyczne). Takie
zmiany wartości 1H są charakterystyczne dla struktur A-RNA przy przejściu do form
nieuporządkowanych331.
Dokładne temperatury topnienia, Tm dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2, w
których zachodzi równowaga termodynamiczna pomiędzy formami dwu- i jednoniciowymi,
otrzymane zostały na podstawie analizy pochodnych względem temperatury funkcji zmian
przesunięć chemicznych sygnałów rezonansowych protonów H6/H8 i grup 2'-O-metylowych
(rys. 64b, 65b, 66b) metodą aproksymacji wielomianową. Wyznaczone temperatury Tm dla
każdej pary zasad są bardzo podobne (Tabela 17). Jedynie wartość Tm otrzymana z krzywej
topnienia dla protonów 2'-O-metylowych końcowej reszty G6 wyraźnie odbiega od
pozostałych wyników dla modyfikowanego dupleksu RNA. Lokalizacja tej grupy na 3' końcu
łańcucha daje znacznie większą swobodę konformacyjną. Również przebieg funkcji
temperaturowych zmian przesunięć chemicznych dla protonów grupy 2'-O-metylowej
jednostki G6 wyraźnie różni się od krzywych dla pozostałych reszt (rys. 66a). Funkcja ta w
przybliżeniu jest monotonicznie malejąca z jednym, nieznacznym przegięciem.
Wysokie temperatury topnienia (Tm = 68,4oC dla macierzystego RNA i Tm = 76,4oC dla
modyfikowanego RNA) wskazują na dużą, termodynamiczną trwałość obu badanych struktur
oraz ich końcowych fragmentów. Wyraźnie wyższa temperatura topnienia dupleksu
2'-O-Me(CGCGCG)2 wskazuje na specyficzną rolę grup 2'-O-metylowych w stabilizacji
struktury RNA.
o
Tabela 17.
Temperatury topnienia dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2 wyznaczone na
podstawie zmian przesunięć chemicznych sygnałów protonów H6/H8 i 2-O'-metylowych [oC].
Reszta
C1
G2
C3
G4
C5
G6
r(CGCGCG)2
H6/H8
68,1
66,7
69,0
68,7
70,0
68,4
H6/H8
74,5
76,9
81,1
74,1
79,4
77,6
2'-O-Me(CGCGCG)2
2'-O-Me
77,9
77,2
77,7
76,1
75,8
68,4
średnia Tm
76,2
77,0
79,4
75,2
77,6
72,4
średnia Tm, oC
odch. stand.
68,4
1,2
77,3
2,8
75,5
3,6
76,4
2,3
Widma 1H NMR wykonane w temperaturze powyżej 90oC charakteryzują się wąskimi
liniami spektralnymi (w wyniku wydłużenia czasów relaksacji T2 w wysokich temperaturach i
przejścia do struktur jednoniciowych). Przesunięcia chemiczne sygnałów protonów H6/H8
jednoniciowych struktur RNA o sekwencjach r(CGCGCG) i 2'-O-Me(CGCGCG) w
temperaturze 95oC podane są w tabeli 18. Dla porównania obliczone zostały teoretyczne
wartości przesunięć chemicznych na podstawie empirycznego wzoru Bella229,
uwzględniającego wpływ najbliższych sąsiadów. Zgodność pomiędzy wartościami
94
teoretycznymi a eksperymentalnymi dla r(CGCGCG) jest stosunkowo duża. Różnice
przesunięć nie przekraczają 0,1 p.p.m. (Tabela 18).
Charakterystyczną cechą widm wysokotemperaturowych, jednoniciowych łańcuchów
r(CGCGCG) i 2'-O-Me(CGCGCG) jest separacja sygnałów H6 i H8. Średnia różnica
pomiędzy przesunięciami chemicznymi tych sygnałów wynosi około 0,25 p.p.m., co zgodne
jest z teoretycznymi obliczeniami229. Ponadto, wszystkie przesunięcia chemiczne protonów
zasad 2'-O-metylowanego oligomeru są o około 0,12 p.p.m większe w porównaniu do
macierzystego RNA. Różnica ta prawdopodobnie spowodowana jest obecnością grup
2'-O-metylowych w strukturze.
Tabela 18.
229
Eksperymentalne i teoretyczne (obliczone na podstawie wzoru Bella ) wartości przesunięć
chemicznych sygnałów protonów H6/H8 [95oC, D2O] dla jednoniciowych struktur r(CGCGCG)
oraz eksperymentalne wartości H6/H8 dla 2'-O-Me(CGCGCG) w p.p.m. względem DSS. W
ostatniej kolumnie podano różnice przesunięć chemicznych w temp. 95oC pomiędzy
eksperymentalnymi wartościami H6/H8 obu badanych struktur RNA.
Proton
H6(C1)
H8(G2)
H6(C3)
H8(G4)
H6(C5)
H8(G6)
eksp.
7,717
7,981
7,737
7,954
7,730
8,004
r(CGCGCG)
teor.
teor. eksp.
7,759
+0,047
8,015
+0,034
7,776
+0,039
7,976
+0,022
7,817
+0,087
7,951
-0,053
2'-O-Me(CGCGCG)
eksp.
7,843
8,135
7,882
8,100
7,909
8,114
średnia:
różnica
eksp.
+0,084
+0,120
+0,110
+0,146
+0,092
+0,163
+0,119
III.5.2. Analiza temperaturowa sygnałów NMR wymienialnych protonów.
Położenie, kształt i intensywność sygnałów rezonansowych, pochodzących od protonów
iminowych i aminowych dupleksów silnie zależą od temperatury, w której wykonywany był
eksperyment NMR. W temperaturach powyżej punktu topnienia dupleksów, szybka wymiana
tych protonów z wodą powoduje uśrednienie ich sygnałów rezonansowych z sygnałem
rozpuszczalnika. Badane dupleksy r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2 odznaczają się
bardzo wysoką temperaturą topnienia, stąd sygnały rezonansowe pochodzące od
wymienialnych protonów mogłem obserwować w bardzo dużym zakresie temperatur.
Jednowymiarowe widma 1H NMR (przy częstotliwości 300 MHz) wykonane w zakresie od
0oC do 70oC co 5oC, z zastosowaniem sekwencji "jump & return" w celu wygaszenia sygnału
wody, przedstawione są na rysunku 67.
Zmiany sygnałów rezonansowych pochodzących od iminowych i aminowych protonów są
związane z szybkością wymiany z protonami wody, która zależy od stopnia hydratacji i
temperatury. Jak wynika z analizy widm temperaturowych, prędkość wymiany jest różna, w
zależności od charakteru grupy funkcyjnej i jej położenia w sekwencji dupleksów.
Najszybszej wymianie z wodą ulegają protony aminowe guanozyn, których sygnały
absorpcyjne widoczne są tylko w bardzo niskich temperaturach (ok. 0oC). Mniejszy kontakt z
cząsteczkami wody mają protony iminowe, które tworzą wewnętrzne wiązania wodorowe
95
r(CGCGCG)2
[OC]
NH1
p.p.m.
NH4a
H6/H8
NH4b
p.p.m.
NH4a
H6/H8
NH4b
2'-O-Me(CGCGCG)2
[OC]
NH1
Rys. 67.
Fragmenty widm 1H NMR [300 MHz, 90%H2O/10%D2O) obejmujące zakres sygnałów
wymienialnych protonów dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2. Widma wykonane zostały
w temperaturach od 0oC do 70oC, z odstępem 5oC. Gwiazdką zaznaczone zostały uśrednione sygnały
protonów grup aminowych cytydyn.
96
typu Watsona-Cricka w sparowanych zasadach CG, stąd ich linie rezonansowe są
obserwowane w znacznie szerszym zakresie temperatur. Zachodzi tutaj pewne zróżnicowanie
temperatur koalescencji sygnałów protonów iminowych guanozyn w zależności od sekwencji
badanych oligomerów. Sygnały NMR od protonów iminowych terminalnych guanozyn G6
ulegają koalescencji znacznie szybciej niż sygnały od jednostek wewnętrznych G2 i G4, co
związane jest z procesem topnienia końców dupleksów i zwiększoną ich hydratacją. Ponadto,
ze względu na różnice w temperaturach topnienia badanych dupleksów, proces ten zachodzi
nieco szybciej dla r(CGCGCG)2. Najwolniejszej wymianie z wodą ulegają protony aminowe
cytydyn. Proces wymiany jest tutaj znacznie bardziej złożony. Oprócz wymiany z wodą,
zachodzi również proces wymiany między protonami w samych grupach aminowych. Z
analizy temperaturowych widm NMR wynika, że szybkość wymiany tych protonów z wodą
jest najmniejsza. W niższych temperaturach obserwowane są rozdzielone sygnały pochodzące
od nierównocennych chemicznie protonów aminowych. Ze wzrostem temperatury wiązania
wodorowe aminowych protonów cytydyn ulegają osłabieniu. W wyniku wzrostu energii
kinetycznej, uruchomiona zostaje rotacja grup aminowych wokół wiązań C4-N4. W efekcie
tego zjawiska sygnały rezonansowe protonów aminowych cytydyn ulegają uśrednieniu
(rys. 67). Dalszy wzrost temperatury powoduje topnienie dupleksów i całkowity zanik tych
sygnałów. Bardzo wysoka temperatura koalescencji sygnałów aminowych cytydyn wskazuje
na bardzo słabą hydratację tych protonów. Szybkość procesów wymiany zależy od położenia
tych protonów w sekwencji dupleksów. Proces uśrednienia sygnałów protonów aminowych
oraz ich dalszy zanik zachodzi najszybciej dla terminalnych jednostek C1, natomiast
najwolniej dla jednostek C3.
Różna szybkość wymiany protonów dupleksu 2'-O-Me(CGCGCG)2 posiada swoje
uzasadnienie w strukturze krystalicznej. Aminowe protony guanozyn znajdują się w bliskim
kontakcie z cząsteczkami wody i mogą tworzyć wiązania wodorowe, natomiast dla grup
aminowych cytydyn, takie wiązania w strukturze krystalicznej nie występują20.
III. 6. Analiza widm 31P NMR dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-OMe(CGCGCG)2.
Sygnały rezonansowe 31P NMR w widmach dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-OMe(CGCGCG)2 znajdują się w zakresach spektralnych o szerokościach mniejszych niż 0,6
p.p.m. Takie wąskie zakresy zajmowane przez pasma jąder fosforu są charakterystyczne dla
prawoskrętnych dupleksów RNA2,263. Wcześniejsze badania prowadzone dla dupleksów
r(CGCGCG)29,10 nie doprowadziły do identyfikacji sygnałów rezonansowych 31P NMR.
Przypisania pasm rezonansowych obu dupleksów dokonałem na podstawie
dwuwymiarowych widm korelacyjnych 31P-1H. W widmach typu COLOC222 (rys. 68, 69)
widoczne są silne sygnały korelacyjne H3'-P oraz słabsze sygnały P-H5', P-H5'' i P-H4'. Te
ostatnie sygnały wskazują na istnienie sprzężeń skalarnych dalekiego zasięgu wzdłuż wiązań
kowalencyjnych P(i)-O5'(i+1)-C5'(i+1)-C4'(i+1)-H4'(i+1) i występują w stabilnych strukturach typu
A-RNA2,4. Wartości przesunięć chemicznych wszystkich jąder atomów fosforu dupleksów
r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2 podane są w tabeli 19.
97
Przesunięcia chemiczne sygnałów jąder fosforu w sekwencjach CpG i GpC wyraźnie
różnią się między sobą. Pierwsze trzy sygnały CpG są przesunięte w stronę większych
wartości 31P w stosunku do dwóch pozostałych pasm GpC (rys. 68, 69, Tabela 19).
Maksymalna różnica pomiędzy skrajnymi sygnałami nie przekracza wartości 1 p.p.m., co jest
charakterystyczne dla struktur prawoskrętnych, A-RNA. W lewoskrętnych dupleksach typu
Z-RNA12-14, obserwowane są znacznie większe zmiany ekranowania jąder atomów fosforu. Z
analizy przesunięć chemicznych wynika, że wszystkie jądra atomów fosforu r(CGCGCG)2 są
bardziej odsłaniane od analogicznych jąder 2'-O-Me(CGCGCG)2. Efekt ten może wynikać z
różnic w hydratacji i oddziaływaniach grup fosfodiestrowych z jonami soli, spowodowanych
obecnością grup 2'-O-metylowych.
Rys. 68
Widmo korelacyjne COLOC 31P-1H [121,4 MHz, 30oC] dupleksu r(CGCGCG)2 w D2O. Na
osi F1 zaznaczona jest skala przesunięć chemicznych protonów, a na osi F2, jąder atomów
fosforu. Na widmie zaznaczone są sygnały korelacyjne:
C1pG2
G2pC3
C3pG4
G4pC5
C5pG6
z protonami:
z protonami:
z protonami:
z protonami:
z protonami:
H3'(C1) [1a], H4'(G2)/H5'(G2) [1bc], H5''(G2) [1d]
H3'(G2) [2a], H4'(C3) [2b], H5'(C3) [2c], H5''(C3) [2d]
H3'(C3)/H4'(G4)/H5'(G4) [3abc], H5''(G4) [3d]
H3'(G4)/H5'(C5) [4ac], H4'(C5) [4b], H5''(C5) [4d]
H3'(C5)/H5'(G6) [5ac], H4'(G6) [5b], H5''(G6) [5d]
98
Tabela 19
Przesunięcia chemiczne 31P NMR [121,4 MHz, 30oC] r(CGCGCG)2 i 2’-O-Me(CGCGCG)2 w D2O
( w p.p.m., względem 85% H3PO4.)
Rys. 69
Jądro fosforu
r(CGCGCG)2
2'-O-Me(CGCGCG)2
C1pG2
G2pC3
C3pG4
G4pC5
C5pG6
-0,72
-1,12
-0,78
-1,26
-0,83
-1.20
-1,48
-1,13
-1,63
-1,04
Widmo korelacyjne COLOC 31P-1H [121,4 MHz, 30oC] dupleksu 2'-O-Me(CGCGCG)2 w D2O.
Na osi F1 zaznaczona jest skala przesunięć chemicznych protonów, a na osi F2, jąder atomów
fosforu. Na widmie zaznaczone są sygnały korelacyjne:
C1pG2
G2pC3
C3pG4
G4pC5
C5pG6
z protonami:
z protonami:
z protonami:
z protonami:
z protonami:
H3'(C1) [1a], H4'(G2)/H5'(G2) [1bc], H5''(G2) [1d]
H3'(G2) [2a], H4'(C3) [2b], H5'(C3) [2c], H5''(C3) [2d]
H3'(C3)/H4'(G4)/H5'(G4) [3abc], H5''(G4) [3d]
H3'(G4)/H5'(C5) [4ac], H4'(C5) [4b], H5''(C5) [4d]
H3'(C5)/H5'(G6) [5ac], H4'(G6) [5b], H5''(G6) [5d]
Wyniki analiz widm 31P NMR r(CGCGCG)2 oraz 2'-O-Me(CGCGCG)2 jednoznacznie
wskazują na prawoskrętną strukturę o charakterze A-RNA obu dupleksów.
99
III.7. Analiza widm 13C NMR dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-OMe(CGCGCG)2.
Analiza 13C NMR dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2 przeprowadzona
została na podstawie widm wykonanych dla próbek o naturalnym składzie izotopowym.
Jednowymiarowe widma 13C NMR badanych dupleksów przedstawione są na rysunku 70 z
zaznaczonymi zakresami występowania sygnałów pochodzących od jąder atomów węgli
aromatycznych (97 - 170 p.p.m.) i alifatycznych (59 - 94 p.p.m).
|
Zakres występowania sygnałów
jąder atomów węgli aromatycznych
Zakres występowania sygnałów
| jąder atomów węgli alifatycznych |
a)
b)
Rys. 70
Widma 13C{1H} NMR [75 MHz, 30oC, D2O] dupleksów r(CGCGCG)2 (a) i 2'-O-Me(CGCGCG)2 (b).
100
a)
b)
Rys. 71. Widma korelacyjne 13C-1H HSQC [500 MHz, 30oC] dupleksów r(CGCGCG)2 (a) i 2’-OMe(CGCGCG)2 (b) w D2O odsprzęgane w czasie akwizycji pasmem częstotliwości 13C NMR
[125,7 MHz]. Na osi F1 zaznaczona jest skala przesunięć chemicznych 13C,, a na osi F2, 1H.
Na widmach zaznaczono zakresy występowania sygnałów korelacyjnych:
1. - C8/C6 - H8/H6
2. - C5/C1' - H5/H1'
3. - C2'/C3'/C4'/C5' - H2'/H3'/H4'/H5'/H5'' (a)
C2'/C3'/C4'/C5'/2'-O-Me - H2'/H3'/H4'/H5'/H5''/2'-O-Me (b)
101
r(CGCGCG)2
2'-O-Me(CGCGCG)2
Rys. 72.
Widma korelacyjne 13C-1H HMQC [500 MHz, 30oC] dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-OMe(CGCGCG)2 w D2O, które odsprzęgane były w czasie akwizycji pasmem częstotliwości
rezonansowej 13C NMR [125,7 MHz]. Fragmenty widm obejmują sygnały korelacyjne protonów z
czwartorzędowymi atomami węgla C4 i C2 reszt cytydynowych oraz C4 i C5 reszt
guanozynowych.
102
Przypisania sygnałów rezonansowych wszystkich atomów węgli grup CH3, CH2 i CH
dokonałem na podstawie dwuwymiarowych widm korelacyjnych 13C-1H HSQC(rys. 71).
Sygnały atomów czwartorzędowych węgli C2 i C4 wszystkich reszt cytydynowych oraz
sygnały atomów węgli C4 i C5 nukleotydów guanozynowych zidentyfikowane zostały z
analizy widm 13C-1H HMQC223,341. Sygnały korelacyjne C2-H6, C4-H6 cytydyn oraz C4-H8
i C5-H8 guanozyn, na podstawie których przypisane zostały sygnały atomów
czwartorzędowych węgli dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2 zaznaczone są na
widmach (rys. 72). Pasma czwartorzędowych węgli C2 (156.3-156.8 p.p.m.) i C6 (161,3162,1 p.p.m.) guanozyn (rys. 70, 73) nie zostały całkowicie przypisane poszczególnym
jednostkom nukleotydowym. Jądra tych atomów nie dają obserwowalnych sprzężeń spinowospinowych z protonami, na podstawie których można byłoby oznaczyć ich sygnały
rezonansowe z widm korelacyjnych, wykonywanych dla próbek o naturalnym składzie
izotopowym. Przesunięcia chemiczne 13C dla dupleksów r(CGCGCG)2 i
2'-O-Me(CGCGCG)2 podane zostały w tabeli 20. Dla porównania, w tabeli zamieszczone
zostały wartości przesunięć chemicznych dla cytydyny i guanozyny w D2O wyznaczone przez
Petersena332.
Tabela 20. Przesunięcia chemiczne 13C (w p.p.m. względem DSS) sygnałów w widmie 13C NMR dupleksów
r(CGCGCG)2 [A] i 2'-O-Me(CGCGCG)2 [B] w D2O [30oC].
Reszta
C1'
A
93.7
92.5
93.9
92.9
93.9
91.4
C1
G2
C3
G4
C5
G6
Ca)
G a)
C2'
B
90.3
88.5
89.7
88.7
89.4
89.7
A
75.1
74.8
75.3
75.2
75.3
77.5
90.6
87.9
Reszta
C3'
B
83.9
83.9
83.5
83.8
83.9
87.0
75.3
75.0
C2
C4
A
B
A
C1
C3
C5
159.8
158.8
158.7
159.7
158.9
158.7
169.0
168.3
168.3
G2
G4
G6
156.8*
156.4*
156.3*
156.6*
156.4*
156.3*
152.1
153.3
152.6
A
73.1
72.6
73.3
73.7
72.0
70.3
C4'
B
73.0
72.4
72.0
72.7
71.6
69.8
A
84.1
81.9
81.4
81.9
81.4
83.6
70.5
71.5
C5
B
A
B
reszty cytydynowe
169.2
99.0
99.0
168.3
97.7
97.8
168.3
97.6
97.6
reszty guanozynowe
152.8
118.7
119.0
153.4
118.7
118.9
153.2
118.7
118.7
C5'
B
84.4
82.1
82.0
81.9
81.7
83.7
A
61.6
64.9
64.8
64.9
64.3
65.4
85.3
86.4
2'-O-CH3
B
59.4
59.8
59.6
59.8
59.3
61.5
B
61.9
65.3
65.8
65.7
64.3
65.5
61.6
62.5
-
C6
C8
A
B
A
B
142.8
140.6
140.1
142.7
140.7
140.4
-
-
161.9*
161.6*
161.3*
162.1*
161.6*
161.4*
136.2
135.7
137.5
136.2
136.1
137.1
157.0
166.7
95.2
C a)
154.7
152.2
117.7
G a)
* Sygnały, które nie zostały jednoznacznie przypisane.
a)
Przesunięcia chemiczne 13C dla cytydyny i guanozyny wg Petersona332.
142.5
158.0
136.9
Jak można było się spodziewać, największe różnice widm 13C NMR r(CGCGCG)2 i
2'-O-Me(CGCGCG)2 występują w zakresach sygnałów atomów węgli alifatycznych.
Metylowanie grupy hydroksylowej zmienia strukturę elektronową i powoduje przesunięcie
sygnału najbliższego węgla pierścienia rybozy (C2') w stronę wyższych wartości 13C333.
103
Paramagnetyczne przesunięcie sygnałów C2' wszystkich jednostek nukleotydowych
2'-O-Me(CGCGCG)2 wynosi od 8,2 do 9,5 p.p.m. Są to największe różnice obserwowane w
widmach 13C NMR badanych dupleksów (Tabela 21).
Tabela 21. Różnice przesunięć chemicznych   13C w p.p.m. pomiędzy sygnałami w widmie
2'-O-Me(CGCGCG)2 i r(CGCGCG)2.
  13C =  13C[2'-O-Me(CGCGCG)2] -  13C r(CGCGCG)2].
Reszta
C1
G2
C3
G4
C5
G6
C1'
-3.4
-4.0
-4.2
-4.2
-4.5
-1.7
C2'
+8.8
+9.1
+8.2
+8.6
+8.6
+9.5
C3'
-0.1
-0.2
-1.3
-1.0
-0.4
-0.5
C4'
+0.3
+0.3
+0.6
0.0
+0.3
+0.1
C5'
+0.3
+0.4
+1.0
+0.8
0.0
+0.1
C2
-0.1
-0.2
+0.1
0.0
0.0
0.0
C4
+0.2
+0.7
0.0
+0.1
0.0
+0.6
C5
0.0
+0.3
+0.1
+0.2
0.0
0.0
C6
-0.1
+0.2
+0.1
0.0
+0.3
+0.1
13
C NMR
C8
0.0
+0.4
-0.4
Diamagnetyczne przesunięcie sygnałów atomów C1' reszt C1, G2, C3, G4, C5 dupleksu
2'-O-Me(CGCGCG)2 o około 4 p.p.m. w stosunku do sygnałów r(CGCGCG)2 wynika z
oddziaływań sterycznych grup 2'-O-metylowych z protonami anomerycznymi (efekt
gauche333). W przypadku końcowej reszty G6, efekt ten jest mniejszy, ze względu na większą
swobodę konformacyjną grupy 2'-O-metylpwej ostatniej jednostki nukleotydowej w
sekwencji RNA. Oddziaływania steryczne pomiędzy grupami anomerycznymi i
metoksylowymi wpływają również na wartości przesunięć chemicznych sygnałów atomów
węgli metylowych. Przesunięcie chemiczne 13C dla grupy 2'-O-metylowej reszty G6 (61,5
p.p.m.) jest wyraźnie większe w stosunku do pozostałych reszt (59,3-59,8 p.p.m.). Powyższe
wyniki potwierdzają konformację grup 2'-O-metylowych, która wyznaczona została
wcześniej na podstawie analizy widm 1H NMR (patrz rozdz. III.3.3).
Różnice wartości przesunięć chemicznych dla pozostałych sygnałów atomów węgla
pierścieni cukrowych (Tabela 21) są bardzo małe, co wskazuje na duże podobieństwo
konformacji obu dupleksów. Przesunięcia te odpowiadają konformacji anti wokół wiązań
N-glikozydowych i konformacji C3'-endo pierścieni cukrowych (Tabela 22).
Tabela 22.
Przesunięcia chemiczne 13C sygnałów atomów węgli pierścienia cukrowego w zależności od
konformacji rybozy i kątów  w łańcuchu RNA*.
Przesunięcia chemiczne 13C [w p.p.m.]
Konformacja
Ryboza
C3'-endo
kąt 
C1'
anti
92 - 94
syn
95 - 97
C2'-endo
anti
86 - 88
syn
89 - 91
*)
na podstawie prac: 4, 124, 145, 335-339.
C2'
C3'
C4'
C5'
74 - 76
76 - 78
74 - 76
76 - 78
70 - 74
76 - 79
70 - 74
76 - 79
81 - 84
85 - 87
81 - 84
85 - 87
61 - 69
61 - 69
61 - 69
61 - 69
Bardzo duże podobieństwo strukturalne dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2
wynika nie tylko z wcześniej wykonanych analiz przesunięć chemicznych 1H, sprzężeń
skalarnych 3JHH, nJPH, efektów Overhausera między protonami, ale także z niezwykle małych
różnic przesunięć chemicznych 13C dla wszystkich aromatycznych węgli heterocyklicznych
zasad (rys. 73). Częstotliwości rezonansowe tych atomów węgla są bardzo czułe na różne
efekty związane z prądami -elektronowymi (efekty pierścieniowe), ze stopniem hydratacji i
104
tworzeniem wiązań wodorowych między zasadami, z oddziaływaniami warstwowymi,
tautomerią i protonacją heteroatomów, oddziaływaniami sterycznymi między orbitalami 
oraz z innymi czynnikami strukturalnymi. Różnice przesunięć chemicznych 13C badanych
dupleksów w tym zakresie spektralnym, nie przekraczają 0,7 p.p.m., a w większości
przypadków są mniejsze od 0,3 p.p.m (Tabela 21). Większe różnice przesunięć chemicznych
13C (dochodzące do 3 p.p.m.) występują pomiędzy dupleksem r(CGCGCG)2 i
d(CGCGCG)2340. Dla porównania, widmo 13C NMR dupleksu d(CGCGCG)2, które
wykonałem w podobnych warunkach jak widma RNA, przedstawione jest na rysunku 73.
Wyraźne zmiany obserwowane w widmach d(CGCGCG)2 w stosunku do widm RNA
odzwierciedlają istotne różnice strukturalne i dynamiczne występujące w obrębie
sparowanych zasad między dwoma prawoskrętnymi formami helikalnymi A-RNA i B-DNA.
Rys. 73.
Fragmenty widm 13C{1H} [75 MHz, 30oC] dupleksów d(CGCGCG)2, r(CGCGCG)2 i 2'-OMe(CGCGCG)2 w D2O, obejmujące sygnały aromatycznych węgli. Przypisania sygnałów
rezonansowych d(CGCGCG)2 dokonano na podstawie danych z prac 334, 340.
105
III.8.
Analiza konformacji r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2
w oparciu o wartości wicynalnych sprzężeń skalarnych i
wielkości NOE.
Analiza konformacyjna pierścieni rybozy, kątów torsyjnych wokół wiązań
N-glikozydowych i wiązań fosforoestrowych przeprowadzona została na podstawie homo- i
heteronuklearnych sprzężeń skalarnych oraz objętości (integracji) intranukleotydowych
sygnałów korelacyjnych widm 2D-NOESY. Wyniki analiz fragmentów strukturalnych
badanych dupleksów w oparciu o bezpośrednie dane eksperymentalne (NOE, 3JHH, nJPH) były
podstawą do wyboru odpowiednich struktur początkowych i strategii ich udokładniania. Były
także jednym z kryteriów zgodności końcowych struktur otrzymanych po restryktywnej
dynamice molekularnej (rozdz. III.9.) z danymi eksperymentalnymi.
III.8.1. Pomiar wartości stałych sprzężeń skalarnych.
Sprzężenia spinowo-spinowe pomiędzy protonami, przenoszone przez elektrony wiązań
chemicznych, odgrywają istotną rolę w analizie strukturalnej kwasów nukleinowych.
Oddziaływania te odzwierciedla subtelna struktura pasm rezonansowych. Miarą tych
oddziaływań są stałe sprzężeń, które staramy się wyznaczyć na podstawie subtelnej struktury
sygnałów. W przypadku słabszej rozdzielczości i przy znacznych poszerzeniach linii
rezonansowych, wartości stałych sprzężeń mogą być określone z intensywności sygnałów
korelacyjnych widm typu COSY244. W badaniach kwasów nukleinowych, z analizy sprzężeń
skalarnych wyznaczane są konformacje pierścieni cukrowych oraz kąty torsyjne w
łańcuchach fosforoestrowych i wokół wiązań N-glikozydowych.
Dokładne wartości stałych sprzężeń 3JH1'H2', 3JH2'H3', 3JH3'H4', 3JH4'H5' , 3JH4'H5'' oraz 2JH5'H5'' dla
dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2 otrzymałem z analizy struktury
multipletowej sygnałów jedno- i dwuwymiarowych widm 1H NMR. W trakcie
eksperymentów włączony był generator częstotliwości rezonansowej atomów 31P, który
redukował strukturę multipletową sygnałów H3', H4', H5' i H5'' o heterojądrowe sprzężenia.
Ze względu na silnie zagęszczone zakresy spektralne protonów rybozy i 2'-O-metylorybozy,
wartości sprzężeń skalarnych dla większości protonów wyznaczone zostały na podstawie
wysokorozdzielczych, fazoczułych widm dwuwymiarowych DQF-COSY.
Pomiar indywidualnych stałych sprzężeń wykonywany był wzdłuż osi F2, gdzie wyższa
rozdzielczość dawała lepszą separację poszczególnych linii w multipletowej strukturze
sygnałów korelacyjnych dwuwymiarowych widm DQF-COSY (rys. 74, 75). W celu
wyeliminowania efektu związanego z szerokością linii (rozdz II.4.1), odpowiednie przekroje
sygnałów korelacyjnych były aproksymowane metodą najmniejszych kwadratów krzywymi
Lorentza. Ostatnim etapem pomiaru wartości stałych sprzężeń skalarnych była symulacja
komputerowa dwuwymiarowych sygnałów widm DQF-COSY za pomocą programu
SPHINX/LINSHA254 i porównanie otrzymanych wyników z danymi eksperymentalnymi. W
obliczeniach tych brane były pod uwagę różne szerokości linii rezonansowych w zakresie od
2 do 5 Hz.
Bardzo słabe sprzężenia 3JH1'H2' analizowane były na podstawie sygnałów protonów
anomerycznych jednowymiarowych widm 1H NMR. Zastosowanie, w trakcie apodyzacji,
przesuniętych w fazie sinusoidalnych funkcji ważących dawało zwężenie linii rezonansowych
do szerokości połówkowych ok. 1 Hz. Największe sprzężenia 3JH1'H2' obserwowałem dla
końcowych reszt nukleotydowych G6. Powodowały one rozszczepienie sygnałów
106
Rys. 74.
H1'-H2'
H2'-H3'
H3'-H4'
H1'-H2'
H2'-H3'
H3'-H4'
H4'-H5'
H4'-H5''
H5'-H5''
H4'-H5'
H4'-H5''
H5'-H5''
Pomiar aktywnych (w przeciwnych fazach) i pasywnych (o zgodnych fazach) sprzężeń skalarnych na
podstawie subtelnej struktury sygnałów korelacyjnych widma DQF-COSY 1H-1H {31P} [500 MHz,
30oC]. Przedstawione zostały wszystkie sygnały dla guanozyny G6 dupleksu 2'-O-Me(CGCGCG)2.
Skala na osiach F1 i F2 podana jest w Hz. Kolorem czerwonym - oznaczone sygnały z dodatnią fazą,
niebieskim - z ujemną fazą.
107
Rys. 75.
C1
G2
C3
C1
G2
C3
G4
C5
G6
G4
C5
G6
Sygnały korelacyjne H2'-H3' i H3'-H4' widma DQF-COSY 1H-1H {31P} [500 MHz, 30oC] wszystkich
reszt nukleotydowych dupleksu 2'-O-Me(CGCGCG)2. Zaznaczone zostały sprzężenia 3JH2'H3' i 3JH3'H4'.
Skala na osiach F1 i F2 podana jest w Hz. Znaczenie kolorów jak na rysunku 74.
108
anomerycznych H1'(G6) na dublety. Wartości 3JH1'H2' wyznaczone na podstawie analizy
sygnałów rezonansowych wynoszą 2,1 i 1,7 Hz dla r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2. Dla
pozostałych jednostek nukleotydowych, bardzo małe sprzężenia skalarne pomiędzy
protonami H1', H2' nie powodowały rozszczepienia sygnałów protonów anomerycznych w
widmach 1H NMR wykonanych w temperaturze 30oC. Wartości sprzężeń 3JH1'H2' rzędu 0,71,0 Hz dla reszt G2, C3, G4 i C5 otrzymałem przez dekonwolucję każdego sygnału H1'
dwoma liniami lorentzowskimi o stałych szerokościach połówkowych, które określone
zostały z pomiarów czasów relaksacji T*2. W przypadku reszt C1 obu dupleksów, niewielkie
rozszczepienie sygnałów anomerycznych protonów obserwowałem w temperaturach powyżej
35oC. Wartości 3JH1'H2' tych reszt dla temperatury 30oC otrzymane zostały przez ekstrapolację
danych.
Heterojądrowe sprzężenia skalarne pomiędzy atomami fosforu i protonami H3', H4', H5',
H5'' dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2 określone zostały na podstawie:
 intensywności sygnałów korelacyjnych dwuwymiarowych widm 31P-1H,
struktury
subtelnej
sygnałów
rezonansowych
sprzężonych,
 analizy
31
jednowymiarowych widm P NMR wykonanych w kilku temperaturach,
 analizy dwuwymiarowych widm typu 31P-1H J-spektroskopii ,
 różnicy subtelnej struktury sygnałów korelacyjnych widm 1H-1H DQF-COSY
nieodsprzęganych i odsprzęganych pasmem częstotliwości rezonansowej jąder
fosforu.
III.8.2. Pomiar wielkości efektów Overhausera (NOE).
Jądrowy efekt Overhausera określony jest przez zmiany integracji sygnałów
rezonansowych, które zachodzą w wyniku wzajemnej (krzyżowej) relaksacji jądrowej (ang.
cross relaxation) związanej z przejściami zero, dwu i wielokwantowymi w układach
spinowych. Wymienna relaksacja, i związany z nią efekt Overhausera, występuje wówczas,
gdy badany układ spinów wyprowadzony jest ze stanu równowagi termodynamicznej i gdy
występują silne oddziaływania dipolowe między analizowanymi jądrami magnetycznymi.
Obserwowane zmiany integracji sygnałów rezonansowych zależą od przestrzennej struktury i
dynamiki badanych związków oraz od stosowanej metody eksperymentalnej i parametrów
sekwencji impulsowych. Istotny wpływ na wielkość NOE mają procesy relaksacyjne. Dla
dużych w sensie NMR molekuł (c >> 1), które nie zawierają paramagnetycznych
zanieczyszczeń, mechanizm dipolowy jest głównym czynnikiem relaksacji jądrowej. W
przypadku małych cząsteczek (c << 1), istnienie konkurencyjnych mechanizmów relaksacji
może powodować znaczne osłabienie NOE aż do całkowitego zaniku347.
Na rysunku 76 przedstawione zostały trzy podstawowe rodzaje eksperymentów NMR,
które stosowane są w badaniach NOE. W eksperymentach jednowymiarowych wielkości
wzmocnienia NOE podawane są w procentach. Dla małych cząsteczek (w sensie NMR)
wzmocnienia NOE obserwowane dla protonów są na ogół dodatnie, natomiast dla dużych
cząsteczek, ujemne. W badaniach RNA, jednowymiarowe eksperymenty NOE oparte na
podwójnym protonowym rezonansie magnetycznym są wykonywane sporadycznie i tylko dla
pewnych fragmentów RNA115-117. Większe możliwości dają widma 2D-NOESY. Są one
głównym źródłem informacji dotyczących odległości między protonami w badaniach
strukturalnych makromolekuł. Mierzone efekty odnoszone są w stosunku do układów, w
których znane są odległości między protonami. W przypadku badań RNA, najczęściej
109
stosowanym układem odniesienia są protony H5-H6 cytydyn, których odległość wynosi
2,45 Å. W niektórych przypadkach mogą być stosowane inne wzorce, jak: H5'-H5'', H1'-H2',
H1'-H3'.
a)
b)
_


