IDEIA Borrelia burgdorferi IgG [PL]

5. ODCZYNNIK DOSTARCZONY
96 - Każdy zestaw diagnostyczny zawiera dość odczynników
na 96 oznaczeń.
5.1. ZAWARTOŚĆ ZESTAWU IDEIA BORRELIA BURGDORFERI,
IgG TEST
Key Code TSMX7841
www.oxoid.com/ifu
Europe +800 135 79 135
CA 1 855 805 8539
Jedna broszura instrukcji stosowania
US 1 855 2360 190
ROW +31 20 794 7071
K602911-2..........................96 Tests
PL
100mL
rozcieńczalnika
próbek
buforowany roztwór z detergentem,
środkiem
przeciwbakteryjnym,
zabarwiony na czerwono
1. P RZEZNACZENIE
Test IDEIA™ Borrelia burgdorferi IgG to test immunoenzymatyczny
do wykrywania ludzkich przeciwciał klasy IgG przeciwko Borrelia
burgdorferi sensu lato. Zestaw jest przewidziany jako pomocniczy
w diagnostyce boreliozy z Lyme.
50mL koncentratu buforu płuczącego
(x25):
roztwór
buforowany
trisem,
zawierający
środek
przeciwbakteryjny i detergent
2. STRESZCZENIE
Borelioza z Lyme to wieloorganowe zakażenie wywołane,
przenoszonym przez kleszcze, krętkiem B. burgdorferi sensu lato1,2.
Borelioza jest najczęstszym zakażeniem przenoszonym wektorowo
w Europie i Ameryce Północnej. Chorobę rozpoznawano w Rosji,
Chinach i Japonii.
1,5mL IgG kontrola dodatnia ludzka
surowica w buforze ze środkiem
przeciwbakteyjnym, barwiona na
ciemnozielono.
W związku ze szczególnie nikłą liczbą komórek B. burgdorferi w
zmianach patologicznych i płynach ustrojowych, próby hodowli
ani ostatnio stosowane techniki PCR, wykrywające bezpośrednio
krętkowy DNA nie okazały się przydatne w rutynowej diagnostyce
boreliozy z Lyme. A zatem najbardziej przydatną metodą jest
nadal pomiar swoistych dla B. Burgdorferi przeciwciał.
IDEIA Borrelia burgdorferi IgG używa jako antygenu testowego
oczyszczonego, natywnej wici szczepu B. afzelii DK1. Ta wić
(flagellum) jest silnie immunogenna i wyzwala wczesną, silną
i trwałą odpowiedź immunologiczną4,5. W porównaniu z
konwencjonalnym i obecnie szeroko stosowanym antygenem
testowym, jakim jest ekstrakt z całych komórek krętka, oczyszczony
antygen flagellum poprawia czułość i swoistość diagnostyczną
testów serologicznych do wykrywania boreliozy z Lyme6,7.
Ponadto użycie flagellum jako antygenu testowego jest właściwe
we wszystkich regionach geograficznych, ponieważ poszczególne
szczepy B. burgdorferi nie wykazują różnic dotyczących flagellum.
3. Z ASADA TESTU
Test IDEIA Borrelia burgdorferi IgG wykonuje się w studzienkach
mikropłytki opłaszczonych oczyszczonym, natywnym flagellum
Borrelia. Przeciwciała obecne w próbkach surowicy ludzkiej wiążą
się z antygenem obecnym na ścianach studzienek mikropłytki
w czasie pierwszej inkubacji. Po usunięciu niezwiązanych białek
surowicy przez wypłukanie, do studzienek dodaje się znakowanego
peroksydazą przeciwciała przeciwko ludzkiej IgG. Koniugat wiąże
się swoiście z przeciwciałami klasy IgG, związanymi uprzednio z
antygenem flagellum. Nadmiar koniugatu jest usuwany przez
wypłukanie, a po dodaniu chromogenu peroksydaza zawarta
w koniugacie katalizuje powstanie niebieskiego zabarwienia.
Reakcję zatrzymuje się dodatkiem kwasu, który zmienia niebieskie
zabarwienie na żółte. Intensywność zabarwienia odpowiada
stężeniu w próbce swoistych przeciwciał przeciwko B. Burgdorferi.
Intensywność tę mierzy się spektrofotometrycznie przy długości
fali 450nm, a wartość absorbcji prób badanych jest porównywana
z absorbancją kontroli.
Standardowe składniki zestawów (Sample Diluent,
Wash Buffer Concentrate, Substrate and Stop Solution),
i podobna procedura wykonania dotyczą też testów
IDEIA Borrelia burgdorferi, IgM ( K603011-2) i IDEIA
Lyme Neuroborreliosis ( K602811-2). Można zatem
wykonywać te testy równolegle, korzystając z tego
samego rozcieńczenia surowicy badanej.
