COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® CMV Test

COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan®
CMV Test
DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO.
COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan®
CMV Test
®
®
®
COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan
Wash Reagent
CMVCAP
72 Tests
P/N: 04902068 190
PG WR
5.1 Liters
P/N: 03587797 190
ZASTOSOWANIE
Test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® CMV jest testem in vitro opartym na amplifikacji kwasu
nukleinowego, służącym do ilościowego oznaczania DNA wirusa cytomegalii w ludzkim osoczu z EDTA,
®
wykorzystującym aparat COBAS AmpliPrep do automatycznego przetwarzania próbek oraz
analizator COBAS® TaqMan® lub COBAS® TaqMan® 48 do automatycznej amplifikacji i detekcji. Za
pomocą testu można dokonywać oceny ilościowej DNA CMV w zakresie stężenia 150–10 000 000
kopii/ml. Jedna kopia DNA CMV (określonego na podstawie testu COBAS® AmpliPrep/COBAS®
TaqMan® CMV) odpowiada 0,91 jednostki międzynarodowej (IU) [1,1 kp/IU] według pierwszego
międzynarodowego standardu WHO dla ludzkiego wirusa cytomegalii dla technologii opartych na
amplifikacji kwasów nukleinowych (NIBSC 09/162)40.
Test ten, łącznie z objawami klinicznymi i innymi markerami laboratoryjnymi, znajduje zastosowanie
w diagnozie i leczeniu zakażenia CMV u pacjentów, u których CMV stanowi zagrożenie.
®
®
®
Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV nie jest przeznaczony do przesiewowego badania
na obecność wirusa CMV we krwi lub produktach krwiopochodnych ani do stosowania jako test
diagnostyczny potwierdzający zakażenie wirusem CMV. Wyniki uzyskane za pomocą testu COBAS®
®
®
AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV należy interpretować w kontekście wszystkich istotnych objawów
klinicznych oraz wyników badań laboratoryjnych.
PODSUMOWANIE I OBJAŚNIENIE TESTU
Ludzki wirus cytomegalii (HCMV lub CMV) jest patogenem należącym do rodziny wirusów Herpes,
a jego obecność stwierdzono zarówno w społeczeństwach uprzemysłowionych, jak i w izolowanych
grupach plemiennych1,2. Może być przenoszony przez krew, wydzielinę z górnych dróg oddechowych,
mocz, wydzielinę szyjkową i pochwową, płyn nasienny, mleko, łzy oraz kał3–9. Pierwotne zakażenia
CMV u osób z prawidłową odpornością występują zazwyczaj bezobjawowo i często prowadzą do
niewykrytych utajonych zakażeń. Najczęstszymi miejscami zakażenia są komórki jednojądrzaste krwi
obwodowej oraz komórki śródbłonka naczyniowego. U człowieka CMV pozostaje w stanie utajonym
w monocytach/makrofagach2. Osoby z zakażeniem utajonym mogą okresowo wydzielać wirusa do
płynów ustrojowych i w ten sposób zarażać innych. Osoby z obniżoną odpornością, w tym
niemowlęta, pacjenci po przeszczepach oraz pacjenci z AIDS, należą do grupy wysokiego ryzyka
wystąpienia ciężkiego zakażenia CMV, które może prowadzić do podwyższonej zachorowalności
i śmiertelności10. Do poważnych objawów klinicznych choroby wywołanej przez CMV należą: zespół
CMV, zapalenie siatkówki, nieżyt żołądkowo-jelitowy, zapalenie wątroby, zapalenie mózgu, zapalenie
przełyku, zapalenie jelit, zapalenie trzustki oraz zapalenie płuc1–13.
Do metod laboratoryjnych stosowanych w diagnostyce rozsianego zakażenia oraz aktywnej choroby
narządu docelowego spowodowanej przez ludzki wirus cytomegalii należą: wyizolowanie wirusa
metodą hodowli z leukocytów krwi obwodowej (ang. peripheral blood leukocytes, PBL), badanie
histologiczne bioptatów, metody serologiczne, pomiar antygenu pp65 oraz detekcję DNA CMV przy
użyciu łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR)14. Metody oceny hodowli mają małą wartość
predykcyjną; wymagają od 48 godzin do 3 tygodni, a ich zastosowanie ograniczone jest do pacjentów
z upośledzoną odpornością. Ocena poziomu antygenu pp65 jest pracochłonna i wymaga
opracowania próbki krwi w ciągu sześciu godzin od jej pobrania, ponieważ przechowywanie próbki
powoduje spadek poziomu antygenu15,22. Ocena pp65 jest również trudna do przeprowadzenia
u pacjentów z ciężką neutropenią.
Część Informacje na temat wersji dokumentu znajduje się na końcu tego dokumentu.
04898362049-02PL
1
Doc Rev. 2.0
Wykazano, że dodatnie wyniki DNA CMV w osoczu uzyskane przy użyciu metody PCR dobrze
korelują z dodatnim wynikiem w hodowli PBL oraz ze zwiększonym ryzykiem rozwoju systemowej
choroby cytomegalowirusowej (CMV). Wiele badań wykazuje związek między wiremią CMV
16–19
.
a ryzykiem wystąpienia choroby spowodowanej przez wirusa CMV
Ryzyko choroby wywołanej przez CMV można w prosty sposób zdefiniować jako znacznego stopnia
wiremię, co wskazuje na ważną rolę miana wirusowego w patogenezie choroby18,27,30,31. Badania
przeprowadzone u pacjentów po transplantacji i chorych na AIDS wykazują, że detekcja DNA CMV
przy pomocy PCR ma dużą wartość predykcyjną odnośnie do dalszego rozwoju choroby
i wystąpienia jej objawów17,23–26. Badania ilościowe poziomu DNA CMV wykazały, że znacznego
stopnia wiremia, jak i narastanie wiremii w czasie są uważane za najgorszy czynnik prognostyczny
dla licznych zagrożeń związanych z CMV18,27,28. Ponadto ilościowe badanie metodą PCR pozwala na
monitorowanie efektywności leczenia przeciwwirusowego oraz pośrednio na ocenę oporności
26,29,30,32
.
wirusa
Zaleca się kontrolować wiremię CMV przy ustalaniu bieżących wytycznych terapeutycznych
u pacjentów, u których przeprowadzano przeszczep narządu miąższowego, dla oceny ryzyka
wystąpienia choroby wywoływanej przez CMV i potrzeby leczenia prewencyjnego, jak również
monitorowania odpowiedzi pacjenta z aktywną chorobą wywołaną przez CMV na leczenie21,22.