A
2
A
m
Rys. 76.
c)
_

t1
t
_

2
_

2
2
t1
t1
t
m
_

2
A
B
t2
m
C
t
D
Sekwencje impulsów stosowane w pomiarach NOE.
a) Jednowymiarowy eksperyment TOE (ang. Truncated Overhauser Effect) z wykorzystaniem
podwójnego rezonansu magnetycznego. Układ spinowy związany z jądrami A wyprowadzany
jest ze stanu równowagi dynamicznej przez naświetlanie polem małej mocy o częstotliwości
rezonansowej A bezpośrednio przed impulsem obserwacyjnym, po którym zbierany jest sygnał
swobodnej precesji. Przy długich czasach mieszania m. następuje stan równowagi i dalsze
wydłużenie czasów naświetlania nie powoduje większych zmian wielkości NOE (ang. SteadyState NOE).
b) Jednowymiarowy eksperyment z przejściowym NOE (ang. Transient NOE) w którym selektywny
impuls  wyprowadza układ związany z spinami jąder A w stan daleki od równowagi
dynamicznej (inwersja obsadzeń poziomów energetycznych). Na wskutek wzajemnej relaksacji
(ang. cross relaxation) następuje w czasie m. transfer podłużnej magnetyzacji, który powoduje
zmiany intensywności sygnałów tych jąder, oddziaływujących dipolowo (przestrzennie) z
naświetlanymi spinami A.
c) Eksperyment NOESY jest dwuwymiarową wersją eksperymentu z przejściowym NOE. Selektywny
impuls  zastąpiony jest dwoma, nieselektywnymi impulsami rozdzielonymi bardzo krótkim
interwałem czasowym t1 (czas ewolucji). Interwał ten zmienia się od minimalnej możliwej
wartości do wartości związanej z zadaną szerokością spektralną drugiego wymiaru. Następny
w sekwencji impulsowej interwał czasowy m, zwany czasem mieszania, nie ulega zmianie
podczas trwania całego eksperymentu. W tym okresie zachodzi transfer podłużnej magnetyzacji
pomiędzy oddziaływującymi ze sobą spinami jąder magnetycznych. Po okresie mieszania m
zadawany jest impuls obserwacyjny  /2, po którym rejestrowany jest sygnał swobodnej precesji.
Sekwencja powtarzana jest kilkadziesiąt lub kilkaset razy dla różnych czasów ewolucji t1. Na
schemacie zaznaczono:
A - okres przygotowawczy (ang. preparation period),
B - okres ewolucji (ang. evolution period),
C - okres mieszania (ang. mixing period),
D - okres akwizycji danych (ang. aquisition period).
Pomiar wartości NOE dla protonów dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2 był
dokonany na podstawie widm 2D-NOESY dla czasów mieszania m = 80 i 150 ms. Wszystkie
sygnały tych widm (w tym sygnały diagonalne) są w tej samej fazie. To wskazuje, że badane
dupleksy są dużymi w sensie NMR układami (c >> 1). W przypadku małych cząsteczek,
sygnały diagonalne są w przeciwnej fazie w stosunku do reszty sygnałów widm 2D-NOESY.
Analizowane sygnały widm 2D-NOESY były wstępnie optymalizowane metodą
nieliniowej aproksymacji krzywymi Lorentza, zawartą w pakiecie programowym FELIX
(firmy MSI). Optymalizacja pasm rezonansowych eliminowała wpływ szumów na wynik
całkowania sygnałów. Ponadto metoda ta umożliwiała integrację tych sygnałów, które
częściowo były zasłonięte przez inne pasma rezonansowe. Linia bazowa dwuwymiarowych
110
widm NOESY była korygowana w kierunkach osi F1 i F2 przez funkcje wielomianowe.
Zoptymalizowane regiony spektralne H6/H8-H5/H1' widm 2D-NOESY badanych dupleksów
oraz względne objętości sygnałów korelacyjnych, które znajdują się w tych obszarach
przedstawione zostały na rysunkach 49-51 (rozdz. III.3.2).
Dla każdego eksperymentu 2D-NOESY (m = 80 i 150 ms), pomiary wielkości NOE
dokonywane na podstawie integracji sygnałów korelacyjnych odnoszone były do średniej
wartości tego efektu dla par H5-H6 wszystkich cytydyn badanych dupleksów. Dla każdej
pary protonów, objętości mierzone były dla dwóch sygnałów korelacyjnych znajdujących się
symetrycznie względem głównej przekątnej widm 2D-NOESY. Następnie, oba wyniki
otrzymywane dla każdej pary protonów i z każdego eksperymentu były porównywane ze sobą
i uśredniane. Wyniki, których różnica w przeliczeniu na odległości między protonami była
większa niż 30%, były eliminowane. Dotyczyło to sygnałów korelacyjnych znajdujących się
w silnie zagęszczonych regionach spektralnych, których nie dało się rozdzielić poprzez
aproksymację pasm rezonansowych.
Najsilniejsze sygnały korelacyjne widm 2D-NOESY obserwowałem dla par H5'-H5''. Ich
objętości są około czterokrotnie większe od sygnałów odniesienia H5-H6 cytydyn.
Porównywalne do stosunkowo silnych sygnałów korelacyjnych H5-H6 są sygnały
internukleotydowe H2'(i)-H6/H8(i+1) oraz intranukleotydowe sygnały dla par H1' i protonów
2'-O-metylowych. Objętości pozostałych sygnałów korelacyjnych są wyraźnie mniejsze od
H5-H6 cytydyn. Najmniejsze objętości, które dawały się zmierzyć wynosiły 0,05 (dla m = 80
ms) i 0,02 (dla m = 150 ms), względem objętości sygnałów odniesienia. Tabela z danymi
NOE dla obszaru H6/H8-H5/H1' przedstawiona została na rysunku 51 (rozdz. III.3.2).
III.8.3. Analiza konformacji pierścieni cukrowych.
Konformacje pierścieni cukrowych dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2
analizowane były dwiema metodami. Podstawą pierwszej metody były wartości sprzężeń
skalarnych pomiędzy protonami pierścieni rybozy . Drugą oparłem na analizie wielkości
NOE obserwowanych dla par H1'-H2', H1'-H3' i H1'-H4'.
8.3.A. Analiza konformacyjna w oparciu o wartości sprzężeń skalarnych.
W badaniach zastosowałem model dwustanowy opisany przez konformacje typu North i
South264. Analiza oparta była na wartościach 3JH1'H2', 3JH2'H3', 3JH3'H4' wyznaczonych z subtelnej
struktury pasm protonów anomerycznych i korelacyjnych sygnałów H2'-H3', H3'-H4' w
widmie DQF-COSY 1H-1H{31P} (rys. 75). Obliczone za pomocą programu PSEUROT 6.2250
parametry pseudorotacji PN i N dla konformacji North oraz procentowy udział tej frakcji
podane są w tabeli 23.
Jak wynikało z wcześniejszych analiz (rozdz. III.3.1), dominującą dla wszystkich
jednostek nukleotydowych r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2 jest, typowa dla A-RNA,
konformacja C3'-endo233. Udział tej konformacji dla większości reszt nukleotydowych
wynosi prawie 100%. Jedynie dla terminalnych jednostek G6 obserwowany jest niewielki
udział konformacji South, co jest efektem tzw. zjawiska topnienia końców dupleksów. Ze
względu na większą termostabilność struktury 2'-O-metylowanego dupleksu, procentowy
udział nietypowych konformacji South (10%) jest mniejszy niż w strukturze r(CGCGCG)2
(16%). Jest to jedyna, niewielka, lecz zauważalna różnica pomiędzy strukturami badanych
dupleksów, wynikająca z analizy przeprowadzonej za pomocą programu PSEUROT. Różnice
111
parametrów pseudorotacji PN i N badanych dupleksów dla pozostałych reszt są bardzo małe
i mieszczą się w granicach błędów pomiarowych.
Wprowadzenie podstawników 2'-O-metylowych powoduje dodatkową stabilizację
konformacji C3'-endo pierścieni cukrowych342,343. Jak wynika z powyżej prezentowanych
obliczeń, pierścienie rybozy macierzystego dupleksu r(CGCGCG)2 znajdują się w stabilnych
konformacjach C3'-endo, stąd efekt 2'-O-metylacji nie daje większych zmian strukturalnych.
Efektu tego trudno się było spodziewać w oparciu o dotychczasowe dane literaturowe.
Tabela 23. Eksperymentalne i wyliczone na podstawie programu PSEUROT wartości JH1´H2´, JH2´H3´, JH3´H4´ ,
parametry opisujące pofałdowanie pierścieni cukrowych PN i N w stanie North oraz procentowy
udział konformacji typu North dla r(CGCGCG)2 i 2´-O-Me(CGCGCG)2. W nawiasach podane są
odchylenia standardowe otrzymanych wyników z wszystkich możliwych kombinacji wartości 3JHH.
Reszta
J H1H2
eksp.
obl.
C1
G2
C3
G4
C5
G6
1.10.2
 1.0
 1.0
 1.0
 1.0
2.10.2
1.1(0.2)
1.1(0.2)
1.1(0.2)
1.1(0.2)
1.1(0.2)
2.1(0.2)
C1
G2
C3
G4
C5
G6
 1.0
 1.0
 1.0
 1.0
 1.0
1.70.2
1.0(0.1)
1.0(0.1)
1.0(0.1)
0.9(0.1)
1.0(0.1)
1.7(0.2)
Wartości 3JHH (Hz)
J H2H3
JH3H4
eksp.
obl.
eksp.
obl.
r(CGCGCG)2
4.6(0.6)
9.0(0.8)
4.31.0
9.01.0
4.4(0.3)
9.3(0.3)
4.30.3
9.30.3
4.4(0.4) 10.01.0 9.5(0.5)
4.21.0
4.3(0.3)
9.6(0.3)
4.30.3
9.60.3
4.3(0.3)
9.8(0.2)
4.30.3
9.90.3
4.4(0.3)
7.9(0.3)
4.40.3
7.90.3
2´-O-Me(CGCGCG)2.
4.4(0.3)
9.1(0.3)
4.30.3
9.10.3
4.3(0.3)
9.2(0.3)
4.30.3
9.30.3
3.9(0.3)
9.8(0.2)
3.80.3
9.90.3
3.9(0.3)
9.7(0.3)
3.80.3
9.40.3
4.2(0.3)
9.5(0.3)
4.20.3
9.80.3
4.9(0.3)
7.9(0.3)
4.90.3
7.90.3
Parametry ()
North%
PN.
N
11(16)
13( 9)
18(13)
19( 8)
23( 7)
5(13)
41(6)
42(3)
44(5)
45(3)
46(3)
42(3)
98(2)
98(2)
99(1)
98(2)
98(2)
84(5)
5(12)
7( 8)
17( 8)
14( 9)
12( 8)
3(12)
41(2)
42(3)
47(3)
47(2)
43(3)
37(3)
99(1)
99(1)
99(1)
99(1)
99(1)
90(4)
8.3.B. Analiza w oparciu o wartości NOE.
Analizę konformacji pierścieni cukrowych r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2
przeprowadziłem również niezależną metodą opartą o analizę wartości integracji
intranukleotydowych sygnałów korelacyjnych protonów H1'-H2', H1'-H3' i H1'-H4' widm
2D-NOESY (m = 80 i 150 ms). Na wstępie wykonałem w tym celu eksperymenty opisane w
literaturze dla badań strukturalnych DNA244,345,346. Dla par H1'-H2' objętości sygnałów widm
2D-NOESY są stosunkowo duże i wynoszą 0,4-0,5 w stosunku do uśrednionych wartości
H5-H6 wszystkich cytydyn. W porównaniu do H1'-H2', wzmocnienia NOE H1'-H3' są
przeszło sześciokrotnie mniejsze dla wszystkich reszt nukleotydowych badanych dupleksów.
Najważniejsze, z punktu widzenia analizy konformacyjnej pierścieni rybozy, objętości
sygnałów H1'-H4' były pośrednie między wartościami dla H1'-H3' i H1'-H2'. Wzmocnienia
NOE H1'-H4' wynosiły od 0,13 do 0,18 (w stosunku do H5-H6) i w przybliżeniu były
trzykrotnie mniejsze od H1'-H2' i dwukrotnie większe od H1'-H3' mierzonych dla tych
samych reszt nukleotydowych.
Opublikowane dane dla pierścieni dezoksyrybozy11,244 dotyczące zależności odległości
H1'-H2', H1'-H3' i H1'-H4' od kątów fazowych pseudorotacji P nie uwzględniały drugiego
parametru konformacyjnego m. Ponadto dane te nie są spójne244. W związku z tym,
112
Rys. 77.
A
Zależność odległości H1’-H4’ od kątów fazowych pseudorotacji P dla amplitudy
pofałdowania pierścieni m = 30o, 35o, 40o, 45o i 50o.
B,C. Obliczone teoretyczne wartości wzmocnienia NOE dla protonów H1'-H4' w stosunku do
H5-H6 w modelu ISPA w zależności od konformacji rybozy.
113
Rys. 78.
A
Zależność odległości H1’-H2’ od kątów fazowych pseudorotacji P dla ampliduty
pofałdowania pierścieni, m = 30o, 35o, 40o, 45o i 50o.
B,C Obliczone teoretyczne wartości wzmocnienia NOE dla protonów H1'-H2' w stosunku do
H5-H6 w modelu ISPA w zależności od konformacji rybozy.
114
Rys. 79.
A
B,C.
Zależność odległości H1’-H3’ od kątów fazowych pseudorotacji P dla amplitudy
pofałdowania pierścieni m = 30o, 35o, 40o, 45o i 50o.
Obliczone teoretyczne wartości wzmocnienia NOE dla protonów H1'-H3' w stosunku do
H5-H6 w modelu ISPA w zależności od konformacji rybozy.
115
zaproponowana przeze mnie metoda obliczania odległości między protonami dla różnych
konformacji pierścieni cukrowych w oparciu o modelowanie komputerowe (rozdz. III.1.3),
może dawać dokładniejsze wyniki. Wyliczone tą metodą odległości H1'-H2', H1'-H3' i
H1'-H4' dla różnych parametrów pseudorotacji P i m przedstawione są w postaci wykresów
warstwicowych na rysunkach 77-79. Dla m = 40o otrzymane wykresy funkcji odległości
H1'-H2', H1'-H3' i H1'-H4' od kątów fazowych pseudorotacji P są porównywalne z danymi
dla dezoksyrybozy244. Przyjmując założenie jednakowych czasów korelacji c i odwrotnie
proporcjonalną zależność NOE od szóstej potęgi odległości między protonami, dla modelu
izolowanej pary spinów ISPA347, obliczyłem względne objętości sygnałów H1'-H2', H1'-H3' i
H1'-H4' w stosunku do objętości sygnałów dla H5-H6 cytydyny. Poszczególne wykresy
wartości NOE w zależności od kątów pseudorotacji P i m przedstawione zostały na
rysunkach 77-79.
Z obliczeń wynika, że konformacje o kątach fazowych P zawartych w przedziale od 0o do
o
30 najlepiej odpowiadają eksperymentalnym wartościom NOE dla par H1'-H2', H1'-H3',
H1'-H4' wszystkich reszt nukleotydowych r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2. Wyniki te
potwierdzają konformacje C3'-endo wszystkich pierścieni rybozy i 2'-O-metylorybozy obu
dupleksów, które wcześniej zostały wyznaczone z analizy sprzężeń skalarnych.
Analiza konformacyjna pierścieni cukrowych oparta na intranukleotydowych efektach
Overhausera może dawać w niektórych przypadkach dokładniejsze wyniki niż dane
otrzymywane z wicynalnych sprzężeń skalarnych. Dotyczy to szczególnie tych przypadków,
gdy poszczególne sprzężenia 3JH1'H2', 3JH2'H3' i 3JH3'H4' przyjmują wartości w zakresie 3-7 Hz.
Takie wartości są często spotykane w niestabilnych, jednoniciowych strukturach RNA.
Podobny zakres wartości przyjmowały stałe sprzężeń 3JH1'H2', 3JH2'H3' i 3JH3'H4' dla
jednoniciowych struktur r(CGCGCG) i 2'-O-Me(CGCGCG) w temperaturach powyżej punktu
topnienia dupleksów. W tych sytuacjach otrzymane za pomocą programu PSEUROT wyniki
są często niejednoznaczne. Wprowadzenie do obliczeń dodatkowych parametrów związanych
z wartościami NOE dawałoby dokładniejsze wyniki. Ponadto dla RNA o dużych masach
cząsteczkowych, dokładny pomiar indywidualnych sprzężeń 3JH1'H2', 3JH2'H3' i 3JH3'H4' jest na
ogół niemożliwy ze względu na zagęszczenie sygnałów i znaczne poszerzenie linii
rezonansowych spowodowane skróceniem czasów relaksacji T2244. Efekt Overhausera zależy
głównie od procesów relaksacji spin-sieć, opisanych przez czasy relaksacji T1. Skrócenie
czasów relaksacji spin-spin (T2) i związany z tym zanik multipletowej struktury sygnałów
rezonansowych nie ma tutaj tak istotnego znaczenia, jak w przypadku wicynalnych sprzężeń
skalarnych, gdzie wymagane są widma o bardzo wysokiej rozdzielczości z wąskimi liniami
spektralnymi.
III.8.4. Analiza kątów torsyjnych wokół wiązań N-glikozydowych reszt
nukleotydowych r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2.
Wzajemne położenie heterocyklicznych zasad reszt nukleotydowych względem pierścieni
cukrowych określają kąty torsyjne wokół wiązań N-glikozydowych. W strukturach kwasów
nukleinowych wartości tych kątów, oznaczone jako  z, znajdują się w dwóch
charakterystycznych zakresach od -180o do -90o (konformacja anti) i od 40o do 90o
(konformacja syn)233. Przy określeniu konformacji syn/anti jednostek nukleotydowych
łańcuchów RNA i DNA stosowane są metody oparte na relacjach pomiędzy kątami
torsyjnymi  a wartościami heteronuklearnych stałych sprzężeń skalarnych, przesunięć
chemicznych oraz na podstawie badań NOE.
116
a)
4,0
Odległość H6/H8 - H1' [A]
3,8
H6 - H1'
H8 - H1'
3,6
3,4
3,2
3,0
2,8
2,6
2,4
2,2
-180
-144
-108
-72
-36
0
36
72
108
144
180
72
108
144
180
o
Kąt pseudorotacji P [ ]
b)
1,6
Objetość sygnałów NOE
1,4
1,2
H6 - H1'
H8 - H1'
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
-180
-144
-108
-72
-36
0
36
Kąt torsyjny 
Rys. 80.
A. Zależność odległości H6/H8 - H1’ od kąta  wyznaczona na podstawie modeli cytydyny i
guanozyny.
B. Zależność względnych objętości intranukleotydowych sygnałów H6/H8 - H1’ (w stosunku do
H5-H6) od kąta  obliczone na podstawie modelu ISPA ze wzoru:
AijNOE 
d H6 5 H 6
, gdzie dH5H6 = 2,45 Å..
d ij6
117
P
a) dH8-H2'
b) dH8-H3'
350
350
2.00
300
2.00
4.00
4.50
3.00
5.50
3.50
250
4.50
4.00
4.50
2.50
250
5.00
2.00
300
6.00
4.00
200
200
3.50
_B
150
5.00
3.00
_B_
4.00 150
4.50
5.00
2.50
100
100
4.00
4.00
2.50
3.50
50
3.00
50
4.00
_A
_Z
2.00
4.50
5.00
4.00
_Z
2.00
_A
0
0
-150
-100
-50
0
50
100
150
-150
-100
Kąt glikozydowy  O4'-C1'-N9-C4
P
4.50
3.50
2.50
3.00
-50
0
50
100
150
Kąt glikozydowy  O4'-C1'-N9-C4
d) dH6-H3'
c) dH6-H2'
350
350
3.50
4.50
4.00
3.00
5.00
300
2.00
4.50
250
4.00
300
4.50
2.50
5.50
3.00
250
3.50
200
4.00
3.50
_B
150
6.00
200
4.00
5.00 4.50
4.00
2.50
_B
150
4.50
2.00
100
100
3.50
2.00
50
3.00
3.00
2.50
4.00
2.00
_A
_A
0
-100
-50
0
50
100
150
-150
-100
Kąt glikozydowy O4'-C1'-N1-C2'
3.50
-50
0
50
100
150
Kąt glikozydowy  O4'-C1'-N1-C2'
dH5-H3'
e) dH5-H2'
P
4.50
0
-150
350
4.00
2.50
50
3.50
350
5.50
5.00
300
300
4.50
4.00
4.00
5.00
5.50
250
250
6.00
5.50
5.50
200
5.50
3.00
_B_
150
5.50
200
2.00
5.00
5.00
_B
150
4.50
100
100
6.00
4.00
5.50
4.50
50
_A
50
4.50
5.00
_A
0
0
-150
-100
-50
0
50
100
150
-150
-100
5.00
-50
0
50
100
Kąt glikozydowy  O4'-C1'-N1-C2
Kąt glikozydowy  O4'-C1'-N1-C2'
Rys. 81.
6.00 5.50
5.00
4.00
150
ponad 6.00 
5.50 - 6.00 
5.00 - 5.50 
4.50 - 5.00 
4.00 - 4.50 
3.50 - 4.00 
3.00 - 3.50 
2.50 - 3.00 
2.00 - 2.50 
poniżej 2.00 
Odległości w funkcji kąta glikozydowego  między protonami H8-H2' (a), H8-H3' (b), H6-H2' (c),
H6-H3' (d), H5-H2' (e), H5-H3' (f). Symbolami A, B i Z oznaczone zostały wartości kątów P i  dla
struktur A-RNA, B-DNA i Z-RNA.
118
Kąty  dla każdej reszty nukleotydowej r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2
wyznaczyłem z analizy intensywności sygnałów korelacyjnych widm 2D-NOESY (m = 80 i
150 ms) wykonanych w temp. 30oC . Małe objętości sygnałów H6/H8-H1' od 0,07 do 0,15 w
stosunku do H5-H6 (rys. 80) są dowodem na konformację anti wszystkich jednostek
nukleotydowych badanych dupleksów o kątach torsyjnych  w zakresie od -185o do -140o
Dodatkowy pomiar kątów torsyjnych wokół wiązań glikozydowych dokonałem na
podstawie analizy integracji intranukleotydowych sygnałów H6/H8-H2' i H6/H8-H3' z widm
2D-NOESY [30oC, m = 80 i 150 ms]. Wielkości wzmocnienia NOE zależą w tym przypadku
również od konformacji rybozy i kąta torsyjnego wokół wiązania N-glikozydowego. Wykresy
odległości pomiędzy protonami zasad a protonami H2', H3', dla różnych kątów  i
konformacji rybozy, które sporządziłem na podstawie własnych obliczeń (rozdz. III.1.3),
przedstawione są na rysunku 81. Zmierzone objętości sygnałów korelacyjnych widm
2D-NOESY wynoszą 0,05-0,12 dla H6-H2' i H8-H2' oraz 0,24-0,75 dla H6-H3' i H8-H3'.
Tym wielkościom odpowiadają odległości H6/H8-H2' w zakresie od 3,55 do 4,0 Å, i od 2,57
do 3,11 Å dla H6/H8-H3'. Przyjmując konformację C3'-endo otrzymaną na podstawie analizy
stałych sprzężeń (rozdz. III.8.3.), odległościom tym odpowiadają kąty  mieszczące się w
przedziale od -177o do -154o. Wynik ten jest zgodny, w granicach błędu, z danymi
otrzymanymi na podstawie analizy sygnałów NOE dla protonów H6/H8-H1'.
III.8.5. Analiza kątów torsyjnych w łańcuchach fosforoestrowych.
Kąty torsyjne ,  i  łańcuchów fosforoestrowych dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-OMe(CGCGCG)2 otrzymałem z analizy eksperymentalnych wartości sprzężeń skalarnych.
Małym wartościom 3JH4'H5' (2,0 ± 1 Hz) i 3JH4'H5'' (2,5 ± 1 Hz), które wyznaczone zostały na
podstawie struktury sygnałów korelacyjnych widm DQF-COSY (rys. 74), odpowiadają kąty 
w zakresie od 41 do 58o 264. Dane te wskazują na konformacją gauche+. Z empirycznej
zależności264
 gauche [%] 
+
13,3 ( 3J H 4' H 5'  3J H 4' H 5'' )
100 ,
9,7
(18)
wynika, że dla jednostek nukleotydowych G2, C3, G4, C5 i G6 udział tego rotameru
wynosi prawie 100 %. Świadczy to o dużej stabilności struktury obu badanych dupleksów.
Dla terminalnych reszt C1, wartości stałych sprzężeń 3JH4'H5'' są nieznacznie większe i
wynoszą ok. 3,7 Hz. Prawdopodobnie, powodem tego jest zawartość pewnej frakcji o
konformacjach trans, które mogą występować na swobodnych końcach 5' łańcuchów RNA.
Udział tej frakcji jest mały i nie przekracza 20%.
Kąty torsyjne  i  określiłem na podstawie obserwowanych heterojądrowych sprzężeń
skalarnych pomiędzy atomami fosforu a protonami H3', H4', H5' i H5''. Odpowiadające tym
sprzężeniom sygnały korelacyjne są widoczne w widmach COLOC (rys. 68, 69). Intensywne
sygnały H3'- P wskazują na duże wartości stałych sprzężeń skalarnych pomiędzy spinami tych
jąder. Z kolei słabym sygnałom P-H4', P-H5' i P-H5'' odpowiadają małe heterojądrowe
sprzężenia. Ta jakościowa, wstępna informacja potwierdzona została dokładną analizą
jednowymiarowych widm 31P NMR wykonanych w zakresie temperatur od 5 do 40oC, oraz
wynikami uzyskanymi na podstawie J-spektroskopii. Sygnały rezonansowe atomów fosforu w
sprzężonych widmach jednowymiarowych rozszczepiały się na dublety ze stałymi sprzężenia
o wartościach ok. 10 Hz (rys. 82). Niestety, na wskutek niekorzystnych, krótkich czasów
119
relaksacji T2 jąder fosforu i stosunkowo szerokich linii spektralnych, subtelna struktura
sygnałów rezonansowych związana z małymi sprzężeniami 3JPH4', 3JPH5' i 3JPH5'' była
niewidoczna. Ponadto, nakładanie się sygnałów 31P NMR pochodzących od jąder atomów
fosforu CpG utrudniało dokładne wyznaczenie wartości sprzężeń 3JH3'P z analizy widm
jednowymiarowych wykonanych w temperaturach 15-40oC. W widmach otrzymanych
metodą J-spektroskopii (rys. 83) można była analizować jedynie wartości dużych sprzężeń.
Ze względu na istnienie licznych małych sprzężeń, które powodowały poszerzenie
składowych dubletów, dokładność pomiaru stałych sprzężeń 3JH3'P wynosiła ok. 2Hz.
Najdokładniejsze pomiary wartości heteronuklearnych sprzężeń otrzymałem z analizy widm
DQF-COSY wykonanych przy włączonym i wyłączonym generatorze częstotliwości
rezonansowej 31P. Porównując zmiany zachodzące w strukturach sygnałów korelacyjnych
widm DQF-COSY spowodowane pojawieniem się dodatkowych pasywnych sprzężeń (rys.
84) mogłem określić z dokładnością do 1Hz wartości wszystkich stałych sprzężeń skalarnych
31
P - 1H.
a)
b)
Rys. 82.
Widma 31P NMR dupleksu 2'-O-Me(CGCGCG)2 sprzężone z protonami wykonane w temp. 30oC (a) i
temp. 5oC (b). Na widmach zaznaczono strzałkami rozszczepienie sygnałów rezonansowych
spowodowanych wicynalnymi sprzężeniami H3'-P.
120
a)
b)
Rys. 83.
Widma typu J-spektroskopii dupleksów r(CGCGCG)2 (a) i 2'-O-Me(CGCGCG)2. Na osi F1
zaznaczona jest skala JPH w Hz, na osi F2 - przesunięcia chemiczne sygnałów atomów fosforu
[p.p.m.]
Wartościom 3JPH5' i 3JPH5'' ok. 2 Hz odpowiadają kąty torsyjne  w przedziale od 178o do
183o264. Jest to typowa dla struktur RNA konformacja trans. Dodatkowym potwierdzeniem tej
konformacji oraz rozpatrywanej wcześniej konformacji gauche+ dla kątów  jest istnienie
sprzężeń spinowo-spinowych przez cztery wiązania chemiczne pomiędzy atomami fosforu i
protonami H4'. Przy takich kombinacjach kątów  i , łańcuch utworzony przez atomy
P-O5'-C5'-C4'-H4' ma kształt litery W, co sprzyja oddziaływaniom dalekiego zasięgu. W
strukturach A-RNA, wartości 3JPH4' wynoszą ok. 3 Hz4.
121
a)
Rys. 84.
b)
Porównanie sygnałów korelacyjnych H3'-H2' (C5) 2'-O-Me(CGCGCG)2 widm 1H-1H DQF-COSY
[500 MHz, 30oC] odsprzęganych częstotliwością rezonansową jąder 31P (a) i bez odsprzęgania (b).
Duże stałe sprzężenia 3JH3'P (Tabela 24) wskazują na konformację trans dla kątów
torsyjnych , zawartych w przedziale 291o - 209o264. Kąty torsyjne  łańcuchów
fosforoestrowych wzdłuż wiązań C5'-C4'-C3'-O3' ściśle zależą od konformacji rybozy, które
opisane zostały w rozdziale III.8.3.
Tabela 24. Wartości stałych sprzężeń 3JH3'P, w Hz.
atom
C1pG2
G2pC3
C3pG4
G4pC5
C5pG6
r(CGCGCG)2
7,9
8,5
7,6
8,8
7,6
2'-O-Me(CGCGCG)2
8,7
9,1
8,8
9,6
8,5
Określenie kątów szkieletowych  i  łańcuchów RNA i DNA metodami NMR jest
najbardziej niepewne. Są one zdefiniowane przez atomy O3'-P-O4'-C5' i C3'-O3'-P-O5'.
Kątom tym nie odpowiadają żadne sprzężenia skalarne, które mogłyby być eksperymentalnie
mierzone. Stąd też nie wyprowadzałem dla nich osobnych więzów. Stosowane czasami więzy
na te kąty wyprowadzone na podstawie wartości przesunięć chemicznych atomów 31P
obarczone są bardzo dużym zakresem niepewności4. Analiza tych kątów torsyjnych dla
dupleksów r(CGCGCG)2 i 2''-O-Me(CGCGCG)2 na podstawie struktur przestrzeni
konformacyjnej przedstawiona została w rozdziale III.10.
122
III.9. Udokładnione struktury dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-OMe(CGCGCG)2.
