Znaczenie prognostyczne ekspresji cykliny D1 i cykliny B u

Znaczenie prognostyczne ekspresji cykliny D1 i cykliny B u

136
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
Znaczenie prognostyczne ekspresji cykliny D1 i cykliny B u pacjentów
z rakiem krtani leczonych radioterapią
Prognostic significance of cyclin D1 and cyclin B expression in laryngeal squamous cell carcinomas
treated with radiotherapy
Dorota Dupla1, Marcin Frączek 2, Tomasz Kręcicki2, Zbigniew Woźniak 3
Otolaryngol Pol 2009;
63 (2): 136-140
©by Towarzystwo
Otorynolaryngologów –
Chirurgów Głowy i Szyi
Otrzymano/Received:
21.12.2008
Zaakceptowano do
druku/Accepted:
26.01.2009
1
Zakład Teleradioterapii,
Dolnośląskie Centrum
Onkologii we Wrocławiu
Kierownik: dr n. med.
B. Spytkowska
2
Klinika Otolaryngologii
AM we Wrocławiu
Kierownik: prof. dr hab.
T. Kręcicki
3
Zakład Anatomii
Patologicznej AM we
Wrocławiu
Kierownik: prof. dr hab.
J. Rabczyński
Wkład pracy autorów/
Authors contribution:
D. Dupla – główny badacz
oraz przewodnicząca
zespołu autorów.
M. Frączek – analiza
danych oraz przygotowanie
manuskryptu.
Z. Woźniak – analiza
histopatologiczna
materiału.
T. Kręcicki – analiza oraz
zbieranie funduszy.
Konflikt interesu/
Conflicts of interest:
Autorzy pracy nie zgłaszają
konfliktu interesów.
Adres do korespondencji/
Address for
correspondence:
imię i nazwisko:
Marcin Frączek
adres pocztowy:
ul. Borowska 213
50-556 Wricław Klinika
Otolaryngologii
tel. 501815421
e-mail [email protected]
SUMMARY
Cyclin B1 and cyclin D1 playing the role of regulatory subunits of cyclin-dependent kinases responsible for progression
of cell cycle are involved in carcinogenesis of head and neck tumors. The aim of this study is to investigate their value for
predicting clinical outcome after radiotherapy of laryngeal squamous cell cancer (LSCC). Material and methods. The study
included 50 patients with LSCC treated between the years 1998 and 2003 with radiotherapy. Tissue samples were studied
immunohistochemically for detection of cyclin B1 and cyclin D1 and their expression were correlated with clinicopathological factors, local tumor control and patient survival. Results. Accumulation of cyclin D1 and cyclin B1 were detected
in 36% and 48% of tumors respectively. No relationship was observed between immunostaining for analyzed proteins
and clinicopathologic factors. Cyclin B1 overexpression was associated with higher rate of locoregional recurrence. Fiveyear disease free survival rate for patients with cyclin B1 positive tumors was 73% v. 84% for cyclin B1 negative patients
(p=0,005). Conclusion. The expression of cyclin D1 in LSCC does not seem to have a prognostic significance. Overexpression of cyclin B1 may be an indicator of the risk of locoregional recurrence in patient receiving radiotherapy. Thus cyclin
B1 detected by immunohistochemistry can be useful for predicting outcome of radiotherapy in patients with LSCC.
Hasła indeksowe: rak krtani, cyklina B1, cyklina D1, immunohistochemia, radioterapia, prognoza
Key words: laryngeal cancer, cyclin B1, cyclin D1, immunohistochemistry, radiotherapy, prognosis
Wstęp
Nowoczesne metody badawcze biologii molekularnej
umożliwiają nam obecnie lepsze poznanie mechanizmów karcinogenezy i wskazują wiele nowych parametrów mogących mieć znaczenie rokownicze i predykcyjne dla pacjentów z chorobą nowotworową. Uzyskanie
informacji na etapie diagnozy o promieniowrażliwości
guza ułatwiłoby podejmowanie decyzji terapeutycznych
i pozwoliło na indywidualizację leczenia poprzez wybór
najskuteczniejszej metody leczenia. Ponieważ nieprawidłowa, niekontrolowana proliferacja jest główną
cechą charakterystyczną nowotworu, a także podstawową przyczyną niepowodzeń radioterapii białka
kontrolujące przebieg cyklu komórkowego znajdują się
obecnie w centrum zainteresowania.