Zaleca się również taką kontrolę w ramach diagnozowania choroby wywołanej przez CMV
u pacjentów po przeszczepie hematopoetycznych komórek macierzystych33.
ZASADY PROCEDURY
Test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® CMV jest testem amplifikacji kwasu nukleinowego
służącym do ilościowego oznaczania DNA wirusa cytomegalii (CMV) w ludzkim osoczu. Test
COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® CMV składa się z dwóch głównych etapów:
(1) przygotowania próbki w celu wyizolowania DNA CMV oraz (2) jednoczesnej amplifikacji PCR
docelowego DNA i detekcji rozszczepionej, podwójnie znakowanej sondy oligonukleotydowej
swoistej dla łańcucha docelowego.
®
®
®
Test COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV umożliwia automatyczne przygotowanie próbki,
a następnie automatyczną amplifikację PCR oraz detekcję docelowego DNA CMV i DNA standardu
ilościowego CMV (ang. Quantitation Standard, QS). Odczynnik Master Mix zawiera primery i sondy
swoiste zarówno dla DNA CMV, jak i DNA CMV QS. Detekcji amplifikowanego DNA dokonuje się
przy użyciu swoistych dla sekwencji docelowych oraz swoistych dla standardu QS podwójnie
znakowanych sond oligonukleotydowych, pozwalających na niezależną identyfikację amplikonu CMV
i amplikonu CMV QS.
DNA CMV oznacza się ilościowo za pomocą standardu ilościowego CMV QS. Kompensuje on wpływ
hamowania oraz kontroluje proces przygotowywania i amplifikacji, pozwalając uzyskać dokładniejsze
oznaczenie ilościowe DNA CMV w każdej próbce. Standard ilościowy CMV QS to niezakaźny
konstrukt DNA, zawierający identyczne miejsca wiązania primerów jak docelowy DNA CMV oraz
charakterystyczne miejsce wiązania sondy, umożliwiające odróżnienie amplikonu CMV QS od
amplikonu CMV.
Standard CMV QS jest dodawany do każdej próbki w znanej liczbie kopii i wraz z nią przechodzi
przez kolejne etapy procesu przygotowania oraz jednoczesnej amplifikacji PCR i detekcji
rozszczepionych, podwójnie znakowanych sond oligonukleotydowych. Analizator COBAS® TaqMan®
®
®
lub analizator COBAS TaqMan 48 oblicza stężenie DNA CMV w badanych próbkach przez
porównywanie sygnału CMV z sygnałem standardu CMV QS dla każdej próbki i kontroli.
Wybór sekwencji docelowej
Próbki DNA wirusa CMV oraz DNA standardu CMV QS przygotowuje się przy użyciu techniki wiązania
kwasów nukleinowych na krzemionce, a jako primery w procesie amplifikacji DNA wirusa CMV i DNA
standardu CMV QS wykorzystywane są określone oligonukleotydy. Podwójnie znakowane sondy
oligonukleotydowe swoiste dla sekwencji docelowej oraz swoiste dla standardu QS pozwalają na
niezależną identyfikację amplikonów CMV oraz CMV QS. W teście COBAS® AmpliPrep/COBAS®
TaqMan® CMV stosuje się dwa primery do reakcji PCR. Generująca sygnał, podwójnie znakowana
sonda ulega hybrydyzacji do jednej z dwóch nici i jest rozszczepiana przez polimerazę DNA Z05
podczas wydłużania primerów.
04898362049-02PL
2
Doc Rev. 2.0
Przygotowanie próbki
®
®
®
Próbka do testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV jest przygotowywana automatycznie
w aparacie COBAS® AmpliPrep przy użyciu techniki wiązania kwasów nukleinowych na krzemionce.
W procedurze używana jest objętość 500 µl osocza. Cząsteczki wirusa CMV poddawane są lizie
poprzez inkubację w podwyższonej temperaturze z proteazą i chaotropowym buforem do
lizy/wiążącym, który uwalnia kwasy nukleinowe i chroni uwolniony DNA wirusa CMV przed
znajdującymi się w osoczu cząsteczkami DNazy. Do każdej próbki wraz z odczynnikiem lizującym
i szklanymi cząstkami magnetycznymi wprowadzana jest proteaza oraz znana liczba cząsteczek
DNA standardu CMV QS. Mieszanina poddawana jest następnie inkubacji, a DNA wirusa CMV oraz
DNA standardu CMV QS ulegają związaniu na powierzchni szklanych cząstek magnetycznych.
Substancje niezwiązane, takie jak sole, białka i inne zanieczyszczenia pochodzenia komórkowego,
ulegają usunięciu poprzez przepłukiwanie szklanych cząsteczek magnetycznych. Po oddzieleniu
cząsteczek szkła magnetycznego i zakończeniu procesu przepłukiwania adsorbowane kwasy
nukleinowe ulegają wymywaniu przy użyciu roztworu wodnego w podwyższonej temperaturze. Tak
przygotowana próbka, zawierająca uwolnione DNA wirusa CMV i DNA standardu CMV QS, jest
dodawana do mieszaniny do amplifikacji i umieszczana w analizatorze COBAS® TaqMan® lub
analizatorze COBAS® TaqMan® 48.
Amplifikacja PCR
Reakcję amplifikacji PCR przeprowadza się z użyciem termostabilnego, rekombinowanego enzymu
polimerazy DNA Z05 Thermus specie (Z05). W obecności jonów magnezu (Mg2+) i w odpowiednich
warunkach układu buforowego, Z05 wykazuje aktywność polimerazy DNA34. Umożliwia to prowadzenie
amplifikacji PCR równocześnie z detekcją amplikonu w czasie rzeczywistym.