III.9.1. Opis metody udokładniania struktur.
Badania strukturalne kwasów nukleinowych, które prowadzone były w latach 80-tych i
wcześniej, koncentrowały się głównie na określeniu zależności pomiędzy parametrami
wyznaczonymi z eksperymentów NMR a fragmentami struktury. W oparciu o pomiary
wielkości NOE i wartości stałych sprzężeń skalarnych określane były konformacje pierścieni
cukrowych, kąty torsyjne oraz układ wiązań wodorowych. Z tych fragmentów strukturalnych
wyznaczane były następnie struktury drugorzędowe oraz przybliżone modele struktur
trzeciorzędowych. Modelowanie komputerowe struktury lub zbioru struktur (ang.
conformational space) cząsteczek RNA, które najbardziej odpowiadają danym
eksperymentalnym NMR zapoczątkowane zostało pod koniec lat 80-tych. Obecnie stosowane
są różne metody udokładniania struktur (ang. refinement), których wybór zależy głównie od
ilości i jakości danych eksperymentalnych oraz od wielkości i dynamiki badanych cząsteczek
RNA. Dotyczy to metod stosowanych przy:
 wyznaczaniu więzów odległościowych,
 generowaniu struktur początkowych,
 modelowaniu molekularnym.
Analiza fragmentów strukturalnych r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2 w oparciu o
bezpośrednie dane eksperymentalne przedstawiona została w poprzednich rozdziałach.
Ustalone z tych badań: układ wiązań wodorowych typu Watsona-Criecka, pofałdowanie
C3'-endo pierścieni rybozy wszystkich reszt nukleotydowych, konformacje anti wokół wiązań
N-glikozydowych oraz kąty torsyjne łańcuchów fosforodiestrowych, wskazują na strukturę
helikalną typu A-RNA. Jak wynika z dalszych badań, w których zastosowałem metody
i
restryktywnej
symulacji
dynamiki
molekularnej,
struktury
r(CGCGCG)2
2'-O-Me(CGCGCG)2 w roztworach wodnych przy małym stężeniu soli wyraźnie różnią się od
formy kanonicznej.
Metody, które zastosowałem w trakcie udokładniania struktur r(CGCGCG)2 i
2'-O-Me(CGCGCG)2, są najczęściej stosowane w badaniach sztywnych, stosunkowo krótkich
dupleksów kwasów nukleinowych82,83. Dla każdego dupleksu wybrałem 16 struktur
początkowych - jedna, odpowiadająca strukturze kanonicznej A-RNA oraz 15
prawoskrętnych dupleksów o specyficznie zmodyfikowanych parametrach helikalnych.
Ogólny schemat obliczeń przedstawiony został na rysunku 85.
Proces udokładniania przebiegał w dwóch zasadniczych etapach. Pierwszy etap
przeprowadzony został za pomocą programu IRMA309 (rozdz II.6). Głównym celem tego
etapu obliczeń było wyeliminowanie wpływu dyfuzji spinów i ruchów molekularnych na
wielkości NOE347. Krótka, restryktywna dynamika molekularna zawarta w każdym cyklu
IRMA dawała pierwszą zbieżność udokładnianych struktur dupleksów. Jeszcze większą
zbieżność struktur przestrzeni konformacyjnej uzyskałem po wprowadzeniu więzów
torsyjnych otrzymanych z analizy stałych sprzężeń skalarnych (rozdz. III.8) i
przeprowadzeniu 100 ps restryktywnej dynamiki molekularnej (drugi etap udokładniania).
Końcowe struktury zebrane z każdej trajektorii rMD były całkowicie zgodne z danymi
eksperymentalnymi (wartości NOE, stałe sprzężenia). Analizę konformacyjną tych struktur
przeprowadziłem za pomocą programu CURVES315 wersja 5,11. Dla obu dupleksów,
końcowa przestrzeń konformacyjna zdefiniowana była przez 16 x 30 struktur, które
uzyskałem z 16 trajektorii rMD wyprowadzonych z różnych modeli początkowych.
123
Współrzędne kartezjańskie struktur r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2 , które otrzymałem
w wyniku uśrednienia wszystkich elementów przestrzeni konformacyjnej i zminimalizowaniu
energii, zdeponowane zostały w bazie danych Protein Data Bank (PDB). Otrzymały one
odpowiednie identyfikatory 1PBM i 1PBL.
Pomiary
wielkości NOE, sprzężeń skalarnych
więzy torsyjne
więzy odległościowe
(metoda ISPA)
16 Struktur początkowych
A-RNA,7a,7b,7c,9a,9b,9c,11a,11b,11c,13a,13b,13c,15a,15b,15c
Program IRMA ( 3 - 5 cykli)
(analiza macierzy relaksacyjnej RMA)
(rMD 5ps, 300 K, pole AMBER)
16 końcowych struktur otrzymanych z ostatnich cykli IRMA
udokładnione
więzy odległościowe
rMD ( pole AMBER, 300oK, 100 ps.)
234 więzy odległościowe i 102 torsyjne dla r(CGCGCG)2
120 więzów odległościowych i 102 torsyjne dla 2'-O-Me(CGCGCG)2
16 trajektorii
(każda trajektoria zawiera 100 struktur )
Przestrzeń konformacyjna
(30 końcowych struktur z każdej trajektorii rMD)
Uśrednione i zminimalizowane struktury
1PBL - 2'-O-Me(CGCGCG)2
1PBM - r(CGCGCG)2
Rys. 85.
Schemat udokładniania struktur r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2. Liczby w oznaczeniach
początkowych struktur wybrałem dla określenia ilości par zasad na jeden skręt dupleksu. Literami
a,b,c oznaczone zostały wartości parametru Dz (rise) początkowych struktur, które wynoszą 2,5, 2,8 i
3,1 Å.
124
III.9.2. Struktury początkowe.
W procesie udokładniania z wykorzystaniem rMD, wybór struktur początkowych o
odpowiednim rozrzucie parametrów strukturalnych, jest bardzo istotny. Wyjściowe modele
dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2 zbudowane zostały za pomocą modułu
Biopolymer zawartym w pakiecie INSIGHT II. Struktury typu prawoskrętnego dupleksu
różniły się między sobą ilością par zasad na jeden skręt podwójnej helisy (parametr n) oraz
odległością między sąsiadującymi zasadami w łańcuchach. Parametr n wynosił w najbardziej
skręconych helisach 7 i zmieniał się skokowo co dwa do wartości 15 par zasad dla najmniej
skręconych struktur. Strukturom tym odpowiadał parametr rotacyjny  (twist,  = 360o/n) o
wartościach w zakresie od -51,4 do -24o. Drugi parametr helikalny Dz (rise) zmieniał się
niezależnie od  i wynosił 2,5, 2,8 i 3,1 Å. W celu dopasowania do odpowiednio ułożonych
pierścieni zasad struktury łańcuchów fosforocukrowych, przeprowadziłem ograniczoną
minimalizację energii w polu siłowym AMBER metodą największego spadku (500 iteracji) i
metodą sprzężonych gradientów (1000 iteracji). Minimalizacja obejmowała wszystkie atomy
znajdujące się w łańcuchach fosforocukrowych, zachowując jednocześnie położenia atomów
zasad określone wcześniej przez zadane parametry helikalne  i Dz.
Rys. 86.
7a
9a
11a
13a
15a
7a
9a
11a
13a
15a
7b
9b
11b
13b
15b
7c
9c
11c
13c
15c
Struktury początkowe r(CGCGCG)2. Liczby w oznaczeniach początkowych struktur określają ilość
par zasad na jeden skręt dupleksu. Literami a,b,c oznaczone zostały wartości parametru Dz (rise)
początkowych struktur, które wynoszą 2,5, 2,8, 3,1 Å. Struktury 7a, 9a, 11a, 13a, 15a przedstawione
są w dwóch rzutach.
125
Oprócz tych 15 struktur wyjściowych (rys. 86), dodatkową strukturą początkową była
struktura kanoniczna A-RNA, która pod względem parametrów n,  i Dz najbardziej zbliżona
jest do struktury 11b.
Wszystkie struktury początkowe, które w dalszych etapach udokładniania były
dopasowywane do danych eksperymentalnych, posiadały formę prawoskrętnych dupleksów z
układem wiązań wodorowych typu Watsona-Cricka. Pierścienie cukrowe o konformacjach
North obejmowały bardzo szeroki zakres kątów fazowych pseudorotacji P o wartościach od
-26 do +90o. Najbardziej zbliżonymi do formy kanonicznej były struktury o parametrach
n = 11 (oznaczone jako 11a, 11b i 11c). Średnie odchylenia kwadratowe (rmsd) między tymi
strukturami a kanoniczną formą A-RNA wynosiły od 1,34 do 1,53 Å. Pozostałe specyficznie
modyfikowane struktury początkowe były bardziej (7a-c, 9a-c) lub mniej (13a-c, 15a-c)
skręcone w stosunku do formy kanonicznej (rys. 86). Wartości rmsd modyfikowanych
struktur początkowych w odniesieniu do formy kanonicznej podane są w tabeli 25.
Tabela 25.
Dz [Å]
2,5
a
2,8
b
3,1
c
Wartości rmsd pomiędzy strukturami wyjściowymi a kanoniczną strukturą A-RNA [w Å]
7
3,27
3,28
3,31
Ilość par zasad na jeden skręt helisy
9
11
13
1,73
1,53
1,83
1,59
1,38
1,78
1,68
1,34
1,68
15
2,10
2,05
1,97
16 struktur początkowych 2'-O-Me(CGCGCG)2. posiadały te same parametry, co
odpowiadające im struktury r(CGCGCG)2. W modelach wyjściowych tych modyfikowanych
RNA, grupy hydroksylowe zastąpione zostały grupami 2'-O-metylowymi. Grupy
2'-O-metylowe skierowane zostały w kierunku małej bruzdy, co zgodne było z danymi
eksperymentalnymi i wynikało z analizy energii w polu AMBER, która przy takiej orientacji
przyjmowała najniższe wartości. Ładunki elektrostatyczne grup 2'-O-metylowych otrzymane
zostały za pomocą programu MOPAC.
III.9.3. Uściślenie więzów odległościowych metodą IRMA (I etap
udokładniania struktur).
Wstępne więzy odległościowe dla obu badanych dupleksów, wyznaczone na podstawie
intensywności sygnałów korelacyjnych widm 2D-NOESY (500 MHz, m. = 80, 150 ms)
metodą ISPA wg. wzoru (13), były następnie udokładniane poprzez analizę pełnej macierzy
relaksacyjnej RMA (rys. 34, rozdz. II.6.3). W obliczeniach, przyjąłem czas korelacji
c=4·10-9 s, który wyznaczyłem na podstawie przybliżonego wzoru Williamsona347:
 c  10 12 WM ,
(19)
gdzie WM jest masą cząsteczkową dupleksu, wyrażoną w Daltonach. Dla grup metoksylowych
przyjąłem model trójstanowy z czasem korelacji trzykrotnie krótszym od pozostałych
protonów. W zależności od struktury początkowej przeprowadziłem od 3 do 5 cykli. W
każdym cyklu obliczane były, na podstawie aktualnej struktury, teoretyczne objętości
sygnałów korelacyjnych widm 2D-NOESY, które były następnie normalizowane i
porównywane z wartościami
eksperymentalnymi.
Po obliczeniu
czynników R,
budowana
była macierz hybrydowa złożona z teoretycznych i eksperymentalnych
szybkości
126
Tabela 26. Minimalne Dd i maksymalne Dg odległości między protonami otrzymane z ostatnich cykli IRMA
dla dupleksu r(CGCGCG)2. Wartości te stanowiły dolne i górne granice więzów odległościowych
w 100 ps rMD.
Atom 1
Atom 2
Dd [Å]
Dg [Å]
Atom 1
Atom 2
Dd [Å]
Dg [Å]
H1'(C1)
H1'(C1)
H1'(C1)
H1'(C1)
H1'(C1)
H1'(C1)
H2'(C1)
H2'(C1)
H2'(C1)
H2'(C1)
H3'(C1)
H3'(C1)
H4'(C1)
H4'(C1)
H4'(C1)
H5'(C1)
H5'(C1)
H5''(C1)
H6(C1)
H6(C1)
H2'(C1)
H4'(C1)
H6(C1)
H5(C1)
H5'(G2)
H8(G2)
H5(C1)
H6(C1)
H1'(G2)
H8(G2)
H5(C1)
H8(G2)
H5'(C1)
H5''(C1)
H6(C1)
H5''(C1)
H6(C1)
H6(C1)
H5(C1)
H8(G2)
2.571
2.629
2.873
4.162
4.279
3.610
4.793
3.291
3.292
2.156
4.101
3.227
2.088
1.810
3.811
1.526
3.164
3.312
1.892
3.765
3.647
3.752
4.056
5.292
4.873
5.017
5.566
4.232
4.756
2.985
5.056
4.000
2.693
2.705
5.024
2.123
3.837
4.462
2.662
4.837
H1'(G4)
H1'(G4)
H1'(G4)
H1'(G4)
H1'(G4)
H1'(G4)
H1'(G4)
H1'(G4)
H2'(G4)
H2'(G4)
H2'(G4)
H3'(G4)
H3'(G4)
H4'(G4)
H5'(G4)
H5''(G4)
H8(G4)
H2'(G4)
H3'(G4)
H4'(G4)
H5'(G4)
H5''(G4)
H8(G4)
H5'(C5)
H6(C5)
H8(G4)
H1'(C5)
H6(C5)
H8(G4)
H6(C5)
H8(G4)
H8(G4)
H8(G4)
H5(C5)
2.544
3.556
3.120
3.878
4.176
3.173
4.510
3.832
3.270
2.980
2.126
2.657
3.315
3.904
3.239
3.262
2.475
3.150
4.235
4.030
4.768
5.263
3.931
5.613
4.922
3.910
3.942
3.008
3.439
3.962
4.771
3.959
4.218
3.664
H1'(G2)
H1'(G2)
H1'(G2)
H1'(G2)
H1'(G2)
H1'(G2)
H1'(G2)
H2'(G2)
H2'(G2)
H2'(G2)
H3'(G2)
H3'(G2)
H4'(G2)
H5'(G2)
H5''(G2)
H8(G2)
H8(G2)
H2'(G2)
H4'(G2)
H5'(G2)
H8(G2)
H5'(C3)
H6(C3)
H5(C3)
H8(G2)
H1'(C3)
H6(C3)
H8(G2)
H6(C3)
H8(G2)
H8(G2)
H8(G2)
H6(C3)
H5(C3)
2.609
3.204
3.971
3.198
4.022
3.642
4.484
3.405
4.165
2.252
2.192
3.416
4.500
2.756
3.143
3.908
3.677
3.547
4.223
5.116
4.419
4.693
4.923
5.559
4.370
5.509
3.073
3.492
4.287
5.751
3.853
5.154
5.142
5.123
H1'(C5)
H1'(C5)
H1'(C5)
H1'(C5)
H1'(C5)
H1'(C5)
H2'(C5)
H2'(C5)
H2'(C5)
H2'(C5)
H2'(C5)
H2'(C5)
H2'(C5)
H3'(C5)
H3'(C5)
H4'(C5)
H5'(C5)
H5''(C5)
H6(C5)
H2'(C5)
H3'(C5)
H4'(C5)
H6(C5)
H5'(G6)
H8(G6)
H5''(C5)
H5(C5)
H6(C5)
H1'(G6)
H2'(G6)
H5''(G6)
H8(G6)
H6(C5)
H8(G6)
H6(C5)
H6(C5)
H6(C5)
H5(C5)
2.158
3.482
2.979
3.102
4.394
3.688
3.966
4.210
3.103
3.608
4.693
3.342
2.133
2.135
2.601
2.736
3.464
3.627
2.296
3.032
4.222
3.721
4.048
5.058
4.639
4.828
5.512
4.203
4.411
5.115
4.173
2.695
2.969
3.744
3.927
4.234
3.874
2.817
H1'(C3)
H1'(C3)
H1'(C3)
H1'(C3)
H1'(C3)
H1'(C3)
H1'(C3)
H1'(C3)
H1'(C3)
H2'(C3)
H2'(C3)
H2'(C3)
H2'(C3)
H3'(C3)
H3'(C3)
H3'(C3)
H4'(C3)
H5'(C3)
H5''(C3)
H6(C3)
H6(C3)
H2'(C3)
H3'(C3)
H4'(C3)
H5'(C3)
H5''(C3)
H6(C3)
H5(C3)
H5'(G4)
H8(G4)
H5(C3)
H6(C3)
H1'(G4)
H8(G4)
H5(C3)
H6(C3)
H8(G4)
H6(C3)
H6(C3)
H6(C3)
H5(C3)
H8(G4)
2.362
3.551
3.233
4.473
4.253
3.157
4.378
3.816
3.356
4.607
3.440
3.428
2.096
4.010
2.733
3.557
4.042
3.845
3.525
1.999
3.664
3.048
4.520
3.606
5.100
5.275
4.128
5.429
4.980
4.786
5.670
4.005
4.243
2.678
5.001
3.323
4.536
4.954
4.409
4.125
2.772
4.917
H1'(G6)
H1'(G6)
H1'(G6)
H1'(G6)
H1'(G6)
H2'(G6)
H2'(G6)
H2'(G6)
H3'(G6)
H3'(G6)
H4'(G6)
H4'(G6)
H5'(G6)
H5''(G6)
H2'(G6)
H3'(G6)
H4'(G6)
H5''(G6)
H8(G6)
H3'(G6)
H4'(G6)
H8(G6)
H5''(G6)
H8(G6)
H5''(G6)
H8(G6)
H8(G6)
H8(G6)
2.335
3.446
2.512
4.366
3.086
1.850
2.880
3.204
2.049
2.162
1.861
3.436
3.443
3.270
3.043
4.199
3.583
5.139
4.084
2.628
3.678
4.177
2.842
3.025
2.611
4.213
3.828
4.105
wzajemnej relaksacji. Po wykonaniu odwrotnej procedury (ang. back calculation), z
hybrydowej macierzy otrzymywałem nowe odległości między protonami, które jako
zaktualizowane więzy strukturalne wprowadzane były do protokółu restryktywnej dynamiki
127
molekularnej. Symulacja dynamiki molekularnej przeprowadzana była w temperaturze 300 K
w polu siłowym AMBER w zakresie 5 ps i kończyła każdy cykl. Obliczenia był przerywane
wówczas, gdy kolejny cykl nie poprawiał wartości czynników R. Obliczone czynniki wg.
wzoru (15) wynosiły 0,02 i 0,01 dla r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2 i były około
dwukrotnie mniejsze w porównaniu do wartości obliczonych dla struktur kanonicznych
A-RNA.
Tabela 27.
Minimalne Dd i maksymalne Dg odległości między protonami otrzymane z ostatnich cykli
IRMA dla dupleksu 2'-O-Me(CGCGCG)2. Wartości te stanowiły dolne i górne granice więzów
odległościowych w 100 ps rMD. Odległości związane z protonami grup metylowych odnoszone
były do tzw. pseudoatomów (uśrednione położenie protonów).
Atom 1
Atom 2
Dd [Å]
Dg [Å]
Atom 1
Atom 2
Dd [Å]
Dg [Å]
H1'(C1)
H1'(C1)
H3'(C1)
H3'(C1)
H5''(C1)
H6(C1)
2'-O-Me(C1)
2'-O-Me(C1)
2'-O-Me(C1)
2'-O-Me(C1)
H6(C1)
H8(G2)
H6(C1)
H8(G2)
H6(C1)
H5(C1)
H1'(C1)
H1'(G2)
H6(C1)
H8(G2)
3.332
4.201
2.798
3.427
4.061
2.371
2.256
3.416
5.254
4.042
3.947
5.075
3.247
4.052
4.656
2.791
2.781
4.194
5.804
4.820
H1'(G4)
H1'(G4)
H3'(G4)
H3'(G4)
H5''(G4)
2'-O-Me(G4)
2'-O-Me(G4)
H8(G4)
H6(C5)
H8(G4)
H6(C5)
H8(G4)
H1'(G4)
H1'(C5)
3.444
4.200
2.711
2.867
3.579
2.454
2.727
4.049
5.100
3.337
3.520
4.312
2.874
3.739
H1'(G2)
H1'(G2)
H3'(G2)
H3'(G2)
H5''(G2)
2'-O-Me(G2)
2'-O-Me(G2)
2'-O-Me(G2)
2'-O-Me(G2)
H8(G2)
H6(C3)
H8(G2)
H6(C3)
H8(G2)
H1'(G2)
H1'(C3)
H8(G2)
H6(C3)
3.241
4.010
2.790
3.067
3.570
2.237
2.918
5.246
3.688
3.999
5.217
3.418
3.793
4.405
2.740
3.858
6.012
4.759
H1'(C5)
H1'(C5)
H3'(C5)
H3'(C5)
H5''(C5)
H6(C5)
2'-O-Me(C5)
2'-O-Me(C5)
2'-O-Me(C5)
2'-O-Me(C5)
H6(C5)
H8(G6)
H6(C5)
H8(G6)
H6(C5)
H5(C5)
H1'(C5)
H1'(G6)
H6(C5)
H8(G6)
3.370
4.313
2.468
3.282
3.770
2.206
2.307
3.187
4.505
4.297
3.988
4.952
3.209
3.813
4.388
2.728
2.837
4.040
5.506
5.730
H1'(C3)
H1'(C3)
H3'(C3)
H3'(C3)
H5''(C3)
H6(C3)
2'-O-Me(C3)
2'-O-Me(C3)
2'-O-Me(C3)
2'-O-Me(C3)
H6(C3)
H8(G4)
H6(C3)
H8(G4)
H6(C3)
H5(C3)
H1'(C3)
H1'(G4)
H6(C3)
H8(G4)
3.263
4.352
2.423
3.238
3.584
2.230
2.176
3.063
4.736
4.598
4.002
4.931
3.026
4.169
4.497
2.727
2.696
4.015
5.704
5.500
H1'(G6)
H3'(G6)
H5''(G6)
2'-O-Me(G6)
2'-O-Me(G6)
H8(G6)
H8(G6)
H8(G6)
H1'(G6)
H8(G6)
3.555
2.617
3.581
2.362
5.017
4.079
3.271
4.241
2.999
6.067
Obliczenia wykonywane były za pomocą programu IRMA zawartym w module
NMRchitect. Celem tych obliczeń było wyeliminowanie wpływu dyfuzji spinów i ruchów
molekularnych na wartości wzmocnień NOE. Obliczone odległości między protonami
otrzymane w ostatnich cyklach IRMA, w zależności od początkowych struktur, wahały się w
zakresie mniejszym niż 20%. Maksymalne i minimalne wartości dla poszczególnych par
protonów, które przyjęte zostały w dalszym etapie jako dolne (rmin) i górne (rmax) granice
więzów odległościowych, zestawione zostały w tabelach 26 i 27. W porównaniu do
początkowych odległości między protonami wyznaczanymi wg. wzoru (13), największe
różnice występowały dla dużych odległości powyżej 4 Å. W tych przypadkach, udokładnione
odległości były na ogół większe niż początkowe wartości otrzymane metodą ISPA.
Najsilniejszy wpływ dyfuzji spinów na intensywności NOE zaznaczył się dla grup
2'-O-metylowych. Związane jest to z silnymi oddziaływaniami dipolowymi tych grup, które
dają dodatkowe drogi przenoszenia magnetyzacji w układach wielospinowych. Początkowe
odległości pomiędzy pseudoatomami wyznaczonymi przez protony grup metylowych a
128
protonami H6/H8 wynosiły poniżej 5 Å. W wyniku udokładnienia metodą IRMA, wartości te
były większe i wynosiły ok. 6 Å. W przypadku dużych i średnich wartości NOE, które
odpowiadają małym odległościom poniżej 3,5 Å, różnice w odległościach między protonami
otrzymanymi metodami ISPA i IRMA mieściły się w granicach błędu pomiarowego.
Prowadzone w każdym cyklu IRMA krótkie, 5 ps restryktywne dynamiki molekularne
dawały wyraźną zbieżność struktur końcowych w stosunku do różnorodności struktur
początkowych. Wartości rmsd (wzór 17) pomiędzy końcowymi strukturami otrzymanymi z
IRMA wahały się od 0,8 do 1,7 Å. Większość otrzymanych struktur końcowych była bardziej
zwinięta w stosunku do kanonicznej struktury A-RNA. Szczegółowa analiza tych struktur
(ang. distance restricted) wykazywała jednak duże odchylenia wartości kątów torsyjnych w
stosunku do oczekiwanych i wyznaczonych na podstawie wartości stałych sprzężeń
skalarnych.
III.9.4. Restryktywna dynamika molekularna (II etap udokładniania
struktur).
Wstępnie wprowadzona metoda rMD w poszczególnych cyklach IRMA ograniczona była
do bardzo krótkich interwałów czasowych, wynoszących 5 ps. Nie dawały one wymagającej
zgodności z wszystkimi eksperymentalnymi danymi NMR, dlatego przeprowadziłem drugi
etap udokładniania metodą rMD w przedziale czasowym 100 ps. Oprócz udokładnionych
więzów odległościowych (Tabela 26, 27) otrzymanych metodą IRMA, wprowadzone zostały
więzy na kąty torsyjne. Większość z nich wyprowadzona została z analizy sprzężeń
skalarnych 3JHH264, 3JPH266 (rozdz III.8.). Zakres niepewności dla kątów torsyjnych
H1'-C1'-C2'-H2', H2'-C2'-C3'-H3', H3'-C3'-C4'-H4' wynosił  10o, dla pozostałych
(H5'-C5'-C4'-H4', H5''-C5'-C4'-H4', H3'-O3'-C3'-P.)  20o. Dodatkowo, na podstawie
wcześniejszych analiz, wprowadzone zostały więzy dla kątów wokół wiązań
N-glikozydowych. Ogółem, do obliczeń rMD na tym etapie wprowadziłem 120 więzów
torsyjnych dla obu dupleksów oraz 234 więzy odległościowe dla r(CGCGCG)2 i 120 więzów
odległościowych dla 2'-O-Me(CGCGCG)2. Większa ilość więzów odległościowych w
przypadku r(CGCGCG)2, podyktowana była większą niepewnością pomiarową danych
eksperymentalnych. Średnia ilość wszystkich więzów przypadająca na jedną resztę
nukleotydową wynosiła 28 i 18,5 dla r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2.
r(CGCGCG)2
Rys. 87.
2'-O-Me(CGCGCG)2
Ilość więzów strukturalnych, przypadająca na poszczególne reszty nukleotydowe dupleksów
r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2.
129
Statystyka więzów strukturalnych, które były wykorzystane w metodzie rMD, podana jest
na rysunkach 87-89. Dodatkowe potencjały VNOE i VTORS związane z więzami
odległościowymi i torsyjnymi wprowadzone do potencjału AMBER (rozdz. II.6.2) opisane są
wzorami (12a) i (12b). Stałe siłowe wynosiły 20 kcal.mol-1.Å-2 dla wszystkich więzów
odległościowych i 30 kcal.mol-1.rad-2 dla więzów torsyjnych. W celu uzyskania elektrycznie
obojętnych dupleksów, ładunki wszystkich grup fosforanowych zredukowane zostały do
wartości -0.32 ładunku elektronu.
Rys. 88.
Ilość więzów odległościowych w zależności od różnicy rmax-rmin dla dupleksów r(CGCGCG)2 (a) i
2'-O-Me(CGCGCG)2.(b) z procentowym udziałem w schematach kołowych.
130
Dla każdego dupleksu zarejestrowałem 16 trajektorii restryktywnej dynamiki
molekularnej, które rozpoczynały się od struktur otrzymanych z pierwszego etapu
udokładniania. Każda trajektoria rMD zawierała 100 struktur, bowiem były one zbierane co 1
ps rMD. Ostatnie 30 struktur z każdej trajektorii były zgodne z danymi NMR i tworzyły
przestrzeń konformacyjną dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2 (rys.90). W sumie
analizowanych było 2x16x30 struktur. Dla wszystkich dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-OMe(CGCGCG)2, średnia wartość rmsd pomiędzy tymi strukturami wynosiła jedynie 0.8 Å.
Wartość ta jest prawie dwukrotnie mniejsza w porównaniu do struktur otrzymanych po
pierwszym etapie udokładniania i przeszło trzykrotnie mniejsza w stosunku do struktur
początkowych.
60
Ilość więzów
50
40
30
20
10
0
1
2
3
4
5
6
7
5
6
7
Średnie wartości D [A]
30
Ilość więzów
25
20
15
10
5
0
1
2
3
4
Średnia odległość D [A]
Rys. 89.
Ilość więzów odległościowych w zależności od średniej odległości D = (rmin + rmax)/2 dla dupleksów
r(CGCGCG)2 (a) i 2'-O-Me(CGCGCG)2.(b).
131
Współrzędne kartezjańskie końcowych struktur r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2
(rys. 90) zdeponowane zostały w banku danych PDB. Struktury te otrzymane zostały po
uśrednieniu wszystkich elementów przestrzeni konformacyjnej i przeprowadzeniu krótkiej
minimalizacji energii metodą sprzężonych gradientów (100 iteracji, bez więzów).
Rys. 90.
r(CGCGCG)2
2'-O-Me(CGCGCG)2
r(CGCGCG)2
2'-O-Me(CGCGCG)2
Struktura kanoniczna A-RNA
Struktury przestrzeni konformacyjnej (30 nałożonych struktur otrzymanych z rMD) dupleksów
r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2. (a). Struktury końcowe (w dwóch rzutach), otrzymane po
uśrednieniu struktur przestrzeni konformacyjnej i minimalizacji energii (b). Dla porównania,
przedstawiono strukturę kananoniczną A-RNA. Atomy węgla grup 2'-O-metylowych zaznaczone są
kolorem czerwonym.
132
III.9.5. Analiza struktur przestrzeni konformacyjnej i końcowych struktur
dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2.
Struktury dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2 wykazują bardzo duże
podobieństwo (rys 90). Średnia wartość odchylenia standardowego (rmsd) pomiędzy
końcowymi strukturami wynosi 1,0 Å. Podobieństwo obu struktur jest jeszcze większe, jeżeli
odrzucone zostaną końce dupleksów. Wartość rmsd dla czterech wewnętrznych par CG
wynosi 0,8 Å. Wyniki te sugerują, że ogólna struktura obu dupleksów jest spowodowana
specyficznymi właściwościami samej sekwencji naprzemiennych par CG. Wpływ
2'-O-metylacji na strukturę macierzystego RNA jest bardzo mały. Obie struktury są
prawoskrętnymi dupleksami i wyraźnie różnią się od formy kanonicznej (rys. 90), otrzymanej
z badań dyfrakcyjnych włókien kwasów nukleinowych233,317. Średnie odchylenie standardowe
(rmsd) w stosunku do kanonicznej formy dupleksu wynosi 1,6 Å dla r(CGCGCG)2 oraz 1,8 Å
dla 2'-O-Me(CGCGCG)2.
Szczegółowe badania współrzędnych końcowych struktur i molekuł przestrzeni
konformacyjnej r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2 przeprowadziłem za pomocą programu
CURVES (wersja 5,11). Jak oczekiwałem, w obu strukturach występują wiązania wodorowe
typu Watsona-Cricka. Rybozy wszystkich reszt nukleotydowych r(CGCGCG)2 i
2'-O-Me(CGCGCG)2 posiadają konformację C3'-endo. Pierścienie heterocyklicznych zasad
przyjmują położenie anti. Kąty torsyjne wokół wiązań N-glikozydowych oraz łańcuchów
fosforoestrowych struktur przestrzeni konformacyjnej przedstawione są w tabeli 28.
Tabela 28.
Kąty torsyjne łańcuchów fosforoestrowycha), parametry fazowe pseudorotacji P oraz kąty  struktur
przestrzeni konformacyjnej b).