10.1.2
Ocena wiarygodności testu opiera się na podwójnym
badaniu każdej próbki. Jeżeli zamierza się badać próbki
pojedyńczo, zalecane jest, aby wykonujący badanie
zapoznał się z opisem wiarygodności testu. Różnice
pomiędzy oznaczeniami (CV%) są o około 50% wyższe,
jeśli są oparte na pojedynczym oznaczeniu.
10.1.3
Jeżeli wytrząsarka na 500rpm nie jest dostępna,
można zredukować szybkość wytrząsania do 300rpm
podczas obu inkubacji, bez wyraźnego ujemnego
wpływu na wyniki testu, a dostępny jest także protokół
statyczny (bez wytrząsania). Proszę skontaktować się z
8. ŚRODKI OSTROŻNOŚCI
- Do diagnostyki in vitro. Osoba wykonująca test musi
być przeszkolona i doświadczona w pracy laboratoryjnej
8.1. ŚRODKI BEZPIECZEŃSTWA
8.1.1
Zestaw IDEIA Borrelia burgdorferi IgG jest tak zaprojektowany,
aby można go było używać w maksymalnie dziesięciu etapach,
podczas trzech miesięcy w okresie ważności. Istotne dla uzyskania
optymalnych wyników jest, aby przechowywać niezużyte części
zestawu zgodnie z poniższym zaleceniem:
Nieużywane paski należy usunąć z ramki i zaraz umieścić z
powrotem w zamykanej torebce ze środkiem suszącym, starannie
zamknąć i przechowywać w temperaturze 2-8°C. Można je zużyć w
ciągu 12 tygodni po pierwszym otwarciu, jeśli są przechowywane
w podany sposób.
Rozcieńczalnik próbek -
Gotowy do użycia. Niezużyty przechowywać w temperaturze
2-8°C.
Roztwór hamujący reakcję zawiera kwas siarkowy
(0,46mol/L). Unikać kontaktu z oczyma i skórą przez
noszenie ochronnej odzieży i okularów.
8.1.3
Nie jeść, nie pić, nie palić, nie przechowywać ani nie
przygotowywać żywności, ani nie stosować kosmetyków
w miejscu przeznaczonym do pracy z odczynnikami i
próbkami.
8.1.4
Nie pipetować ustami.
8.1.5
Nosić jednorazowe rękawiczki podczas pracy z
materiałem klinicznym i zawsze myć ręce po pracy z
materiałem zakaźnym.
8.1.6
Usuwać wszelkie pozostałości próbek klinicznych
zgodnie z miejscowymi przepisami.
8.1.7
Arkusz dotyczący bezpieczeństwa dostępny na żądanie
dla osób zawodowo przygotowanych.
8.1.8
Substrat TMB zawiera 1-metylopirolidon (NMP) w
stężeniu >5% i <10%, klasyfikowany zgodnie z odnośnymi
dyrektywami EWG jako Repro. Kat. 2. Poniżej podano
odpowiednie określenia dotyczące ryzyka (zwroty R) i
bezpieczeństwa (zwroty S)
R61
Może działać szkodliwie na dziecko w łonie
matki.
S53
Unikać narażenia - przed użyciem zapoznać
się z instrukcją
S45 W przypadku awarii lub jeżeli źle się
poczujesz, niezwłocznie zasięgnij porady
lekarza (pokaż etykietę jeśli to możliwe)
8.2. UWAGI TECHNICZNE
8.2.1
Koncentrat buforu płuczącego -
Dostarczany w postaci stężonej x25. Przed użyciem rozcieńczyć,
dodając jedną objętość koncentratu do 24 objętości świeżej
destylowanej lub dejonizowanej wody (lub dodać całą zawartość
do 1200mL świeżej destylowanej lub dejonizowanej wody).
Bufor płuczący o stężeniu roboczym należy przygotować w
dniu, w którym zostanie wykorzystany. Niezużyty koncentrat
przechowywać w temperaturze 2-8°C.
Niewykorzystanego buforu o stężeniu roboczym
przechowywać do następnego użycia (zob. część 8.2.11).
Wszystkie surowice dawców, użyte jako kontrole IgG,
zostały przebadane indywidualnie i ustalono, że są
ujemne, jeśli chodzi o antigen powierzchniowy wirusa
hepatitis B i przeciwciała przeciwko HIV i wirusowi
hepatitis C.
8.1.2
Studzienki -
Otworzyć torebkę z mikropłytką, tnąc wzdłuż zamknięcia. Odłamać
potrzebną ilość pasków ze studzienkami i umieścić je z powrotem
w ramce. Jeden pasek pozwala na podwójne oznaczenie próbki
od jednego pacjenta, pozostałe sześć studzienek wykorzystuje
się na próbę ślepą (rozcieńczalnik próbek) oraz kontrolę ujemną i
dodatnią. Każdy następny pasek umożliwia oznaczenie próbek od
czterech osób badanych. Jeśli wykorzystuje się naraz całą płytkę,
można zbadać próbki od 45 osób badanych.
