Rola syntetycznych i naturalnych białek z motywem tagów

mgr Joanny Wątły:
Rola syntetycznych i naturalnych białek z motywem tagów polihistydylowych
w wiązaniu jonów Cu2+, Ni2+ oraz Zn2+
Promotor: Prof. dr hab. Henryk Kozłowski
STRESZCZENIE
Dane literaturowe wskazują na występowanie ponad 2000 białek bogatych w histydylowe
reszty aminokwasowe, których role w funkcjonowaniu organizmów żywych nie zostały jeszcze dobrze
scharakteryzowane. Specyficzną grupę polihistydylowych białek stanowią peptydy zawierające
domenę z motywem His-tag, które są przedmiotem mojej rozprawy doktorskiej. Nazwa His-tag
pochodzi od sekwencji, która zazwyczaj zawiera ciąg sześciu do dziewięciu reszt histydylowych i jest
powszechnie używana w biologii molekularnej w celu oczyszczania rekombinowanych białek przy
użyciu chromatografii powinowactwa z unieruchomionym jonem metalu (IMAC). Wielu natywnym
białkom z domeną His-tag przypisuje się różne funkcje, np. większość bakteryjnych białek,
zawierających wspomniany motyw, zaangażowanych jest najprawdopodobniej w homeostazę jonów
niklu, inne natomiast, np. nowo-wyizolowane peptydy z jadu węża z rodzaju Atheris, zawierające
polihistydylowe- poliglicylowe sekwencje (pHpG) mogą działać na układ sercowo-naczyniowy
poprzez hamowanie poszczególnych metaloproteinaz oraz wpływać na jego funkcjonowanie poprzez
oddziaływanie na specyficzne receptory.
Głównym celem moich badań było określenie roli domen zawierających motyw His-tag w
2+
2+
2+
wiązaniu dwuwartościowych jonów metali (Cu , Zn , Ni ), porównanie termodynamicznej trwałości
tworzących się kompleksów oraz ich struktury, a także zrozumienie, dlaczego w naturze tak bardzo
powszechnie występują sekwencje z wielokrotnym powtórzeniem reszty His. W tym celu
przeprowadziłam
szczegółowe
badania
dotyczące
sześciohistydylowego
peptydu
His-tag,
powszechnie stosowanego w biotechnologii do oczyszczania rekombinowanych białek oraz naturalnie
występujących sekwencji z motywem His-tag w peptydach z jadów węży z rodzaju Atheris oraz Echis.
Do swoich badań użyłam szerokiego wachlarza technik eksperymentalnych, w tym: spektrometrię
mas, potencjometrię oraz metody spektroskopowe: UV-Vis, CD, EPR. Dodatkowo nawiązano
współpracę z grupą badawczą z Uniwersytetu Ben-Guriona w Beer Szewie (Izrael) oraz z zespołem
teoretycznego modelowania procesów chemicznych z Wydziału Chemii Uniwersytetu Wrocławskiego
w celu uzupełnienia danych eksperymentalnych symulacjami dynamiki molekularnej oraz danymi
obliczeniowymi.
Badania wykazały, że sekwencje z motywem His-tag bardzo skutecznie wiążą jony metali
(Cu
2+
2+
>> Ni
2+
> Zn ). Polihistydylowy fragment z jadu węża Atheris squamigera zawierający ciąg
dziewięciu reszt histydylowych (pHG) wykazuje najwyższą skuteczność w wiązaniu jonów metali w
porównaniu z peptydem zawierającym sześciohistydylowy motyw His-tag oraz peptydem, który obok
tej domeny zawiera dodatkowe dwie reszty His w sekwencji. Wykazano, że wiązanie jonu metalu
indukuje tworzenie struktury α-helisy (regularna α-helisa w przypadku pHG), a dzięki zdolności
tworzenia stanów ‘polimorficznych’ metal może ‘poruszać się’ wzdłuż długiej polihistydylowej domeny
z motywem His-tag. Sekwencje zawierające ciąg sąsiadujących reszt His wiążą jony metali znacznie
silniej niż inne sekwencje białkowe bogate w histydyny, rozdzielone innymi aminokwasami.
2+
2+
Dzięki zrozumieniu chemii bionieorganicznej kompleksów Cu , Ni i Zn
2+
z sekwencjami
zawierającymi motywy tagów polihistydylowych, mogę śmiało postawić hipotezęodnośnie ich roli w
syntetycznych i naturalnych białkach. Po pierwsze, ze względu na wysoką trwałość tworzonych
kompleksów stanowią miejsce przechowywania jonów metali, pełniąc funkcję ‘gąbki’, po drugie: ze
względu na obecność stanów ‘polimorficznych’ są odpowiedzialne za dystrybucję metali w i między
białkami; po trzecie: ze względu na indukcję struktury α-helisy pod wpływem wiązania metali
determinują strukturę białek.