Reszta
C1
G2
C3
G4
C5
G6
średnia
a)

ribo
2-OMe
ribo
2-OMe
ribo
2-OMe
292(5)
281(4)
298(4)
266(7)
295(5)
286
277(9)
267(7)
262(8)
247(8)
274(8)
265
181(5)
189(4)
182(4)
175(4)
176(4)
181
180(4)
177(5)
179(5)
177(5)
173(4)
177
51(7)
52(6)
49(4)
43(6)
81(5)
52(4)
55
72(9)
70(7)
75(5)
79(6)
85(6)
72(6)
75
89(3)
87(3)
92(4)
90(3)
85(4)
85(4)
88
86(4)
87(3)
88(4)
93(3)
82(3)
82(4)
86
294
285
186
208

Reszta
A-RNAc)
A-DNAd)

2-OMe
A-RNAc)
A-DNAd)
C1
G2
C3
G4
C5
G6
średnia

ribo
49
45
88
88
P.


ribo
2-OMe
ribo
2-OMe
ribo
2-O-Me
ribo
2-O-Me
195(4)
189(4)
193(4)
201(4)
200(4)
196
197(4)
203(4)
201(4)
208(4)
201(4)
202
296(5)
301(3)
290(4)
301(4)
300(4)
298
285(4)
291(5)
288(5)
294(4)
288(4)
289
10(6)
13(6)
18(5)
11(5)
20(6)
8(8)
8(6)
11(4)
20(5)
13(5)
15(5)
6(7)
218(5)
208(5)
208(5)
204(5)
204(5)
195(5)
206
201(5)
202(4)
213(5)
207(5)
206(5)
191(5)
203
202
178
P  O5  C5  C4  C3  O3  P
lit. 316, 348.
d)
lit. 316, 348.
294
313
18
18
b)
c)
202
206
w nawiasach podane są odchylenia standardowe.
W badanych dupleksach RNA, charakterystyczny dla struktur typu A-RNA kanał biegnący
wzdłuż osi helisy ma zmniejszony promień. Wartości parametrów dx (x-Displ.) są wyraźnie
133
mniejsze niż w strukturze kanonicznej i wynoszą -4 i -3,3 Å dla r(CGCGCG)2 i
2'-O-Me(CGCGCG)2. (Tabela 29) Charakterystyczną cechą badanych dupleksów są mniejsze
odstępy pomiędzy sąsiadującymi parami zasad. Wartości Dz (rise) wahają się w granicach od
2,0 Å do 2,7 Å. Skręcenie par zasad wokół osi dupleksu jest większe niż w kanonicznej
strukturze A-RNA. Kąty  (twist) przyjmują wartości w zakresie od 36o do 42o. Średnia ilość
par zasad przypadająca na pełen skręt dupleksu wynosi 9,6. W centralnych fragmentach,
skręcenie helis jest większe niż na końcach. W stosunku do formy kanonicznej, nachylenie
par zasad względem głównej osi jest większe w obu badanych strukturach. Średnia wartość
inklinacji wynosi ok. 24o (Tabela 29). Zmiany inklinacji poszczególnych par zasad
obserwowane w trakcie dynamiki molekularnej są silnie ze sobą zsynchronizowane. W
wyniku oddziaływań warstwowych, wzrost inklinacji jednej pary powoduje automatyczny
wzrost wartości tego parametru dla par sąsiednich (efekt "domina"). Z analizy przebiegu
symulacji dynamiki molekularnej wynika również pewna korelacja pomiędzy inklinacją a
kątem skręcenia,  (twist). Im większa jest inklinacja tym większe jest na ogół skręcenie
helisy. Duże wahania wykazują wartości kątów propeller twist (Tabela 29), które
dostosowują się do oddziaływań sąsiadujących heterocyklicznych pierścieni par zasad. W obu
badanych strukturach, wartości kątów roll są stosunkowo małe. W fragmentach CG są one
dodatnie, co wskazuje na tendencje otwierania sąsiadujących par zasad w kierunku małej
bruzdy. Ujemne wartości parametrów roll występują natomiast w traktach GC. W tych
fragmentach dupleksów, heterocykliczne pierścienie par zasad są rozwarte w kierunku dużej
bruzdy. Podobna tendencja obserwowana była w strukturach krystalicznych dupleksów
A-DNA, zawierających więcej par CG349.
Tabela 29.
Wartości wybranych parametrów helikalnycha) dla r(CGCGCG)2 i 2-O-Me(CGCGCG)2., otrzymane z
analizy końcowych struktur po minimalizacji energii (A) i z analizy struktur przestrzeni konformacyjnej
(B). W nawiasach podano odchylenia standardowe.
Para
zasad
C1-G12
G2-C11
C3-G10
G4-C9
C5-G8
G6-C7
x-Displacement (Å)
Propeller twist (°)
2-O-Me(CGCGCG)2
r(CGCGCG)2
2-O-Me(CGCGCG)2
r(CGCGCG)2
A
B
A
B
A
B
A
B
A
B
A
B
-3.9
-4.0
-4.0
-4.0
-4.0
-3.9
-3.9(0.3)
-3.9(0.3)
-3.9(0.3)
-3.9(0.3)
-3.9(0.3)
-3.9(0.3)
-3.4
-3.2
-3.3
-3.2
-3.3
-3.1
-3.3(0.4)
-3.1(0.4)
-3.2(0.3)
-3.3(0.3)
-3.2(0.3)
-3.0(0.4)
23
23
24
25
25
25
24(6)
24(5)
23(5)
23(5)
24(5)
24(6)
23
26
28
30
24
20
21(5)
24(5)
25(5)
28(5)
20(5)
17(5)
-33
-23
-29
-29
-26
-33
-24(8)
-18(8)
-14(7)
-16(8)
-18(9)
-27(10)
-5
-17
-26
-38
-25
-23
-2(11)
-11(8)
-19(8)
-28(8)
-16(8)
-25(8)
Rise (Å)
sekwencja
par
zasad
C1-G2
G2-C3
C3-G4
G4-C5
C5-G6
Inclination (°)
2-O-Me(CGCGCG)2
r(CGCGCG)2
r(CGCGCG)2
Twist (°)
2-O-Me(CGCGCG)2
r(CGCGCG)2
Roll (°)
2-O-Me(CGCGCG)2
r(CGCGCG)2
2-O-Me(CGCGCG)2
A
B
A
B
A
B
A
B
A
B
A
B
2.1
2.6
2.0
2.5
2.1
2.1(0.4)
2.5(0.3)
2.3(0.3)
2.6(0.3)
2.1(0.4)
2.3
2.4
2.6
2.6
2.7
2.5(0.6)
2.4(0.3)
2.7(0.4)
2.5(0.3)
2.9(0.5)
37
37
39
38
38
37(3)
36(4)
44(4)
36(3)
34(4)
34
37
42
41
34
33(3)
38(3)
41(5)
40(4)
33(3)
2
-5
2
-4
3
6(4)
-5(4)
1(5)
-7(6)
8(4)
0
-3
6
-6
1
2(5)
-0(5)
5(5)
-3(5)
-1(4)
Charakterystyczną cechą struktur obu dupleksów z powtarzającymi się parami CG jest
wzajemne położenie pierścieni heterocyklicznych zasad (rys. 91). Dla sekwencji CG,
pierścienie zasad guanozyn, znajdujące się w przeciwległych łańcuchach, są ustawione
względem siebie równoległe, natomiast znajdujące się w tych samych fragmentach
pierścienie cytydyn są względem siebie wyraźnie skręcone (ok. 40o). Zasada ta dotyczy
również końcowych par zasad. Dla traktów GC sytuacja jest odwrotna. Cytydyny mają
większą tendencję do równoległego usytuowania pierścieni zasad w stosunku do guanozyn.
134
Ta cecha jeszcze bardziej jest widoczna w strukturze krystalicznej 2'-O-Me(CGCGCG)220.
Schemat ustawienia płaszczyzn heterocyklicznych pierścieni zasad w traktach CG i GC
przedstawiony jest na rysunku 92.
Rys. 91.
Rys. 92.
Odziaływania warstwowe. w r(CGCGCG)2..
Schemat ułożenia zasad w sekwencjach CG i GC.
Strzałkami zaznaczono równolegle położone pierścienie cytydynowe
135
Ukształtowanie bruzd końcowych struktur dupleksów określone zostało za pomocą
programu CURVES 6,0. Szerokość małej bruzdy wynosi 11.0 Å dla r(CGCGCG)2 i 11.4 Å dla
2'-O-Me(CGCGCG)2. W obu przypadkach, średnia głebokość tych bruzd wynosi 0,7 Å. W
celu porównania z innymi strukturami, przeprowadziłem analizę struktury bruzd dla różnych
dupleksów RNA i hybrydowych dupleksów DNA:RNA, otrzymanych w roztworze i
opisanych w PDB. Z analizy wynika liniowa zależność pomiędzy głebokością i szerokością
małej bruzdy (rys. 93). Na podstawie analizy regresji liniowej otrzymałem następujący wzór
empiryczny:
hg = - 0,61wg + 7,54,
(20)
gdzie hg i wg - oznaczają głebokość i szerokość małej bruzdy. W stosunku do kanonicznej
struktury A-RNA, małe bruzdy w strukturach r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2 są płytsze
i węższe. W przeciwieństwie do nich, w pośrednich strukturach hybrydowych RNA:DNA
(typ H dupleksów), szerokość małej bruzdy maleje, gdy struktura dąży do formy B,
charakterystycznej dla DNA. Jednocześnie, przy przejściu z typu A do B, głębokość małej
bruzdy wzrasta, co wynika z otrzymanej zależności (20) (rys. 93).
5
4
3
2
1
0
4
6
8
10
12
Szerokość małej bruzdy [Å]
Rys. 93.
Zależność pomiędzy głębokością i szerokością małej bruzdy w prawoskrętnych dupleksach kwasów
nukleinowych.
Ze względu na niepełny skręt dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2,
bezpośrednie wyznaczenie głębokości i szerokości dużych bruzd ze współrzędnych
kartezjańskich końcowych struktur jest niemożliwe. Również ilość dostępnych danych
strukturalnych, która pozwala na wyznaczenie parametrów określających kształt dużych
bruzd jest mniejsza. Mimo tych ograniczeń, z analizy dłuższych struktur helikalnych RNA i
hybrydowych DNA:RNA, otrzymałem pewne dalsze zależności (21), (22) pomiędzy
parametrami opisującymi kształt bruzd.
Hg = - 0,66Wg + 12,7
136
(21)
wg = - 0,85Wg + 11,4,
(22)
gdzie Hg i Wg - oznaczają głębokość i szerokość dużej bruzdy. Dla krótkich dupleksów, o
niepełnym skręcie, wyznaczenie parametrów Hg i Wg opisujących kształt dużych bruzd jest
niemożliwe. Jednakże, na podstawie uzyskanych zależności (20), (21), (22), obliczona
szerokość dużej bruzdy dla sekwencji z powtarzającymi się parami CG i GC powinna mieć
minimalną wartość blisko 0 Å i maksymalną głebokość ok. 12,5 Å. Zbudowane modele
r(CG)10 i 2'-O-Me(CG)10 (rys. 94) w oparciu o współrzędne dla odpowiednich dupleksów
heksamerów potwierdzają te wyniki.
Rys. 94.
Model 2'-O-Me(CG)10 , otrzymany na podstawie współrzędnych końcowej struktury dupleksu 2'-OMe(CGCGCG)2 w rzucie wzdłuż osi dupleksu (a) i w rzucie prostopadłym do osi (b). Na modelu,
sferami zaznaczone zostały atomy węgla grup 2'-O-metylowych .
Powyższa analiza parametrów helikalnych i bruzd pokazuje wyraźne zróżnicowanie
końcowych struktur r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2 w stosunku do kanonicznej formy
A-RNA. Zasadniczą kwestią jest odpowiedź na pytanie, w jakim kierunku te zmiany
zachodzą?. Ze względu na małe wartości parametrów rise i x-Displacement oraz duże kąty 
i inklinacji, różnica pomiędzy stukturą badanych dupleksów a strukturą typu A'-RNA
poli(I)*poli(C)348 jest jeszcze większa. Również znaczne różnice występują w porównaniu do
krystalicznych struktur A-DNA (12 par zasad na jeden skręt, parametr Dz (rise) = 3,0 Å).
Analiza ukształtowania bruzd jednoznacznie wskazuje, że badane struktury dupleksów można
137
traktować jako skrajne formy typu A-RNA. Struktura kanoniczna oraz znane struktury
dupleksów RNA są bardziej przesunięte w kierunku struktur hybrydowych, które są
przejściowymi formami pomiędzy typami A i B.
III.9.6. Efekt 2'-O-metylacji.
W ostatnich latach, fizykochemiczne i enzymatyczne właściwości modyfikowanych
2'-O-Me(RNA) i użycie ich jako sond oligonukleotydowych w terapii wg. strategii
antysensownych RNA były przedmiotem intensywnych badań350. Ze względu na małą ilość
danych, wpływ 2'-O-metylacji na strukturę RNA nie był dokładnie poznany. Struktury
hybrydowych dupleksów DNA:2'-O-Me(RNA) nie były udokładniane i stąd ich całkowita
struktura nie została w pełni określona351. Struktura dupleksu DNA o wzajemnie
komplementarnych sekwencjach, zawierających jedną resztę 2'-O-metyloadenozynę została
rozwiązana metodami rentgenowskimi352. W oparciu o tę sktrukturę autorzy zbudowali
komputerowy model zawierający wszystkie 2'-O-metylorybonukleotydowe reszty.
Rozwiązanie struktur 2'-O-Me(CGCGCG)2 i macierzystego r(CGCGCG)2, po raz pierwszy
umożliwia określenie wpływu 2'-O-metylacji na strukturę RNA. Jak wynika z moich badań,
efekt ten jest znacznie mniejszy niż się spodziewałem. Główny wpływ na strukturę mają
inherentne własności dupleksu zawierającego powtarzające się pary CG. Metylowanie w
pozycji 2'-OH powoduje dodatkową stabilizuję pierścieni cukrowych. Temperatura topnienia
dupleksu po 2'-O-metylacji wszystkich reszt nukleotydowych wzrasta z 68o do 76oC. Ponadto,
dane NMR wskazują na większą stabilność konformacji C3'-endo 2'-O-metylowanych reszt
C1 i G6 w stosunku do niemodyfikowanych pierścieni cukrowych. Na wzrost stabilizacji
dupleksów, może wpływać również dodatkowe hydrofobowe oddziaływanie grup
2'-O-metylowych z protonami H5' sąsiadujących po stronie 3' reszt nukleotydowych.
Odległości pomiędzy atomami węgla grup metoksylowych a tymi protonami są bardzo małe i
wynoszą średnio 3,4 Å.
Zmiany strukturalne spowodowane 2'-O-metylacją obserwowane są jedynie w obszarze
występowania grup fosforodiestrowych. Efektem tych zmian strukturalnych są różnice
wartości przesunięć chemicznych jąder fosforu oraz kątów  i zależnych od nich kątów 
(tab. 28). Wartości kątów  dla 2'-O-Me(CGCGCG)2 są o ok. 20o większe w porównaniu do
tych samych kątów torsyjnych obserwowanych w macierzystym RNA. Kąty  wykazują
natomiast odwrotną tendencję. W porównaniu do r(CGCGCG)2, w strukturze
modyfikowanego dupleksu obserwowane jest nieznaczne zwężenie kanału biegnącego wzdłuż
osi helisy (rys. 90).
Skierowanie grup 2'-O-metylowych w stronę małych bruzd powoduje ich częściowe
wypełnienie. W efekcie tego, hydrofobowe grupy metoksylowe powodują zmiany hydratacji
w obrębie małych bruzd20. Odległość pomiędzy węglami grup 2'-O-metylowych mierzona w
przekroju poprzecznym małej bruzdy jest bardzo mała i wynosi średnio 7,5 Å. Po odjęciu
promieni van der Waalsa dla grup metylowych, efektywne pole kompleksowania w obszarze
małych bruzd zwęża się w tych miejscach do 3,5 Å. Wyniki te są pośrednie pomiędzy danymi
otrzymanymi dla struktur krystalograficznych352. Odległość między węglami grup
2'-O-metylowych sąsiadujących w łańcuchu reszt nukleotydowych wynosi 6,3 Å. Wartość ta
jest zgodna z danymi otrzymanymi dla modelu 2'-O-Me(RNA) dekameru352.
138
III.10. Porównanie struktur 2'-O-Me(CGCGCG)2 w roztworze i
w krysztale.
Struktura 2'-O-Me(CGCGCG)2 w krysztale została rozwiązana, w naszym zespole, za
pomocą synchrotronu radiacyjnego z największą, jak dotychczas znaną w obrębie badań
RNA, rozdzielczością 1,3 Å20. Dupleks tworzy niepełny skręt prawoskrętnej helisy typu
A-RNA (rys. 95). Oddziaływania warstwowe między końcowymi zasadami dupleksów
powodują, że w sieci krystalicznej, poszczególne helisy są uszeregowane wzdłuż osi
helikalnych (rys. 96) w nieskończenie długie ciągi. Struktura takiego szeregu cząsteczek
przypomina model 2'-O-Me(CG)10 (rys. 94), który wygenerowałem na podstawie
współrzędnych 2'-O-Me(CGCGCG)2, uzyskanych z badań NMR. Podobnie jak w modelu,
mała bruzda dupleksu w strukturze krystalicznej jest bardzo szeroka i płytka, natomiast duża
bruzda jest maksymalnie zwężona do bardzo wąskiej i głębokiej szczeliny. Zasadniczą
różnicą pomiędzy tymi strukturami jest szerokość centralnego kanału. W strukturze
krystalicznej promień tego kanału jest większy niż w kanonicznej formie A-RNA i w modelu
2'-O-Me(CG)10.
Rys. 95
Struktura dupleksu 2'-O-Me(CGCGCG)2.w krysztale w rzucie stereoskopowym, na który zaznaczono
44 cząsteczki wody, dwa hydratowane jony magnezu oraz atomy węgla grup 2'-O-metylowych.
Ze względu na bardzo duże podobieństwo pomiędzy strukturami r(CGCGCG)2 i 2'-OMe(CGCGCG)2 otrzymanymi metodami NMR, analiza porównawcza struktur w krysztale i w
roztworze, oraz pewne wnioski wynikające z tej analizy odnoszą się również do
macierzystego RNA. Analizę porównawczą struktur przeprowadziłem ze względu na dwa
interesujące mnie pytania. Po pierwsze, interesowało mnie, jakie elementy strukturalne są
139
konserwatywne dla struktur RNA o powtarzających się sekwencjach CG i zasadniczo nie
zmieniają się w zależności od stanu skupienia (roztwór, ciało stałe)?. Po drugie, jakie różnice
pomiędzy strukturami mogą wynikać zarówno z metod ich ustalania i środowiska, w którym
badane cząsteczki się znajdują .
Rys. 96.
Upakowanie w strukturze krystalicznej 2'-O-Me(CGCGCG)2.
Analizę struktury dupleksu w krysztale przeprowadziłem za pomocą programu CURVES
(wersja 5,11). Konserwatywnymi elementami strukturalnymi badanych dupleksów są:
konformacja pierścieni cukrowych, kąty torsyjne , , ,  oraz kąty wokół wiązań
N-glikozydowych. Elementy te nie ulegają zasadniczym zmianom zarówno przy przejściu z
roztworu do stanu krystalicznego, jak również pod wpływem 2'-O-metylacji. W krysztale i w
roztworze, dominującą konformacją pierścieni cukrowych jest C3'-endo o małych kątach
fazowych pseudorotacji P. Różnice w średnich wartościach kątów torsyjnych , , , 
mierzonych w ciele stałym i w roztworze dla dupleksu 2'-O-Me(CGCGCG)2 nie przekraczają
140
10o (Tabela 30). Również bardzo małe różnice występują pomiędzy wartościami kątów 
wiązań N-glikozydowych. Wszystkie reszty nukleotydowe w strukturze krystalicznej
posiadają konformacje anti o wartościach kątów  w zakresie 193 - 202o.
Tabela 30. Kąty torsyjne łańcuchów fosforoestrowycha) oraz kąty  struktury 2'-O-Me(CGCGCG)2 w
krysztale oraz w strukturach przestrzeni konformacyjnej b) w roztworze.

Reszta

roztwór
kryształ
roztwór
-
-
-
-
C1
C7
297
G2
277(9)
267(7)
262(8)
247(8)
215
219
C3
C11
G6
G12
średnia
203(4)
291
A-RNA
A-DNAd)
P  O5  C5  C4  C3  O3  P
lit. 348
d)
lit. 316
77
kryształ
285(4)
202
291(5)
193
86
288(5)
197
213(5)
201
285
294(4)
200
207(5)
198
296
288(4)
196
291
206(5)
197
288
289
294
313
b)
202(4)
195
290
c)
roztwór
201(5)
193
290
202
82(4)

roztwór
290
-
202
178
75
287
201(4)
212
75
72
280
211
c)
a)
288
215
207
C5
72(6)
53
kryształ
197(4)
208(4)
82(3)
73

201(4)
215
G10
72
49
45
217
C9
G4
177
203
G8
93(3)
63
219
C7
G2
85(6)
63

202
75
76
54
173(4)
roztwór
88(4)
72
79(6)
186
208
kryształ
68
52
174
175
Reszta
C1
75(5)
55
177(5)
294
285
87(3)
54
182
265
82
93
61
179(5)
173
274(8)
296
291
A-RNAc)
A-DNAd)
70(7)
171
291
G12
średnia
86(4)
49
177
293
C11
G6
177(5)
roztwór
76
46
176
293
C5
93
51
172
293
G10
kryształ
72(9)
170
288
G4
180(4)
292

roztwór
41
177
277
C9
kryształ
52
176
291
G8
C3

kryształ
201
191(5)
199
198
203
202
206
w nawiasach podane są odchylenia standardowe.
Konserwatywne zachowanie powyższych fragmentów struktury 2'-O-Me(CGCGCG)2 w
krysztale i w cieczy wpływa na dużą zachowawczość większości parametrów helikalnych
(Tabela 31). Wartości najważniejszych parametrów helikalnych  (Twist) i Dz (rise), na
podstawie których klasyfikowane są struktury dyfrakcyjne dupleksów kwasów nukleinowych,
są porównywalne w roztworze i w krysztale. W stosunku do innych struktur krystalicznych
kwasów nukleinowych o strukturze podwójnej helisy typu A, średnia wartość Dz dla 2'-OMe(CGCGCG)2 jest wyjątkowo mała, jednocześnie drugi parametr  odznacza się wysokimi
wartościami (powyżej 36o). Analiza struktur rozwiązanych metodami NMR wykazała
podobną unikalność wartości tych parametrów dla r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2 w
stosunku do innych prawoskrętnych dupleksów w roztworze. Można stąd sądzić, że małe
141
wartości Dz oraz duże kąty  są charakterystycznymi cechami dla sekwencji RNA o
powtarzających się parach CG (Tabela 31).
Tabela 31. Wybrane parametry helikalnea) dla struktury 2'-O-Me(CGCGCG)2 w krysztale i dla struktur
przestrzeni konformacyjnejb) w roztworze.
Para zasad
C1-G12
G2-C11
C3-G10
G4-C9
C5-G8
G6-C7
średnia
trakt
C1-G2
G2-C3
C3-G4
G4-C5
C5-G6
średnia
a)
x-Displacement dx (Å)
-4.8
-3.3 (0.4)
-4.8
-3.1 (0.4)
-4.9
-3.2 (0.3)
-5.0
-3.3 (0.3)
-5.0
-3.2 (0.3)
-5.0
-3.0 (0.4)
-4.9
-3.2
3.2
2.2
2.2
2.2
2.9
2.5
Rise Dz (Å)
2.5 (0.6)
2.4 (0.3)
2.7 (0.4)
2.5 (0.3)
2.9 (0.5)
2.6
Inklinacja  (°)
19
21 (5)
19
24 (5)
21
25 (5)
22
28 (5)
21
20 (5)
22
17 (5)
21
23
40
34
34
38
37
37
Twist  (°)
33 (3)
38 (3)
41 (5)
40 (4)
33 (3)
37
Propeller twist
-6
-16
-12
-8
-16
-7
-11
 (°)
-2 (11)
-11 (8)
-19 (8)
-28 (8)
-16 (8)
-25 (8)
-17
Roll  (°)
-4
6
4
4
-4
1
2 (5)
-0 (5)
5 (5)
-3 (5)
-1 (4)
1
Parametry obliczone za pomocą programu CURVES 5.11., b) w nawiasach podane są odchylenia standardowe.
Skok helisy h (długość dupleksu dla pełnego skrętu) związany z powyższymi parametrami
zależnością233:
360 o
h  n  Dz 
 Dz ,