8.2.2
nie
Nie należy używać składników zestawu po upływie
daty ważności podanej na etykietach. Nie mieszać
ani nie zamieniać odczynników z różnych zestawów i
serii, z wyjątkiem standardowych składników (Sample
Diluent, Wash Buffer Concentrate, Substrate and Stop
Solution), które wchodzą też w skład zestawu IDEIA™
Borrelia burgdorferi, IgM ( K603011-2) i IDEIA™ Lyme
Neuroborreliosis ( K602811-2).
Odczynniki są dostarczane w ustalonych stężeniach
roboczych. Wynik testu może nie być wiarygodny, jeśli
są one mieszane, rozcieńczane lub przechowywane w
warunkach innych niż wskazane w rozdz. 5.2.
-
8.2.3
Gotowa do użycia. Przechowywać niezużytą IgG cut-off control w
temperaturze 2-8°C.
8.2.4
żywać osobnych pipet lub jednorazowych końcówek
U
do każdej próby badanej, kontroli czy odczynnika, aby
uniknąć zanieczyszczenia I błędnych wyników.
8.2.5
Przechowywać wodę destylowaną lub dejonizowaną
do rozcieńczania koncentratów odczynników w
czystych pojemnikach, aby zapobiec zanieczyszczeniu
mikrobiologicznemu.
5.2.4
4. D EFINICJE
Poniższe symbole zostały użyte w informacji o produkcie.
10.1.1
Dostępne są zasady stosowania tego testu w otwartych systemach
automatycznych. Proszę się skontaktować z miejscowym
przedstawicielem lub dystrybutorem Oxoid
5.2. PRZYGOTOWANIE, PRZECHOWYWANIE I POWTÓRNE
UŻYCIE SKŁADNIKÓW ZESTAWU
5.2.3
10.1.UWAGI DOTYCZĄCE WYKONANIA
Plastikowa pokrywka do mikropłytki
Spektrofotometr lub czytnik ELISA do odczytu 96 studzienkowej
płytki złożonej z ośmiostudzienkowych pasków, przy długości
fail 450nm z odczytem odniesienia w zakresie 620-650nm
(opcjonalne, rozdz. 10.3, Odczyt wyników testu)
25mL r oztworu hamującego
0,46mol/L kwas siarkowy.
5.2.2
Czysty ręcznik papierowy do osuszania mikropłytki
Uwaga: jeśli mniej niż osiem studzienek jest używanych do testu
i płukanych w automatycznej płuczce przewidzianej na osiem
studzienek, należy dopełnić pasek pustymi studzienkami
12mL
substatu
stabilizowany
roztwór
nadtlenku
i
3,3’-5,5’-tetrametylobenzydyny
w
rozcieńczonym
roztworze
buforowym. TMB została uznana za
niekarcynogenną, jednak zaleca się
używanie środków ochrony osobistej,
aby
uniknąć
bezpośredniego
kontaktu.
5.2.1
Pojemniki na odczynniki do pipety wielokanałowej (opcjonalnie)
10. WYKONANIE TESTU
PROSZĘ ZAPOZNAĆ SIĘ Z ROZDZ. 8.2, „UWAGI TECHNICZNE”
PRZED WYKONANIEM TESTU.
Automatyczna płuczka do mikropłytek (opcjonalnie) lub inny
sprzęt potrzebny do wypłukania 8 studzienkowych pasków
(rozdz.10.2.3)
13mL znakowanego przeciwciała
anty-IgG
królicze
przeciwciało
przeciwko ludzkiej IgG koniugowane
peroksydazą chrzanową i barwione
na jasnoniebiesko.
W stadium I, w ciągu kilku dni do kilku tygodni od ugryzienia przez
kleszcza rozwija się wysypka skórna, rumień wędrujący (erythema
migrans = EM). Zakażeniu mogą towarzyszyć nieswoiste objawy,
takie jak bóle głowy, złe samopoczucie, gorączka, bóle mięśni i
stawów; w stadium II – pojawiającym się tygodnie lub miesiące
później – choroba zwykle objawia się limfocytarnym zapaleniem
opon i korzeni nrewowych z lub bez zajęcia nerwów czaszkowych
i porażeniem kończyn (zespół Bannwartha), zapaleniem wsierdzia
lub stawów; stadium III, obejmujące skórę, centralny układ
nerwowy lub stawy, może przebiegać jako zanikowe zapalenie
skóry częsci obwodowych kończyn (ACA), przewlekłe postępujące
zapalenie mózgu i opon mózgowych lub zapalenie stawów, do
których może dochodzić wiele lat po zakażeniu.
Mikropipety i końcówki jednorazowe, do podawania objętości
10-1000µL
Kontrola
punktu
odcięcia
(ujemna)
Numer produktu i numer katalogowy
5.2.5
Wyrób medyczny do diagnostyki in vitro
Gotowa do użycia. Przechowywać niezużytą IgG positive control
w temperaturze 2-8°C.
