Dako Liquid DAB+ Substrate Chromogen System Nr kat

Dako
Liquid DAB+ Substrate
Chromogen System
Nr kat. K3468
Przeznaczenie
Do stosowania w diagnostyce in vitro.
Niniejszy system substrat-chromogen jest to system DAB o duŜej czułości, który nadaje się do stosowania w immunohistochemicznych
metodach barwienia, opartych na peroksydazie (IHC) oraz w metodach barwienia z wykorzystaniem hybrydyzacji in situ (ISH). Po utlenieniu,
DAB tworzy brązowy produkt końcowy w miejscu docelowego antygenu lub kwasu nukleinowego.1
Zobacz dokument Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych firmy Dako lub następujące części instrukcji do
systemu detekcji IHC: 1) Zasady procedury, 2) Materiały wymagane, ale niedostarczone z zestawem, 3) Przechowywanie, 4) Przygotowanie
preparatu, 5) Wykonanie odczynu, 6) Kontrola jakości, 7) Rozwiązywanie problemów, 8) Interpretacja wyniku odczynu, 9) Ograniczenia
metody.
Dostarczany odczynnik
Dostarczane są następujące materiały, wystarczające do przygotowania 110 ml roztworu substrat-chromogen. Objętość jest wystarczająca
do barwienia co najmniej 500 próbek.
Ilość
1x5 ml
Opis
Chromogen DAB+
Roztwór chromogenu, 3,3'-diaminobenzydyny
110 ml
Bufor substratu
Bufor imidazol-HCl, pH 7,5, zawierający nadtlenek wodoru oraz czynnik przeciwbakteryjny.
1x110 ml do barwienia ręcznego
10x11 ml przystosowany do stosowania z aparatem Dako Autostainer
Środki ostroŜności
1. Odczynniki są przeznaczone dla przeszkolonych uŜytkowników.
2. Chromogen DAB oraz bufor do substratu są wraŜliwe na zanieczyszczenia róŜnymi czynnikami utleniającymi, takimi jak metale,
bakterie, pył i typowe szkło laboratoryjne. Aby uniknąć zanieczyszczenia i konieczności przedwczesnego wycofania odczynnika z
uŜytku, naleŜy unikać kontaktu odczynników z wszelkimi potencjalnymi źródłami zanieczyszczenia.
3. Aby uniknąć zanieczyszczenia, nie naleŜy nigdy pobierać pipetą chromogenu DAB lub buforu substratu bezpośrednio z butelek. Wlać
potrzebną ilość do czystych pojemników i stamtąd pipetować. Nie wlewać nadmiaru roztworu z powrotem do głównych pojemników.
4. Nie naleŜy przechowywać składników DAB ani wykonywać barwienia w silnym oświetleniu, takim jak bezpośrednie światło słoneczne.
5. Jako zasadę naleŜy przyjąć zakaz pracy z produktem przez osoby w wieku poniŜej 18 lat. UŜytkowników naleŜy starannie poinstruować
co do właściwych procedur pracy, niebezpiecznych własności produktu i środków ostroŜności.
6. NaleŜy stosować właściwe wyposaŜenie ochronne, zabezpieczające przed kontaktem odczynnika ze skórą bądź oczyma.
Niewykorzystany odczynnik naleŜy usuwać zgodnie ze stosownymi przepisami lokalnymi i ogólnokrajowymi.
7. Karta Charakterystyki Substancji Niebezpiecznej jest dostępna na Ŝądanie.
Niebezpieczeństwo
Chromogen DAB+: czterochlorek bifenylo-3,3’,4,4’-tetrailotetraamonowy w stęŜeniu 1-5%
H350
MoŜe powodować raka.
H341
Podejrzewa się, Ŝe powoduje wady genetyczne.
P201
Przed uŜyciem zapoznać się ze specjalnymi środkami ostroŜności.
P202
Nie uŜywać przed zapoznaniem się i zrozumieniem wszystkich środków bezpieczeństwa.
P280
Stosować rękawice ochronne. Nosić okulary ochronne lub ochronę twarzy. Stosować odzieŜ ochronną.
P308 + P313
W PRZYPADKU naraŜenia lub styczności: Zwrócić się o pomoc lekarską.
P405
Przechowywać pod zamknięciem.
P501
Zawartość pojemnika jak i pojemnik utylizować zgodnie z lokalnymi, regionalnymi, narodowymi oraz
międzynarodowymi przepisami.
(126078-001)
P04041PL_01/K3468/2015.04 p. 1/2
Przechowywanie
System substrat-chromogen DAB naleŜy przechowywać w oryginalnym pojemniku w temperaturze 2–8°C.