(23)
est bardzo mały i wynosi ok. 25 Å dla struktur 2'-O-Me(CGCGCG)2 w roztworze i w
krysztale. Dla kanonicznej formy A-RNA o parametrach Dz = 2,81 Å i  = 32,7o, skok helisy
wynosi 30,9 Å. Wyraźna, silna kompresja struktur 2'-O-Me(CGCGCG)2 średnio o około 6 Å
na jeden skręt dupleksu może decydować o specyficznych właściwościach strukturalnych
sekwencji o powtarzających się parach CG. W strukturze krystalicznej 2'-O-Me(CGCGCG)2,
kompresja ta jest jeszcze większa, jeżeli pominięte zostaną pary zasad znajdujące się na
końcach dupleksów. Obliczony skok helisy w oparciu o średnie wartości Dz i  dla czterech
wewnętrznych par zasad tej struktury wynosi 22,4 Å. Wartość ta jest porównywalna ze
strukturą r(CGCGCG)2, otrzymaną w roztworze (Tabela 32). W innych sekwencjach RNA,
skok helisy h jest znacznie większy niż w badanych strukturach r(CGCGCG)2 i
2'-O-Me(CGCGCG)2233.
Charakterystyczną cechą struktur o powtarzających się parach CG jest także bardzo duży
kąt nachylenia par zasad typu Watsona-Cricka do osi dupleksu. Dla 2'-O-Me(CGCGCG)2,
średnia wartość inklinacji wynosi 21o w krysztale i 23o w roztworze.
Cechą wspólną struktur 2'-O-Me(CGCGCG)2 w krysztale i w roztworze jest także sposób
ułożenia sąsiednich par zasad. Reguła równoległości ułożenia odpowiednich zasad w traktach
CG i GC (rozdz. III.9.5) została całkowicie potwierdzona analizą struktury
2'-O-Me(CGCGCG)2 w krysztale.
142
Tabela 32. Średnie wartości parametrów Rise (Dz) i Twist (), ilości par zasad na jeden skręt dupleksu (n),
wielkości skoku helisy (h) dla różnych dupleksów o strukturze typu A, obliczonych na podstawie
współrzędnych kartezjańskich zdeponowanych w bazie Protein Data Bank (PDB).
Identyfikator
Sekwencja
Metoda a)
Dz [Å]
[o]
n
h[Å]
310D
310D
1PBL
2'-O-Me(CGCGCG)2
2'-O-Me(CGCGCG)2
2'-O-Me(CGCGCG)2
2'-O-Me(CGCGCG)2 c)
r(CGCGCG)2
r(CGCGCG)2 c)
X-Ray (1,3 Å)
X-Ray (1,3 Å)
NMR
NMR
NMR
NMR
2,54
2,20 b)
2,52
2,60
2,26
2,32
36,6
35,3 b)
37,8
37,0
37,8
37,4
9,8
10,2 b)
9,5
9,7
9,5
9,6
25,0
22,4 b)
24,0
25,3
21,5
22,3
r(UUAUAUAUAUAUAA)2
5'-r(UAAGGAGGUGAU)-3'
5'-r(AUCACCUCCUUA)-3'
5'-r(UAAGGAGGUGAU)-3'
5'-r(AUCACCUCCUUA)-3'
r(CGCGAAUUAGCG)2
r(GGACUUUGGUCC)2
5'-d(GGGTATACGC)-3'
5'-r(GCG)-d(TATACCC)-3'
X-RAY (2,25 Å)
X-RAY (2,6 Å)
2,72
2,79
33,3
33,1
10,8
10,9
29,4
30,3
X-RAY (2,6 Å)
2,69
33,2
10,9
29,2
X-RAY (1,8 Å)
X-RAY (2,64 Å)
X-RAY (2,0 Å)
2,70
2,90
2,90
33,3
33,1
32,0
10,8
10,9
11,3
29,2
31,6
32,6
1PBM
1RNA
1SDR
1SDR
157d
205D
1OFX
a)
Dla struktur rozwiązanych metodami rentgenowskimi w nawiasach podana jest rozdzielczość., b) Parametry obliczone na
podstawie czterech wewnętrznych par zasad, c) Parametry obliczone dla struktur przestrzeni konformacyjnej.
Powyższe wspólne cechy struktur w krysztale i w cieczy sugerują możliwość
wyodrębnienia spośród struktur typu A podklasę dupleksów, które charakteryzują się dużą
kompresją helisy (małe wartości rise i duże wartości twist) oraz dużym nachyleniem par
zasad w stosunku do osi helikalnej. Bruzdy małe są bardzo szerokie i płytkie, natomiast duże
bruzdy mają kształt bardzo wąskich i głębokich szczelin. Te cechy umiejscawiają powyższe
struktury w pozycji najbardziej skrajnej dla struktur typu A.
Analiza porównawcza struktur 2'-O-Me(CGCGCG)2 wykazała również rozbieżności
niektórych parametrów strukturalnych. Wartość rmsd pomiędzy strukturami
2'-O-Me(CGCGCG)2 w krysztale i w roztworze wynosi 1,7 Å. W przeciwieństwie do silnie
zachowawczej długości dupleksów, promienie helis są bardziej zmienne i zależą od
środowiska. W krysztale, promień dupleksu 2'-O-Me(CGCGCG)2 jest większy o 1,6 Å niż w
roztworze. Związana z tym szerokość wewnętrznego kanału dupleksu w strukturze
krystalicznej jest bardziej zbliżona do formy kanonicznej. Stąd wartość rmsd pomiędzy
strukturą kanoniczną a strukturą w krysztale wynosi tylko 1,3 Å, natomiast dla roztworu 1,8
Å. Różnice promieni kanałów w badanych strukturach r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2
wyraźnie uwidaczniają się w ich rzutach wzdłuż osi helis (rys. 80, 85).
Jak wykazała analiza kątów torsyjnych, szerokość kanału wykazuje pewną zależność od
kątów torsyjnych  i . Dla dupleksu r(CGCGCG)2 wartości tych kątów są bardziej zbliżone
do otrzymanych dla 2'-O-Me(CGCGCG)2 w krysztale niż w roztworze (Tabela 33). Zjawisko
to może wynikać z pewnej niedokładności w wyznaczeniu kątów  metodami NMR. Kątom
tym nie odpowiadają żadne mierzalne wicynalne sprzężenia skalarne, które mogłyby ściśle je
określać. Drugi powód może być związany z hydratacją. W strukturze krystalicznej,
środkowy kanał biegnący wzdłuż dupleksu wypełniony jest cząsteczkami wody, które tworzą
klastery w kszałcie wieloboków20. To usieciowienie może powodować rozdęcie dupleksu. W
roztworze, takie usieciowanie wody jest nietrwałe. W związku z tym, szerokość kanału się
zmniejsza. Ponadto zmiany kątów , które zależą od konformacji grup fosforoestrowych,
stopienia hydratacji oraz od jonów znajdujących się w roztworze, mogą przyczyniać się do
zmniejszania lub zwiększania kanału. Jak wykazała analiza widm 31P NMR, różnice w
143
przesunięciach chemicznych jąder fosforu r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2 , które
odzwierciedlają te procesy, są znaczne.
Tabela 33. Średnie wartości parametrów dx (x-Displ.) oraz kątów torsyjnych  i  dupleksów r(CGCGCG)2 i
2'-O-Me(CGCGCG)2.
Identyfikator
Sekwencja
Metoda a)
dx [Å]
 [o]
 [o]
310D
310D
1PBL
2'-O-Me(CGCGCG)2
2'-O-Me(CGCGCG)2
2'-O-Me(CGCGCG)2
2'-O-Me(CGCGCG)2 c)
r(CGCGCG)2
r(CGCGCG)2 c)
X-Ray (1,3 Å)
X-Ray (1,3 Å)
NMR
NMR
NMR
NMR
-4,9
-4,9 b)
-3,2
-3,2
-4,0
-3,9
291,1
290,5 b)
53,4
52,8 b)
265,4
75,4
286,4
54,7
1PBM
a)
b
Dla struktur rozwiązanych metodami rentgenowskimi w nawiasach podana jest rozdzielczość., ) Parametry obliczone na
podstawie czterech wewnętrznych par zasad, c) Parametry obliczone dla struktur przestrzeni konformacyjnej.
144
IV. PODSUMOWANIE.
Szybki postęp w dziedzinie analizy strukturalnej cząsteczek RNA, przy wykorzystaniu
nowoczesnych technik spektroskopii NMR i modelowania komputerowego najlepiej obrazuje
liczba publikacji dotyczącej tej problematyki, która rośnie w błyskawicznym tempie.
Spektroskopia wysokiej zdolności rozdzielczej NMR jest jedyną metodą badań w roztworze,
która umożliwia wyznaczanie molekularnych struktur z dokładnością do współrzędnych
atomowych i jest konkurencyjna do metod rentgenowskich.
Analiza konformacyjna kwasów nukleinowych w roztworze metodami spektroskopii
NMR, a szczególnie rybonukleinowych, jest znacznie trudniejsza w porównaniu do analiz
struktur białkowych. W analizie strukturalnej RNA, najtrudniejszy etap związany jest z
identyfikacją sygnałów rezonansowych. Problem ten szczególnie dotyczy sygnałów rybozy.
W widmach monomerów, sygnały rezonansowe pochodzące od protonów rybozy występują
w bardzo wąskim zakresie spektralnym. W przypadku oligomerów, w których pierścienie
rybozy są powtarzającym się elementem strukturalnym, nachodzenie sygnałów
rezonansowych staje się istotnym problemem przy rozwiązaniu struktur RNA.
Znacznym utrudnieniem w analizie strukturalnej makromolekuł, w tym również RNA, jest
poszerzenie linii rezonansowych, wynikające ze skrócenia czasów relaksacji spin - spin.
Efektem tego zjawiska jest zanik struktury subtelnej sygnałów rezonansowych oraz
zmniejszenie ich amplitudy.
Istotnym problemem w badaniach RNA jest także uzyskanie miligramowych ilości
funkcjonalnie istotnych substruktur RNA. Cząsteczki kwasów rybonukleinowych są
szczególnie podatne na degradację (rybonukleazy, jony metali).
Z powyższych powodów, ilość rozwiązanych struktur RNA odnotowanych w bankach
danych jest stosunkowo niewielka. Do końca 1997 roku, w Protein Data Bank
zdeponowanych było zaledwie około 50 struktur RNA. Dla porównania, w tej samej bazie
danych było ponad 900 struktur białek i ponad 100 struktur DNA, które rozwiązane zostały
metodami NMR.
Przedmiotem moich badań były dwa dupleksy r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2, o
naturalnym składzie izotopowym. Wybrałem je ze względu na szczególne właściwości
konformacyjne (przejścia z A-RNA do Z-RNA) kwasów rybonukleinowych o powtarzających
się parach CG.
Główne etapy analizy strukturalnej, które opisane zostały w niniejszej pracy to:




Rejestracja widm NMR i ich obróbka,
Przypisania sygnałów rezonansowych 1H, 31P i 13C,
Określenie więzów strukturalnych,
Wyznaczenie struktur, które spełniają zadane więzy, metodami modelowania
komputerowego.
 Porównanie z innymi strukturami dupleksów.
 Odniesienie się do struktury rentgenowskiej 2'-O-Me(CGCGCG)2
Podstawową bazą w określeniu struktur dupleksów były dwuwymiarowe eksperymenty
typu DQF-COSY i NOESY (500 MHz). Na ich podstawie przypisane zostały wszystkie
sygnały rezonansowe niewymienialnych protonów. W oparciu o analizę tych widm określone
zostały więzy strukturalne, umożliwiające wyznaczenie struktur na poziomie atomowym.
Osobne znaczenie miały widma wykonane w 90% H2O / 10% D2O. Służyły one do analizy
sygnałów wymienialnych protonów. Głównym problemem przy wykonaniu tych
145
eksperymentów był silny sygnał rozpuszczalnika, który zasłaniał i tłumił sygnały
rezonansowe protonów badanych RNA. Zastosowałem trzy różne sekwencje impulsowe do
redukowania sygnałów wody, z których najlepszą okazała się sekwencja gradientowa
(Watergate). Dalsza redukcja sygnałów rozpuszczalnika była wykonywanea podczas obróbki
widm metodami liniowej ekstrapolacji i dekonwolucji resztkowego sygnału wody. Efektem
stosowanych metod była możliwość analizowania sygnałów rezonansowych protonów RNA,
które znajdowały się w bliskim sąsiedztwie sygnału rozpuszczalnika.
Dla obu badanych dupleksów, dokonane zostały przypisania wszystkich sygnałów 1H
NMR, z wyjątkiem sygnałów protonów aminowych guanozyn, które ulegają koalescencji z
sygnałem wody już w temperaturze około 0oC. Osiągnięciem było stereospecyficzne
przypisanie sygnałów prochiralnych protonów H5' i H5'', które dokonałem dla próbek
r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2 o naturalnym składzie izotopowym. Przypisanie to było
możliwe dzięki specyficznym oddziaływaniom grup 2'-O-metylowych z protonami H5'
sąsiednich reszt nukleotydowych.
Na podstawie analizy temperaturowych zmian przesunięć chemicznych 1H wyznaczone
zostały krzywe topnienia dupleksów. Bardzo wysokie temperatury topnienia (68oC i 76oC),
wskazują na wysoką trwałość strukturalną obu badanych dupleksów. Wyższa o około 8oC
temperatura topnienia modyfikowanego dupleksu RNA jest efektem stabilizowania
konformacji pierścieni cukrowych C3'-endo przez grupy 2'-O-metylowe.
Temperaturowe zmiany parametrów spektralnych sygnałów wymienialnych protonów
dawały obraz procesów zachodzących podczas topnienia dupleksów. Uśrednianie sygnałów
rezonansowych protonów grup aminowych cytydyn, jest wynikiem rotacji wokół wiązań
C4-N4, która zachodzi już w temperaturach poniżej punktu topnienia dupleksów. Tego typu
proces zachodzący podczas przejść dupleksów RNA do struktur jednoniciowych, w tak
szerokim zakresie temperaturowym, obserwowany był po raz pierwszy.
Różną szybkość wymiany protonów aminowych i iminowych dupleksu
2'-O-Me(CGCGCG)2 potwierdzają wyniki badań hydratacji tego dupleksu w krysztale20.
Istotne znaczenie w analizie strukturalnej miały widma heteronuklearne. Głównym celem
eksperymentów korelacyjnych 31P-1H oraz 13C-1H było przypisanie sygnałów rezonansowych
heteroatomów. Oznaczone zostały wszystkie pasma jąder fosforu oraz sygnały atomów węgla
sprzeżonych skalarnie z protonami przez jedno lub trzy wiązania chemiczne. Zastosowanie
bardzo czułych technik z odwrotną detekcją umożliwiło przypisanie pasm rezonansowych 13C
NMR dla nie wzbogaconych izotopowo próbek RNA. Analiza przesunięć chemicznych
sygnałów rezonansowych jąder atomów węgla i fosforu dostarczyła dodatkowych
argumentów konformacyjnych. Ponadto, korelacyjne eksperymenty heteronuklearne NMR,
potwierdziły poprawność przypisań sygnałów protonowych.
Przypisania sygnałów rezonansowych jąder atomu 31P i 13C dokonane zostały na podstawie
dwuwymiarowych widm korelacyjnych. Analiza przesunięć chemicznych tych jąder oraz
protonów wskazuje na bardzo duże podobieństwo strukturalne obu dupleksów. Szczególnie
widoczne jest to w widmach 13C NMR, w aromatycznym zakresie spektralnym. Różnice
pomiędzy wartościami 13C dla sygnałów aromatycznych atomów węgla dupleksów
r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2 są wyjątkowo małe. Odmienny sposób aranżacji
pierścieni zasad w strukturze B-DNA uwidacznia się znacznie większymi zmianami wartości
przesunięć chemicznych sygnałów d(CGCGCG)2 w stosunku do sygnałów r(CGCGCG)2 .
Kolejnym, ważnym etapem przy rozwiązywaniu struktur było wyznaczenie więzów
strukturalnych w oparciu o wartości stałych sprzężeń spinowo-spinowych oraz wartości NOE.
Prawie wszystkie sprzężenia spin-spin pomiędzy protonami oraz sprzężenia proton-fosfor
dokonane zostały na podstawie analizy wysokorozdzielczych, fazoczułych widm DQFCOSY, które były wykonywane z włączonym i wyłączonym generatorem częstotliwości
rezonansowej jąder atomów fosforu. Zastosowanie symulacji sygnałów rezonansowych widm
za pomocą programów SPHINX/LINSHA, zwiększało dokładność pomiarów wartości
sprzężeń skalarnych. Wartości stałych sprzężeń 3JH1'H2', 3JH2'H3', 3JH3'H4', na podstawie których
146
analizowane były konformacje pierścieni cukrowych poszczególnych reszt nukleotydowych
(program PSEUROT), były wyznaczone z bardzo dużą, jak dla makromolekuł, dokładnością
rzędu 0,3 Hz.
Pomiaru efektów NOE dokonałem na podstawie widm 2D-NOESY, wykonanych przy
czasach mieszania m = 80 i 150 ms. Zastosowanie optymalizacji sygnałów za pomocą
krzywych Lorentza dawało możliwość dokładnego zmierzenia objętości sygnałów
korelacyjnych, nawet w tych przypadkach, gdzie sygnały widm 2D-NOESY nie były
całkowicie rozseparowane.
Istotnym problemem przy wyznaczaniu więzów odległościowych jest eliminacja wpływu
dyfuzji spinów i ruchów molekularnych na wielkości NOE. Głównym celem zastosowania
procedury IRMA było zredukowanie tych czynników przy ustalaniu więzów
odległościowych. Ilość więzów stosowanych do badań była wystarczająco duża do
wyznaczenia dokładnych struktur. Istotne znaczenie, przy określaniu więzów strukturalnych
miały także komputerowe modele cytydyn i guanozyn (o różnych kątach  i konformacjach
pierścieni cukrowych), które wygenerowane zostały za pomocą programu DISCOVER.
Obliczenie struktur dokonane zostało w dwóch etapach. Zastosowanie w pierwszym etapie
udokładnienia kilku cykli IRMA, w których zawarta była krótka, restryktywna dynamika
molekularna, dawało pierwszą zbieżność otrzymywanych struktur w porównaniu do 16
struktur początkowych. Jeszcze większą zbieżność (rmsd = 0,8 Å) otrzymałem po drugim
etapie udokładniania. Zgodność końcowych struktur z danymi eksperymentalnymi badana
była za pomocą czynników R (0,020 i 0,010). Małe wartości tych parametrów wskazują na
dużą zgodność otrzymanych struktur z danymi NMR.
Analiza otrzymanych struktur (program CURVES) wykazała istotne różnice
konformacyjne badanych dupleksów w stosunku do kononicznej formy A-RNA.
Charakterystyczną cechą obu badanych dupleksów jest silne skręcenie par zasad (duże
wartości parametru twist ) i ściśnięcie helis (małe wartości parametru rise, Dz). Podobne
wartości parametrów  i Dz posiada również struktura 2'-O-Me(CGCGCG)2 w krysztale,
która została rozwiązana w naszej Pracowni. Również inne parametry, np. opisujące
ukształtowanie bruzd, są bardzo podobne dla struktur 2'-O-Me(CGCGCG)2 w roztworze i w
krysztale. Zasadniczą różnicą pomiędzy strukturami 2'-O-Me(CGCGCG)2 jest średnica
dupleksów, która w krysztale jest wyraźnie większa niż w roztworze.
Przedstawione w niniejszej pracy metody NMR i metody obliczeniowe stosowane były do
analizy krótkich fragmentów dwuniciowych, które są często spotykane w biologicznie
funkcjonalnych cząsteczkach RNA. Krótka analiza jednoniciowych struktur r(CGCGCG) i
2'-O-Me(CGCGCG) otrzymanych w temperaturach powyżej 90oC nie odzwierciedla tych
problemów, jakie stwarzają te formy przy ustaleniu ich struktury i dynamiki metodami NMR.
Analiza jednoniciowych form w dłuższych sekwencjach RNA oparta jest na znakowanych
cząsteczkach izotopem 13C i 15N. Metody te przedstawiłem w części literaturowej.
Obecnie prowadzone są w naszej Pracowni intensywne badania nad strukturą
konformacyjną większych cząsteczek RNA, zawierających 29 jednostek, stanowiących
analogi fragmentów wirusa HIV-1. Sądzę, że metody NMR i modelowania komputerowego,
które zastosowałem skutecznie do określenia konformacji struktury dupleksów r(CGCGCG)2
i 2'-O-Me(CGCGCG)2 będą pomocne w tych badaniach.
Opisane struktury dupleksów r(CGCGCG)2 i 2'-O-Me(CGCGCG)2 umieszczone zostały w
rejestrze Protein Data Bank (Brookhaven University).
Większość przedstawionych
wyników zawartych jest w dwóch pracach19,20 opublikowanych w Nucleic Acids Research.
147
V. LITERATURA.
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
Wyatt J.R., Tinoco I. Jr. (1993) The RNA World. Cold Spring Harbor Laboratory
Press, New York, 465.
Varani G., Tinoco I. Jr. (1991) Q. Rev. Biophys., 24, 479.
Pardi A. (1995) Methods in Enzymology, 261, 350.
Varani G., Aboul-ela F., Allain F.H.T. (1996) Prog. NMR Spectrosc., 29, 51.
Milligan J.F., Uhlenbeck O.C. (1990) Methods in Enzymology, 180, 51.
Usman N, Ogilvie K.K, Jiang M.J., Cedergren R.J. (1987) J. Am. Chem. Soc., 109,
7845.
Tolbert T.J., Williamson J.R. (1996) J. Am. Chem. Soc., 118, 7929.
Glemarec C., Kufel J., Foldesi A., Maltseva T., Sandström A., Kirsebom L.A.,
Chattopadhyaya J. (1996) Nucleic Acids Res., 24, 2022.
Westerink H.P., van der Marel G.A., van Boom J.H., Haasnoot C.A.G. (1984) Nucleic
Acids Res., 12, 4323.
Haasnoot C.A.G., Westerink H.P., van der Marel G.A., van Boom J.H. (1984) J.
Biomol Struct. Dyn., 2, 345.
Wuthrich K. (1986) NMR of Proteins and Nucleic Acids. John Willey & Sons, New
York.
Hall K., Cruz P., Tinoco I. Jr., Jovin T.M., van de Sande J.H. (1984) Nature, 311, 584.
Adamiak R.W., Gałat A., Skalski B. (1985) Biochim. Biophys Acta, 825, 345.
Davis P.W., Adamiak R.W., Tinoco I. Jr. (1990) Biopolymers, 29, 109.
Krzy¿aniak A., Barciszewski J., Furste J.P., Bald R., Erdmann V.A., Sa³añski P.,
Jurczak J. (1994) Int. J. Biol. Macromol., 16, 159.
Krzy¿aniak A., Sa³añski P., Adamiak R.W., Jurczak J., Barciszewski J. (1996) High
Pressure Bioscience and Biotechnology. Elsevier Science, Amsterdam, 189.
Biała E., Milecki J., Kowalewski A., Popenda M., Antkowiak W.Z., Adamiak R.W.
(1993) Acta Biochim. Pol., 40, 1.
Popenda M., Milecki J, Bia³a E., Adamiak R.W. (1995) Nucleosides Nucleotides, 14,
983.
Popenda M., Bia³a E., Milecki J., Adamiak R.W. (1997) Nucleic Acids Res., 25, 4589.
Adamiak D.A., Milecki J., Popenda M., Adamiak R.W., Dauter Z., Rypniewski W.A.
(1997) Nucleic Acids Res., 25, 4599.
Quigly G.J., Teeter M.M., Rich A. (1978) Proc. Nat. Acad. Sci USA, 75, 64.
Brown R.S., Dewan J.C., Klug A. (1985) Biochemistry, 24, 4785.
Sussma J.L., Holbrook R.S., Warrant R.W., Church G.M., Kim S.H. (1978) J. Mol.
Biol., 123, 607.
Comarmond M.B., Giege R., Thierry J.C., Moras D., Fischer J. (1986) Acta
Crystallogr., Sect. B, 42, 272.
Westhof E., Sundaralingam M. (1986) Biochemistry, 25, 4868.
Westhof E., Dumas P., Moras D. (1986) Acta Crystallogr., Sect. A, 44, 112.
Hingety B.E., Brown R.S., Jack A. (1978) J. Mol. Biol., 124, 523.
Basavappa R., Sigler P.B. (1991) EMBO J., 10, 3105.
Portmann S., Usman N., Egli M. (1995) Biochemistry, 34, 7569.
Egli M., Portmann S., Usman N. (1996) Biochemistry, 35, 8489.
Schindelin H., Zhang M., Bald R., Fuerste J.P., Erdmann V.A., Heinemann U. (1995)
J. Mol. Biol., 249, 595.
148
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
52.
53.
54.
55.
56.
57.
58.
59.
60.
61.
62.
63.
64.
65.
66.
Dock-Bregeon A.C., Chevrier B., Podjarny A., Johnson J., De Bear J.S., Gough G.R.,
Gilham P.T., Moras D. (1989) J. Mol. Biol., 209, 459.
Betzel C., Lorentz S., Furste J.P., Bald R., Zhang M., Schneider T.R., Wilson K.S.,
Erdmann V.A. (1994) FEBS Lett., 351, 159.
Holbrook S.R., Cheong C., Tinoco I. Jr., Kim S.H. (1991) Nature, 353, 579.
Leonard G.A., McAuley-Hecht K.E., Ebel S., Lough D.M., Brown T., Hunter W.N.
(1994) Structure, 2, 483.
Wahl M.C., Rao S.R., Sundaralingam M. (1996) Nat. Struct. Biol., 3, 24.
Baeyens K.J., De Bondt H.L., Holbrook S.R. (1995) Nat. Struct. Biol., 2, 56.
Correll C.C., Freeborn B., Moore P.B., Steitz T.A. (1997) Cell, 91, 705.
Carter R.J., Baeyens K.J., SantaLucia J. Jr., Turner D.H., Holbrook S.R. (1997)
Nucleic Acids Res., 25, 4117.
Lietzke S.E., Barnes C.L., Kundrot C.E. (1996) Structure, 4, 917.
Baeyens K.J., De Bondt H.L., Pardi A., Holbrook S.R. (1995) Proc. Nat. Acad. Sci
USA, 93, 12851.
Wahl M.C., Ban C., Sekharudu B., Ramakrishnan B., Sundaralingam M. (1996) Acta
Crystallogr., Sect. D, 52, 655.
Biswas R., Wahl M.C., Ban C., Sundaralingam M. (1997) J. Mol. Biol., 267, 1149.
Biswas R., Sundaralingam M. (1997) J. Mol. Biol., 270, 511.
Cruse W., Saludjian P., Biała E., Strazewski P., Prange T., Kennard O. (1994) Proc.
Nat. Acad. Sci USA, 91, 4160.
Wang A.H.J., Fujii S., Van Boom J.H., Van Der Marel G.A., Van Boeckel S.A.A.,
Rich A. (1982) Nature, 299, 601.
Egli M., Usman N., Zhang S., Rich A. (1992) Proc. Nat. Acad. Sci USA, 89, 534.
Egli M., Usman N., Zhang S., Rich A. (1993) Biochemistry, 32, 3221.
Ban C., Ramakrishnan B., Sundaralingam M. (1994) J. Mol. Biol., 236, 275.
Ban C., Ramakrishnan B., Sundaralingam M. (1994) Nucleic Acids Res., 22, 5466.
Gao Y.G., Robinson H., Van Boom J.H., Wang A.H.J. (1995) Biophys. J., 69, 559.
Horton N.C., Finzel B.C. (1996) J. Mol. Biol., 264, 512.
Lubini P., Zuercher W., Egli M. (1994) Chem. Biol., 1, 39.
Portmann S., Grimm S., Workman C., Usman N., Egli M. (1996) Chem. Biol., 3, 173.
Teng M., Liaw Y.C., van der Marel G.A., van Boom J.H., Wang A.H.J. (1989)
Biochemistry, 28, 4923.
Pley H.W., Flaherty K.M., McKay D.B. (1994) Nature, 372, 68.
Scott W.G., Finch J.T., Klug A. (1995) Cell, 81, 991.
Cate J.H., Gooding A.R., Podell E., Zhou K., Golden B.L., Kundrot C.E., Cech T.R.,
Doudna J.A. (1996) Science, 273, 1678.
Scott W.G., Murray J.B., Arnold J.R.P., Stoddard B.L., Klug A. (1996) Science, 274,
2065.
Feig A.L., Scott W.G., Uhlenbeck O.C. (1998) Science, 279, 81.
Murray J.B., Terwey D.P., Maloney L., Karpeisky A., Usman N., Beigelman L., Scott
W.G. (1998) Cell, 92, 665.
Rould M.A., Perona J.J., Soell D., Steitz T.A. (1989) Science, 246, 1135.
Rould M.A., Perona J.J., Steitz T.A. (1991) Nature, 352, 213.
Biou V., Yaremchuk A., Tukalo M., Cusack S. (1994) Science, 263, 1404.
Ruff M., Krishnaswamy S., Boeglin M., Poterszman A., Mitschler A., Podjarny A.,
Rees B., Thierry J.C., Moras D. (1991) Science, 252, 1682.
Cavarelli J., Eriani G., Rees B., Ruff M., Boeglin M., Mitschler A., Martin F.,
Gangloff J., Thierry J.C., Moras D. (1994) Embo J., 13, 327.
149
67.
68.
69.
70.
71.
72.
73.
74.
75.
76.
77
78.
79.
80.
81.
82.
83.
84.
85.
86.
87.
88.
89.
90.
91.
92.
93.
94.
95.
96.
97.
98.
99.
Arnez J.G., Steitz T.A. (1996) Biochemistry, 35, 14725.
Cusack S., Yaremchuk A., Tukalo M. (1996) Embo J., 15, 6321.
Chen Z., Stauffacher C., Li Y., Schmidt T., Bomu W., Kamer G., Shanks M.,
£omonosow G., Johnson J.E. (1989) Science, 245, 154.
Farmer B.T., Muller L., Nikonowicz E.P., Pardi A. (1994) J. Biomol. NMR, 4, 129.
Valegard K., Murray J.B., Stonehause N.J., Van Den Worm S., Stockley P.G., Liljas
L. (1997) J. Mol. Biol., 270, 724.
Wery J.P., Reddy V.S., Hosur M.V., Johnson J.E. (1994) J. Mol. Biol., 235, 565.
Speir J.A., Munshi S., Wang G., Timothy S., Baker J.E., Johnson J.E. (1995)
Structure (London), 3, 63.
Vandenworm S., Stonehouse N.J., Valegard K., Murray J.B., Walton C., Fridborg K.,
Stockley P.G., Liljas L. (1998) Nucleic Acids Res., 26, 1345.
Nissen P., Kjeldgaard M., Thirup S., Polekhina G., Reshetnikova L., Clark B.F.,
Nyborg J. (1995) Science, 270, 1464.
Popov I.A., Hallenga K. (1991) Modern NMR techniques and their application in
Chemistry, M. Dekker, New York.
Nikonowicz, E.P. and Pardi, A. (1992) Three-dimensional heteronuclear NMR studies
of RNA, Nature, 355, 86.
Nikonowicz, E.P. and Pardi, A. (1993) J. Mol. Biol. 232, 1141.
Hall K.B. (1995) Methods in Enzymol., 261, 542.
Heus, A.H., Wijmenga, S.S., and van de Ven, M.J.F.(1994) J. Am. Chem. Soc. 116,
4983.
James, T., Oppenheimer, N.J., ed. (1994) Methods in Enzymol. 239, Part C, a)
Techniques: selective pulses and gradient techniques b) Protein Structure.
James, T., Oppenheimer, N.J., ed. (1995) Methods in Enzymol. 261, Nuclear Magnetic
Resonance and Nucleic Acids a)DNA and RNA b) Nucleic acid dynamics c) Nucleic