Kontrola dodatnia -
do użytku laboratoryjnego
5.2.6
Koniugat
(przeciwciało
przeciwko
IgG)
9. ZBIERANIE I PRZYGOTOWANIE PRÓBEK
Test IDEIA Borrelia burgdorferi IgG nadaje się wyłącznie do
badania próbek ludzkiej surowicy. Badanie próbek mętnych lub
lepkich może prowadzić do nieprawdziwych wyników z powodu
błędów pipetowania. Próbki surowicy mogą być przechowywane
przez 14 dni w temperaturze 2-8°C przed badaniem, lub do 6
miesięcy w temperaturze –20°C lub poniżej.
Minutnik laboratoryjny
2,5mL IgG kontroli punktu odcięcia
ludzka surowica w buforze ze
środkiem
przeciwbakteyjnym,
barwiona na jasnozielono.
Zakażenie B. burgdorferi charakteryzuje się dużą różnorodnością
objawów i przebiega w trzech stadiach3.
Probówki o pojemności około 5mL
Wytrząsarka do mikropłytek o zakresie do 500rpm przy średnicy
obrotu 3-4mm. W sprawie przydatności posiadanego sprzętu
proszę skontaktować się z miejscowym przedstawicielem lub
dystrybutorem Oxoid
Jedna buteleczka każdego z następujących odczynników:
Test immunoenzymatyczny do oznaczania przeciwciał klasy IgG
przeciwko Borrelia burgdorferi sensu lato.
Cylinder miarowy (2L)
Wielokanałowa pipeta (osiem kanałów) do podawania 100µL
(opcjonalnie)
96 studzienkowa płytka (12 pasków
po 8 studzienek) pokryta natywnym
flagellum Borrelia. Nadająca się do
powtórnego zamknięcia torebka
foliowa służy do przechowania
niezużytych pasków studzienek
IDEIA Borrelia
burgdorferi IgG
7. WYPOSAŻENIE
Wymagane jest następujące wyposażenie:
8.2.6
Unikać zanieczyszczenia jonami metali lub środkami
utleniającymi.
8.2.7
Nie używać substratu enzymatycznego, który ma
niebieski kolor przed dodaniem do studzienek.
Temperatura przechowywania
Gotowy do użycia. Przechowywać niezużyty anti-IgG conjugate w
temperaturze 2-8°C.
Numer serii
5.2.7
Gotowy do użycia. Przechowywać niezużyty substrat w
temperaturze 2-8°C.
8.2.8
Chronić substrat przed światłem.
Zużyć przed
8.2.9
Studzienki nie mogą być użyte powtórnie.
Wyprodukowany przez
5.2.8
8.2.10
Ręczny lub automatyczny sprzęt płuczący musi być wolny
od zanieczyszczń mikrobiologicznych, wykalibrowany i
utrzymany zgodnie z zaleceniami producenta.
8.2.11
Niewykorzystanego buforu o stężeniu roboczym
nie przechowywać do następnego użycia. Aktualnie
niewykorzystywane zbiorniki na bufor płuczący należy
przepłukać wodą dejonizowaną lub destylowaną, a
następnie pozostawić do wyschnięcia.
Substrat -
Roztwór hamujący reakcję -
Gotowy do użycia. Przechowywać niezużyty roztwór hamujący w
temperaturze 2-8°C.
6. DODATKOWE ODCZYNNIKI
6.1. ODCZYNNIKI
Świeża woda destylowana lub dejonizowana do przygotowania
rozcieńczonego buforu płuczącego.
10.2.WYKONANIE TESTU
UWAGA: Wykonanie testu wymaga użycia wytrząsarki. W
sprawie informacji o przydatności posiadanej wytrząsarki proszę
skontaktować się z miejscowym dystrybutorem.
Jeśli używa się kilku pasków, zaleca się podawanie koniugatu,
substratu i roztworu hamującego reakcję pipetą wielokanałową.
10.2.1 Dodawanie próbek i kontroli
Umieścić wymaganą liczbę pasków w ramce. Dodać 100µL
rozcieńczonej surowicy do odpowiednich studzienek. Dodać
100µL kontroli dodatniej, kontroli punktu odcięcia (ujemnej) i
rozcieńczalnika próbek do osobnych studzienek. (Co najmniej
3 kontrole ujemne, 2 kontrole dodatnie i 1 studzienka z
rozcieńczalnikiem próbek powinny zostać uwzględnione przy
każdym oznaczaniu surowic osób badanych).
10.2.2 Inkubacja próbek
Przykryć i inkubować studzienki w temperaturze pokojowej (2025°C) wytrząsając przez 60 minut.
10.2.3 Płukanie studzienek
Studzienki powinny zostać wypłukane rozcieńczonym buforem
płuczącym (patrz rozdz. 5.2.3).
Właściwe płukanie jest bardzo istotne dla wiarygodnych wyników
(patrz rozdz. 8.2.10) i powinno zostać wykonane tak, żeby za
każdym razem maksymalnie napełnić studzienki (co najmniej
350µL buforu płuczącego) i całkowicie je opróżnić.
