Ampli-LAMP Babesia canis

Novazym Products
Novazym Polska ul. Żywokostowa 23, 61-680
Poznań, tel. +48 0 61 610 39 10, fax +48 0
61 610 39 11, email [email protected]
Ampli-LAMP Babesia canis
Zestaw do identyfikacji materiału genetycznego pierwotniaka
Babesia canis canis techniką Loop-mediated Isothermal
AMPlification (LAMP)
Numery katalogowe produktu:

AML-Bc-200

AML-Bc-400
Wydanie 1 (październik 2012)
Ampli-LAMP Babesia canis
1. Przeznaczenie testu
Babeszjoza jest groźną chorobą inwazyjną ludzi i zwierząt. Rodzaj Babesia liczy około
110 gatunków patogennych dla szerokiego spektrum kręgowców, w tym i człowieka. Głównym
czynnikiem etiologicznym babeszjozy u psów jest gatunek Babesia canis, gatunek zbiorczy,
reprezentowany przez 3 podgatunki: B. canis canis, B. canis rossi i B. canis vogeli, dla których
wektorami są kleszcze. Zarażenie kręgowca następuje poprzez ślinę, podczas ssania krwi przez
zarażonego pierwotniakami kleszcza. Pierwotniaki Babesia bezpośrednio atakują czerwone
krwinki i niszczą je, doprowadzając do anemii, uszkodzenia wątroby i nerek oraz innych
narządów wewnętrznych. Babeszjoza w błyskawicznym tempie sieje spustoszenie
w organizmie psa, a nieleczona lub leczona niewłaściwie szybko prowadzi do zgonu.
Test pozwala na jakościową detekcję DNA pierwotniaków z gatunku Babesia canis
canis w krwi psów chorych na babeszjozę. W zależności od wielkości, zestaw pozwala na
przeprowadzenie 200 i 400 testów.
Zestaw zawiera:
- Isothermal Master Mix (bufor reakcyjny, dNTPs, polimeraza GspSSD, barwnik fluorescencyjny –
pochodna 6-FAM)
- Primers (F3, B3, FIP, BIP każdy w stężeniu 10 µM)
- kontrolę pozytywną DNA (sekwencja DNA amplikonu w wektorze plazmidowym)
- sterylną wodę MiliQ do reakcji.
2. Zasada działania testu
Test oparty jest na technice LAMP (ang. Loop-mediated Isothermal Amplification)
i zapewnia bardzo szybką oraz wysoce specyficzną identyfikację materiału genetycznego
pierwotniaka Babesia canis. Zoptymalizowane mieszaniny i specjalnie zaprojektowane startery
umożliwiają specyficzną amplifikację konserwatywnego regionu DNA występującego w genomie
Babesia canis.
Wysoka czułość testu Ampli-LAMP Babesia canis pozwala na detekcję nawet 0,1 pg DNA
patogenu.
Czas potrzebny na przeprowadzenie reakcji to ok. 30 minut w przypadku wykorzystania
standardowego termocyklera oraz 15-20 minut w przypadku termocyklera do Real-time PCR lub
platformy Genie II. Test oparty o metodę amplifikacji LAMP jest co najmniej dwukrotnie szybszy
od testu opartego o standardową amplifikację PCR.
Novazym Polska s.c., ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań, NIP 9721099648
Tel. +48 0 61 610 39 10 Fax +48 0 61 610 39 11E-mail:[email protected]
www.novazym.com
2
Ampli-LAMP Babesia canis
W zależności od urządzenia wykorzystanego do przeprowadzenia testu, różni się sposób analizy
wyników testu:
PLATFORMA
SPOSÓB ANALIZY WYNIKÓW
Rozdział elektroforetyczny w żelu agarozowym
Termocykler do PCR
Obserwacja fluorescencji w probówce w świetle UV
Termocykler do Real-time PCR
Analiza krzywej topnienia produktu po reakcji LAMP
Platforma Genie II do LAMP
Analiza krzywej topnienia produktu po reakcji LAMP
Produkt reakcji wybarwiony bromkiem etydyny w żelu agarozowym ma postać tzw. drabinki
(ang. Ladder-pattern structure), ponieważ w wyniku reakcji LAMP powstają różnej długości
konkatamery złożone z powtórzeń sekwencji matrycowej. Wynik pozytywny reakcji można
również zaobserwować w postaci silnej fluorescencji produktów reakcji w świetle UV.
Wynik pozytywny reakcji przeprowadzonej w termocyklerze do Real-time PCR oraz na
platformie Genie II umożliwia analizę przyrostu ilości produktu w czasie rzeczywistym
(proporcjonalnie do wzrostu emisji fluorescencji, odczytywanej przez kanał FAM). Możliwa jest
również analiza specyficzności reakcji na podstawie profilu topnienia produktów amplifikacji
(ang. Melt Curve Analysis). W analizie Melt Peak widoczny jest jeden specyficzny produkt reakcji.
Zaleca się prowadzenie analizy wyników testu w układzie zamkniętym (wizualizacja
w świetle UV lub na podstawie analizy profilu topnienia produktów reakcji).
3. Zawartość zestawu Ampli-LAMP Babesia canis
Lp.
Oznaczenie
Element zestawu
Ampli-LAMP Babesia canis
Isothermal Master Mix
Ampli-LAMP Babesia canis
Primers
Ampli-LAMP Babesia canis
Positive Control
Woda MiliQ sterylna do reakcji
MiliQ Water
[1]
[2]
[3]
[4]
AML-Bc200
AML-Bc400
2
4
4
4
1
1
1
1
Warunki przechowywania:

