Elektroda tlenowa Clarka jest sensorem do oznaczania tlenu, jak

Ćwiczenie 4.
Elektrochemiczny czujnik glukozy
(na prawach rękopisu)
Czujniki są prostymi urządzeniami, które dają informacje o parametrach
obiektu czy też otoczenia bez wstępnego przygotowania próbek. Można je podzielić na
dwie podstawowe grupy: fizyczne i chemiczne. Podstawą tego podziału jest rodzaju
sygnału wejściowego powodującego zmiany parametrów sensora.
Czujniki chemiczne są urządzeniami, w których informacja chemiczna
(obecność, próg detekcji, itp.) jest przekształcana na użyteczny sygnał analityczny
(według IUPAC). Sensory chemiczne zbudowane są z minimum dwóch części: części
receptorowej i aktuatorowej. Część receptorowa oddziałuje bezpośrednio
z analizowanym czynnikiem. W wyniku tego oddziaływania zmianie ulegają jej
parametry. Zmiany te przekształcane są przez część aktuatorową w sygnał analitycznie
użyteczny.
Sensory chemiczne dzielmy w zależności od rodzaju sygnału wyjściowego.
I tak można wyróżnić chemiczne sensory: optyczne, elektrochemiczne, rezystancyjne,
czułe na zmianę masy, termometryczne, itp. Wśród chemicznych sensorów można
wyróżnić jeszcze jedną grupę tzn. biosensory. Grupa ta zawiera dodatkowo część
biologiczną (rys. 1), którą stanowią różnego rodzaju materiały biologiczne. W wyniku
oddziaływania tych materiałów biologicznych z oznaczaną substancją powstają
różnego rodzaju sygnały pośredni, które są sygnałem wejściowym różnego rodzaju
sensorów (rys. 1).
Tkanka
Mikroorganizm
eę
Organ lla
Kwas nukleinowy
órka
Kom
A
t
nali
receptorowa Enzym
ła
Przeciwcia
ł
Materia y biologiczne
ą
cz stki elektrodowoaktywe
Elektrody jonoselektywne
zmiana pH
FET ISFET
Elektrody pH metryczne
ciep
ło
Termistor
zmiana masy
Piezoelektryk
ło
Fotodetektor
ś
wiat
ł ś
Sygna po redni
Sygnał wyjś
ciowy
Sensor
ł
Zasada dzia ania biosensora
Rys. 1. Schemat biosensora.
W zależności od metody detekcji sygnału pośredniego biosensory można podzielić na
amperometryczne, potencjometryczne, konduktometryczne, termistorowe czy też
z tranzystorem. Wśród biosensorów najważniejsze są czujniki elektrochemiczne
określane jako elektroda jonoselektywna lub układ takich elektrod. Jeśli elektrodę
jonoselektywną pokryje się warstewką materiału zawierającego enzym, powodującego
przebieg określonej reakcji enzymatycznej, wówczas elektrodę taką nazywa się
elektrodą enzymatyczną. Elektrody enzymatyczne według IUPAC należą do elektrod
uczulanych, tj. są wykonane z materiału biologicznego wyodrębniającego i
przetwarzającego oraz z właściwej elektrody jonoselektywnej. W wyniku reakcji
enzymatycznej zachodzącej w na elektrodzie powstaje produkt powodujący zmianę
potencjału elektrody jonoselektywnej. Klasycznym przykładem elektrody
enzymatycznej jest elektroda służąca do oznaczania mocznika. Cząsteczki mocznika
dyfundujące z objętości roztworu przez pierwszą błonę półprzepuszczalną do
powierzchni elektrody ulegają w warstwie żelu zawierającego enzym ureazę
rozkładowi enzymatycznemu zgodnie z reakcją enzymatyczną:
CO (NH 2 )2 + H 2 O + 2 H + ureaza
→ CO2 + 2 NH 4+
(1).
