Tworzenie protoplastów i sferoplastów

ĆWICZENIE III
METODA SFEROPLASTYZACJI
Autor i główny prowadzący dr Dorota Korsak
Wstęp
Jedną z metod badania zawartości przestrzeni peryplazmatycznej bakterii gramujemnych
jest metoda sferoplastyzacji. Polega ona na otrzymaniu sferoplastów czyli komórek z
częściowo zdegradowaną ścianą komórkową. W środowisku hipertonicznym (wysokie
stężenia sacharozy) w obecności EDTA (tworzy kompleksy z jonami metali co prowadzi do
destabilizacji błony zewnętrznej bakterii) i lizozymu (enzym lityczny hydrolizujący wiązanie
glikozydowe typu 1-4 pomiędzy N-acetyloglukozoaminą i kwasem N-acetylomuraminowym
w peptydoglikanie) powstają sferoplasty. Zawartość przestrzeni peryplazmatycznej zostaje
uwolniona do środowiska, w tym różnego rodzaje enzymy, np. -laktamazy.
1. Celem ćwiczenia jest izolacja metodą sferoplastyzacji i oznaczenie jakościowe enzymu
- -laktamazy z komórek E. coli.
1.1. Materiały
Szczepy bakteryjne
E. coli produkujący indukowną -laktamazę
L. monocytogenes
S. aureus
P. aeruginosa
E. faecalis
Bufory
0,2 M Tris/HCl, pH 8,0
0,2 M bufor Tris/HCL, pH 8,0; 1 M sacharoza
10 mM EDTA, pH 8,0
1 M Mg SO4
roztwór lizozymu (2 mg/ml)
Antybiotyki
roztwór ampicyliny w stężeniu wyjściowym 10 mg/ml i 1 mg/ml
1.2 Otrzymanie sferoplastów
1) Odwirować (10 min, 5 tyś.obr/min, 4oC) 40 ml hodowli E. coli w fazie logarytmicznej.
2) Usunąć dokładnie supernatant, a osad zwiesić w 0,25 ml 0,2 M Tris/HCl o pH 8,0.
3) Zawiesinę schłodzić w lodzie (10 min).
4) Dodać:
0,5 ml 0,2 M buforu Tris/HCL o pH 8,0, 1 M sacharoza
0,05 ml 10 mM EDTA o pH 8,0
0,05 ml lizozymu
5) Wszystko dokładnie, delikatnie wymieszać i pozostawić w lodzie (10 min)
6) Dodać 1,6 ml jałowej ogrzanej do temp. 30 oC !!!!!! wody destylowanej i inkubować
w tej samej temp. Co 10 min wykonywać obserwacje mikroskopowe w celu
zaobserwowania zmian morfologii komórek.
7) Po otrzymaniu sferoplastów dodać 0,05 ml 1M MgS04 .
8) Próbę odwirować (3 min, 5 tyś. Obr/min)
9) Uwaga: supernatant jest źródłem enzymu – β-laktamazy!!!!!!
1.3. Oznaczenie jakościowe enzymu - -laktamazy E. coli
I
1) Do reakcji wziąć:
100 µl supenatantu, który jest źródłem -laktamazy
10 µl ampicyliny z odpowiedniego stężenia
90 µl jałowej wody
Kontrola: zamiast supernatantu - woda
2) Inkubować 30 min w 30 oC.
3) Na podłoże agarowe LB wymazówką wysiać szczepy: L. monocytogenes, S. aureus,
P. aeruginosa, E. coli, E. faecalis, Micrococcus luteus.
4) Na podłożu umieścić cylinderki.
5) Nanieść po 200 l odpowiednio: próby badanej (ampicylina + supernatant) i kontroli.
6) Hodowle inkubować 24 godz. w temp. 37 oC.
7) Odczytać wyniki.
Uwaga: Obserwować obecność lub brak strefy zahamowania wzrostu badanego szczepu
bakterii wokół cylinderka z próbą kontrolną i próbą badaną. Na podstawie obserwacji
wyciągnąć wnioski.
II
Pobrać 0,1 ml supernatantu i nanieść na krążek nasączony nitrocefiną. Obserwować
zmiany zabarwienia.
Uwaga: Nitrocefina jest chromogenną cefalosporyną, skuteczną w wykrywaniu
wszystkich znanych -laktamaz. -laktamazy hydrolizują wiązanie amidowe w
pierścieniu -laktamowym nitrocefiny, powodując wyraźną zmianę koloru z żołtego na
czerwony.
2. Określenie przynależności gatunkowej szczepów Listeria spp.
2.1. Izolacja DNA metodą lizy termicznej
Pobrać kilka kolonii bakteryjnych z podłożu TSYEA i zawiesić w 20 l roztworu 0,25%
SDS i 0,05 NaOH. Całość inkubować w 95 oC przez 15 minut, a następnie dodać 180 l
zimnej redestylowanej jałowej wody. Zawiesinę wirować 3 minuty przy 13,4 obrotów/min.
Supernatant jest źródłem totalnego DNA.
2.2. Określenie przynależności gatunkowej szczepów Listeria spp.
W celu określenia przynależności gatunkowej szczepów bakterii z rodzaju Listeria
przeprowadzić reakcję amplifikacji DNA stosując odpowiednią parę starterów. Startery,
amplifikowane fragmenty genów i wielkość powstających produktów przedstawiono w Tab. 1.
Matrycą w reakcji amplifikacji jest DNA otrzymany metodą lizy termicznej.
Końcowa objętość mieszaniny reakcyjnej wynosi 25 l, jej skład przedstawiono w Tab.2.
Warunki reakcji amplifikacji:
wstępna denaturacja: 95 oC, 4 min,
30 cykli:
denaturacja w temp. 94 oC przez 30 s;
przyłączanie starterów w temp. 60 oC przez 30 s;
synteza DNA w temp 72 oC przez 1 min.
ostatni etap reakcji: 7-minutowa synteza w 72 oC
Tabela 1. Startery
Starter
Gatunek
Produkt amlifikacjii genu
LisI-F
LisI-R
?
potencjalny regulator
transkrypcji
453
?
N-acetylomuramidaza
493
?
iap
250
LisII-F
LisII-R
LisIII-F
LisIII-R
Produkt
(pz)
Tabela 2. Skład mieszaniny reakcyjnej
Składnik
woda redestylowana
Ilość składnika na
1 x próbę
17.5l
bufor do polimerazy
2,5 l
mieszanina dNTP
odpowiedni starter F
odpowiedni starter R
polimeraza Taq
matryca DNA
1 l
1 l
1 l
1 l
1 l
Stężenie końcowe
składnika
400 M
400 nM
400 nM
1U
-