DYNAMIKA FORMOWANIA ZARODKÓW SOMATYCZNYCH W

ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2009 z. 534: 163-171
DYNAMIKA FORMOWANIA ZARODKÓW SOMATYCZNYCH
W KULTURACH in vitro TULIPANA
Małgorzata Maślanka, Anna Bach
Katedra Roślin Ozdobnych, Uniwersytet Rolniczy im. H. Kołłątaja w Krakowie
Wstęp
Tulipan, ze względu na długotrwałą i mało wydajną drogę rozmnaŜania, jest
obiektem wielu badań, mających na celu zwiększenie plonu oraz przyspieszenie jego
uprawy. Obiecującą technologią produkcji tulipana jest somatyczna embriogeneza, ze
względu na bardzo szybki i wydajny sposób rozmnaŜania [DE VROOMEN 1997].
Somatyczne zarodki, powstające z komórek innych niŜ zygota, czyli na drodze
rozmnaŜania bezpłciowego, poprzez manipulowanie składem poŜywki, mogą tworzyć
się w duŜej ilości, w stosunkowo krótkim czasie [KĘPCZYŃSKA 2006]. Liczba uzyskanych
zarodków, obok ich jakości, decyduje o przydatności somatycznej embriogenezy do
masowej produkcji roślin. W przypadku tulipana nie opracowano, jak dotąd, metody
szybkiego i synchronicznego otrzymywania licznych somatycznych zarodków, pomimo
poznania juŜ mechanizmów kontrolujących te procesy.
Celem przeprowadzonych badań było określenie wpływu czasu trwania kultury
na efektywność formowania zarodków somatycznych (terminu pojawienia się
pierwszych zarodków globularnych i torpedo oraz ich liczby) u tulipana. Zbadano takŜe
wpływ róŜnych stęŜeń auksyny na dynamikę formowania zarodków.
Materiał i metody
Badania przeprowadzono na tulipanach odmiany ‘Apeldoorn’ (naleŜącej do grupy
mieszańców Darwina) i ‘Rosy Wing’ (z grupy pojedynczych późnych). Jako
eksplantaty inicjalne zastosowano zaląŜnie, wyizolowane z chłodzonych przez 12
tygodni, w 5°C, cebul o obwodzie 11-12 cm. Zdezynfekowane eksplantaty cięto na 1-2mm fragmenty (plastry) i wykładano do szalek Petriego na poŜywki zawierające sole
mineralne według MURASHIGE i SKOOG [1962], 25 lub 50 µM Picloramu; 0,25-10 µM BA,
3% sacharozy, zestalone 0,7% agarem. Kultury prowadzono w ciemności, w 20°C.
Tworzący się Ŝółty, embriogeniczny kalus odejmowano od tkanki matecznej,
namnaŜano na jednej z poŜywek inicjalnych, a następnie poddano działaniu 10 lub 5
µM Picloramu oraz 1 µM BA, w celu formowania zarodków somatycznych, zgodnie
z procedurą według BACH i PTAK [2001].
W czasie 20 tygodni prowadzenia kultury określono procent eksplantatów
róŜnicujących zarodki globularne oraz liczbę, powstałych z 1 g kalusa, zarodków w
164
M. Maślanka, A. Bach
stadium torpedy (długości 5-10 mm), w zaleŜności od genotypu, stęŜenia auksyny i
czasu trwania kultury.
Analizę histologiczną formujących się struktur sporządzono w oparciu
o preparaty mikroskopowe, wykonane metodą parafinową według FILUTOWICZA
i KUśDOWICZA [1951]. Doświadczenie wykonano w 5 powtórzeniach po 5 eksplantatów.
Wyniki opracowano statystycznie za pomocą metody analizy wariancji. Porównanie
średnich i określenie grup jednorodnych wykonano przy uŜyciu testu Duncana, z
uwzględnieniem poziomu istotności α = 0,05.
Wyniki i dyskusja
RóŜnicowanie zarodków w fazie rozwoju globularnego
Do rozwoju somatycznych zarodków u tulipana niezbędne jest obniŜenie stęŜenia
auksyny w poŜywce lub jej usunięcie [GUDE, DIJKEMA 1997]. RóŜnicowanie zarodków
stymuluje równieŜ obecność cytokinin, najsilniej podczas powstawania zarodków w
stadium globularnym, któremu towarzyszą intensywne podziały komórkowe
[SZWEYKOWSKA 1994]. Kultury zwykle prowadzi się w ciemności, stymulującej m.in.
rozwój zarodków globularnych [BACH, WARCHOŁ 2000] oraz obniŜającej stopień
deformacji zarodków w stadium torpedy [MAŚLANKA, BACH 2007].