Przetworzone próbki dodaje się do mieszaniny amplifikacyjnej w probówkach do amplifikacji (K-tube),
gdzie zachodzi amplifikacja PCR. W obecności jonów Mg2+ i nadmiarze trójfosforanów dezoksyrybonukleotydów (dNTP), do których należą trójfosforany dezoksyadenozyny, dezoksyguanozyny,
dezoksycytydyny, dezoksyurydyny i dezoksytymidyny, polimeraza Z05 wydłuża przyłączone
w wyniku hybrydyzacji primery, tworząc nici DNA.
Amplifikacja sekwencji docelowej
®
®
®
®
Zainstalowany w analizatorze COBAS TaqMan lub analizatorze COBAS TaqMan 48 termocykler
podgrzewa mieszaninę reakcyjną w celu denaturacji dwuniciowego DNA i odsłonięcia sekwencji
docelowych swoistych dla primerów. Podczas schładzania mieszaniny primery hybrydyzują do DNA
docelowego. W obecności jonów Mg2+ i nadmiaru trójfosforanów dezoksyrybonukleotydów (dNTP)
Z05 wydłuża przyłączone primery wzdłuż docelowej matrycy, tworząc dwuniciowe cząsteczki DNA,
®
®
®
®
zwane amplikonami. Analizator COBAS TaqMan lub analizator COBAS TaqMan 48
automatycznie powtarza powyższy proces przez określoną liczbę cykli, w każdym z nich zmierzając
do podwojenia ilości amplikonu DNA. Wymagana liczba cykli jest zaprogramowana w analizatorze
COBAS® TaqMan® lub analizatorze COBAS® TaqMan® 48. Amplifikacja następuje tylko w strefie
genomu CMV ograniczonej primerami; nie jest amplifikowany cały genom CMV.
Amplifikacja wybiórcza
W teście COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® CMV amplifikację wybiórczą docelowego kwasu
nukleinowego z próbki osiąga się dzięki zastosowaniu enzymu AmpErase (uracylo-N-glikozylaza)
i trójfosforanu dezoksyurydyny (dUTP). Enzym AmpErase rozpoznaje i katalizuje niszczenie nici DNA
zawierających dezoksyurydynę35, lecz nie DNA zawierającego dezoksytymidynę. W DNA
występującym w naturze nie ma dezoksyurydyny, natomiast jest ona zawsze obecna w amplikonie
wskutek zastosowania trójfosforanu dezoksyurydyny jako jednego spośród trójfosforanów
dezoksyrybonukleotydu (dNTP) w odczynniku Master Mix. Dlatego dezoksyurydynę zawiera
wyłącznie amplikon. Dezoksyurydyna warunkuje wrażliwość zanieczyszczającego amplikonu na
rozkład przez enzym AmpErase przed amplifikacją docelowego DNA. Enzym AmpErase niszczy
także wszystkie nieswoiste produkty reakcji powstałe po wstępnej aktywacji odczynnika Master Mix
przez jony magnezu. Enzym AmpErase zawarty w odczynniku Master Mix katalizuje rozkład DNA
zawierającego dezoksyurydynę w miejscu reszt dezoksyurydynowych przez otwarcie łańcucha
dezoksyrybozy w pozycji C1. Podczas ogrzewania w pierwszym cyklu termicznym łańcuch amplikonu
DNA pęka w miejscu, gdzie znajduje się dezoksyurydyna, w ten sposób wykluczając dalszą
amplifikację DNA. Gdy enzym AmpErase zostanie wystawiony na działanie temperatury powyżej
55°C, tj. w czasie trwania całego cyklu termicznego, ulega inaktywacji i dlatego nie niszczy
docelowego amplikonu utworzonego w trakcie amplifikacji.
04898362049-02PL
3
Doc Rev. 2.0
Detekcja produktów reakcji PCR w teście COBAS® TaqMan®
W teście COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® CMV wykorzystano technologię PCR w czasie
rzeczywistym36,37 (ang. real-time PCR). Zastosowanie sond podwójnie znakowanych barwnikiem
fluorescencyjnym pozwala na detekcję w czasie rzeczywistym gromadzenia się produktu reakcji PCR
przez monitorowanie intensywności emisji fluorescencyjnych barwników reporterowych uwalnianych
w trakcie procesu amplifikacji. Sondy składają się z oligonukleotydów swoistych dla wirusa CMV
i standardu CMV QS znakowanych barwnikiem reporterowym i wygaszaczem. W teście COBAS®
AmpliPrep/COBAS® TaqMan® CMV sondy dla wirusa CMV i standardu CMV QS są oznakowane
różnymi fluorescencyjnymi barwnikami reporterowymi. Gdy sondy są nienaruszone, fluorescencja
barwnika reporterowego jest tłumiona bliskością wygaszacza na zasadzie efektu przenoszenia
energii typu Förstera. Podczas reakcji PCR sonda ulega hybrydyzacji z sekwencją docelową,
a następnie rozszczepieniu pod wpływem posiadanej przez termostabilną polimerazę DNA Z05
aktywności 5' → 3' nukleazy. Od chwili uwolnienia i rozdzielenia reportera i wygaszacza nie zachodzi
już zjawisko wygaszania, a aktywność fluorescencyjna barwnika reporterowego nasila się.
Amplifikację DNA wirusa CMV oraz DNA CMV QS mierzy się niezależnie od siebie, wykorzystując
różne długości fal. Proces ten powtarza się przez określoną liczbę cykli, a w każdym cyklu następuje
efektywne zwiększenie intensywności emisji poszczególnych barwników reporterowych, umożliwiając
niezależną identyfikację DNA wirusa CMV oraz DNA CMV QS. Cykl PCR, w którym krzywa wzrostu
rozpoczyna wzrost wykładniczy, jest zależny od ilości materiału startowego na początku reakcji PCR.
