„Kompleks powierzchniowy”

„Kompleks powierzchniowy”
Kardiomiocyt
- aktyna
- miozyna
Kompleks powierzchniowy
Konglomerat wzajemnie powiązanych
ze sobą systemów regulacyjnych
zakotwiczonych w błonie komórkowej,
obejmujących receptory macierzy
zewnątrzkomórkowej (np. integryny), i
czynników wzrostowych, białka adhezji
międzykomórkowej (np. kadheryny)
oraz determinanty bezpośredniej
międzykomórkowej wymiany
informacji (np. koneksyny)
1 1
Mutacje genów powodujących nadaktywność ścieżek
zależnych od czynników wzrostowych powodują zanik
zależności wzrostu od przyczepienia komórki do podłoża
Mutacje genu kodującego białko
Ras powodują zanik wrażliwości
komórek na fizyczny kontakt z
mikrośrodowiskiem
Collaborative cancerous
signalling
2 2
Comoglio et al., 2003
Wpływ aktywności receptorów czynników wzrostowych
na ruchliwość komórek
HGF i EGF regulują ruchliwość komórek
poprzez wpływ na status funkcjonalny
kompleksów cytoszkieletarnych związanych z
integrynami
Comoglio et al., 2003
3 3
Patologiczna nadaktywność ścieżek zależnych od HGF i
EGF powoduje wzrost ruchliwości komórek
HGF, EGF i TNF-alfa wpływają na
inwazyjność komórek nowotworowych
poprzez wpływ na status funkcjonalny
kompleksów cytoszkieletarnych związanych z
integrynami
Collaborative cancerous
signalling
Comoglio et al., 2003
4 4
Przejście epitelialno-mezenchymalne
Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT)
Radisky, D. C. J Cell Sci 2005;118:4325-4326
1. EMT regulowane jest przez szlaki sygnałowe zależne od b-kateniny, oraz białek z rodziny Snail i Slug a te
regulowane są przez szereg cytokin i czynników wzrostowych np. HGF, TGF, EGF, FGF, Wnt itd.
W jego wyniku obserwowane są:
2. Zmiany morfologiczne – m. in. polaryzacja komórki „góra-dół” zastępowana jest przez polaryzację „przódtył”
3. Związana z tym jest indukcja ruchliwości komórek oraz:
4. Zmiany ekspresji genów kodujących białka adhezji komórkowej, m.in. z rodziny integryn i kadheryn
Radisky, D. C. J Cell Sci 2005;118:4325-4326
Komórki o morfologii mezenchymalnej cechuje zwiększony poziom ekspresji N-kadheryny i integryny avb3
A549
Epi
Int
Mes
5
Promocja i progresja nowotworu
Primary tumour
TIC
TSC
Clonal expansion,
proliferation,
heterogeneity,
angiogenesis
EMT: epithelial-mesenchymal transition
(przejście epitelialno-mezenchymalne)
- zmiany morfologiczne
Lymphocyte
Tissue
invasion
Intravasation
Platelets
Secondary tumour
Capillary arrest
Extravasation
- aktywacja białek z rodziny Snail
- zmiany ekspresji genów (E-cadherin -> N-cadherin)
Oddziaływania z
komórkami ukladu
odpornościowego
-limfocyty
-płytki krwi
-monocyty/makrofagi
Angiogenesis
Metastasis
6
Immune system in carcinogenesis
(-) Increased risk of cancer after:
a) Immunosuppression
b) Chronic inflammation
(+) Presence of monocytes in solid tumours:
a) monocytes migrating to tumours undergo phenotypic transition into tumourinfiltrating macrophages (TIMs)
b) TIMs may constitute up to 80% of the tumour mass
c) TIMs (M2) represent a tumour-promoting phenotype i.e. secrete factors
promoting cancer expansion
Monocytes in cancer progression:
- Monocytes induce the invasion of mammary and hepatoma cancer cells by means
of EGF (Wyckoff et al., 2004; Lin et al. 2002; Condeelis and Pollard, 2006)
- Microglia-derived TGF-b is an inducer of glioma cell invasion (Śliwa et al., 2007;
Wesołowska et al.. 2008)
7
Pętle parakrynne między makrofagami a nowotworem
8
Condeelis&Pollard, 2006
Komórki HPC-4 (rak trzustki)
HPC-4 cells
- Linia ustalona w 1993 (Siedlar et al., 1994)
- fenotyp epithelioidalny
- linia inwazyjna in vivo
- komórki HPC- indukują sekrecję cytokin prozapalnych przez
monocyty/makrofagi, w tym IL-12 i TNF-a (Zembala et al., 1993)
Jak monocyty wpływają na ruchliwość komórek
HPC-4 w ko-hodowli?
9
Metodyka
N
N
N
Non-polarised
N
Polarised
P
P
P
P
Morfometria
Wideomikroskopia
10
Mikroskopia fluorescencyjna
Adhezja i ruchliwość monocytów w kohodowli z komórkami HPC-4
Adhezywność monocytów
Kontrola
Mo + HPC-4
% of adhered cells
50
40
actin
vinculin
30
20
10
0
Control
Mo + HPC Mo +cond.