średnie oznaczone tymi samymi literami nie róŜnią się istotnie na poziomie istotności α=0,05; means marked
with the same letter du not differ significantly at the significance level α=0.05
Rys. 1.Wpływ czasu trwania kultury i stęŜenia auksyny na róŜnicowanie zarodków globularnych
u odmiany ‘Apeldoorn’
Fig. 1.
Effect of cultivation time and auxin concentration on the globular embryo differentiation of cv. ‘Apeldoorn’
W przeprowadzonym doświadczeniu, formowanie zarodków globularnych
zachodziło na drodze embriogenezy pośredniej, przez kalus. RóŜnicowanie to miało
miejsce od pierwszych tygodni doświadczenia, ale nasiliło się po 2-3 miesiącach
prowadzenia kultury. W przypadku odmiany ‘Apeldoorn’ i poŜywki z 5 µM auksyny,
najwyŜszy procent eksplantatów formujących zarodki globularne, wynoszący 76%,
odnotowano po 8 tygodniach trwania kultury. Stosując 10 µM Picloramu, większe
róŜnicowanie zarodków, równe 60%, otrzymano po 12 tygodniach od załoŜenia
DYNAMIKA FORMOWANIA ZARODKÓW SOMATYCZNYCH ...
165
doświadczenia, w stosunku do pozostałego okresu kultury. Wraz z upływem czasu
trwania kultury obniŜała się wydajność kalusa embriogenicznego w tworzeniu
zarodków, a po 20 tygodniach pod wpływem 5 µM Picloramu nie obserwowano
róŜnicowania nowych zarodków (rys. 1).
U tulipana ‘Rosy Wing’ zaobserwowano intensywniejsze róŜnicowanie zarodków
globularnych po 2-3 miesiącach, w stosunku do całego okresu kultywacji, niezaleŜnie
od stęŜenia auksyny (rys. 2).
objaśnienia jak w rys. 1; explanations see Fig. 1
Rys. 2.Wpływ czasu trwania kultury i stęŜenia auksyny na róŜnicowanie zarodków globularnych
u odmiany ‘Rosy Wing’
Fig. 2.
Effect of cultivation time and auxin concentration on the globular embryo differentiation of cv. ‘Rosy Wing’
Tabela 1; Table 1
Procent eksplantatów róŜnicujących zarodki globularne, w zaleŜności od genotypu
i stęŜenia auksyny, przez 20 tygodni prowadzenia kultury
Percentage of explants forming globular embryos, depending on genotype
and auxin concentration, for 20 weeks of cultivation
PoŜywka; Medium
Odmiana; Cultivar
Apeldoorn
Rosy Wing
10 µM Picloram, 1 µM BA
39,2 b
20,8 a
5 µM Picloram, 1 µM BA
33,6 b
23,2 a
Średnia; Average
36,4 b
22,0 a
objaśnienia jak w rys. 1; explanations see Fig. 1
Oceniając wpływ stęŜenia auksyny na róŜnicowanie zarodków, u obu odmian
tulipana stwierdzono, Ŝe badana cecha nie była zaleŜna od róŜnych stęŜeń Picloramu
(tab. 1). RóŜnicowanie zarodków globularnych uzaleŜnione było natomiast od
genotypu. Odmiana ‘Apeldoorn’ efektywniej formowała początkowe stadia zarodków
(36,4% eksplantatów) niŜ ‘Rosy Wing’ (22% eksplantatów; tab. 1).
Kalus embriogeniczny obu badanych odmian tulipana, utrzymywany na poŜywkach z 10 lub 5 µM Picloramu oraz 1 µM BA, stopniowo tracił embriogeniczny
charakter i róŜnicował coraz mniej zarodków. W kulturach kalusa przetrzymywanych
166
M. Maślanka, A. Bach
przez dłuŜszy czas na poŜywce z auksyną lub cytokininą następują zwykle zmiany
epigenetyczne, polegające na względnie trwałym uniezaleŜnieniu się od egzogennych
regulatorów. Procesowi temu sprzyja prowadzenie kultur w ciemności [ORLIKOWSKA
1997]. Być moŜe kalus tulipana po kilku miesiącach kultury in vitro traci stopniowo
wraŜliwość na obecne w poŜywce auksyny i cytokininy, albo teŜ stosowane regulatory
w niŜszych stęŜeniach działają słabiej. O działaniu regulatorów roślinnych decyduje nie
tylko ich rodzaj i koncentracja, ale takŜe wraŜliwość eksplantatu na te regulatory w
momencie aplikacji. Działanie substancji wzrostowych zaleŜy takŜe od wieku kultur
[ORLIKOWSKA 1997]. Niestety zdarza się, Ŝe kalus embriogeniczny ma powolny wzrost i
szybko traci kompetencję do embriogeniczności [RAGHAVAN 1997].