Podstawy oceny ilościowej w teście COBAS® TaqMan®
Test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® CMV zapewnia dokładność wyników oznaczeń
ilościowych w bardzo szerokim zakresie dynamiki, ponieważ monitorowanie amplikonu przeprowadza
się w trakcie fazy wykładniczej amplifikacji. Im wyższe jest miano wirusa CMV w badanej próbce, tym
wcześniej fluorescencja barwnika reporterowego sondy CMV wzrasta powyżej wyjściowego poziomu
fluorescencji (patrz rysunek 1). Ponieważ ilość DNA standardu CMV QS jest stała we wszystkich
próbkach, fluorescencja barwnika reporterowego sondy CMV QS powinna pojawiać się w każdej
próbce po podobnej liczbie cykli (patrz rysunek 2). W próbkach, w których fluorescencja standardu
QS jest nieprawidłowa, stężenie jest poddawane odpowiedniej modyfikacji. Pojawienie się swoistych
sygnałów fluorescencyjnych jest rejestrowane jako krytyczna wartość progowa (Ct). Wartość Ct
definiuje się jako liczbę cykli, po której fluorescencja barwnika reporterowego przekracza ustaloną
wcześniej wartość progową (ustalony poziom fluorescencji) i zapoczątkowuje fazę wykładniczego
wzrostu siły sygnału (patrz rysunek 3). Większa wartość Ct wskazuje na niższe miano początkowe
docelowych sekwencji CMV. Uogólniając, 2-krotny wzrost miana koreluje ze zmniejszeniem wartości
Ct docelowego DNA wirusa CMV o 1, natomiast 10-krotny wzrost miana koreluje ze zmniejszeniem
Ct o 3,3.
Rysunek 1 przedstawia przykładowe krzywe wzrostu dla sekwencji docelowej w serii rozcieńczeń,
obejmującej przedział 5-krotnej wartości log10. W miarę wzrostu stężenia wirusów krzywe wzrostu
przesuwają się w kierunku wcześniejszych cykli. Zatem krzywa wzrostu leżąca najdalej na lewo
odzwierciedla najwyższy poziom miana wirusa, a krzywa wzrostu leżąca najdalej na prawo oznacza
najniższy poziom miana wirusa.
04898362049-02PL
4
Doc Rev. 2.0
Normalizowana fluorescencja
Rysunek 1
Krzywe wzrostu dla sekwencji docelowej w serii rozcieńczeń wirusa
obejmującej zakres 5-krotnej wartości log10
Miano najwyższe
Miano najniższe
Liczba cykli
Rysunek 2 przedstawia przykładowe krzywe wzrostu dla standardu Quantitation Standard
w próbkach z serią rozcieńczeń wirusa obejmującą zakres 5-krotnej wartości log10. Ilość dodanego
do każdej próbki preparatu Quantitation Standard jest stała dla każdej reakcji. Wartość Ct dla
preparatu Quantitation Standard jest podobna niezależnie od miana wirusa.
Normalizowana fluorescencja
Rysunek 2
Krzywe wzrostu dla standardu ilościowego w serii rozcieńczeń wirusa
obejmującej zakres 5-krotnej wartości log10
Miano najniższe
Miano najwyższe
Liczba cykli
04898362049-02PL
5
Doc Rev. 2.0
Rysunek 3 przedstawia na przykładzie, w jaki sposób wartości fluorescencji w każdym cyklu są
normalizowane dla każdej krzywej wzrostu. Liczbę cykli cząstkowych (Ct) oblicza się w chwili, gdy
sygnał fluorescencyjny przekracza ustalony poziom fluorescencji.
Normalizowana fluorescencja
Rysunek 3
Wartości fluorescencji w każdym cyklu są normalizowane dla każdej krzywej wzrostu
Ustalony poziom fluorescencji
Wartość Ct = 27,3
Liczba cykli
Ocena ilościowa DNA CMV
Test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® CMV służy do ilościowego oznaczania stężenia DNA
wirusa CMV z wykorzystaniem drugiej sekwencji docelowej (preparat CMV Quantitation Standard),
którą w znanym stężeniu dodaje się do każdej próbki testowej. Standard CMV QS jest niezakaźnym
konstruktem DNA zawierającym fragmenty sekwencji wirusa CMV z obszarami wiązania primerów,
które są identyczne z obszarami wiązania na docelowej sekwencji wirusa CMV. Standard CMV QS
zawiera miejsca wiązania primerów CMV i daje produkt amplifikacji o takiej samej długości i składzie
zasad jak w docelowym DNA wirusa CMV. Obszar wiązania sondy detekcyjnej w obrębie CMV QS
został zmodyfikowany, aby umożliwić odróżnienie amplikonu CMV QS od amplikonu docelowego
CMV.
Podczas fazy hybrydyzacji reakcji PCR w analizatorze COBAS® TaqMan® lub analizatorze COBAS®
TaqMan® 48 próbki zostają oświetlone i wzbudzone światłem przefiltrowanym, a następnie rejestruje
się wyniki emisji przefiltrowanej fluorescencji każdej próbki. Odczyty dotyczące poszczególnych
próbek poddaje się korekcji w celu wyeliminowania zmienności wywołanej działaniem instrumentów.
Aparat wprowadza odczyty fluorescencji do programu AMPLILINK i zapisuje w bazie danych. Stosuje
się metodę odczytów wstępnych do określenia, czy DNA wirusa CMV oraz DNA standardu CMV QS
reprezentują zestawy, które można uznać za ważne; w sytuacji, gdy dane nie mieszczą się
w ustalonych granicach, generowane są odpowiednie oflagowania. Po ukończeniu i pomyślnej
ocenie wszystkich odczytów wstępnych odczyty fluorescencji są następnie przetwarzane w celu
obliczenia wartości Ct dla DNA wirusa CMV i DNA standardu CMV QS. Tablica swoistych dla danej
serii stałych kalibracji dołączona do testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® CMV służy do
obliczania wartości miana próbek i kontroli na podstawie wartości Ct DNA wirusa CMV oraz DNA
standardu CMV QS. Wyniki oznaczenia miana podaje się jako liczbę kopii/ml (kp/ml).