- indukcja adhezji
- polaryzacja przód-tył monocytów (PBM)
11
Adhezja i ruchliwość monocytów w
obecności „medium warunkowanego”
Adhezywność monocytów
Kontrola
Mo + CM
% of adhered cells
50
40
actin
vinculin
30
20
10
0
Control
Mo + HPC Mo +cond.
„Monocyte-macrophage transition”
Czyz, J, Siedlar M.,(unpublished)
12
Zachowanie komórek HPC-4 w kohodowli z monocytami krwi
obwodowej
Kontrola
Ko-kultura
13
Wpływ monocytów/macrofagów na
ruchliwość komórek HPC-4
70
60
50
50
40
40
30
30
20
20
10
10
0
0
VCM [um/h]
Control
TLCD [um/h]
60
70
TLCD
VCM
Control
HPC + Mo
HPC-4 + Mo
Baran, B., Bechyne, I., Siedlar, M., Szpak, K., Mytar, B., Sroka, J., Laczna, E., Madeja, Z., Zembala, M., and Czyz, J. Eur. J. Cell
Biol. 88 (2009) 743-752.
14
Wpływ monocytów/makrofagów na
morfologię komórek HPC-4
Control
- indukcja ruchliwości
- rozproszenie kolonii
- polaryzacja przód-tył
HPC-4 + Mo
} EMT ???
Baran, B., Bechyne, I., Siedlar, M., Szpak, K., Mytar, B., Sroka, J., Laczna, E., Madeja, Z., Zembala, M., and Czyz, J. Eur. J. Cell
Biol. 88 (2009) 743-752.
15
Mediatory wymiany informacji między
komórkami HPC-4 i makrofagami
2000
Monocyty/makrofagi aktywowane
przez komórki HPC-4 wydzielają TNFalfa (Szaflarska, 2004)
TNF [pg/ml]
MO
1500
1000
MO+LPS
MO+neo
500
0
W zależności od kontekstu komórkowego TNF-alfa
może hamować lub promować rozwój nowotworu
16
Mediatory wymiany informacji między komórkami HPC-4 i
makrofagami
Inhibitory TNF obniżają reaktywność komórek HPC-4
17
na obecność monocytów/makrofagów
Egzogenny TNF indukuje ruchliwość komórek HPC-4
Baran, B., Bechyne, I., Siedlar, M., Szpak, K., Mytar, B., Sroka, J., Laczna, E., Madeja, Z., Zembala, M., and Czyz, J. Eur. J. Cell
Biol. 88 (2009) 743-752.
18
Egzogenny TNF indukuje ruchliwość
komórek HPC-4
Control
TNF
19
Morfologia i architektura cytoszkieletu
komórek HPC-4 w obecności TNF
HPC-4 + Mo
HPC-4 + TNF
Baran, B., Bechyne, I., Siedlar, M., Szpak, K., Mytar, B., Sroka, J., Laczna, E., Madeja, Z., Zembala, M., and Czyz, J. Eur. J. Cell
Biol. 88 (2009) 743-752.
20
Funkcja
czynników
transkrypcyjnych
z rodziny Snail
21
EMT ?
Control
10 u/ml TNF
100 u/ml TNF
1000 u/ml TNF
TNF-alpha induces expression of Snail-1
22
Wnioski
Monocyty wspomagają proces progresji
nowotworu trzustki
TNF jest zaangażowany w pętle parakrynne
regulujące te współzależność
TNF indukuje EMT w komórkach
nowotworowych
23
Przejście epitelialno-mezenchymalne
Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT)
Radisky, D. C. J Cell Sci 2005;118:4325-4326
24
Interakcje między szlakami sygnałowymi zależnymi od
czynników humoralnych a białkami adhezji międzykomórkowej
z rodziny kadheryn
25 25
Comoglio, 2003
Model inwazji nowotworowej
GUZ PIERWOTNY
Ekspansja klonalna,
wzrost, dywersyfikacja,
angiogeneza
TSC
TIC
Właściwości komórek nowotworowych
Limfocyt
Oddziaływania z
komórkami
limfatycznymi
3.
Brak zależności wzrostu od
lokalnej adhezji i funkcji
czynników wzrostowych
Zanik wrażliwości na czynniki
hamujące proliferację komórek
Zanik zdolności do apoptozy
Adhezja do śródbłonka i
błony podstawnej
4.
Wzmożona ruchliwość
Inwazja tkanki i
intrawazacja
1.
2.