Ważne jest wykonanie czterech cykli płukania, albo automatycznie,
albo ręcznie, przy czym cykl powinien zawierać dwuminutowe
namoczenie studzienek podczas drugiego płukania albo
namoczenie na w sumie 2 minuty podczas całego cyklu.
Ręczne płukanie
Jeśli płucze się studzienki ręcznie, należy odsysać zawartość
studzienek albo usuwać bufor przez strząśnięcie i napełniać
ponownie
całkowicie
opróżnione
studzienki
świeżo
przygotowanym roztworem buforu płuczącego, dbając o to, żeby
i opróżnienie, i napełnienie było całkowite. Podczas każdego
cyklu płukania resztkę buforu ze studzienek należy usuwać przez
umieszczenie mikropłytki dnem do góry na arkuszu czystego
ręcznika papierowego. Skuteczność ręcznego płukania zapewnia
także napełnianie studzienek pod kątem, aby bufor zawirował w
każdej studzience. Po ostatnim płukaniu należy odwrócić płytkę
dnem do góry na arkuszu czystego ręcznika papierowego i do
końca usunąć resztkę buforu.
Płukanie automatyczne
Płukanie automatyczne powinno zostać zaprogramowane na
cztery kompletne cykle i zawierać dwuminutowe namaczanie
studzienek w czasie całego cyklu. Płuczka musi zostać odpowiednio
skalibrowana, aby napełnianie i opróżnianie studzienek było
całkowite. Po ostatnim płukaniu należy odwrócić płytkę dnem do
góry na arkuszu czystego ręcznika papierowego i do końca usunąć
resztkę buforu.
10.2.4 Dodanie koniugatu anty IgG (Anti-IgG Conjugate)
Dodać 100µL koniugatu anty-IgG do każdej studzienki.
10.2.5 Inkubacja z koniugatem
-
Sprawdzić w instrukcji stosowania
Unikać zanieczyszczenia odczynników.
miejscowym przedstawicielem lub dystrybutorem co do
stosownego protokołu.
Przykryć i inkubować studzienki w temperaturze pokojowej (2025°C) wytrząsając przez 60 minut.
10.2.6 Płukanie studzienek
Studzienki należy wypłukać zgodnie z zaleceniami z rozdz.10.2.3.
10.2.7 Dodanie substratu i inkubacja
Dodać 100µL substratu do każdej studzienki.
Przykryć i inkubować w temperaturze pokojowej (20–25°C) bez
wstrząsania przez 10 minut.
10.2.8 Zatrzymanie reakcji
Dodać 100µL roztworu hamującego reakcję do każdej studzienki.
Starannie wymieszać zawartość. Produkt barwny jest trwały przez
30 minut. Nie wystawiać na bezpośrednie światło słoneczne,
ponieważ dochodzi do utraty zabarwienia pod wpływem światła.
10.3.ODCZYT WYNIKÓW
11.4.1 Interpretacja jakościowa
10.3.1 Odczyt fotometryczny
Granica wykrywalności (OD WYKRYWALNOŚĆ IgG) w odniesieniu do
przeciwciał IgG przeciw bakterii Borrelia burgdorferi jest obliczana
jako ODCut-Off x 0,5.
Odczytu powinno się dokonać w ciągu 30 minut od dodania
roztworu hamującego reakcję. Zawartość studzienek należy
zmieszać przez delikatne postukanie w narożnik ramki i
odczytać absorbancję dla każdej studzienki w odpowiednim
spektrofotometrze lub czytniku ELISA, przy długości fali 450nm.
Przed odczytem należy się upewnić, czy dno studzienek jest czyste
od spodu, a do środka nie przedostały się zanieczyszczenia. Probą
odniesienia jest powietrze, to znaczy w czasie zerowania nie ma
ramki w czytniku.
Zamiennie, jeśli spektrofotometr lub czytnik ELISA pozwala na
zastosowanie odczytu przy dwóch długościach fail (i długością
odniesienia może być 620 do 650nm), można zastosować taki
podwójny odczyt, ponieważ pozwala on na wyeliminowanie
wyników błędnych z powodu zanieczyszczeń lub nierówności w
plastiku mikropłytki
Poziom, powyżej którego istnieje prawdopodobieństwo
występowania przeciwciał spowodowanej aktywną infekcją, jest
równy ODIgG Cut-Off.
Wartości OD między tymi dwoma stężeniami świadczą o niskim
poziomie przeciwciał w próbkach, co należy interpretować
ostrożnie. Interpretacja jest następująca:
ODPróbka < ODWYKRYWALNOŚĆ IgG Wynik negatywny w odniesieniu do przeciwciał IgG przeciw
bakterii B. burgdorferi
ODPróbka > ODWYKRYWALNOŚĆ IgG i < ODIgG wartość graniczna
10.4.STRESZCZENIE PROCEDURY
BURGDORFERI IgG
TESTU
IDEIA
BORRELIA
Doprowadzić odczynniki do temperatury pokojowej (15–30°C)
przed użyciem
Rozcieńczyć próbki 1/200 dodając 10µL surowicy do 2mL
rozcieńczalnika próbek
100µL kontroli lub próbki badanej
Inkubować w
20–25°C wstrząsając
przez 60 minut
Wypłukać (x4)
Dodać100µL koniugatu anty -IgG
Przeciwciała są obecne.