04898362049-02PL
6
Doc Rev. 2.0
ODCZYNNIKI
®
®
®
COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test
(P/N: 04902068 190)
CMVCAP
72 testy
CMV CS1
(Kaseta odczynnikowa z cząsteczkami magnetycznymi)
Szklane cząsteczki magnetyczne
Bufor Tris-base
0,09% azydku sodu
0,1% metyloparaben
1 x 72 testy
CMV CS2
(Kaseta z odczynnikiem lizującym do oznaczeń CMV)
Cytrynian sodu dwuwodny
42,5% tiocyjanian guanidyny
3,6% polidokanol
1,8% ditiotreitol
Xn
42,5% (wagowo) tiocyjanian guanidyny
1 x 72 testy
Produkt szkodliwy
R20/21/22, R52/53, R32: Działa szkodliwie przez drogi oddechowe,
w kontakcie ze skórą i po połknięciu. Działa szkodliwie na organizmy
wodne; może powodować długo utrzymujące się niekorzystne zmiany
w środowisku wodnym. W kontakcie z kwasami uwalnia bardzo
toksyczne gazy.
S24/25, S36/37/39, S61: Unikać zanieczyszczenia skóry i oczu. Nosić
odpowiednią odzież ochronną, odpowiednie rękawice ochronne i okulary
lub ochronę twarzy. Unikać zrzutów do środowiska. Postępować
zgodnie z instrukcją lub kartą charakterystyki.
CMV CS3
Kaseta wieloodczynnikowa do oznaczeń CMV, zawierająca:
Pase
(Roztwór proteinazy)
Bufor Tris
< 0,05% EDTA
Chlorek wapnia
Octan wapnia
≤ 7,8% proteinaza
Glicerol
Xn
≤ 7,8% (wagowo) proteinaza
1 x 72 testy
1 x 3,8 ml
Produkt szkodliwy
R36, R42: Działa drażniąco na oczy. Może powodować uczulenie
w następstwie narażenia drogą oddechową.
S23, S45: Nie wdychać pary. W przypadku awarii lub jeżeli źle się
poczujesz, niezwłocznie zasięgnij porady lekarza — jeżeli to możliwe,
pokaż etykietę.
04898362049-02PL
7
Doc Rev. 2.0
EB
(Bufor do elucji)
Bufor Tris-base
Wodorotlenek sodu
0,09% azydku sodu
1 x 8,1 ml
CMV CS4
Kaseta odczynników swoistych dla testu do oznaczeń CMV zawierająca:
1 x 72 testy
CMV QS
(Standard ilościowy CMV)
Bufor Tris-HCl
EDTA
< 0,005% Poly rA RNA (syntetyczny)
< 0,001% niezakaźny plazmid DNA (bakteryjny) zawierający sekwencje
CMV wiążące primery i unikalny region wiążący sondę
0,05% azydku sodu
1 x 6,2 ml
CMV MMX
(Odczynnik CMV Master Mix)
Bufor Tricine
Octan potasu
Wodorotlenek potasu
< 20% dimetylosulfotlenek
Glicerol
< 0,05% dATP, dCTP, dGTP, dUTP, dTTP
< 0,01% primery sensowne i antysensowne CMV
< 0,01% aptamer oligonukleotydowy
< 0,01% znakowane barwnikami fluorescencyjnymi sondy
oligonukleotydowe swoiste dla CMV oraz standardu oznaczenia CMV
Quantitation Standard
< 0,05% polimeraza DNA Z05 (bakteryjna)
< 0,1% enzymu AmpErase (uracylo-N-glikozylazy) (bakteryjnej)
0,09% azydku sodu
1 x 3,2 ml
MgCl2
(Roztwór magnezu CAP/CTM)
< 0,6% chlorku magnezu
0,09% azydku sodu
1 x 9,8 ml
CMV H(+)C
(Kontrola CMV wysoko dodatnia)
< 0,001% fag lambda zawierający DNA wirusa CMV
Osocze ludzkie niereaktywne w testach licencjonowanych przez US FDA
w zakresie przeciwciał przeciwko HCV, przeciwciał przeciwko HIV-1/2
i antygenu HIV p24 lub RNA HIV-1, HBsAg; DNA wirusa CMV
niewykrywalne przy użyciu metod PCR
6 x 0,65 ml
0,1% substancja konserwująca ProClin® 300
Xi
mieszanina 5-chloro-2-metylo-2H-izotiazolo-3-onu
i 2-metylo-2H-izotiazolo-3-onu (3 : 1)
Produkt drażniący
S24, S37: Unikać zanieczyszczenia skóry. Nosić odpowiednie rękawice ochronne.
R43: Może powodować uczulenie w kontakcie ze skórą.
04898362049-02PL
8
Doc Rev. 2.0
CMV L(+)C
(Kontrola CMV nisko dodatnia)
< 0,001% fag lambda zawierający DNA wirusa CMV w średnim stężeniu około
100 razy mniejszym niż średnie stężenie DNA wirusa CMV w CMV H(+)C
Osocze ludzkie niereaktywne w testach licencjonowanych przez US FDA
w zakresie przeciwciał przeciwko HCV, przeciwciał przeciwko HIV-1/2
i antygenu HIV p24 lub RNA HIV-1, HBsAg; DNA wirusa CMV
niewykrywalne przy użyciu metod PCR
6 x 0,65 ml
®
0,1% substancja konserwująca ProClin 300
Xi
mieszanina 5-chloro-2-metylo-2H-izotiazolo-3-onu
i 2-metylo-2H-izotiazolo-3-onu (3 : 1)
Produkt drażniący
S24, S37: Unikać zanieczyszczenia skóry. Nosić odpowiednie rękawice ochronne.
R43: Może powodować uczulenie w kontakcie ze skórą.
CMV (–) C
(Kontrola ujemna CMV)
Osocze ludzkie niereaktywne w testach licencjonowanych przez US FDA
w zakresie przeciwciał przeciwko HCV, przeciwciał przeciwko HIV-1/2
i antygenu HIV p24 lub RNA HIV-1, HBsAg; DNA wirusa CMV
niewykrywalne przy użyciu metod PCR
6 x 0,65 ml
0,1% substancja konserwująca ProClin® 300
Xi
mieszanina 5-chloro-2-metylo-2H-izotiazolo-3-onu
i 2-metylo-2H-izotiazolo-3-onu (3 : 1)
Produkt drażniący
S24, S37: Unikać zanieczyszczenia skóry. Nosić odpowiednie rękawice ochronne.
R43: Może powodować uczulenie w kontakcie ze skórą.