RóŜnicowanie zarodków w stadium torpedy
Somatyczne zarodki tulipana w stadium torpedy, długości 5-10 mm, obserwowano w 8 i 12 tygodniu prowadzenia kultury, odpowiednio u odmiany ‘Apeldoorn’ i
‘Rosy Wing’. U obu badanych odmian więcej zarodków uformowało się po 12
tygodniach kultury, w porównaniu z pozostałym okresem trwania doświadczenia (rys.
3, 4). BOUMAN i in. [1999] otrzymywali w pełni wykształcone zarodki tulipana po 10
tygodniach na poŜywkach niezawierających auksyn. BACH i PTAK [2001] natomiast
obserwowały formowanie się pierwszych zarodków w 12. tygodniu od chwili załoŜenia
kultur.
objaśnienia jak w rys. 1; explanations see Fig. 1
Rys. 3.Wpływ czasu trwania kultury i stęŜenia auksyny na liczbę zarodków w stadium torpedy
u odmiany ‘Apeldoorn’
Fig. 3.
Effect of cultivation time and auxin concentration on the number of torpedo-shaped
embryos of cv. ‘Apeldoorn’
StęŜenie auksyny nie miało wpływu na liczbę otrzymanych zarodków w stadium
torpedy. U obu badanych odmian, więcej (o ponad 30%) uformowanych zarodków na
poŜywce z 5 µM Picloramu nie stanowiło istotnej róŜnicy w stosunku do poŜywki ze
stęŜeniem Picloramu równym 10 µM (tab. 2). PTAK i BACH [2007] największą liczbę
somatycznych zarodków tulipana uzyskały na poŜywkach z przewaŜającym udziałem
Picloramu nad BA.
DYNAMIKA FORMOWANIA ZARODKÓW SOMATYCZNYCH ...
167
objaśnienia jak w rys. 1; explanations see Fig. 1
Rys. 4.Wpływ czasu trwania kultury i stęŜenia auksyny na liczbę zarodków w stadium torpedy
u odmiany ‘Rosy Wing’
Fig. 4.
Effect of cultivation time and auxin concentration on the number of torpedo-shaped
embryos of cv. ‘Rosy Wing’
Tabela 2; Table 2
Liczba zarodków w stadium torpedy, z 1 g kalusa, w zaleŜności od genotypu i stęŜenia auksyny,
przez 20 tygodni prowadzenia kultury
Number of torpedo-shaped embryos, from 1 g of callus, depending on genotype and auxin
concentration, for 20 weeks of cultivation
PoŜywka; Medium
Odmiana; Cultivar
Apeldoorn
Rosy Wing
10 µM Picloram, 1 µM BA
5,32 ab
1,6 a
5 µM Picloram, 1 µM BA
7,96 b
2,6 a
Średnia; Average
6,64 b
2,1 a
objaśnienia jak w rys. 1; explanations see Fig. 1
Podobnie jak w przypadku róŜnicowania zarodków globularnych, liczba
uzyskanych zarodków w stadium torpedy takŜe zaleŜała od genotypu rośliny. Średnio
6,64 zarodków otrzymano z 1 g kalusa tulipana ‘Apeldoorn’ w ciągu 20 tygodni,
niezaleŜnie od poŜywki. Odmiana ‘Rosy Wing’ uformowała w tych samych warunkach
trzykrotnie mniej zarodków (tab. 2). Porównana przez autorów [BACH, PTAK 2002]
odmiana ‘Apeldoorn’ równieŜ charakteryzowała się większą efektywnością procesu
somatycznej embriogenezy w stosunku do odmiany ‘Red Matador’ (mieszaniec
Darwina). Z kolei w badaniach PODWYSZYŃSKIEJ i in. [1997] odmiana ‘Apeldoorn’ okazała
się mieć najsłabsze zdolności do róŜnicowania, w porównaniu z innymi odmianami
tulipana.
Analiza histologicza
Analiza histologiczna otrzymanych regularnych, dwubiegunowych struktur,
z uformowanym liścieniem, pasmem wiązek przewodzących i merystemem pędowym
potwierdziła, Ŝe w przeprowadzonych badaniach istotnie formowały się zarodki
168
M. Maślanka, A. Bach
somatyczne, które swoją budową odpowiadały zarodkom zygotycznym (fot. 1).