+
Powstałe w wyniku reakcji jony amonowe ( NH 4 ) dyfundują przez drugą
półprzepuszczalną błonę do powierzchni elektrody szklanej powodując zmianę jej
potencjału (rys. 2).
elektroda szklana
błona półprzepuszczalna
warstwa enzymu ureazy
błona półprzepuszczalna
mocznik
jon amonowy
Rys. 2. Schemat warstw w enzymatycznym czujniku mocznika.
W czujnikach enzymatycznych produktami powodującymi zmiany potencjału
elektrochemicznego
elektrody,
są
na
ogół
jony
nieorganiczne,
np. jodkowe lub produkty gazowe, np. amoniak. Ten rodzaj elektrod
jonoselektywnych służy do oznaczania substratu.
Elektrody enzymatyczne mogą również służyć do oznaczania koncentracji
danego enzymu. W tym przypadku elektroda jonoselektywna pokryta jest warstwą
materiału zawierającego substrat. Substrat ten reaguje z oznaczanym enzymem.
W wyniku tej reakcji powstaje produkt, który wpływa na wartość potencjału
elektrochemicznego elektrody.
Czujniki enzymatyczne można podzielić, ze względu na rodzaj metody
elektrochemicznej
zastosowanej
do
detekcji
sygnału
pośredniego,
na: potencjometryczne, amperometryczne i konduktometryczne. Najczęściej stosuje
się metodę potencjometryczną. Enzymatyczne czujniki potencjometryczne można
z kolei podzielić w zależności od rodzaju zastosowanej elektrody jonoselektywnej,
np.: amonowa, jodkowa, fluorkowa, itp., gazowa, elektroda redoks czy też tranzystor
polowy czuły na jony wodorowe lub amonowe (ISFET, HEMFET).
Innym stosowanym kryterium podziału elektrod enzymatycznych jest liczba
enzymów w warstwie: czujniki monoenzymatyczne (najliczniejsza grupa)
i polienzymatyczne. Występują również czujniki mieszane enzymatyczno-bakteryjne
lub enzymatyczno-tkankowe.
Nową grupą biosensorów, które mają duże znaczenie w ocenie stanu
środowiska naturalnego oraz w medycynie są bioczujniki immunologiczne
(immunosensory)1. Biosensory te służą do oznaczania różnych substancji
posiadających znaczenie immunologiczne. Substancjami tymi są proteiny, surowice,
hormony, herbicydy i inne. Immunosensory charakteryzują się na ogół dużą czułością,
dużą szybkością odpowiedzi, małym zakresem detekcji oraz dają możliwość
automatyzacji.
Biosensory znajdują zastosowanie przede wszystkim w medycynie. Jednym
z biosensorów bardzo powszechnie stosowanym są czujniki glukozy (cukier prosty).
Pomiar stężenia glukozy ma istotne znaczenie nie tylko w medycynie. Jednakże
zdecydowanie najważniejszą rolę odgrywają one w życiu ludzi chorych na cukrzycę.
Według danych US NIH (Instytut Zdrowia USA) w 2002 roku w Stanach
Zjednoczonych było około 15,9 mln. diabetyków.
Węglowodany (cukry) są to związki organiczne szeroko rozpowszechnione
zarówno w świecie zwierzęcym jak i roślinnym. Związki te pełnią rolę substancji
strukturalnych jak również metabolicznych. Najważniejszym węglowodanem jest
glukoza. W roślinach syntezowana jest ona z dwutlenku węgla i wody w procesie
fotosyntezy i gromadzona w roślina jako skrobia lub jest przekształcana w błonnik
szkieletu roślinnego. Również zwierzęta mogą syntezować niektóre węglowodany
z tłuszczu. Jednak większa część węglowodanów zwierzęcych jest pochodzenia
roślinnego. Większość węglowodanów zawartych w pokarmach wchłania się do
krwioobiegu jako glukoza lub też jest w nią przekształcana w wątrobie. W organizmie
z glukozy mogą powstawać wszystkie inne cukry. Glukoza jest bardzo ważnym
źródłem energii w tkankach ssaków (z wyjątkiem przeżuwaczy) oraz uniwersalnym
„paliwem” dla płodu.