Zaleca się pobranie próbki kontrolnej po dwóch tygodniach w celu
potwierdzenia stanu pacjenta.
ODPróbka > ODIgG wartość graniczna
11.4.2 Interpretacja półilościowa (jednostki umowne)
W zakresie wartości OD pomiędzy ODIgG Cut-Off i ODIgG Positive,
wartości OD odpowiadają bezpośrednio logarytmowi umownych
jednostek swoistych przeciwciał. Ilustruje to rycina 1, pokazująca
wyniki dla rozcieńczeń seryjnych surowicy dodatniej co do
przeciwciał przeciwko B. burgdorferi w surowicy ujemnej.
2.500
IgG Positive Control
Dodać 100µL roztworu hamującego reakcję
Odczytać absorbancję przy 450nm (odniesienie: 620-650nm)
IgG Cut-Off Control
0.000
1
10
100
1000
Log
Rozcieñczenia
Rycina 1 Wyniki dwukrotnych rozcieńczeń seryjnych surowicy
dodatniej co do przeciwciał IgG przeciwko B. burgdorferi w
surowicy ujemnej. Dodatkowo pokazano wartości OD dla kontroli
ujemnej (IgG Cut-Off Control) I dodatniej (IgG Positive Control).
Poziom swoistych przeciwciał w kontroli ujemnej przyjęto za 1
(UIgG Cut-Off = 1 jednostka). Poziom swoistych przeciwciał w kontroli
dodatniej przyjęto za 8 x UIgG Cut-Off (UIgG Positive = 8 jednostek).
Dla próbki badanej ilość jednostek umownych swoistych
przeciwciał (UPróbki) wylicza się następująco:
11. KONTROLA JAKOŚCI I INTERPRETACJA WYNIKÓW
TESTU
11.1.ROZCIEŃCZALNIK PRÓBEK
Wartość OD dla rozcieńczalnika próbek musi wynosić mniej niż
0,100, ale więcej niż 0.000 (przy odczycie z podwójną długością
fali). Jeżeli wartość wynosi powyżej 0.100, prawdopodobną
przyczyną jest niedokładne wypłukanie lub zanieczyszczenie
substratu. Jeżeli wartość wynosi mniej niż 0.000, należy raz
jeszcze wyzerować czytnik wobec powietrza i raz jeszcze odczytać
absorbancję dla wszystkicjh studzienek.
Jeśli te wymagania nie zostaną spełnione, wyniki są niewiarygodne
i oznaczenie należy powtórzyć.
11.2.KONTROLA PUNKTU ODCIĘCIA (UJEMNA) I DODATNIA
Obliczyć średnie wartości OD dla 3 studzienek przewidzianych
dla kontroli ujemnej (IgG Cut-Off Control) (ODIgG Cut-Off) i dwóch dla
kontroli dodatniej (IgG Positive Control) (ODIgGPositive). Poszczególne
wartości nie powinny się różnić o ponad 25% od średniej wartości
OD. Jeśli jedna z trzech wartości OD dla kontroli ujemnej różni się
o ponad 25% od średniej wartości OD, należy ją pominąć i obliczyć
średnią tylko dla dwóch pozostałych.
Różnica pomiędzy wartością OD dla kontroli ujemnej i dodatniej
musi wynosić co najmniej 0,500. Jeżeli wynosi mniej niż 0,500,
prawdopodobną przyczyną jest niedostateczne wypłukanie,
niedostateczne wstrząsanie podczas inkubacji lub za niska
temperatura, zwłaszcza podczas inkubacji z substratem.
Jeśli te wymagania nie zostaną spełnione, wyniki są niewiarygodne
i oznaczenie należy powtórzyć.
ODPróbki - ODIgG Cut-off
UPróbki=10a, a = ODIgG Positive- ODIgG Cut-off
Objaw kliniczny
Rumień wędrujący
Limfocytarne zapalenie opon
i korzeni nerwowych
Zanikowe zapalenie skóry
obwodowych części kończyn
Czułość diagnostyczna
36%
77%
100%
14. SZCZEGÓŁOWE WARTOŚCI CHARAKTERYZUJĄCE TEST
14.1.SWOSTOŚĆ
Swoistość testu IDEIA™ Borrelia burgdorferi, IgG została wyliczona
w niezależnym laboratorium rutynowym w Szwecji. Badania
przeprowadzono na zestawie 200 próbek surowicy pochodzących
od zdrowych dawców krwi, mieszkających na obszarach
endemicznego występowania boreliozy
Czułośc diagnostyczną testu IDEIA Borrelia burgdorferi, IgG
wyliczono w niezależnym laboratorium rutynowym w Szwecji.