przechowywanie długoterminowe -20 °C

przy częstym, rutynowym użyciu +4 °C

chronić przed światłem
 unikać częstego zamrażania i rozmrażania.
Novazym Polska s.c., ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań, NIP 9721099648
Tel. +48 0 61 610 39 10 Fax +48 0 61 610 39 11E-mail:[email protected]
www.novazym.com
3
Ampli-LAMP Babesia canis
4. Zalecana procedura przed analizą LAMP
Szybka izolacja genomowego DNA z krwi obwodowej psa z wykorzystaniem zestawu
Nova FAST Blood Genomic DNA Purification KIT, Novazym Polska.
5. Przeprowadzenie testu Ampli-LAMP Babesia canis
Warunki reakcji
STANDARD PCR
Etap
Amplifikacja
Chłodzenie
Temperatura
66 °C
4 °C
Czas
35 min
1 min
Ilość cykli
1
REAL-TIME PCR
Etap
Amplifikacja
Temperatura
66 °C
Czas
30 sek
Ilość cykli
70
Pomiar fluorescencyjny ilości produktu amplifikacji
po każdym cyklu reakcji, w czasie rzeczywistym
Topnienie
produktu
66 – 98 °C
0,5 °C / 5 sek
Pomiar fluorescencji po każdorazowej zmianie
temp. o 0,5 °C
Chłodzenie
40 °C
30 sek
Przygotowanie mieszaniny reakcyjnej
Lp.
Oznaczenie
probówki
[1]
[2]
[3]
[4]
Element zestawu
Objętość na 1 reakcję
Ampli-LAMP Babesia canis
Isothermal Master Mix
Ampli-LAMP Babesia canis
Primer F3/B3 10 µM – 0,5 µl
Primer FIP/BIP 10 µM – 2 µl
Ampli-LAMP Babesia canis
Positive Control
lub inna matryca DNA
Ampli-LAMP Babesia canis
MiliQ Water
15 µl
5 µl
1 µl
4 µl
RAZEM
25 µl
Novazym Polska s.c., ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań, NIP 9721099648
Tel. +48 0 61 610 39 10 Fax +48 0 61 610 39 11E-mail:[email protected]
www.novazym.com
4
Ampli-LAMP Babesia canis
Obligatoryjne kontrole testu Ampli-LAMP Babesia canis
Dla prawidłowej interpretacji wyników testu należy obok próbek badanych zastosować trzy
kontrole reakcji:

kontrolę pozytywną reakcji (Positive Control), która pozwala ocenić poprawność
przebiegu amplifikacji docelowego produktu – matrycę stanowi próbka zawierająca
amplifikowaną sekwencję DNA [3].

kontrolę negatywną reakcji, która pozwala ocenić poprawność przebiegu amplifikacji –
matrycę stanowi izolat z krwi obwodowej psa zdrowego.

kontrolę negatywną reakcji bez matrycy DNA, która pozwala ocenić czystość
odczynników używanych do reakcji amplifikacji LAMP – zamiast matrycy, woda MiliQ [4].
Fakultatywnie kontrole testu Ampli-LAMP Babesia canis
Okresowo zaleca się przeprowadzić:

kontrolę negatywną izolacji DNA – pozwala ocenić czystość odczynników do izolacji.
Należy wykonać jedną taką kontrolę w każdej serii izolacji lub okresowo w krótkich
odstępach czasu, izolując z wody (zamiast z krwi psa).

kontrolę pozytywną izolacji – pozwala potwierdzić skuteczność procesu izolacji.
Należy stosować okresowo np. dla nowej partii odczynników do izolacji DNA
(do izolacji należy podać krew naturalnie lub sztucznie zanieczyszczoną pierwotniakiem
Babesia canis).
Novazym Polska s.c., ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań, NIP 9721099648
Tel. +48 0 61 610 39 10 Fax +48 0 61 610 39 11E-mail:[email protected]
www.novazym.com
5
Ampli-LAMP Babesia canis
UWAGA! Wysokie ryzyko kontaminacji miejsca pracy!
Aby zapobiegać kontaminacji laboratorium produktami amplifikacji LAMP, należy zwrócić
szczególną uwagę, aby nie otwierać probówek z produktami amplifikacji w tym samym
pomieszczeniu, gdzie jest wykonywany proces izolacji DNA Babesia canis oraz przygotowywanie
mieszaniny reakcyjnej do testu.
Reakcję LAMP charakteryzuje bardzo wysoka wydajność - powstaje nawet do 25 µg DNA,
zawierającego bardzo dużą liczbę kopii amplikonu!
Zalecamy wykonywanie izolacji DNA i przygotowywanie mieszaniny reakcyjnej w innym
pomieszczeniu, niż rozdział elektroforetyczny produktów amplifikacji.
Pomimo możliwości analizy wyników reakcji w żelu agarozowym, zalecamy korzystanie
z możliwości wykonania reakcji i analizy wyników w układzie zamkniętym, bez konieczności
otwierania probówek z produktami reakcji LAMP (obserwacja fluorescencji produktów
amplifikacji w probówce w świetle UV oraz wykorzystanie do wykonania testu aparatu do
Real-time PCR lub platformy Genie II).
Technologia LAMP została wynaleziona i jest własnością firmy Eiken Chemical Co., Ltd.
Lot nr:
Data ważności:
Novazym Polska s.c., ul. Żywokostowa 23, 61-680 Poznań, NIP 9721099648
Tel. +48 0 61 610 39 10 Fax +48 0 61 610 39 11E-mail:[email protected]
www.novazym.com
6