Niestety, zregenerowane zarodki tulipana nie posiadały korzenia. WzdłuŜ somatycznych
zarodków tulipana PODWYSZYŃSKA i MARASEK [2003] równieŜ zaobserwowały podłuŜne
pasma wiązek naczyniowych, nie odnotowały natomiast formowania się korzonka
zarodkowego. Brak korzeni u somatycznych zarodków tulipana moŜna tłumaczyć
wysoką temperaturą (20-23°C) kultur in vitro i obecnością cytokinin, które opóźniają
ich rozwój [PODWYSZYŃSKA, MARASEK 2003].
Fot. 1. Przekrój podłuŜny przez somatyczny zarodek tulipana (pow. 30×, li - liścień, mp merystem pędowy)
Photo 1.
Longitudinal section of the tulip somatic embryo (magnification 30×, li - cotyledon,
mp - shoot meristem)
Wnioski
1.
Długość okresu prowadzenia kultury odgrywała istotną rolę w somatycznej
embriogenezie tulipanów. Wzrost róŜnicowania zarodków globularnych obserwowano do 8-12 tygodnia kultury in vitro, a formowanie zarodków w stadium
torpedy nasiliło się po 3 miesiącach kultury.
2.
StęŜenie auksyny w zakresie 5 i 10 µM nie miało istotnego wpływu na róŜnicowanie zarodków globularnych i formowanie torped.
3.
Wydajność somatycznej embriogenezy zaleŜała od genotypu. Zarodki globularne
róŜnicowało średnio 36% eksplantatów ‘Apeldoorn’ i 22% ‘Rosy Wing’. Tulipan
‘Apeldoorn’ uformował większą liczbę zarodków somatycznych (średnio 6,6) niŜ
DYNAMIKA FORMOWANIA ZARODKÓW SOMATYCZNYCH ...
169
‘Rosy Wing’ (średnio 2,1) z 1 g kalusa.
4.
Analiza histologiczna
w stadium torpedy.
potwierdziła
formowanie
zarodków somatycznych
Literatura
BACH A., PTAK A. 2001. Somatic embryogenesis and plant regeneration from ovaries of
Tulipa gesneriana L. in in vitro cultures. Acta Horticulturae 560: 391-394.
BACH A., PTAK A. 2002. Nowa metoda mikrorozmnaŜania tulipana (Tulipa gesneriana L.)
z tkanek zaląŜni. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol. 483: 13-19.
BACH A., WARCHOŁ M. 2000. Effect of light quality on proliferation of embryogenic
callus of Hyacinthus orientalis cv. Delft’s Blue. Acta Biologica Cracoviensia 42: 17.
BOUMAN H., LANGENS M., SCHOO W., DIJKEMA M. 1999. Somatic embryogenesis of tulip.
Acta Biologica Cracoviensa 41: 34.
DE VROOMEN C.O.N. 1997. Farm management aspects of somatic embryogenesis for tulip
bulb production. Acta Horticulturae 430: 383-388.
FILUTOWICZ A., KUśDOWICZ A. 1951. Mikrotechnika roślinna. PWRiL, Warszawa.
GUDE H., DIJKEMA M.H.G.E. 1997. Somatic embryogenesis in tulip. Acta Horticulturae
430: 275-280.
KĘPCZYŃSKA E. 2006. Kiełkowanie i konwersja somatycznych zarodków in vitro. Biotechnologia 4(75): 78-94.
MAŚLANKA M., BACH A. 2007. Wpływ kwasu abscysynowego oraz światła na wzrost
i rozwój zarodków somatycznych tulipana (Tulipa gesneriana L.). Zesz. Probl. Post.
Nauk Rol. 523: 155-161.
MURASHIGE T., SKOOG F. 1962. A revised medium for rapid growth and bioassays with
tobacco tissue culture. Plant Physiology 15: 473-497.
ORLIKOWSKA T. 1997. Regulatory roślinne w kulturach in vitro, w: Regulatory wzrostu i
rozwoju roślin. Zastosowanie w ogrodnictwie, rolnictwie, leśnictwie i w kulturach
tkanek. Jankiewicz S.L. Praca zbiorowa, PWN, Warszawa: 219-247.
PODWYSZYŃSKA M., MARASEK A. 2003. Effects of thidiazuron and paclobutrazol on
regeneration potential of tulip flower stalk explants in vitro and subsequent shoot
multiplication. Acta Societatis Botanicorum Poloniae 72(3): 181-190.
