Immobilizacja związków organicznych i białek

Marian Kuczek
Department of Experimental and Molecular Biology,
University of Opole, Kominka 4, 45-035 Opole, Poland
Immobilizacja związków organicznych i białek
Immobilizacją nazywa się przyłączenie związku rozpuszczalnego do ciała stałego
nierozpuszczalnego. Robi się to w celu prowadzenia kolejnych reakcji ze związkiem bez
konieczności wyodrębniania produktów z mieszaniny poreakcyjnej. Metoda wymyślona
została przez autochtona amerykańskiego jako metoda syntezy peptydów. Gdy wszyscy
przyzwyczaili się do metody Merrifielda, została na nowo odkryta i nazwana
chromatografią powinowactwa.
Zastosowano tę metodę w latach sześćdziesiątych do izolacji swoistych przeciwciał
przeciwwirusowych z surowic zwierząt szczepionych wirusami. Wykonano to
w stosunkowo prosty sposób zawieszając w ciepłym roztworze agaru wirusy. Po
zastygnięciu agaru, posiekano go w mikserze, zwanym homogenizatorem. Zawieszono
grubo posiekany żel w soli fizjologicznej i wypełniono tym kolumnę chromatograficzną.
Po przesączeniu przez kolumnę rozcieńczonej solą fizjologiczną surowicy, niewielka
część białek nie dawała się wypłukać solą fizjologiczną z tej kolumny, wypłukała się
roztworem chlorku sodowego o kilkakrotnie większym stężeniu. Były to prawie czyste
przeciwciała antywirusowe.
Po kilku latach zaczęto tę metodę stosować do izolacji enzymów. Jako złoże
w kolumnie używane były stałe polimery z przyłączonymi substratami lub inhibitorami
konkurencyjnymi enzymów. Wyniki były dalekie od spodziewanych, lecz i tak znakomite
w porównaniu z tradycyjnymi metodami izolacji enzymów.
Metodę tę stosuje się do przeprowadzania reakcji enzymatycznych z tym, że to
enzym jest przyłączony do stałej matrycy. Często otacza się całe komórki lub ich
agregaty żelowatymi substancjami by zaoszczędzić sobie procesu np. klarowania piwa.
Matryca do immobilizacji
Matryca, inaczej nazywana jest podłożem.
Pierwszym zastosowanym do immobilizacji
podłożem był agar. Głównym składnikiem
agaru jest heteropolisacharyd agaroza.
W roztworze wodnym łańcuchy polisacharydowe układają się równolegle i gdzieniegdzie
łączą się wiązaniami wodorowymi tworząc
żel. Jeżeli do zasadowego roztworu agaru
doda się trochę epoksydu, wówczas
odczynnik ten może utworzyć wiązania
eterowe z grupami alkoholowymi policukru
i żel zostanie utrwalony. Po ogrzaniu nie
będzie przechodził w zol.
Można otrzymać zawiesinę drobnych
kulek zolu agarowego w benzynie,
przeprowadzić reakcję z epoksydem i po
odsączeniu, przemyciu, wysuszeniu, otrzyma
się kulki żelu, które w wodzie będą nasiąkały
jak gąbka. Nazywa się to usieciowaną
agarozą.
Rozmiary porów w takich kulkach żelu
zależą od stężenia agaru i od stężenia
epoksydu. Wielkość kulek zależy od
szybkości mieszania zawiesiny i od dodatku
detergentów.
Aktywacja podłoża
Wysuszone
kulki
sztywnego
żelu
agarozowego, zawieszone w roztworze
wodnym z dodatkiem bardzo małej ilości
“dwugłowego” epoksydu, w stosunkowo
łagodnych warunkach reagują z odczynnikiem i ze względu na warunki “steryczne”
tylko część grup alkoholowych tworzy
wiązania eterowe. Pozostaje część nieprzereagowanych i przyłączonych jednym
końcem ugrupowań epoksydowych. Można
odmyć ową agarozę od nadmiaru
odczynników i w łagodnych warunkach
wysuszyć. Tak przygotowany żel agarozowy
nazywa się aktywną lub aktywowaną
agarozą.
Immobilizacja
Pozostałe
grupy
epoksydowe
w
normalnej
temperaturze,
stosunkowo
szybko reagują z grupami SH i z grupami
aminowymi. Wolniej reagują z grupami
karboksylowymi i alkoholowymi. W przypadku przyłączania białek, najszybciej reaguję
grupy funkcyjne na powierzchni białka,
trudniej te schowane pomiędzy pętlami
polipeptydowymi. Ta sama reguła dotyczy
ziarenek
matrycy,
głównie
ulegają
modyfikacji na powierzchni. Czyli im
drobniejsze kulki tym więcej przyłączonego
związku, inhibitora lub enzymu. Zwykle
stosuje się matryce o uziarnieniu 0,1 do
1 mm średnicy. Centrum aktywne enzymów,
to
zazwyczaj
szczelina
pomiędzy
pofałdowaniami polipeptydu, rzadko ulega
w tym procesie uszkodzeniu.
Wszystko ładnie ale w praktyce jest
trochę trudniej.
Opracowano wiele metod immobilizacji
i wiele matryc. Metody te dobiera się
indywidualnie do każdego procesu.
Dopływ ekstraktu
białek z homogenatu
Płukanie solą fizjologiczną
v
Filtr
Wypływ roztworu białek zbędnych
Inhibitor
CH2OPO3R
- +
COOCH
Do immobilizowanego inhibitora
zazwyczaj przyłączają się enzymy
oraz wszystkie substancje, które tworzą
trudno dysocjujące kompleksy, zarówno
z inhibitorem jak i z izolowanym
enzymem oraz miedzy sobą. Asocjaty
takie są w równowadze dynamicznej
asocjacji-dysocjacji.
COOCH2
COO
CH
2
COO
CH
CH O
2 PO R
3
- +
Płukanie roztworami buforu
o wzrastającym stężeniu
Złoże z zaadsorbowanymi
białkami o powinowactwie
do immobilizowanej substancji
i do siebie wzajemnie
v
Białka, w tym także enzymy,
wykazują właściwości adsorpcyjne.
Tworzą ze sobą agregaty a także
adsorbują na swojej powierzchni
różne substancje (tłuszczowce,
cukry, kwasy karboksylowe,
nukleotydy, itp). Dlatego ta metodą,
w jednej operacji, nie udaje się
wydzielić czystego pojedynczego
białka.
Wypływ białek, w tym
enzymu zaadsorbowanego
na immobilizowanym
inhibitorze.
Regeneracja kolumny
Płukanie roztworem
detergentów, mocznika itp.
v
Zanieczyszczenia