Nie ma jednoznacznych oznak świadczących o niestabilności odczynników, dlatego równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od
pacjentów, naleŜy wykonywać dodatnie i ujemne próby kontrolne. W razie uzyskania nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie moŜna
wyjaśnić róŜnicami w procedurach laboratoryjnych, jeŜeli podejrzewa się problem z zestawem, naleŜy się skontaktować z działem pomocy
technicznej firmy Dako.
Przygotowanie odczynnika
Dodać 1 kroplę (lub 20 µl) chromogenu DAB na ml buforu substratu.
Stosować dostarczoną probówkę z podziałką, aby odmierzyć potrzebną ilość buforu substratu. Dobrze wymieszać i nanieść roztwór stosując
dostarczoną pipetę transferową. Po uŜyciu dokładnie wypłukać probówkę z podziałką i pipetę wodą destylowaną. Przygotowany roztwór
roboczy substratu (CHROM) naleŜy przechowywać w temperaturze 2–8°C i wykorzysta ć w przeciągu 5 dni.
Procedura
Do barwienia IHC i ISH, po inkubacji z odczynnikiem HRP, umieścić próbki w kąpieli w buforze. Odciągnąć nadmiar buforu i ostroŜnie
wytrzeć preparat wokół próbki.
1.
2.
3.
4.
Nakryć próbkę roztworem DAB. Inkubować przez 5–30 minut. W razie potrzeby, inkubację z systemem substrat-chromogen DAB
moŜna przeprowadzać w temperaturach wyŜszych niŜ temperatura pokojowa.
Delikatnie spłukać wodą destylowaną.
W razie potrzeby wykonać barwienie kontrastowe.
Przykryć wodnym środkiem do zatapiania lub środkiem do trwałego zatapiania.
W przypadku stosowania szkiełek typu capillary gap slide naleŜy przestrzegać poniŜszych zaleceń:
1.
2.
Nie ma potrzeby dodawania detergentu do systemu substrat-chromogen w celu zmniejszenia napięcia powierzchniowego.
Naciągnąć substrat-chromogen DAB na 20–30 sekund i osuszyć roztwór co najmniej dwa razy przed inkubacją, przez 5–30 minut.
Wyniki
W procedurach IHC i ISH, system substrat-chromogen DAB daje brązowy końcowy produkt reakcji w miejscu docelowego antygenu lub
kwasu nukleinowego.
W celu prawidłowej interpretacji, w kaŜdym cyklu barwienia naleŜy uwzględnić kontrolę dodatnią i ujemną. Kontrole dodatnie stosuje się jako
wskaźniki prawidłowej obróbki i techniki pracy z preparatami. Kontrole ujemne stosuje się w celu oceny odczynu nieswoistego. Jeśli
występuje odczyn nieswoisty, zazwyczaj ma on charakter rozproszony.
Ograniczenia
Endogenna aktywność peroksydazy lub o podobnym charakterze, występująca w białkach zawierających cząsteczki hemu – np.
hemoglobinie, mioglobinie, cytochromach i katalazie oraz w eozynofilach moŜe dawać wyniki fałszywie dodatnie.2,3 W tkankach utrwalonych
formaliną tego rodzaju aktywność moŜna zahamować, inkubując tkankę w 3% nadtlenku wodoru przez pięć minut, przed zastosowaniem
przeciwciał pierwotnych lub sondy. Rozmazy krwi i szpiku kostnego oraz zamroŜone wycinki tkanek moŜna poddać działaniu odczynnika
Peroxidase Blocking Reagent (nr kat. S2001). Ta procedura nie usuwa jednak czerwonawo-brązowego zabarwienia wywołanego
obecnością hemoprotein. MoŜna równieŜ stosować roztwór metanolu i nadtlenku wodoru, ale procedura ta moŜe spowodować denaturację
niektórych antygenów.
Piśmiennictwo
1. Graham RC, Karnovsky MJ. The early stages of absorption of injected horseradish peroxidase in the proximal tubules of mouse kidney:
ultra-structural cytochemistry by a new technique. J Histochem Cytochem 1966;14(4):291-302
2. Escribano LM, Gabriel LC, Villa E, Navarro JL .Endogenous peroxidase activity in human cutaneous and adenoidal mast cells. J
Histochem Cytochem 1987;35(2):213-20
3. Elias JM. Immunohistopathology: A practical approach to diagnosis. Chicago: Amer Soc Clin Pathol Press. 1990;46
Wydanie 04/15
(126078-001)
P04041PL_01/K3468/2015.04 p. 2/2