CMV H(+)C Clip
(Klips z kodem kreskowym dla kontroli CMV wysoko dodatniej)
1 x 6 klipsów
CMV L(+)C Clip
(Klips z kodem kreskowym dla kontroli CMV nisko dodatniej)
1 x 6 klipsów
CMV (–) C Clip
(Klips z kodem kreskowym dla kontroli ujemnej CMV)
1 x 6 klipsów
COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® Wash Reagent
Odczynnik płuczący COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan®
(P/N: 03587797 190)
PG WR
1 x 5,1 l
PG WR
(Odczynnik płuczący COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan®)
Cytrynian sodu dwuwodny
< 0,1% N-metyloizotiazolon-HCl
04898362049-02PL
9
Doc Rev. 2.0
OSTRZEŻENIA I ŚRODKI OSTROŻNOŚCI
A.
DO STOSOWANIA W DIAGNOSTYCE IN VITRO.
B.
Test jest przeznaczony do stosowania z osoczem ludzkim pobranym na antykoagulant EDTA.
C.
Nie należy pipetować za pomocą ust.
D.
Nie jeść, nie pić ani nie palić w obszarach roboczych laboratorium. Posługując się próbkami
i odczynnikami z zestawów, należy stosować jednorazowe rękawice, fartuchy laboratoryjne
oraz odpowiednią ochronę oczu. Dokładnie umyć ręce po pracy z próbkami i odczynnikami
testowymi.
E.
Przy pobieraniu materiału z fiolek kontroli unikać skażenia odczynników bakteriami lub
nukleazą.
F.
Zaleca się używanie jałowych
niezawierających DNazy.
jednorazowych
pipet
oraz
końcówek
pipet
G.
Nie mieszać kontroli pochodzących z różnych serii lub różnych fiolek tej samej serii.
H.
Nie mieszać ze sobą kaset odczynników lub kontroli pochodzących z różnych zestawów.
I.
®
Nie otwierać kaset COBAS AmpliPrep; nie wymieniać, nie mieszać, nie usuwać ani nie
dodawać butelek do kasety.
J.
Wyrzucić wszystkie niezużyte odczynniki, odpady i próbki, postępując zgodnie z przepisami
krajowymi, federalnymi, stanowymi i lokalnymi.
K.
Nie używać zestawu po upływie daty ważności.
L.
Karty charakterystyki substancji niebezpiecznych (MSDS, ang. Material Safety Data Sheet) są
dostępne na żądanie w miejscowym przedstawicielstwie firmy Roche.
M.
Z próbkami oraz kontrolami należy obchodzić się jak z materiałem zakaźnym, stosując
bezpieczne procedury laboratoryjne przedstawione w Biosafety in Microbiological and
38
oraz w CLSI Document M29-A339. Dokładnie wyczyścić
Biomedical Laboratories
i zdezynfekować wszystkie powierzchnie robocze świeżo przygotowanym 0,5-procentowym
roztworem podchlorynu sodowego w wodzie dejonizowanej lub destylowanej.
Uwaga: Dostępny w handlu płynny domowy wybielacz zazwyczaj zawiera podchloryn
sodu w stężeniu 5,25%. Rozcieńczenie domowego wybielacza w stosunku
1:10 pozwoli uzyskać roztwór 0,5% podchlorynu sodu.
N.
UWAGA: Odczynniki CMV (–) C, CMV L(+)C i CMV H(+)C zawierają ludzkie osocze
otrzymane z krwi ludzkiej. Materiał źródłowy został przebadany i uznany za niereaktywny pod
względem obecności antygenu powierzchniowego wirusa zapalenia wątroby typu B (HBsAg),
przeciwciał przeciwko HIV-1/2 oraz HCV, a także antygenu HIV p24 lub RNA HIV-1.
Testowanie ujemnego osocza ludzkiego metodą PCR nie wykazało obecności DNA wirusa
CMV. Nie ma znanych metod testowych mogących zapewnić całkowitą pewność, że produkty
pochodzące z krwi ludzkiej nie przenoszą czynników zakaźnych. Dlatego każdy materiał
pochodzenia ludzkiego należy traktować jako potencjalnie zakaźny. Z odczynnikami
CMV (–) C, CMV L(+)C i CMV H(+)C należy obchodzić się jak z materiałem zakaźnym,
stosując bezpieczne procedury laboratoryjne przedstawione w Biosafety in Microbiological and
Biomedical Laboratories38 oraz w CLSI Document M29-A339. Dokładnie wyczyścić
i zdezynfekować wszystkie powierzchnie robocze świeżo przygotowanym 0,5% roztworem
podchlorynu sodowego w wodzie dejonizowanej lub destylowanej.
O.
Odczynniki MGP, EB, CMV QS, MgCl2 i CMV MMX zawierają azydek sodu. Azydek sodu
może reagować z instalacjami wodno-kanalizacyjnymi wykonanymi z ołowiu lub miedzi,
tworząc silnie wybuchowe azydki metali. Usuwając roztwory zawierające azydek sodu do
zlewów laboratoryjnych, należy spłukać je dużą ilością wody, aby zapobiec nagromadzeniu
azydków.
P.
Podczas pracy z jakimkolwiek odczynnikiem należy używać osłon na oczy oraz fartuchów
laboratoryjnych i rękawic jednorazowych. Należy unikać kontaktu wymienionych materiałów ze
skórą, oczami i błonami śluzowymi. Jeżeli dojdzie do kontaktu, trzeba natychmiast spłukać
dużą ilością wody. Jeżeli nie zostaną podjęte odpowiednie środki, może dojść do oparzeń.
W razie rozlania wspomnianych odczynników należy przed wytarciem plam rozcieńczyć je
wodą.
04898362049-02PL
10
Doc Rev. 2.0
Q.
Nie dopuszczać do kontaktu CMV CS2 i odpadów płynnych z aparatu COBAS® AmpliPrep
zawierających tiocyjanian guanidyny z roztworem podchlorynu sodu (wybielaczem). Takie
mieszaniny mogą spowodować powstanie silnie toksycznego gazu.
R.