acids complexes.
James, T. ed. (1989) Methods in Enzymol. 176, Nuclear Magnetic Resonance Part A
Spectral Techniques and Dynamic.
Dieckmann T., Feigon J. (1997) J. Biomol. NMR, 9, 259.
Farmer T.B., Muller L. (1993) J. Am. Chem. Soc., 115, 11040.
Heus S.W., Leeuw A.H., Hoppe E.A.H., Graaf H., Hilbers, M. (1995) J. Biol. NMR,
5, 82.
Heus A.H., Wijmenga S.S., van de Ven M.J.F.(1994) J. Am. Chem. Soc., 116, 4983.
Mariano P.J., Schwalbe H., Anklin C., Bermel W., Crothers M.D., Griesinger C.
(1995) J. Biomol. NMR, 5, 87.
Marino P.J., Prestegard H.J., Crothers M.D. (1994) J. Am. Chem. Soc., 116, 2205.
Chow C.S., Bogdan F.M. (1997) Chem. Rev., 97, 1489.
Pardi A., Nikonowicz E. (1992) J. Am. Chem. Soc., 114, 9202.
Varani G., Tinoco I. Jr. (1991) Biochemistry, 113, 9349.
Wijmenga S.S., Heus H.A., Werten B., van der Marl G.A., van Boom J.H., Hilbers,
C.W. (1994) J. Magn. Reson., 103, 134.
Hoffman R.E., Levy G.C. (1991) Prog. NMR Spectrosc., 23, 211.
Majumdar A., Hosur R.V. (1992) Prog. NMR Spectrosc., 24, 109.
Wilfred B., van Gunsteren F., Berendsen H.J.C. (1990) Angew. Chem. Int. Ed. Engl.,
29, 992.
Wilson W.D., Veal J.M. (1991) J.Biomol Struct.Dyn., 8, 1119.
Schmitz U., James T.L. (1995) Methods in Enzymology, 261, 3
James T.L. (1994) Curr. Opin. In Struct. Biol., 4, 275.
150
100.
101.
102.
103.
104.
105.
106.
107.
108.
109.
110.
111.
112.
113.
114.
115.
116.
117.
118.
119.
120.
121.
122.
123.
124.
125.
126.
127.
128.
129.
130.
131.
132.
133.
134.
135.
136.
137.
138.
139.
140.
141.
Rao S., Kollman P. (1986) Biopolymers, 25, 267.
Zhu L., Salazar M., Reid B.R. (1995) Biochemistry, 34, 2372.
Salazar M., Fedoroff O.Y., Reid B.R. (1996) Biochemistry, 35, 8126.
Salazar M., Fedoroff O.Y., Zhu L., Reid B.R. (1994) J. Mol. Biol., 241, 440.
Fedoroff O.Y., Salazar M., Reid B.R. (1996) Biochemistry, 35, 11070.
Salazar M., Champoux J.J., Reid B.R. (1993) Biochemistry, 32, 739.
Fedoroff O.Y., Salazar M., Reid B.R. (1993) J. Mol. Biol., 233, 509.
Salazar M., Fedoroff O.Y., Miller J.M., Ribeiro N.S., Reid B.R. (1993) Biochemistry,
32, 4207.
Brown S.C., Thomson S.A., Veal J.M., Davis D.G. (1994) Science, 265, 777.
Cross C.W., Rice J.S., Gao X. (1997) Biochemistry, 36, 4096.
Conte M.R., Conn G.L., Brown T., Lane A.N. (1997) Nucleic Acids Res., 25, 2627.
Conte M.R., Conn G.L., Brown T., Lane A.N. (1996) Nucleic Acids Res., 24, 3693.
Nishizaki T., Iwai S., Ohkubo T., Kojima C., Nakamura H., Kyogoku Y., Ohtsuka E.
(1996) Biochemistry, 35, 4016.
Nishizaki T., Iwai S., Ohtsuka E., Nakamura H. (1996) Biochemistry, 36, 2577.
White S.A., Nilges M., Huang A., Brunger A.T., Moore P.B. (1992) Biochemistry, 31,
1610.
McDowell J.A., Turner D.H. (1996) Biochemistry, 35, 14077.
Wu M., Turner D.H. (1996) Biochemistry, 35, 9677.
Wu M., SantaLucia J. Jr, Turner D.H. (1997) Biochemistry, 36, 4449.
Fedoroff O.Y., Ge Y., Reid B.R. (1997) J. Mol. Biol., 269, 225.
McDowell J.A., He L., Chen X., Turner D.H. (1997) Biochemistry, 36, 8030.
Cheong C., Moore P.B. (1992) Biochemistry, 31, 8406.
SantaLucia J. Jr., Turner D.H. (1993) Biochemistry, 32, 12612.
Gonzalez C., Stec W., Reynolds M.A., James T.L. (1995) Biochemistry, 34, 4969.
Gonzalez C., Stec W., Kobylañska A., Hogrefe R.I., Reynolds M., James T.L. (1994)
Biochemistry, 33, 11062.
Butcher S.E., Dieckmann T., Feigon J. (1997) J. Mol. Biol., 268, 348.
Kieft J.S., Tinoco I. Jr. (1997) Structure, 5, 713.
Luebke K.J., Landry S.M., Tinoco I. Jr. (1997) Biochemistry, 36, 10246.
Luebke K.J., Tinoco I. Jr. (1996) Biochemistry, 35, 11677.
Aboul-ela F., Varani G., Karn J. (1995) J. Mol. Biol., 253, 313.
Churcher M.,J., Lamont C., Hamy F., Dingwall C., Green S.M., Lowe A.D., Butler
J.G., Gait M.J., Karn J. (1993) J. Mol. Biol., 230, 90.
Puglisi J.D., Tan R., Calnan B.J., Frankel A.D. Williamson J.R. (1992) Science, 257,
76.
Kolk M.H., Heus H.A., Hilbers C.W. (1997) EMBO J., 16, 3685.
Peterson R.D., Feigon J. (1996) J. Mol. Biol., 264, 863.
Allain F.H., Varani G. (1995) Nucleic Acids Res., 23, 341.
Allain F.H., Varani G. (1995) J. Mol. Biol., 250, 333.
Ramos A., Varani G. (1997) Nucleic Acids Res., 25, 2083.
Kang H., Hines J.V., Tinoco I. Jr. (1996) J. Mol. Biol., 259, 135.
Shen L.X., Tinoco I. Jr. (1995) J. Mol. Biol., 247, 963.
Kang H., Tinoco I. Jr, (1997) Nucleic Acids Res., 25, 1943.
Borer P.N., Lin Y., Wang S., Roggenbuck M.W., Gott J.M., Uhlenbeck O.C., Pelczer
I. (1995) Biochemistry, 340, 6488.
Woese C.R., Winker S., Gutell R.R. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 87, 8467.
Jucker F.M., Pardi A. (1995) Biochemistry, 34, 14416.
151
142.
143.
144.
145.
146.
147.
148.
149.
150.
151.
152.
153.
154.
155.
156.
157.
158.
159.
160.
161.
162.
163.
164.
165.
166.
167.
168.
169.
170.
171.
172.
173.
174.
175.
176.
177.
Chen X., Chamorro M., Lee S.I., Shen L.X., Hines J.V., Tinoco I Jr, Varmus H.E.
(1995) EMBO J., 14, 842.
Szewczak A.A., Moore P.B., Chang Y.L., Wool I.G. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA., 90, 9581.
Greenbaum N.L., Radhakrishnan I., Patel D.J., Hirsh D. (1996) Structure (London), 4,
725.
Greenbaum N.L., Radhakrishnan I., Hirsh D., Patel D.J. (1995) J. Mol. Biol., 252,
314.
Butcher S.E., Dieckmann T., Feigon J. (1997) EMBO J., 16, 7490.
Puglisi E.V., Puglisi J.D. (1997) Nat. Struct. Biol., 4, 775.
Heus H.A., Pardi A. (1991) Science, 253 ,191.
Jucker F.M., Heus H.A., Yip P.F., Moors E.H., Pardi A. (1996) J. Mol. Biol., 264,
968.
Brodsky A.S., Williamson J.R. (1998) Nucleic Acids Res., 26, 1991.
Brodsky A.S., Williamson J.R. (1997) J. Mol. Biol., 267, 624.
Gelbin A., Schneider B., Clowny L., Hsieh S.H., Olsen W.K., Berman H.M. (1996) J.
Am. Chem. Soc., 118, 519.
Puglisi J.D., Chen L., Frankel A.D., Williamson J.R. (1993) Proc. Nat. Acad. Sci.
USA., 90, 3680.
Hamy F., Asseline U., Grasby J., Iwai S., Pritchard C., Slim G., Butler P.J., Karn J.,
Gait M.J. (1993) J. Mol. Biol., 230, 111.
Ye X., Kumar R.A., Patel D.J. (1995) Chem. Biol., 2, 827.
Zimmermann G.R., Pardi A. (1997) Nat. Struct. Biol., 4, 644.
Jenison R.D., Gill S.C., Pardi A., Polisky B. (1994) Science, 263, 1425.
Battiste J.L., Mao H., Rao N.S., Tan R., Muhandiram D.R., Kay L.E., Frankel A.D.,
Williamson J.R. (1996) Science, 273, 1547.
Battiste J.L., Tan R., Frankel A.D., Williamson J.R. (1995) J. Biomol. NMR, 6, 375.
Battiste J.L., Tan R., Frankel A.D., Williamson J.R. (1994) Biochemistry, 33, 2741.
Tan R., Chen L., Buettner J.A., Frankel A.D., (1994) Cell, 73, 1031.
Fan P., Suri A.K., Fiala R., Live D., Patel D.J. (1996) J. Mol. Biol., 258, 480.
Jiang L., Suri A.K., Fiala R., Patel D.J. (1997) Chem. Biol., 4, 35.
Yang Y., Kochoyan M., Burgstaller P., Westhof E., Famulok M. (1996) Science, 272,
1343.
Burgstaller P., Kochoyan M., Famulok M. (1995) Nucleic Acids Res., 23, 4769.
Puglisi J.D., Chen L., Blanchard S., Frankel A.D. (1995) Science, 270, 1200.
Avis J.M., Allain F.H., Howe P.W., Varani G., Nagai K., Neuhaus D. (1996) J. Mol.
Biol., 257, 398.
Oubridge C., Ito N., Evans P.R., Teo C.H., Nagai K. (1994) Nature, 372, 432.
Allain F.H., Gubser C.C., Howe P.W., Nagai K., Neuhaus D., Varani G. (1996)
Nature, 380, 646.
Gubser C.C., Varani G. (1996) Biochemistry, 35, 2253.
Fourmy D., Recht M.I., Blanchard S., Puglisi J.D. (1996) Science, 274, 1367.
Dieckmann,T., Suzuki,E., Nakamura,G.K., Feigon,J. (1996) RNA, 2, 628.
Sassanfar,M., Szoatak,J.W. (1993) Nature, 364, 550.
Lorsch J.R., Szostak J.W. (1994) Nature, 371, 31.
Ye X., Gorin A., Ellington A.D., Patel D.J. (1996) Nat. Struct. Biol., 3, 1026.
Jiang F., Kumar R.A., Jones R.A., Patel D.J. (1996) Nature, 382, 183.
Addes K.J., Basilion J.P., Klausner R.D., Rouault T.A., Pardi A. (1997) J. Mol. Biol.,
274, 72.
152
178.
179.
180.
181.
182.
183.
184.
185.
186
187.
188
189.
190.
191.
192.
193.
194.
195.
196.
197.
198.
199.
200.
201.
202.
203.
204.
205.
206.
207.
208.
209.
210.
211.
212.
213
214.
215.
216.
217.
218.
219.
Chang K.Y., Tinoco I. Jr. (1997) J. Mol. Biol., 269, 52.
Stallings S.C., Moore P.B. (1997) Structure (London), 5, 1173.
Sich C., Ohlenschlager O., Ramachandran R., Gorlach M., Brown L.R. (1997)
Biochemistry, 36, 13989.
Aue P.W., Bartholdi E., Ernst R.R. (1976) J. Chem. Phys., 64, 2229.
Bax A., Freeman R. (1981) J. Magn. Reson., 44, 542.
Piantini U., Sorensen O.W., Ernst R.R. (1982) J. Am. Chem. Soc., 104, 6800.
Shaka A.J., Freeman R., (1983) J. Magn. Reson., 51, 169.
Rance M., Sorensen O.W., Bodenhausen G., Wagner G., Ernst R.R., Wüthrich K.
(1983) Biochem. Biophys. Res. Commun., 117, 458.
Müller N., Ernst R.R., Wüthrich K. (1986) J. Am. Chem. Soc., 108, 6482.
Marion D., Wüthrich K. (1983) Biochem. Biophys. Res. Commun., 113, 967.
States D.J., Haberkorn R.A., Ruben D.J. (1982) J. Magn. Reson., 48, 286.
Griesinger C., Sorensen O.W., Ernst R.R. (1986) J. Am. Chem. Soc., 107, 6394.
Griesinger C., Sorensen O.W., Ernst R.R. (1987) J. Magn. Reson., 74, 474.
Boyd J., Dobson C.M., Redfield C. (1985) FEBS Lett., 186, 35.
Müller L. (1987) J. Magn. Reson., 72, 191.
Wörgötter E., Wagner G., Wüthrich K. (1986) J. Am. Chem. Soc., 108, 6162.
Griffey R.H., Redfield A.G. (1987) Q. Rev. Biophys., 19, 51.
Wokaun A., Ernst R.R. (1978) Mol. Phys., 36, 317.
Bodenhausen G., Vold R.L., Vold R.R. (1980) J. Magn. Reson., 37, 93.
Bodenhausen G. (1981) Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc., 14, 137.
Braunschweiler L., Bodenhausen G., Ernst R.R. (1983) Mol. Phys., 48, 535.
Mareci T.H., Freeman R. (1983) J. Magn. Reson., 51, 531.
Oschkinat H., Pastore A., Bodenhausen G. (1987) J. Am. Chem. Soc., 109, 4110.
Oschkinat H., Pastore A.,Pfändler P., Bodenhausen G. (1986) J. Magn. Reson., 69,
559.
Pfändler P., Bodenhausen G. (1987) J. Magn. Reson., 72, 475.
Eich G., Bodenhausen G., Ernst R.R. (1982) J. Am. Chem. Soc., 104, 3731.
Bax A., Drobny G. (1985) J. Magn. Reson., 61, 306.
Braunschweiller L., Ernst R.R. (1983) J. Magn. Reson., 53, 521.
Davis D.G., Bax A. (1985) J. Am. Chem. Soc., 107, 2821.
Edwards M.W., Bax A. (1896) J. Am. Chem. Soc., 108, 918.
Piveteau D., Delsuc A., Guittet E., Lallemand J.Y. (1987) J. Magn. Reson., 71, 347.
Kay L.E., Ikura M., Bax A. (1990) J. Am. Chem. Soc., 112, 888.
Bax A., Clore G.M., Driscoll P.C., Gronenborn A.M., Ikura M. (1990) J. Magn.
Reson., 87, 620.
Bax A., Clore G.M., Gronenborn A.M. (1990) J. Magn. Reson., 88, 425.
Fesik S.W., Eaton H.L., Olejniczak E.T., Zuiderweg E.R.P., McIntosh L.P., Dahlquist
F.W. (1990) J. Am. Chem. Soc., 112, 886.
Eggenberger U., Karimi-Nejad Y., Thüring H. Rütrejans H., Griesinger C. (1992) J.
Biomol. NMR, 2, 583.
Griesinger C., Eggenberger U. (1992) J. Magn. Reson., 97, 426.
Schwalbe H., Marino J.P., Glaser S.J., Griesinger C. (1995) J. Am. Chem. Soc., 117,
7251.
Jeener J., Meier B.H., Bachmann P., Ernst R.R. (1979) J. Chem Phys., 71, 4546.
Bax A., Davis D.G. (1985) J. Magn. Reson., 63, 207.
Neuhaus D., Keller J. (1986) J. Magn. Reson., 68, 568.
Griesinger C., ernst R.R. (1987) J. Magn. Reson., 75, 261.
153
220.
221
222.
223
224.
225.
226.
227.
228.
229.
230.
231.
232.
233.
234.
235.
236.
237.
238.
239.
240.
241.
242.
243.
244.
245.
246.
247.
248.
249.
250.
251.
252.
253.
254.
255.
256.
257.
258.
259
Bodenhausen G., Freeman R. (1977) J. Magn. Reson., 28, 471.
Kessler H.J., Griesinger C., Zarbock J., Loosli H.R. (1984) J. Comp. Chem., 5, 331.
Kessler H., Griesinger C., Zimmermann G. (1987) Magn. Reson. Chem., 25, 579.
Facke T., Wagner R., Berger S. (1994) Concepts in Magn. Reson., 6, 293.
Bax A., Griffey R.H., Hawkins B.L. (1983) J. Magn. Reson., 55, 301.
Berger S. (1993) J. Magn. Reson.Ser. A, 101, 329.
Bodenhausen G., Ruben D.J. (1980) Chem. Phys. Lett., 69, 185.
Fesik S., Zuiderweg E.R.P. (1988) J. Magn. Reson., 78, 588.
Zuidderweg E.R.P., Fesik S.W. (1989) Biochemistry, 28, 2378.
Marion D., Driscoll P.C., Kay L.E., Wingfield P.T., Bax A., Gronenborn A., Clore
G.M. (1989) Biochemistry, 28, 6150.
Rinaldi P.L. (1983) J. Am. Chem. Soc., 105, 5167
Metzler W.J., Leighton P., Lu P. (1988) J. Magn. Reson., 76, 534.
Metzler W.J., Lu P. (1989) J. Mol. Biol., 205, 149.
Saenger W. (1984) Principles of Nucleic Acids Structure, Springer, Berlin Heidelberg.
Rao S.T., Westhof E., Sundaralingam M. (1981) Acta Cryst., 37, 421.
Altona C., Sundaralingam M. (1972) J. Am. Chem. Soc., 94, 8205.
Altona C., Sundaralingam M. (1973) J. Am. Chem. Soc., 95, 2333.
Guschlbauer W. (1980) Biochim. Biophys. Acta, 610, 47.
Olson K.W., Sussman J.L. (1982) J. Am. Chem. Soc., 104, 270.
Chary K.V.R., Hosur R.V., Govil G., Zu-Kun T., Miles H.T. (1987) Biochemistry 26,
1315.
Chary K.V.R., Hosur R.V., Govil G., Chen C.Q., Miles H.T. (1988) Biochemistry 27,
3858.
Hines J.V., Landry S.M., Varani G., Tinoco I. Jr. (1994) J. Am. Chem. Soc., 116,
5823.
Kline P.C., Serianni A.S. (1990) J. Am. Chem. Soc., 112, 7373.
Podlasek C.A., Stripe W.A., Carmichael I., Shang M., Basu B., Serianni S. (1996) J.
Am. Chem. Soc., 112, 1413.
Chary K.V.R., Modi S. (1988) FEBS Lett., 233, 319.
Sheth A., Hosur R.V., Govil G., Hosur M.V., Kannan K.K., Zu-Kun T., Miles H.T.
(1989) Biochemistry 28, 7275.
Haasnoot C.A.G., de Leeuw F.A.A.M., Altona C. (1980) Tetrahedron Lett., 28, 2783.
Minch M.J. (1994) Concepts in Magn. Reson., 6, 41.
Huggins M.L. (1953) J. Am. Chem. Soc., 75, 4123.
Haasnoot C.A.G., de Leeuw F.A.A.M., de Leeuw H.P.M., Altona C. (1981) Org.
Magn. Res., 15, 43.
de Leeuw F.A.A.M., Altona C. (1983) J. Comp. Chem., 4, 428.
Kessler B.H., Gehrke M., Griesinger C. (1988) Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 27, 490.
Celda H., Widmer H., Leupin W., Chazin W., Denny A., Wüthrich K. (1989)
Biochemistry 28, 1462.
Gochin M., Zon G., James T.L. (1990) Biochemistry 29, 11161.
Widmer H., Wüthrich K. (1986) J. Magn. Reson., 70, 270.
Sibisi S., Skilling J., Brereton R.G., Laue E.D., Staunton J. (1984) Nature 311, 446.
Hodgkinson P., Mott H.R., Driscoll P.C., Jones J.A., Hore P.J. (1993) J. Magn.
Reson., 101, 218.
Ni F., Scheraga H.A. (1989) J. Magn. Reson., 82, 413.
Borer P.N., Levy G.C. (1994) Methods in Enzymol. 239, 257.
Aboul-ela F., Varani G. (1995) Cur. Opinions Biotechnol., 6, 89.
154
260.
261.
262.
263
264
265
266.
267.
268.
269.
270.
271.
272.
273.
274.
275.
276.
277.
278.
279.
280.
281.
282.
283.
284
285.
286.
287.
288.
289.
290.
291.
292.
293.
294.
Nair V., Young D.A. (1987) Magn. Reson. Chem., 25, 937.
IUPAC-IUB Nomenclature Commission (1983) Eur. J. Biochem., 131, 9.
IUPAC-IUB Nomenclature Commission (1986) J. Biol. Chem., 261, 13.
Gorenstein D.G. (1984) Phosphotus-31 NMR: Principles and Applications, Academic
Press, New York.
Altona C. (1983) Recl. Trav. Chim. Pays-Bas, 101, 413.
Giessner-Prettre C., Pullman B., Prado F.R., Cheng D.M., Iuorno V., Ts'o P.O.P.
(1984) Biopolymers, 23, 377.
Lankhorst P.P., Haasnoot C.A.G., Erkelens C., Altona C. (1984) J. Biomol. Struct.
Dyn., 1, 1387.
Arter D.B., Schmidt P.G. (1976) Nucleic Acids Res., 3, 156.
Dieckman T., Feigon J. (1994) Curr. Opin. In Struct. Biol., 4, 747.
Kellogg G.W., Szewczak A.A., Moore P.B. (1992) J. Chem. Soc., 114, 2727.
Kellogg G.W., Schweitzer B.I. (1993) J. Biomol. NMR., 3, 577.
Kim S.G., Lin L.J., Reid B.R. (1992) Biochemistry, 31, 3564.
Croasmun W.R., Carlson R.M.K. (ed.) (1993) Two-Dimensional NMR Spectroscopy.
Applications for Chemists and Biochemists, VCH Publishers, Inc., New York,
Weinheim, Cambridge.
Simorre J.P., Zimmermann G.R., Pardi A., Farmer B.T.I., Mueller L. (1995) J.
Biomol. NMR, 6, 427.
Tate S., Ono A., Kainosho (1994) J. Am. Chem. Soc., 116, 5977.
Sklenar V., Peterson R.D., Rejante M.R., Feigon J. (1993) J. Biomol. NMR, 3, 721.
Krishnamurthy V.V. (1995) J. Magn. Reson. Ser. B, 109, 117.
Földesi A., Yamakage S.I., Maltseva T.V., Nilson F.P., Agback P., Chattopadhyaya J.
(1995) Tetrahedron, 51, 10065.
Földesi A., Yamakage S.I., Nilson F.P.R., Maltseva T.V., Chattopadhyaya J. (1996)
Nucleic Acids Res., 24, 1187.
Glemarec C., Kufel J., Földesi A., Maltseva T.V., Sandström A., Kirsebom L.A.,
Chattopadhyaya J. (1996) Nucleic Acids Res., 24, 2022.
Földesi A., Yamakage S.I., Nilson F.P.R., Maltseva T.V., Glemarec C,
Chattopadhyaya J. (1997) Nucleosides Nucleotides, 16, 517.
Levine I. N. (1983) Quantum Chemistry, Allyn and Bacon, Boston
Binkley J.S., Frisch M., Krishman R., DeFrees D.J., Schlegel H.B., Whiteside R.A.,
Fluder E., Seeger R., Pople J.A. (1994) GAUSSIAN 82. Carnegie-Mellon Quantum
Chemistry Publishing Unit, Pittsburgh.
Stewart J.H.P. (1993) MOPAC 7,0, Quantum Chemistry Program Exchange, Indiana