Jednym z najczęściej aktywowanych onkogenów
w nowotworach głowy i szyi jest cyklina D1 należąca
do rodziny białek odgrywających kluczową rolę w inicjacji oraz regulacji progresji poszczególnych etapów
cyklu komórkowego. Cykliny uważane za produkty
protoonkogenów w pewnych okolicznościach mogą
zakłócić delikatną równowagę pomiędzy pozytywnymi
i negatywnymi regulatorami cyklu. Akumulacja cykliny
D1 w komórce w fazie G1 umożliwia przejście przez
punkt restrykcyjny i rozpoczęcie podziału komórkowego [ ]. Nieprawidłowy, podwyższony poziom cykliny
D1 może znosić indukowaną przez promieniowanie
przerwę w G1. Cyklina B1 jest główną cykliną fazy G2,
a tworząc aktywny kompleks z kinazą cyklinozależną
CDK1 warunkuje przejście interfazy G2/M i prawidłowy
przebieg procesów zachodzących w trakcie mitozy [ ].
Nadekspresja cykliny B1 może modulować odpowiedź
komórek na działanie promieniowania jonizującego
poprzez wpływ na punkty kontrolne fazy G2 i M, efektem czego może być dalsza nieprawidłowa proliferacja
przyczyniająca się do promieniooporności [ ].
Celem pracy było określenie wartości predykcyjnej cykliny D1 oraz cykliny B1 w prognozowaniu
skuteczności radioterapii, poprzez ustalenie związku
ekspresji ocenianych markerów z ryzykiem wznowy
miejscowej i przeżyciem swoistym pacjentów z rakiem
płaskonabłonkowym krtani leczonych samodzielną
radioterapią.
Materiał i metody
Do badań włączono 50 chorych leczonych w Zakładzie
Teleradioterapii Dolnośląskiego Centrum Onkologii we
Wrocławiu w latach 1998–2003. Wśród chorych było
40 mężczyzn i 10 kobiet. Wiek pacjentów wahał się od
33 do 82 lat (średnia 61 lat). Kliniczne zaawansowanie
nowotworu określono za pomocą klasyfikacji TNM wg
UICC. Wśród chorych były 4 przypadki raka przedinwazyjnego (Tis), 20 chorych z guzem T1, 20 z T2,
5 z T3 i 1 z T4. W 46 przypadkach nie stwierdzono
Otolar yngologia Polska tom 63, nr 2, mar zec – k wiecień 20 0 9
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
obecności przerzutów do węzłów chłonnych, 2 chorych
oceniono jako N1, a pozostałych 2 jako N2. Pierwszy
stopień zaawansowania stwierdzono u 19 chorych,
II u 18, III u 7 i IVa u 2 pacjentów. U 39 pacjentów
guz nowotworowy zlokalizowany był w głośni, a w 11
przypadkach w nagłośni.
Wszyscy chorzy byli leczeni radykalną radioterapią.
W niezaawansowanych rakach głośni bez przerzutów do węzłów chłonnych obszar napromieniany był
ograniczony do samej krtani, a w rakach nadgłośni
oraz w przypadku N+ napromieniano również układ
chłonny szyi. Dawka całkowita wahała się od 51 Gy
do 72 Gy, dawka frakcyjna od 2 do 3 Gy. Czas trwania
radioterapii wynosił średnio 45 dni (mediana 46 dni;
SD 8 dni). Średni czas obserwacji po leczeniu wynosił
48,4 miesięcy (SD 22 mies.).
U 9 chorych stwierdzono wznowę procesu nowotworowego w krtani. U 1 osoby wznowie miejscowej
towarzyszyła wznowa w obrębie węzłów chłonnych szyi.
Czas ujawnienia się wznowy liczony od rozpoczęcia
radioterapii do momentu potwierdzenia histopatologicznego wynosił od 4 do 46 miesięcy. Spośród 6
chorych, u których wykonano ratującą laryngektomię,
3 żyje bez cech wznowy, 2 zmarło z powodu progresji miejscowej nowotworu a jedna osoba z przyczyn
nienowotworowych. Spośród pozostałych 3 osób ze
wznową 1 zmarła z powodu progresji miejscowej, a 2
osoby żyją nadal.