1
Immunologia to nauka zajmująca się wpływem czynników chorobotwórczych na odporność organizmu.
W cząsteczce glukozy (rys. 2) występują
asymetryczne atomy węgla wobec tego występują
izomery konfiguracyjne D i L. Obecność
asymetrycznych atomów w cząsteczce glukozy
nadaje jej również aktywność optyczną. Znaczenie
fizjologiczne ma glukoza D(-). Jej źródłem są soki
owoców i hydrolizaty skrobi, sacharozy, maltozy i
laktozy.
Rys. 3. Wzór strukturalny
glukozy.
Określanie poziomu glukozy jest bardzo ważne w medycynie, biotechnologii
i przemyśle spożywczym. Dokładność i szybkość określenia poziomu tej substancji
jest szczególnie istotne w przypadku osób chorych na cukrzycę. Stężenie glukozy
w analicie można określać metodami optycznym lub elektrochemicznymi.
Zdecydowanie szerzej stosowane są różne metody elektrochemiczne takie jak
amperometria czy też cykliczna woltamperometria. Jako czujniki do oznaczania
glukozy stosuje się między innymi amperometryczne sensory uczulane
enzymatycznie. Czujnik ten stanowi elektroda tlenowa zawierająca odpowiedni enzym
w części receptorowej. Enzymem tym jest β-oksydaza glukozowa, która katalizuje
następującą reakcję utleniania glukozy:
C6 H12O6 + O2 + H 2O → C6 H12O7 + H 2O2
(2)
Czujniki te cechuje przede wszystkim wysoka selektywność w stosunku do glukozy.
Na powierzchni elektrody tlenowej znajduje się warstwa immobilizowanego
(unieruchomionego) enzymu. Tak skonstruowaną elektrodę tlenową uczuloną
enzymatycznie zanurza się w roztworze nasyconym tlenem z powietrza i rejestruje
prąd początkowy. Po wprowadzeniu do badanego roztworu glukozy część tlenu
dyfundującego do katody jest zużywana w reakcji utlenienia glukozy
z wykorzystaniem immobilizowanego enzymu zgodnie z reakcją (2). W wyniku tego
procesu zmniejsza się koncentracja tlenu w roztworze i maleje strumień jego dyfuzji
w kierunku powierzchni katody. Gdy procesy na elektrodzie osiągną stan ustalony,
wówczas rejestruje się prąd końcowy. Obserwowany spadek natężenia prądu jest
wprost proporcjonalny do stężenia glukozy. Wykonując pomiary natężenia prądu dla
różnych koncentracji glukozy wyznacza się krzywą kalibracyjną. Na podstawie
znajomości krzywej kalibracyjnej oznacza się stężenie glukozy w badanej próbce.
Często przed pomiarem należy daną próbkę rozcieńczyć.
Określenia poziomu glukozy można również dokonać stosując elektrodę
jodkową. Jeśli elektroda ta stanowi istotną część sensora wówczas reaguje ona na
obecność produktu reakcji (2), tzn. nadtlenku wodoru, który w reakcji następczej
utlenia jony jodkowe według równania:
H 2 O2 + 2 J − + 2 H + → J 2 + 2 H 2 O .
(3)
W wyniku tej reakcji zmienia się koncentracja jonów jodkowych w membranie
zawierającej jod i jony jodkowe co powoduje zmianę sygnału elektrochemicznego
elektrody. Do oznaczeń tych można stosować również inne elektrody redoks.
Cel ćwiczenia:
1. Zapoznanie się z metodami pomiaru glukozy.
2. Przygotowanie roztworów.
3. Wykonanie krzywej kalibracji.
4. Wyznaczenie koncentracji glukozy w podanym roztworze.
Literatura.
1. Cygański A., Podstawy metod elektroanalitycznych, WNT Warszawa (1999).
2. Dowolny podręcznik do „Chemii fizycznej”.