Płytki
krwi
GUZ WTÓRNY
Ekstrawazacja
(Hanahan&Weinberg, 2000)
Angiogeneza
Błona
podstawna
Proliferacja
Macierz
zewnątrzkomórkowa
26 26
Strategie migracji komórek
Cancer Science
Volume 96, Issue 7, pages 379-386, 29 JUL 2005 DOI: 10.1111/j.1349-7006.2005.00062.x
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1349-7006.2005.00062.x/full#f2
27
AFM
Mikroskop AFM
Ostrze noża
Wnętrze głowicy
28
Principle of AFM
1 min Cytospin
12 h Culture
Komórki uzyskano 2 metodami; 1 min Cytospin, 12 h Culture
Cross et al.29
2008
AFM
L
Ddetektor
Dioda lasera
Ostrze noża
Preparat
30
„Sztywność mechaniczna ” komórek
B16
Cross et al.31
2008
Mutacje genów powodujących nadaktywność ścieżek zależnych od
czynników wzrostowych powodują zanik zależności wzrostu od
przyczepienia komórki do podłoża
CHF
B16
Collaborative cancerous
signalling
32 32
Comoglio et al., 2003
Wizualizacja statycznych i dynamicznych sił
wywieranych na podłoże przez komórki
Podłoża elastyczne
33 33
Funkcja „Niszy” czyli mikrośrodowiska komórek w
transformacji nowotworowej
Mediatory wymiany informacji
między komórką a „niszą” wspomagające
transformację nowotworową:
Neo
- zaburzenia funkcji endo- i egzogennych
czynników humoralnych– oddziaływania
„krynne”
1
P1
1
2
S
- modyfikacje składu macierzy
międzykomórkowej oraz ekspresji receptorów
adhezji komórkowej, np. integryn i kadheryn
2
P2
P3
3
Wnts
3
- zmiany równowagi mechanochemicznej w
obrębie „niszy”, prowadzące do zaburzeń
wymiany bodźców mechanicznych między
komórka a jej mikrośrodowiskiem
-deregulacja bezpośredniej wymiany
metabolitów za pośrednictwem złącz
szczelinowych
Czyz J., Wobus A.M. Differentiation (2001) 68: 167-174
34
Tensegralny model architektury cytoszkieletu komorek
HSF
B16
35
„Tensegrity”
Integryny i kadheryny
łącząc domeny
cytoszkieletarne
sąsiadujących
komórek za
pośrednictwem
adhezji
międzykomórkowej
…
Tensegralność
… pośredniczą w tworzeniu wielokomórkowych
kontinuów mechanochemicznych
Alberts et al., 2005
36 36
Adhezja komórkowa za pośrednictwem kompleksów białkowych
związanych z cytoszkieletem
aktyna
winkulina
białka strukturalne
białka funkcjonalne
Kontakty zogniskowane to wyspecjalizowane kompleksy białkowe
uczestniczące w stabilizacji adhezji komórkowej… ale również w
przenoszeniu generowanych przez komórki bodźców mechanicznych na
mikrośrodowisko
37
ORIENTACJA WIĄZEK MIKROFILAMENTÓW DECYDUJE
O KIERUNKU SIŁ MECHANICZNYCH GENEROWANYCH
PRZEZ KOMÓRKI
38
Regulacja ruchu komórek nowotworowych poprzez
reorganizację aktyny
Cancer Science
Volume 96, Issue 7, pages 379-386, 29 JUL 2005 DOI: 10.1111/j.1349-7006.2005.00062.x
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1349-7006.2005.00062.x/full#f1
39
Adhezja komórkowa za pośrednictwem kompleksów białkowych
związanych z cytoszkieletem
aktyna
winkulina
białka strukturalne
białka funkcjonalne
Kontakty zogniskowane uczestniczą w przenoszeniu bodźców
mechanicznych generowanych przez mikrośrodowisko do komórki…
40
„Nisza” jako mikrośrodowisko komórek pozostające z
nimi w stanie ciągłej wymiany informacji
Mediatory wymiany informacji
między komórką a „niszą”:
1
P1
1
2
S
2
P2
P3
3
Wnts
- czynniki humoralne (np. czynniki wzrostowe
i cytokiny – oddziaływania „krynne”
- adhezja komórkowa (ścieżki sygnałowe
zależne od integryn, kadheryn etc.
- wymiana bodźców mechanicznych (za
pośrednictwem białek adhezji
międzykomórkowej i receptorów ECM)
3
-bezpośrednia wymiana metabolitów (złącza
szczelinowe)
Czyz J., Wobus A.M. Differentiation (2001) 68: 167-174
41
Oddziaływania autobaryczne i parabaryczne
Banes et al,, 1995
42
Biomechaniczna kontrola morfogenezy
„Nisza”
Prog. Biophys. Mol. Biol. (2008) 97: 163
43 43
„Nisza” jako mikrośrodowisko komórek pozostające z
nimi w stanie ciągłej wymiany informacji
Mediatory wymiany informacji
między komórką a „niszą”:
- czynniki humoralne (np. czynniki wzrostowe
i cytokiny – oddziaływania „krynne”
- adhezja komórkowa (ścieżki sygnałowe
zależne od integryn, kadheryn etc.
- wymiana bodźców mechanicznych (za
pośrednictwem białek adhezji
międzykomórkowej i receptorów ECM)
-bezpośrednia wymiana metabolitów (złącza
szczelinowe)
Czyz J., Wobus A.M. Differentiation (2001) 68: 167-17444