Badania immunohistochemiczne, stosując metodę ABComplex/HRP, wykonywano na skrawkach
parafinowych grubości 4 μm, które umieszczono na
szkiełkach silanizowanych (DAKO), odparafinowano
w ksylenie i przeprowadzono przez szereg alkoholowy
o malejących stężeniach. Endogenną peroksydazę blokowano przez 10 min 3% roztworem H2O2. Następnie
na skrawki nanoszono pierwotne mysie monoklonalne
przeciwciała p/ludzkiemu białku: cyklinie D1 (DCS-22
DAKO M7155) w rozcieńczeniu 1/50, inkubowano 30
min; cyklinie B1 (7A9 NOVO CASTRA) w rozcieńczeniu
1/20, inkubowano 60 min. Inkubacje prowadzono
w temperaturze pokojowej. Reakcja immunocytochemiczna wywołano roztworem 3,3-diaminobenzidine
tetrahydrochloride (DAB) (K3486 DAKO). W kontroli
negatywnej przeciwciała zastępowano surowicami
kontrolnymi zachowując pozostałe warunki reakcji.
Do oceny preparatów użyto mikroskopu Olimpus
BX 50 i komputerowego systemu analizy obrazów MultiScanBase v.8.08 (css Scan). Każdorazowo pod powiększeniem 40x wybierano pola o najsilniejszej reakcji
barwnej, a następnie pod powiększeniem 400-krotnym
zliczano komórki nowotworowe oraz komórki wykazujące reakcję dodatnią, uwzględniając co najmniej
500 komórek. Następnie obliczano odsetek komórek
wybarwionych. W przypadku cykliny D1 za dodatnią
uznawano reakcję jądrową, w przypadku cykliny B1
reakcję cytoplazmatyczną i jądrową. Obecność reakOtolar yngologia Polska tom 63, nr 2, mar zec – k wiecień 20 0 9
cji barwnej w więcej niż 5% komórek dla obu cyklin
uznano jako wynik pozytywny.
Wyniki uzyskanych badań poddano opracowaniu
statystycznemu pakietem programów statystycznych
EPIINFO Ver. 3.2. Dla parametrów dyskretnych częstość występowania cechy w grupach analizowano
testem t2 z poprawką Yatesa lub, gdy wartość oczekiwana w komórce była mniejsza od 5, testem dwustronnym Fishera. Przeżycie porównywano używając
testu log-rank. Analizę wieloczynnikową przeprowadzono stosując model regresji proporcjonalnego
hazardu Coxa. Wartość p<0,05 uznawano za znaczącą
statystycznie.
Wyniki
W badaniu immunohistochemicznym cyklinę D1 i cyklinę B1 stwierdzono odpowiednio w 18 (36%) i 24
(48%) analizowanych przypadkach.
Guzy pozytywne dla cykliny D1 wykazywały znaczną heterogenność w intensywności wybarwienia oraz
liczbie wybarwionych komórek pomiędzy poszczególnymi przypadkami. Nowotwory głośni charakteryzowały
się wyższym odsetkiem komórek z pozytywną reakcją
na cyklinę D1 (43%) niż nowotwory o lokalizacji nadgłośniowej, wśród których stwierdzono tylko 1 przypadek reakcji dodatniej (9%) (p=0,07) (tab. I).
Nie wykazano związku pomiędzy podwyższoną
ekspresją analizowanych białek a pozostałymi parametrami klinicznymi i histopatologicznymi guzów jak
płeć, wiek, cecha T, stopień zaawansowania klinicznego i obecność przerzutów do węzłów chłonnych. Nie
stwierdzono również zależności pomiędzy ekspresją
samych białek.
Analiza jednoczynnikowa nie wykazała istotnego
statystycznie wpływu badanych markerów immunohistochemicznych na ryzyko wznowy i zgonu z powodu
raka krtani (tab. II). Jednak w analizie wieloczynnikowej istotnymi statystycznie, niezależnymi czynnikami
związanymi z ryzykiem wznowy miejscowej okazały
się: cecha T (p=0,004), wiek (p=0,009) i cyklina B1 (tab.
III). Guzy gromadzące cyklinę B1 charakteryzowały
się wyższym ryzykiem wystąpienia wznowy miejscowej (rr=1,44; p=0,005). Krzywa przeżycia wolnego od
wznowy nowotworu w zależności od obecności cykliny
B1 przedstawia ryc. 1.