PODWYSZYŃSKA M., MARASEK A., GABRYSZEWSKA E. 1997. Indukcja tworzenia pędów
przybyszowych i zarodków somatycznych w kulturach in vitro tulipana. Zeszyty Naukowe AR w Krakowie 318: 195-198.
PTAK A., BACH A. 2007. Somatic embryogenesis in tulip (Tulipa gesneriana L.) flower
stem cultures. In Vitro Cellular and Developmental Biology - Plant 43: 35-39.
RAGHAVAN V. 1997. Molecular embryology of flowering plants. Somatic embryogenesis.
Cambridge University Press: 467-499.
SZWEYKOWSKA A. 1994. Procesy róŜnicowania w kulturach tkanek i komórek roślinnych.
Prace Ogrodu Botanicznego Polskiej Akademii Nauk 5/6: 9-18.
M. Maślanka, A. Bach
170
Słowa kluczowe:
tulipan, somatyczna embriogeneza, zarodki globularne, torpedo
Streszczenie
Kalus embriogeniczny tulipanów odmian ‘Apeldoorn’ i ‘Rosy Wing’, uzyskany
z eksplantatów zaląŜni, wykładano na poŜywki z obniŜoną zawartością substancji
wzrostowych, w stosunku do poŜywki namnaŜającej, w celu formowania zarodków
somatycznych. W czasie 20 tygodni prowadzenia kultury tkanki embriogenicznej, na
poŜywkach z 10 i 5 µM Picloramu, określano procent eksplantatów róŜnicujących
zarodki w fazie rozwoju globularnego w zaleŜności od genotypu, stęŜenia auksyny i
czasu trwania kultury. Określano równieŜ liczbę, powstałych z 1 g kalusa, zarodków w
stadium torpedy.
Największy procent eksplantatów róŜnicujących zarodki globularne odnotowano
po 8 i 12 tygodniach prowadzenia kultury, wynoszący odpowiednio 62% i 50% dla
odmiany ‘Apeldoorn’ oraz 32% i 30% dla odmiany ‘Rosy Wing’. RównieŜ po 3
miesiącach kultury uzyskano najwięcej zarodków w stadium rozwoju torpedo (blisko 14
szt. u ‘Apeldoorn’ i 4 szt. u ‘Rosy Wing’), po tym czasie obniŜała się liczba
pozyskiwanych zarodków. Formowanie zarodków somatycznych uzaleŜnione było od
genotypu badanej rośliny. Średnio 6,64 zarodków otrzymano z kalusa odmiany
‘Apeldoorn’ w ciągu 20 tygodni, niezaleŜnie od poŜywki, co stanowiło trzykrotną,
istotną przewagę nad odmianą ‘Rosy Wing’.
DYNAMICS OF SOMATIC EMBRYO FORMATION IN TULIP
in vitro CULTURES
Małgorzata Maślanka, Anna Bach
Department of Ornamental Plants, Agricultural University, Kraków
Key words:
tulip, somatic embryogenesis, globular and torpedo-shaped embryos
Summary
Embryogenic callus of tulips cv. ‘Apeldoorn’ and ‘Rosy Wing’, obtained from
ovary explants, was put on medium with a lower level of growth regulators, as
compared to the proliferation medium, in order to produce somatic embryos. During 20
weeks of the embryogenic tissue cultivation, treated with 10 and 5 µM Picloram, the
effect of genotype, auxin concentration and cultivation time on the globular embryo
differentiation were investigated. The number of torpedo-shaped embryos obtained from
1g of callus were also examined.
The highest percentage of explants forming globular embryos were observed after
8 and 12 weeks of cultivation. For ‘Apeldoorn’ it was 62 and 50%, and for ‘Rosy Wing’
32 and 30%, respectively. After three months of the embryogenic callus cultivation, the
highest number of torpedo-shaped embryos (about 14 for ‘Apeldoorn’ and 4 for ‘Rosy
Wing’) were obtained. However, during the prolongation of culture the embryo number
decreased.
Somatic embryo formation closely depended on the genotype. During 20 weeks
of cultivation, ‘Apeldoorn’ tulip produced, on the average, 6,64 embryos, independently
of medium composition. It trebled the results of ‘Rosy Wing’.
DYNAMIKA FORMOWANIA ZARODKÓW SOMATYCZNYCH ...
Dr inŜ. Małgorzata Maślanka
Katedra Roślin Ozdobnych
Uniwersytet Rolniczy im. H. Kołłątaja
al. 29 Listopada 54
31-425 KRAKÓW
e-mail: [email protected]
171