University, Bloomington.
Allinger N.L. (1977) J. Am. Chem. Soc., 99, 8127.
Lesyng B., McCammon J.A. (1994) Pharmac. Ther., 60, 149.
van Gunsteren W.F., Berendsen H.J.C. (1990) Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 29, 992.
van Gunsteren W.F., Mark A.E. (1992) Eur. J. Biochem., 204, 947.
Havel T., Kuntz I.D., Crippen G.M. (1983) Bull. Math. Biol., 45, 665.
Havel T., Wuthrich K. (1984) Bull. Math. Biol., 46, 673.
Ryckaert J.P., Cicotti G., Berendsen H.J.C. (1977) J. Chem. Phys., 23, 327.
Radha P.K., Nibedita R., Kumar R.A. Hosur (1995) Methods in Enzymology, 261, 73
Youang M.A., Srinivasan J., Goljer I., Kumar S., Beveridge D.L., Bolton P.H. (1995)
Methods in Enzymology, 261, 121
Withka J.M., Srinivasan J., Bolton P.H. (1992) J. Magn. Reson., 98, 611.
Momany F.A.,McGuire R.F., Burgess A.W., Scheraga H.A. (1975) J. Phys. Chem.,
155
295.
296.
297.
298.
299.
300.
301
302.
303.
304.
305.
306.
307.
308.
309.
310.
311.
312.
313.
314.
315.
316.
317.
318.
319.
320.
321.
322.
323.
324.
325.
326.
327.
328.
329.
79, 2361.
Nemethy G., Pottle M.S., Scheraga H.A. (1983) J. Phys. Chem., 87, 1883.
Dunfield L.G., Burgess A.W., Scheraga H.A. (1978) J. Phys. Chem., 82, 2609.
Hermans J., Berendsen H.J.C., van Gunsteren W.F. (1984) Biopolymers, 23, 1513.
Brooks B.R., Bruccoleri R.E., Olafson B.D., States D.J., Swaminathan S., Karplus M.
(1983) J. Comp. Chem., 4, 187.
Weiner S.J., Kollman P.A., Nguyen D.T., Case D. (1986) J. Comp. Chem., 7, 230.
Weiner S.J., Kollman P.A. Case D.A., Singh U.C., Ghio C., Alagona G., Profeta S.,
Weiner P. (1984) J. Am. Chem. Soc., 106, 765.
Cornell, W.D., Cieplak P., Bayly C.I., Gould I.R., Merz K.M., Ferguson D.M.,
Spellmeyer D.C., Fox T., Caldwell J.W., Kollman P.A. (1995) J. Am. Chem. Soc.,
107, 5179.
Biosym/Molecular Simulations Discover version 95.0/3.0 user guide, San Diego
1995.
Keepers J.W., James T.L. (1984) J. Magn. Reson., 57, 404.
Borgias B.A., James T.L. (1990) J. Magn. Reson., 87, 475.
Boelens R., Koning T.M.G. , Kaptein R. (1988) J. Mol. Struct., 173, 299.
Macura S., Ernst R.R. (1980) Mol. Phys., 41, 95
James T.L. (1991) Curr. Opin. In Struct. Biol., 1, 1042.
Edmondson S. (1992) J. Magn. Reson., 98, 283.
Boelens R., Koning T.M.G., van der Marel G.A., van Boom J.H., Kaptein R. (1989) J.
Magn. Reson., 82, 291.
Nilges M., Clore G.M., Gronenborn A.M., (1988) FEBS Lett., 229, 317.
Gonzales C., Rullmann J.A.C., Bonvin A.M.J.J., Boelens R., Kaptein R. (1991) J.
Magn. Reson., 91, 659
Varani G. (1997) Accounts Chem. Research, 30, 189.
Dickerson R.E. (1989) J.Biomol. Struct. Dyn., 6, 627.
Fratini A.F., Kopka M.L., Drew H.R., Dickerson R.E. (1982), J. Biol. Chem., 257,
14686.
Lavery R., Sklenar H. (1988) J.Biomol.Struct.Dyn., 6, 63.
Chandrasekaran R., Arnott S. (1989) Landolt-Bornstein, New Series, Group VII.
Springer, Berlin, Vol. 1a, 31.
Kennard O., Hunter W.W. (1989) Landolt-Bornstein, New Series, Group VII.
Springer, Berlin, Vol. 1a, 255.
Oglivie K.K., Usman N., Nicoghosian K., Cedergren R.J. (1988) Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A., 85. 5764
Pennino D.J. (1985) Spectroscopy, 2, 36.
Shaka A.J., Keeler J. (1986) Prog. Nucl. Magn. Reson. Spectrosc., 19. 47.
Barkhuijsen H., de Beer R., Bovée W.M.M.J., van Ormondt D. (1985) J. Magn.
Reson., 61, 465.
Sklenar V., Piotto M., Leppik R., Saudek V. (1993) J. Magn. Reson. A, 102, 241.
Plateau P., Guéron M. (1982) J. Am. Chem. Soc., 104, 7310.
Otting G., Widmer H., Wagner D. Wüthrich K. (1986) J. Magn. Reson., 66, 187.
Powers R., Jones C.R., Gorenstein D.G. (1990) J.Biomol.Struct.Dyn., 8, 253.
Milecki J., Popenda M., Adamiak R.W. (1994) , Pol. J. Chem., 68, 275.
Remin M., Shugar D. (1972) Biochem. Biophys. Res. Commun., 48, 636
Petersheim,M., Turner,D.H. (1983) Biochemistry, 22, 269.
Bell,R.A, Everett,J.R., Hughes,D.W., Coddington,J.M., Alkema,D., Hader,A.P.,
Neilson,T. (1985) J.Biomol.Struct., 2, 693.
156
330.
331.
332.
333.
334.
335.
336.
337.
338.
339.
340.
341
342.
343.
344.
345.
346.
347.
348.
349.
350.
351.
352.
Cheng,D.M., Kan,L., Frechet,D., Ts’O,P.O.P (1984) Biopolymers, 23, 775.
Sinclair,A., Alkema,D., Bell.R.A., Coddington,J.M., Hughes,D.W., Neilson,T.,
Romaniuk,P.J. (1984) Biochemistry, 23, 2656.
Petersen S.P., Led,J.J., (1981) J. Am. Chem. Soc., 103, 5308.
Breitmaier,E., Voelter,W. (1989) Carbon-13 NMR Spectroscopy, VCH
Verlagsgellschaft mbH, Weinheim
LaPlante R.S. (1994), Biochemistry, 33, 2430.
Ghose R., Marino J.I., Wiberg K.B., Prestegard J.H. (1994) J. Am. Chem. Soc., 116,
8827.
Ghose R., Marino J.I., Wiberg K.B., Prestegard J.H. (1994) J. Am. Chem. Soc., 116,
8827.
Wang Y, de los Santos C., Gao X., Greene K., Live D., Patel D.J. (1991) J.Mol.Biol.,
222, 819.
Mao B., Cosman M., Hingerty B.E., Broyde S., Patel D.J. (1995) Biochemistry, 34,
6226.
Jiang F., Fiala R., Live D., Kumar A.R., Patel D.J. (1996) Biochemistry, 35, 13250.
LaPlante R.S., Boudreau A.E., Zanatta N., Levy G.C., Borer P.N. (1988)
Biochemistry, 27, 7902.
Martin G.E., Zektzer A.S. (1988) Two-Dimensional NMR Methods for Establishing
Molecular Connectivity, VCH Publishers, Inc., New York, Weinheim, Cambridge.
Uesugi S., Miki H., Ikehara M., Iwahashi H., Kyogoku Y. (1979) Tetrahedron Lett.,
20, 4073.
Guschlbauer W., Jankowski K (1980) Nucleic Acids Res., 8, 1421.
Shakked Z., Rabinovitch D., Kennard O., Cruse W.B.T., Salisbury S.A., Viswamitra
M.A. (1983) J. Mol. Biol., 166, 181.
Conte M.R., Bauer C.J., Lane A.N. (1996) J. Biomol. NMR., 7, 190.
Chary K.V., Modi S., Hosur R.V., Govil G., Chen C.Q., Miles H.T. (1989)
Biochemistry, 28, 5240.
Neuhaus D., Williamson M. (1989) The Nuclear Overhauser Effect in Structural and
Conformational Analysis, VCH Publishers, Inc., New York, Weinheim, Cambridge.
Arnott S., Hukins D.W.L., Dover S.D., Fuller W., Hodgson A.R. (1973) J. Mol. Biol,
8, 107.
Heinemann U. (1991) J. Biomol. Struct. Dyn., 8, 801.
Sproat B.S. (1995) J. Biotechnol., 41, 221.
Blommers M.J.J., Pieles U., Mesmaeker A. (1994) Nucleic Acids Res., 22, 4287.
Lubini P., Zurcher W., Egli M. (1994) Chem. Biol., 1, 39.
157
Aneks 1. Oznaczenie skrótów
A
AIDS
C
COLOC
COSY
DG
DNA
DQF
DQF-COSY
DR.COSY
E.COSY
FID
G
HETCOR
HIV
HMQC
HOESY
HSQC
INEPT
IRMA
ISPA
LP
MD
MEM
MLM
MQ-COSY
MQF-COSY
mRNA
NMR
NOE
NOESY
P.E.COSY
R.COSY
RMA
rMD
RNA
ROESY
rRNA
SA
TOCSY
TPPI
TQF
tRNA
U
adenozyna
ang. acquired immunodeficency syndrome
cytydyna
ang. COrrelated spectroscopy for LOng range Coupling
ang. COrrelation SpectroscopY
ang. Distance Geometry
kwas deoksyrybonukleinowy
ang. Double Quantum Filtered
ang. Double Quantum Filtered Correlation SpectroscopY
ang. Double Relayed Correlation SpectroscopY
ang. Extensive Corelation Spectroscopy
ang. Free Induction Decay
guanozyna
ang. HETeronuclear CORrelation spectroscopy
ang. human immunodeficiency virus
ang. Heteronuclear Multiple Quantum Coherence
ang. Heteronuclear Overhauser Effect SpectroscopY
ang. Heteronuclear Single Quantum Coherence
ang. Intensitive Nuclei Enhanced by PolarisaTion
ang. Iterative Relaxation Matrix Approach
ang. Isolated Spin Pair Approximation
ang. Linear Prediction
ang. Molecular Dynamics
ang. Maximum Entropy Method
ang. Maximum Likelihood Method
ang. Multi-Quantum Correlation SpectroscopY
ang. Multi Quantum Filtered Correlation SpectroscopY
matrycowy kwas rybonukleinowy
ang. Nuclaer Magnetic Resonance
ang. Nuclear Overhauser Effect
ang. Nuclear Overhauser Enhancement SpectroscopY
ang. Primitive E.COSY
ang. Relayed Correlation SpectroscopY
ang. Relaxation Matrix Approach
ang. restrained Molecular Dynamics
kwas rybonukleinowy
ang. Rotating Frame Overhauser Effect SpectroscopY
rybosomalny kwas rybonukleinowy
ang. Simulated Annealing
ang. Total COrrelation SpectroscopY
ang. Time Proportional Phase Incrementation
ang. Triple Quantum Filtered
transferowy kwas rybonukleinowy
urydyna
158
Aneks 2. Spis publikacji i komunikatów.
Publikacje:
1.
M.Popenda, J.Ciesiołka, W.Krzyżosiak,
komputerowych stosowanych w analizie
Biotechnologia 1-2, 34-41 (1988).
"Przegląd pakietów programów
kwasów nukleinowych i białek",
2.
M.Popenda, J.Ciesiołka, W.Krzyżosiak, "Program analizy sekwencji kwasów
nukleinowych NASEQ", Biotechnologia 1-2, 24-33 (1988).
3.
J.Ciesiołka, M.Popenda, W.Krzyżosiak, "Komputerowe banki sekwencji kwasów
nukleinowych i białek" Biotechnologia 1-2, 42-50 (1988).
4.
B.Golankiewicz, J.Zeidler, M.Popenda, "Determination of the Tautomerism of 5,5Disubstituted Analogues of 6-Amino-2-thiouracil by 1H and 13C Nuclear Magnetic
Resonsnce Spectroscopy", J. Chem. Perkin Trans. 2, 1001-1004 (1990).
5.
M.D.Bratek-Wiewiórowska, M.Popenda, N.Malinowska, M.Wiewiórowski "The
nature of drastic differences in the recognition of protonated cytidinium and
deoxycytidinium cations by their parent nucleosides within dihydrogenphosphate salts
in the light of the computer-simulated crystal structure of dCyd hemiphosphate
(dCyd)2H+ H2PO4", J. Mol. Struct. 237, 123-137 (1990).
6.
M.Stobiecki, M.Popenda, K.Gulewicz, "Four coumarins isolates from seeds of
Lupinus angustifolius", Biochemical Systematics and Ecology. 21, 413 (1993)
7.
E.Biała, J.Milecki, A.Kowalewski, M.Popenda, W.Z.Antkowiak, R.W.Adamiak, "ZRNA. The synthesis of 2'-O-[13C]methyl- and 5-methyl-analogs of ribo-CGCGCG",
Acta Biochim. Pol., 40 (4), 521-530 (1993).
8.
J.Milecki, M.Popenda, R.W.Adamiak, "1H NMR analysis of isomeric 2' (3')-Otrialkylsilyl and 2' (3')-O-methyl ribonucleosides", Pol. J. Chem. 68, 275-280 (1994).
9.
M.D.Bratek-Wiewiórowska, M.Alejska, M.Popenda, E.Utzing, M.Wiewiórowski,
"The crystal engineering of cytidine (Cyd), 2'-deoxycytidine (dCyd) and their
phosphate salts. Part 2. The mechanistic analysis of an easy transformation of two
dCyd phosphate salts, mono and hemi(dihydrogenphosphates), when in a crystal state,
using thermochemical data, computer experiments and FT-IR-PAS spectra.", J. Mol.
Struct. 327, 327-336 (1994).
10. B.Golankiewicz, P.Januszczyk, J.Zeidler, M.Popenda, E.Bartoszak, Z.Kosturkiewicz,
"The Route from 4-Oxo- to 4-Amino-imidazo[1,5-a]-1,3,5-triazines and the
Tautomerism of 4-Oxo, 4-Thioxo and 4-Oxo-2-thioxo Derivatives. A 1H and 13C NMR
and X-Ray Crystallographic Study", J. Chem. Res. (M), 644-671 (1994), J. Chem.
Res. (S), 96-97 (1994).
11. M.Stobiecki, M.Popenda, "Flavan-3-ols from seeds of Lupinus Angustifolius",
Phytochemistry 37, 1707-1711 (1994).
12. M.Popenda, J.Milecki, E.Biała, R.W.Adamiak, "The solution NMR structure of 2'-Omethyl-CGCGCG RNA duplex", Nucleosides & Nucleotides 14 (3-5), 283-284
(1995).
13. D.M.Napierała, M.Popenda, "NMR and computational comarative study of the
159
Amylose - Bengal Rose complexing in DMSO solution", Żywność. Technologia.
Jakość. 2 (7), 28-35 (1996).
14. M.Popenda, E.Biała, J.Milecki, R.W.Adamiak, "Solution structure of RNA duplexes
containg alternating CG base pairs: NMR study of r(CGCGCG)2 and 2'-OMe(CGCGCG)2 under low salt conditions", Nucl. Acids. Res. 25 (22), 4589-4598
(1997).
15. D.A.Adamiak, J.Milecki, M.Popenda, R.W.Adamiak, Z.Dauter, W.R.Rypniewski
"Crystal structure of 2'-O-Me(CGCGCG)2, an RNA duplex at 1.30 Å resolution.
Hydration pattern of 2'-O-methylated RNA", Nucl. Acids. Res. 25 (22), 4599-4607
(1997).
16. A.Burdzy, B.Skalski, S.Paszyc, M.Popenda, R.W.Adamiak "Acid promoted
transformations of fluorescent luminarosine and its 2'-modified analogs.", ", Acta
Biochim. Pol., 45 (4), 0000 (1998).
Komunikaty:
1.
A.Stroiński, M.Popenda, "Badania kompleksu Zn-lipoproteidów izolowanych z
membran chloroplastrowych za pomocą 1H i 13C NMR., Materiały Zjazdowe.
PTBioch, Kraków 1985.
2.
D.Napierała, M.Popenda, S.Poliszko, "Spektroskopia 13C MRJ żeli skrobi pszenicy.",
Materiały Zjazdowe PTBF 6, Szczecin 1986.
3.
S.Poliszko, M.Popenda, D.Napierała, "Badania kinetyki strukturowania w żelach
skrobi pszenicy metodami spektroskopii MRJ i DMA.", Materiały XX
Ogólnopolskiego Seminarium na temat MRJ i jego zastosowań, Kraków 1987.
4.
D.Napierała, M.Popenda, S.Popliszko, "Spektroskopia 13C MRJ skondensowanych
układów skrobi.", Materiały XX Ogólnopolskiego Seminarium na temat MRJ i jego
zastosowań, Kraków 1987.
5.
S.Poliszko, D.Napierała, M.Popenda, "Analiza przesunięć chemicznych w widmach
MRJ żeli skrobi pszenicy w obszarze przejść konformacyjnych spirala-kłębek.",
Materiały XXI Ogólnopolskiego Seminarium na temat MRJ i jego zastosowań,
Kraków 1988.
6.
L.Schulz, M.Popenda, "Similarity and Dissimilarity of structures.", Fouth
International Symposium on Biological an Artifical Intelligence Systems, Toronto
1988.
7.
L.Schulz, M.Popenda "Sequence analysis by set spectra and program DANS",
Intenational Symposium on the analysis of Nucleoside, Nucleotide and
Oligonucleotide Compounds, Antwerpia 1989.
8.
D.Napierała, M.Popenda, W.Maciejewska "Badania kompleksu skrobia - barwnik
metodami NMR", Materiały XXV Ogólnopolskiego. Seminarium na temat MRJ i
jego zastosowań, Kraków 1993.
9.
J.Milecki, E.Biała, A.Kowalewski, M.Popenda, W.Z.Antkowiak, R.W.Adamiak,
160
"Synteza 2'-O-[13C]metylo-analogów rybo-CGCGCG.", V Środowiskowa Konferencja
Naukowa Chemików, Poznań 1994.
10.
M.Popenda, J.Milecki, E.Biała, R.W.Adamiak, "Struktura dupleksu 2'-O-[13C]metyloCGCGCG RNA w oparciu o metody NMR", V Środowiskowa Konferencja Naukowa
Chemików, Poznań 1994.
11.
I.Zagórowska, M.Popenda, B.Skalski, R.W.Adamiak, Synteza i termodynamika
wybrzuszonych dupleksów RNA (bulge duplexes) modyfikowanych fluoroforem -2Aminopuryną.", V Środowiskowa Konferencja Naukowa Chemików, Poznań 1994.
12.
D.Napierała, M.Popenda "Observations on NMR spectra of Amylose - Rose Bengal.",
12th Specialized Colloque Ampere on Dynamics of Partially Disordered Condensed
Matter, Corfu 1995.
13.
D.M.Napierała, M.Popenda, K.Polewski, S.Poliszko "Molecular dynamics of starch
chain in multicomponent system", J. Magn. Res. Analysis 2 (3), 224 (1996); The
Third International Conference on Applications of Magnetic Resonance in Food
Science, Nantes 1996.
14.
D.M.Napierała, M.S.Popenda "Badania kompleksowania amylozy z Rose Bengal w
obecności DMSO.", Materiały XXVIII Ogólnopolskiego Seminarium na temat MRJ
i jego zastosowań, Kraków 1995.
15.
D.Napierała, S.Poliszko, M.Popenda "NMR study on the what starch spatial network
forming in water", Properties of Water in Foods. Proceedings of the Eight Seminar,
Warszawa 1997.
16.
Z.Fojud, M.Popenda "Czasy relaksacji T1 i przesunięć chemicznych w lipotropowym
ciekłym krysztale DDACl.", Materiały XXX Ogólnopolskiego Seminarium na temat
MRJ i jego zastosowań, Kraków 19987
17.
M.Popenda, R.W.Adamiak "13C-NMR spectra support unexpected similarities
between r(CGCGCG)2 and 2'-O-Me(CGCGCG)2 duplex structures", International
Conference "Nucleic Acids and their Constituents: Chemical Evolution Underlying
Biological Evolution", Poznań 1998.
18.
M.Popenda, D.A.Adamiak, W.Rypniewski, Z.Dauter, J.Milecki, E.Biała,
R.W.Adamiak "Niekanoniczne formy dupleksów RNA zawierających powtarzające
się pary zasad C-G", VI Środowiskowa Konferencja Naukowa Chemików, Poznań
1998
19.
D.Napierała, M.Popenda, S.Surma, G.Plenzler "The study of water activity in
glucose solutions.", Properties of Water in Foods. Proceedings of the Ninth Seminar,
Warszawa 1998.
20.
B.Golankiewicz, W.Folkman, M.Popenda "2-Metylowyozyna. Pierwszy przykład
nukleozydu o zamrożonej konformacji East w roztworze", V Ogólnopolskie
Sympozjum Chemii Organicznej, Konstancin-Jeziorna 1998.
161
Aneks 3. Odbitki prac.
1. E.Biała, J.Milecki, A.Kowalewski, M.Popenda, W.Z.Antkowiak, R.W.Adamiak,
"Z-RNA. The synthesis of 2'-O-[13C]methyl- and 5-methyl-analogs of ribo-CGCGCG",
Acta Biochim. Pol., 40 (4), 521-530 (1993).
2. J.Milecki, M.Popenda, R.W.Adamiak, "1H NMR analysis of isomeric 2' (3')-Otrialkylsilyl and 2' (3')-O-methyl ribonucleosides", Pol.J.Chem. 68, 275-280 (1994).
3. M.Popenda, J.Milecki, E.Biała, R.W.Adamiak, "The solution NMR structure of 2'-Omethyl-CGCGCG RNA duplex", Nucleosides&Nucleotides 14 (3-5), 283-284 (1995).
4. M.Popenda, E.Bia³a, J.Milecki, R.W.Adamiak, "Solution structure of RNA duplexes
containg alternating CG base pairs: NMR study of r(CGCGCG)2 and 2'-OMe(CGCGCG) 2 under low salt conditions", Nucl.Acids.Res. 25 (22), 4589-4598 (1997).
5. D.A.Adamiak, J.Milecki, M.Popenda, R.W.Adamiak, Z.Dauter, W.R.Rypniewski
"Crystal structure of 2'-O-Me(CGCGCG)2, an RNA duplex at 1.30 Å resolution.
Hydration pattern of 2'-O-methylated RNA", Nucl.Acids.Res. 25 (22), 4599-4607
(1997).
162