Analiza jednowariantowa wykazała znaczący wpływ
cechy T na ryzyko wznowy miejscowej (p=0,035) i zgonu
z powodu raka krtani (p=0,035). Zawansowanie kliniczne wg TNM korelowało z ryzykiem zgonu z powodu
nowotworu (p=0,029). W analizie wieloczynnikowej
całkowitego czasu przeżycia jedynym niezależnym
czynnikiem rokowniczym pozostała wielkość guza
nowotworowego. Ryzyko zgonu chorych z powodu raka
krtani z guzami T3 i T4 było wyższe niż dla nowotworów
T1 i T2 (rr=14,6; p=0,028).
137
138
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
Tabela I. Zależność pomiędzy ekspresją analizowanych białek a cechami kliniczno-patologicznymi
Parametr
Płeć
Wiek (lata)
Lokalizacja guza
Cecha T
Zaawansowanie
Cecha N
Wznowa miejscowa
Cyklina B1
N
Cyklina D1
Cyklina B1
≤5%
> 5%
≤5%
> 5%
kobiety
10
6 (60)
4 (40)
6 (60)
4 (40)
mężczyźni
40
26 (65)
14 (35)
20 (50)
20 (50)
<60
23
14 (61)
9 (39)
13 (56)
10 (44)
60
27
18 (66)
9 (34)
13 (48)
14 (52)
głośnia
39
22 (56)
17 (44)
18 (46)
21 (54)
nadgłośnia
11
10 (91)
1 (9)
8 (73)
3 (27)
T1+T2+Tiss
44
26 (59)
18 (41)
22 (50)
22 (50)
T3+T4
6
6 (100)
0
4 (77)
2 (33)
I+II+Tiss
41
24 (59)
17 (41)
21 (51)
20 (49)
III+IV
9
8 (89)
1 (11)
5 (56)
4 (44)
N0
56
29 (63)
17 (27)
25 (54)
21 (46)
N+
4
3 (75)
1 (25)
1 (25)
3 (75)
0
41
28 (68)
13 (32)
22 (54)
19 (46)
1
9
4 (44)
5 (56)
4 (44)
5 (56)
≤5%
26
19 (73)
7 (27)
-
-
> 5%
24
13 (54)
11 (46)
-
-
Tabela II. Analiza jednowariantowa wznów miejscowych i zgonów swoistych pacjentów z rakiem krtani
Parametr
Cyklina D1
Cyklina B1
N
Wznowa
(n=9) (%)
5Y RFS
P
Zgony (n=3)
(%)
5Y OS
P
≤ 5%
32
8 (25)
74,0%
0,134
3 (9)
88,9%
0,192
> 5%
18
1 (5)
85,7%
0
100%
≤5%
26
4 (15)
84,6%
0,590
2 (8)
89,9%
0,62
> 5%
24
5 (21)
73,4%
0,590
1(4)
95,7%
0,62
5Y RFS (recurrens free survival) - 5-letnie przeżycie bez cech wznowy miejscowej; 5Y OS – ryzyko zgonu z powodu nowotworu; p – poziom
istotności statystycznej
Dyskusja
Nieskuteczność radioterapii może być spowodowana
zbyt dużą w stosunku do podanej maksymalnej dawki
liczbą komórek nowotworowych, ich opornością na promieniowanie, niedotlenieniem guza lub przyspieszoną
repopulacją komórek nowotworowych. Wydaje się, że
najbardziej istotną przyczyną niepowodzeń leczenia
raka krtani jest właśnie przyspieszona repopulacja [ ].
Mechanizmy i przyczyny tego procesu nie są jednak do
końca wyjaśnione. Czynniki molekularne zaangażowane w kontrolę cyklu komórkowego, zwłaszcza związane
z fazą G1 (cyklina D1) oraz fazą G2 (cyklina B1) mogą
mieć bezpośredni związek z tym zjawiskiem.