Podczas utylizacji zużytych zestawów do przetwarzania próbek COBAS® AmpliPrep Sample
Processing Units (SPU) zawierających tiocyjanian guanidyny należy unikać ich kontaktu
z roztworem podchlorynu sodu (wybielaczem). Takie mieszaniny mogą spowodować
powstanie silnie toksycznego gazu.
WYMAGANIA DOTYCZĄCE PRZECHOWYWANIA I UŻYTKOWANIA
A.
Nie zamrażać odczynników ani kontroli.
B.
Odczynniki CMV CS1, CMV CS2, CMV CS3 i CMV CS4 należy przechowywać
w temperaturze od 2 do 8°C. Odczynniki te, jeśli są nieużywane, są stabilne aż do upływu
podanej daty ważności. Po otwarciu odczynniki zachowują stabilność przez 70 dni
w temperaturze od 2 do 8°C lub do upływu daty ważności, zależnie od tego, co nastąpi
wcześniej. Odczynniki CMV CS1, CMV CS2, CMV CS3 i CMV CS4 mogą być stosowane
przez maksymalnie 6 cykli pracy urządzenia, łącznie przez okres do 100 godzin pracy
®
w aparacie COBAS AmpliPrep. Pomiędzy kolejnymi cyklami pracy odczynniki należy
przechowywać w temperaturze 2–8°C.
C.
Odczynniki CMV H(+)C, CMV L(+)C i CMV (–) C należy przechowywać w temperaturze od 2 do
8°C. Kontrole są stabilne aż do upływu podanej daty ważności. Po otwarciu niewykorzystane
do badania odczynniki należy wyrzucić.
D.
Klipsy z kodem kreskowym [CMV H(+)C Clip, CMV L(+)C Clip i CMV (–) C Clip] należy
przechowywać w temperaturze 2–30°C.
E.
Odczynnik PG WR przechowywać w temperaturze 2–30°C. Odczynnik PG WR zachowuje
stabilność do upływu podanej daty ważności. Po otwarciu odczynnik zachowuje stabilność
przez 28 dni w temperaturze 2–30°C lub do upływu daty ważności, zależnie od tego, co
nastąpi wcześniej.
DOSTARCZONE MATERIAŁY
A.
®
®
®
COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV Test
(P/N: 04902068 190)
CMVCAP
CMV CS1
(Kaseta zawierająca szklane cząsteczki magnetyczne do oznaczeń CMV)
CMV CS2
(Kaseta z odczynnikiem lizującym do oznaczeń CMV)
CMV CS3
(Kaseta wieloodczynnikowa do oznaczeń CMV)
CMV CS4
(Kaseta odczynników swoistych dla testu do oznaczeń CMV)
CMV H(+)C
(Kontrola CMV wysoko dodatnia)
CMV L(+)C
(Kontrola CMV nisko dodatnia)
CMV (–) C
(Kontrola ujemna CMV)
CMV H(+)C Clip
(Klips z kodem kreskowym dla kontroli CMV wysoko dodatniej)
CMV L(+)C Clip
(Klips z kodem kreskowym dla kontroli CMV nisko dodatniej)
04898362049-02PL
11
Doc Rev. 2.0
CMV (–) C Clip
(Klips z kodem kreskowym dla kontroli ujemnej CMV)
B.
COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® Wash Reagent
Odczynnik płuczący COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan®
(P/N: 03587797 190)
PG WR
PG WR
(Odczynnik płuczący COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan®)
MATERIAŁY WYMAGANE, LECZ NIEDOSTARCZANE
Przyrządy i oprogramowanie
•
Aparat COBAS® AmpliPrep
•
Analizator COBAS® TaqMan® lub analizator COBAS® TaqMan® 48
•
Opcjonalnie: stacja dokująca
•
Opcjonalnie: aparat cobas p 630
•
Program AMPLILINK w wersji 3.3 Series
•
Stacja robocza z drukarką do programu AMPLILINK
•
Podręczniki programu AMPLILINK w wersji serii 3.3:
–
Instrukcja obsługi aparatu COBAS® AmpliPrep, współpracującego z
analizatorem COBAS® TaqMan®, analizatorem COBAS® TaqMan® 48 lub
aparatem cobas p 630 i oprogramowaniem AMPLILINK w wersji serii 3.3;
–
Instrukcja obsługi analizatora COBAS® TaqMan® (z opcjonalną stacją dokującą)
do użytku z podręcznikiem programu AMPLILINK w wersji serii 3.3;
–
Instrukcja obsługi analizatora COBAS® TaqMan® 48 do użytku z oprogramowaniem AMPLILINK, podręcznik programu w wersji serii 3.3;
–
Podręcznik programu AMPLILINK w wersji serii 3.3 do użytku z narzędziem
COBAS® AmpliPrep, analizatorem COBAS® TaqMan®, analizatorem COBAS®
TaqMan® 48 oraz analizatorem COBAS® AMPLICOR
–
Podręcznik programu AMPLILINK w wersji serii 3.3 do użytku z aparatem
COBAS® AmpliPrep, analizatorem COBAS® TaqMan®, analizatorem COBAS®
TaqMan® 48 i aparatem cobas p 630.
lub
Materiały jednorazowe
•
•
•
•
Jednostki przetwarzania próbki: SPU
Probówki wejściowe na próbki (ang. S-tube input) z klipsami z kodem kreskowym
Statywy z końcówkami K
Statywy z probówkami K
04898362049-02PL
12
Doc Rev. 2.0
INNE MATERIAŁY WYMAGANE, LECZ NIEDOSTARCZANE
•
•
•
•
•
•
•
Statyw na próbki (statyw SK24)
•
•
Rękawice jednorazowe bezpudrowe
Statyw na odczynnik
Statyw na SPU
Nośnik K
Transporter nośników K
Statyw na nośniki K (wymagany tylko do analizatora COBAS® TaqMan® 48)
Pipetory z barierą aerozolową lub końcówkami dodatniego wypierania niezawierającymi
DNazy (pojemność 1000 µl)*
Mieszadło wibracyjne
* Dokładność pipetorów musi mieścić się w zakresie 3% podanej objętości. Tam gdzie jest to
wymagane, należy używać pozbawionych DNazy końcówek z barierą aerozolową lub końcówek
dodatniego wypierania w celu zapobieżenia skażeniu krzyżowemu między próbką i amplikonem.