Badania przeprowadzono na trzech zestawach próbek badanych
od chorych z niektórymi najbardziej typowymi objawami
klinicznymi zakażenia B. burgdorferi: 45 próbek od chorych z
rumieniem wędrującym, 38 próbek od chorych z limfocytarne
zapalenie opon i korzeni nerwowych i 20 próbek od chorych
z zanikowym zapaleniem skóry części obwodowych kończyn.
Wyniki porównano z uprzednio opisywanymi spodziewanymi
wartościami6,8
Objaw kliniczny
Rumień wędrujący
Limfocytarne zapalenie opon i
korzeni nerwowych
Zanikowe zapalenie skóry
obwodowych części kończyn
Czułość diagnostyczna
Spodziewana Wyliczona*
36%
38%
77%
79%
100%
100%
* Wyniki niejednoznaczne uznano za ujemne.
x 0,9*
*logUIgG Positive -logUIgG Cut-off = log8 - log1 = 0,9
Wyniki niejednoznaczne.
Granica wykrywalności przeciwciał IgG wynosi 0,65 jednostki.
Powyżej 1 jednostki istnieje prawdopodobieństwo obecności
przeciwciał spowodowane aktywną infekcją. Próbki zawierające
poniżej 0,9 jednostki specyficznych przeciwciał są interpretowane
jako negatywne pod względem zawartości przeciwciał IgG
przeciw bakterii B. burgdorferi. Wartości od 0,9 do 1,1 jednostki
wskazują na niski poziom przeciwciał, który należy interpretować
ostrożnie. Zaleca się pobranie próbki po dwóch tygodniach w celu
potwierdzenia stanu pacjenta. Próbki zawierające 1,1 lub więcej
jednostek specyficznych przeciwciał są interpretowane jako
pozytywne w kierunku obecności przeciwciał IgG przeciw bakterii
B. Burgdorferi.
Dla próbek o wartościach OD powyżej wartości dla kontroli
dodatniej ODIgG Positive, wynik testu należy podać jako więcej niż 8
jednostek swoistych przeciwciał IgG przeciwko B. burgdorferi.
Zmiana w poziomie przeciwciał u danej osoby badanej może być
uznana za istotną, jeśli ilość jednostek umownych w kolejnych
badaniach podwoiła się lub zmalała o połowę. Są to jednak
jedynie ogólne wytyczne.
11.3.PRÓBKI BADANE
11.4.3 Komentarze do interpretacji wyników
Obliczyć średnią wartość OD dla każdej próbki badanej (ODPróbki).
Poszczególne wartości dla danej próbki nie powinny różnić się o
ponad 25% od średniej. Jeśli by tak było, próbkę należy zbadać
ponownie. Jednak jeżeli w obu studzienkach wynik jest ujemny,
a wartości różnią się o ponad 25%, można zaakceptować wynik,
gdyż niskie wartości OD są mierzone z mniejszą dokładnością.
Wyniki ujemne
11.4.INTERPRETACJA WYNIKÓW
Wynik dodatni wskazuje na niedawną ekspozycję na B.
burgdorferi.
Test IDEIA Borrelia burgdorferi IgG obejmuje kontrolę wartości
granicznej, zawierającą określoną ilość specyficznych przeciwciał
IgG przeciw bakterii Borrelia burgdorferi. Poziomy przeciwciał
oznaczone powyżej wartości granicznej wskazują na aktywną
infekcję spowodowaną przez bakterię Borrelia burgdorferi. Za
pomocą zestawu IDEIA Borrelia burgdorferi IgG można oznaczać
przeciwciała na poziomie poniżej tej specyficznej wartości
granicznej. Mogą to być ukryte przeciwciała, pochodzące z
wcześniejszej infekcji lub bardzo niskie poziomy przeciwciał
występujące niedługo po świeżej infekcji. Niski poziom przeciwciał
należy interpretować ostrożnie. Dla uzyskania pewności co do
znamienności niskiego poziomu przeciwciał, zaleca się kontrolę
drugiej próbki od pacjenta po co najmniej dwóch tygodniach w
celu określenia zmian w poziomie przeciwciał.
13. S PODZIEWANE WARTOŚCI
Poziom kontroli punktu odcięcia (IgG Cut-Off Control) został
tak dobrany, aby miał swoistość 98% dla normalnych surowic.
Odpowiedź produkcją przeciwciał na wić B. burgdorferi zależy
od klinicznych objawów zakażenia i czasu trwania choroby.
W przypadku niektórych najczęstszych objawów klinicznych
zakażenia B. burgdorferi, diagnostyczna czułość pośredniego
testu do wykrywania IgG z użyciem oczyszczonego antygenu
flagellum B. burgdorferi została opisana następująco6,8
14.2.CZUŁOŚĆ DIAGNOSTYCZNA
1.000
0.500
Inkubować w 20–25°C
przez 10 minut
12.4.Wyniki testu są wątpliwe, jeśli odczynniki uległy modyfikacji
lub były przechowywane inaczej niż zalecono w sekcji 5.2.