W analizowanej grupie pacjentów z rakiem krtani leczonych samodzielną radioterapią wykazano, że
nadekspresja cykliny B1 jest związana z wyższym
ryzykiem wystąpienia wznowy miejscowej, co może
świadczyć o promieniooporności tych guzów. Korelację
akumulacji tego białka z krótszym przeżyciem i zwiększonym ryzykiem nawrotu po radioterapii stwierdzono także w innych badaniach [5, 6]. Cyklina B1 jest
białkiem regulatorowym, które zarządza prawidłowym
przebiegiem fazy G2 i mitozy. Zaburzenia w przebiegu
tych faz mogą przyczyniać się do rozwoju promieniooporności nowotworów. Napromienianie komórek
Otolar yngologia Polska tom 63, nr 2, mar zec – k wiecień 20 0 9
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
Tabela III. Analiza wielowariantowa wznów miejscowych pacjentów z rakiem krtani
Parametr
Wariant
N
Wznowa (n=9)
5Y RFS
Cyklina B1
≤ 5%
26
4 (15%)
84,6%
> 5%
24
5 (21%)
73,4%
Rr
beta
P
1,44
0,367
0,005
rr (relative risk) - ryzyko względne; 5Y RFS (recurrens free survival) - 5-letnie przeżycie bez cech wznowy miejscowej; p – poziom istotności
statystycznej
z nadekspresją cykliny B1 wykazało znaczne skrócenie
fazy G2, wynikiem czego jest przedwczesne rozpoczęcie mitozy w komórkach z nienaprawionym DNA [9].
Zazwyczaj w takich komórkach dochodzi do indukcji apoptozy lub katastrofy mitotycznej i ostatecznie
śmierci komórek, co zabezpiecza organizm przed dalszą
proliferacją niestabilnych genetycznie komórek [9].
Obecność cykliny B1 w komórkach nowotworowych
może świadczyć o zablokowaniu tych mechanizmów,
co umożliwia komórkom z uszkodzonym DNA przeżycie katastrofy mitotycznej i kontynuowanie podziałów
komórkowych. W przypadku długotrwałego działania
czynników uszkadzających może to być jeden z mechanizmów adaptacyjnych umożliwiających komórce
przeżycie i proliferację w niekorzystnych warunkach,
jednak kosztem zwiększonej tolerancji na uszkodzenia
DNA [9]. Nieprawidłowa aktywacja tego mechanizmu
w komórkach nabłonka może odgrywać istotną rolę
zarówno w procesie karcinogenezy, jak i być przyczyną
powstania klonów opornych na promieniowanie.
W naszym badaniu nie stwierdziliśmy związku
pomiędzy ekspresją cykliny D1 a ryzykiem wznowy
i przeżyciem chorych po radioterapii. Według modelu
karcinogenezy raków głowy i szyi wg Califano nadekspresja cykliny D1 jest zmianą późną, związaną
z progresją nowotworową. Liczne badania potwierdzają
tę teorię wykazując związek pomiędzy jej nadekspresją
a zaawansowaniem choroby, zajęciem węzłów chłonnych, krótszym przeżyciem i zwiększonym ryzykiem
wznowy [10, 11]. Brak związku z czynnikami klinicznymi i patologicznymi stwierdzono w innych doniesieniach [12].
Cyklina D1 może także modulować odpowiedź komórek na napromienianie, pomimo że jej wpływ na
promieniowrażliwość nowotworów jest przedmiotem
kontrowersji. W większości badań klinicznych wykazano większą promieniowrażliwość nowotworów z nadekspresją cykliny D1 [13, 14]. Obserwowaną w tych
przypadkach zwiększoną promieniowrażliwość można
tłumaczyć znacznym skróceniem fazy G1, co jest przyczyną nieukończenia zarówno syntezy i prawidłowego
rozmieszczenia wszystkich kompleksów prereplikacyjnych jak i naprawy popromiennych uszkodzeń DNA.
Uszkodzenia DNA aktywują poprzez białko p53 proces
apoptozy, eliminując nieprawidłową komórkę z organizmu [15]. Z kolei Milas i wsp. wykazali, że wysoki
Otolar yngologia Polska tom 63, nr 2, mar zec – k wiecień 20 0 9
Ryc. 1. Czas przeżycia bez wznowy dla chorych z rakiem
krtani w zależności od ekspresji cykliny B1.
poziom cykliny D1 wraz z nadekspresją EGFR jest
związany z promienioopornością guzów [16]. Prawdopodobną przyczyną promieniooporności tych guzów
był brak apoptozy. Ostateczny wpływ cykliny D1 na
promieniowrażliwość nowotworów może zależeć od
innych czynników molekularnych i stopnia uszkodzenia mechanizmów zabezpieczających organizm przed
karcinogenezą.
Wpływ analizowanych białek na promieniowrażliwość nowotworów jest procesem złożonym i zależy
prawdopodobnie od rodzaju komórki, jej aktualnej
pozycji w cyklu komórkowym, od typu i natężenia
uszkodzeń popromiennych a także sprawności mechanizmów ich naprawy. Również aktywność samych
białek jest regulowana wielopoziomowo i zależy zarówno
od zwiększenia ich syntezy jak i zahamowania degradacji. Przedstawione w pracy wyniki badań wskazują
na użyteczność analizy ekspresji białek cykliny B1
w prognozowaniu skuteczności konwencjonalnej radioterapii u pacjentów z rakiem krtani.
PIŚMIENNICTWO
1.
Coqueret O. Linking cyclins to transcriptional control.
2.
Smits V, Medema RH. Checking out the G2/M transition.
Gene 2002; 299: 35-55.
Biochimica et Biophisica Acta 2001; 1219: 1-12.
3.
Tamamoto T, Ohnishi A. Correlation between -ray-induced G2 arrest and radioresistance in two human cancer
cells. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 1999; 44: 905-9.
139
140
PRACE ORYGINALNE / ORIGINALS
4.
Składowski K, Tarnawski R, Maciejewski B, Wygoda A,
Slosarek D. Clinical radiobiology of glottic T1 squamous
cell carcinoma. Int J Radiation Oncology Biol Phys. 1999;
5.
M, Sasiadek M. Studies of the cell cycle regulatory protei-
Hassan KA, El-Naggar AK, Soria JC, Liu D, Hong WK, Mao
ns (P16, cyclin D1 and retinoblastoma protein) in larynge-
squmous cell carcinoma of the tongue. Clin Cancer Res.
randina G. Cyclin D1 gene amplification in human laryn-
Kushner J, Bradley G, Young B, Jordan RC. Aberrant ex-
geal squmous cell carcinomas: prognostic significance and
ma. J Oral Pathol Med. 1999; 28: 77-81.
Kao GK, McKenna G. Cyclin B1 availability is a rate-limiting component of the radiation-induced G2 delay in HeLa
cells. Cancer Res. 1997; 57: 753-758.
8.
clinical implications. Clin Cancer Res. 1996; 2: 175-180.
13. Martin J, Balkenender A. Cyclin D1 overexpression enhances radiaton induced apoptosis and radiosensitivity in
a breast tumor cell line. Cancer Res. 1999; 59: 1134-1140.
14. Milas L, Akimoto T, Hunter NR, Mason KA, Buchmiller L,
Ying X-Y, Grove L, Datta NS. Inverse regulation of cyclin
Yamakawa M, i wsp. Relationship between cyclin D1 ex-
B1 by c-myc and p53 and induction of tetraploidy by cyc-
pression and poor radioresponse of murine carcinomas.
lin B1 overexpression. Cancer Res. 2001; 6: 6487-6493.
9.
al carcinoma tissue. J Laryng Otol 2004; 118; 676-680.
12. Bellacosa A, Almadori G, Cavallo S, Cadoni G, Galli J, Fer-
2001; 7: 2458-2462.
pression of cyclin A and cyclin B1 proteins in oral carcino7.
497-502.
11. Krecicki T, Smigiel R, Kaczmarz M, Fraczek M, Kowalczyk
43: 101-106.
L. Clinical significance of cyclin B1 protein expression in
6.
and neck. Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 1997; 125:
Int J Radiation Oncology Biol Phys. 2002; 52: 514-521.
Illidge TM, Cragg MS, Fringes B, Olive P, Erenpreisa JA.
15. Martin J, Balkenender A. Cyclin D1 overexpression en-
Polyploid giant cells provide a survival mechanism for p53
hances radiaton-induced apoptosis and radiosensitivity in
mutant cells after DNA damage. Cell Biol Internat. 2000;
24: :621-633.
a breast tumor cell line. Cancer Res. 1999; 59: 1134-1140.
16. Milas L, Akimoto T, Hunter NR, Mason KA, Buchmiller L,
10. Michalides RJ, van Veelen NM, Kristel PM, Hart AA, Loftus
Yamakawa M, i wsp. Relationship between cyclin D1 ex-
BM, Hilgers FJ I in.. Overexpression of cyclin D1 indicates
pression and poor radioresponse of murine carcinomas.
of poor prognosis in squmous cell carcinoma of the head
Int J Radiation Oncology Biol Phys. 2002; 52: 514-521.
Otolar yngologia Polska tom 63, nr 2, mar zec – k wiecień 20 0 9