Swoistość
Spodziewana
Wyliczona*
98%
98.5%
*Wyniki niejednoznaczne uznano za ujemne
OD 1.500
Wypłukać (x4)
Dodać 100µL substratu
12.3.Wszystkie wyniki dodatnie muszą być poddane interpretacji
w odniesieniu do całej dostępnej informacji klinicznej i
epidemiologicznej, a nie usprawiedliwiają podjęcia leczenia.
Możliwość ekspozycji na ugryzienie przez kleszcza musi być
zawsze brana pod uwagę.
Wynik pozytywny w odniesieniu do aktywnego wytwarzania
przeciwciał IgG przeciw bakterii B. burgdorferi.
2.000
Inkubować w
20–25°C wstrząsając
przez 60 minut
12.2.Wynik dodatni wskazuje na uprzedni kontakt z antygenami,
a nie jest dowodem bieżącego, aktywnego zakażenia.
Ujemny wynik badania nie wyklucza ekspozycji na B. burgdorferi.
Jeśli nadal podejrzewa się boreliozę z Lyme, należy poddać
badaniom kolejną próbkę, pobraną później.
Wyniki dodatnie
14.3.REAKTYWNOŚĆ KRZYŻOWA
Surowice od chorych na kiłę lub choroby zapalne (z dodatnim
czynnikiem reumatoidalnym, RF) badano testem IDEIA Borrelia
burgdorferi IgG, uzyskując następujące wyniki:
Surowice
Liczba próbek
Liczba dodatnich *
badane
Kiła
25
0
RF
18
1
* Wyniki niejednoznaczne uznano za ujemne.
15. LITERATURA
1. Burgdorferi W, Barbour AG, Hayes SF, Benach JL, Grunwaldt E, Davis JP.
(1982) Lyme disease - a tick-borne spirochetosis? Science 216: 1317-9.
2. Steere AC, Grodzicki RL, Kornblatt AN, Craft JE, Barbour AG, Burgdorferi
W, et al. (1983) The spirochetal etiology of Lyme disease. N Engl J Med 308:
733-40.
3. Steere AC. (1989)Lyme disease. N Engl J Med 321: 586-96.
4. Craft JE, Duncan KF, Shimamoto GT, Steere AC. (1986) Antigens of
Borrelia burgdorferi recognized during Lyme disease. Appearance of a
new immunoglobulin M response and expansion of the immunoglobulin G
response late in the illness. J Clin Invest 78: 934-9.
5. 5.Zöller L, Burkard S, Schäfer H. (1991) Validity of Western immunoblot
band patterns in the serodiagnosis of Lyme borreliosis. J Clin Microbiol 29:
174-82.
6. Hansen K, Pii K, Lebech A-M. (1991) Improved immunoglobulin M
serodiagnosis in Lyme borreliosis by using a µ-capture enzyme-linked
immunosorbent assay with biotinylated Borrelia burgdorferi flagella. J Clin
Microbiol 29: 166-73.
7. Hansen K, Hindersson P, Pedersen NS. (1988) Measurement of
antibodies to the Borrelia burgdorferi flagellum improves serodiagnosis in
Lyme disease.J Clin Microbiol 26: 338-46.
8. 8.Karlsson M. (1990) Western immunoblot and flagellum enzyme-linked
immunosorbent assay for serodiagnosis of Lyme borreliosis. J Clin Microbiol
28: 2148-50.
Wyniki podejrzane (niejednoznaczne)
Wynik zawarty pomiędzy ±20% wartości OD dla kontroli
ujemnej (IgG Cut-off) powinien być uznany za niejednoznaczny
i interpretowany ostrożnie. Zaleca się powtórne poddanie
badaniom tej samej próbki.
Ponadto niejednoznaczny wynik powinien skłonić do pobrania
od tej samej osoby i zbadania kolejnej próbki, w ciągu dwóch
tygodni. Jeśli obie próbki (albo kolejne pobrane) nadal dają taki
sam niejednoznaczny wynik, osoba badana może zostać uznana
za ujemną co do przeciwciał IgG przeciwko B. burgdorferi.
12. O GRANICZENIA TESTU
12.1.Ujemny wynik nie wyklucza możliwości zakażenia B.
burgdorferi u osoby badanej. Niewykrycie B. burgdorferi
może być wynikiem działania takich czynników jak pobranie
materiału w nieodpowiednim czasie, przed pojawieniem
się wykrywalnych przeciwciał, nieprawidłowe pobranie lub
obchodzenie się z próbką. Wczesna terapia antybiotykowa
może stłumić odpowiedź humoralną, a niektóre osoby nie
produkują przeciwciał na wykrywalnym poziomie.
X7841 poprawione października 2011
OXOID Limited,
Wade Road, Basingstoke,
Hampshire, RG24 8PW,
Verenigd Koninkrijk
Wszelkie pytania prosimy kierować do miejscowego
przedstawicielstwa lub dystrybutora Oxoid