POBIERANIE, TRANSPORT I PRZECHOWYWANIE PRÓBEK
Uwaga: Ze wszystkimi próbkami i próbami kontrolnymi należy obchodzić się jak
z materiałem potencjalnie zakaźnym.
Uwaga: Ten test został zatwierdzony wyłącznie do badania ludzkiego osocza pobranego jako
antykoagulant. Badanie innych rodzajów próbek może dawać nieprawidłowe wyniki.
A.
Pobieranie próbek
Test COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® CMV jest przeznaczony do stosowania z próbkami
osocza. Krew należy pobierać do jałowych probówek zawierających EDTA (korek lawendowy) jako
antykoagulant, a następnie mieszać zgodnie z zaleceniami producenta probówki.
B.
Transport próbek
Krew pełną należy przechowywać w temperaturze 2–25°C nie dłużej niż 6 godzin. Oddzielić osocze
od pełnej krwi w ciągu 6 godzin od pobrania, odwirowując (800–1600 x g przez 20 minut)
w temperaturze pokojowej. Osocze należy przenieść do jałowych probówek polipropylenowych.
Transport pełnej krwi lub osocza musi przebiegać zgodnie z przepisami krajowymi i lokalnymi
dotyczącymi transportu czynników zakaźnych41. Krew pełną należy transportować w temperaturze
2–25°C i odwirować w ciągu 6 godzin od pobrania. Osocze należy transportować w temp. 2–8°C lub
zamrożone w temp. ≤ –20°C.
C.
Przechowywanie próbek
Próbki osocza można przechowywać w temperaturze 2–8°C do 7 dni. Próbki osocza wykazują
stabilność przez 6 tygodni w stanie zamrożenia w temperaturze ≤ –20°C. Zaleca się przechowywanie
próbek w porcjach o objętości 550–600 µl w sterylnych polipropylenowych probówkach o pojemności
2,0 ml z nakrętką (takich jak Sarstedt 72.694.006). Rysunek 4 przedstawia dane dotyczące
stabilności próbek pochodzące z badań nad przechowywaniem próbek przeprowadzonych z użyciem
testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® CMV.
04898362049-02PL
13
Doc Rev. 2.0
Rysunek 4
Stabilność wirusa CMV w osoczu z dodatkiem EDTA
Log10 miana (kp/ml)
3,50
3,00
2,50
2,00
1,50
1,00
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Próbka
2–8ºC 0 dni
2–8ºC 3 dni
2–8ºC 7 dni
–20ºC 6 tyg.
Próbki osocza można zamrażać i rozmrażać do 3 razy bez znacznej utraty DNA wirusa CMV.
Rysunek 5 przedstawia dane pochodzące z badania dotyczącego zamrażania i rozmrażania
przeprowadzonego z użyciem testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® CMV.
Rysunek 5
Wyniki oznaczania wirusa CMV po zastosowaniu do 3 cykli zamrażania i rozmrażania (Z–R)
próbki (osocze z dodatkiem EDTA)
Log10 miana (kp/ml)
3,50
3,00
2,50
2,00
1,50
1,00
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Próbka
04898362049-02PL
Zamrażanie/rozmrażanie 0 x
Zamrażanie/rozmrażanie 1 x
Zamrażanie/rozmrażanie 2 x
Zamrażanie/rozmrażanie 3 x
14
Doc Rev. 2.0
INSTRUKCJA UŻYTKOWANIA
Uwaga: Szczegółowe instrukcje obsługi, szczegółowy opis dotyczący możliwych
konfiguracji, drukowania wyników oraz interpretacji oflagowań wyników, komentarze
®
i komunikaty o błędach można znaleźć w (1) instrukcji obsługi aparatu COBAS
AmpliPrep do użytku z analizatorem COBAS® TaqMan®, COBAS® TaqMan® 48 lub
aparatem cobas p 630 i programem AMPLILINK w wersji serii 3.3; (2) instrukcji
obsługi analizatora COBAS® TaqMan® (z opcjonalną stacją dokującą) do użytku
z podręcznikiem programu AMPLILINK w wersji serii 3.3; (3) instrukcji obsługi
analizatora COBAS® TaqMan® 48 do użytku z podręcznikiem programu AMPLILINK w
wersji serii 3.3; (4) podręczniku programu AMPLILINK w wersji serii 3.3 do użytku
z aparatem COBAS® AmpliPrep, analizatorem COBAS® TaqMan®, analizatorem
COBAS® TaqMan® 48 lub podręcznikiem programu AMPLILINK w wersji serii 3.3 do
użytku z aparatem COBAS® AmpliPrep, analizatorem COBAS® TaqMan®, COBAS®
TaqMan® 48 i aparatem cobas p 630.
Wielkość serii
Każdy zestaw zawiera odczynniki wystarczające do 72 testów, które można przeprowadzać
w seriach liczących 12–24 testów. Każda seria musi obejmować co najmniej jedno powtórzenie
kontroli CMV (–) C, CMV L(+)C i CMV H(+)C (patrz rozdział „Kontrola jakości”).
Przebieg pracy
Przebieg pracy analizatora COBAS® TaqMan® lub analizatora COBAS® TaqMan® 48 należy
rozpocząć w ciągu 120 minut od zakończenia przygotowywania próbki i kontroli.
Uwaga: Próbek i kontroli po obróbce nie zamrażać ani nie przechowywać w temperaturze
2–8°C.
Przygotowanie próbki i kontroli
Uwaga: W przypadku stosowania próbek zamrożonych należy je pozostawić w temperaturze
pokojowej do całkowitego rozmrożenia i przed użyciem wymieszać na mieszadle
wibracyjnym przez 3–5 sekund. Kontrole przed użyciem należy wyciągnąć z miejsca
przechowywania o temperaturze 2–8°C i pozostawić do ogrzania do temperatury
pokojowej.
®
Przygotowanie aparatu COBAS AmpliPrep
Część A. Konserwacja i płukanie
A1.
Aparat COBAS® AmpliPrep w trybie oczekiwania (stand by) jest gotowy do pracy.
A2.
Włącz stację roboczą programu AMPLILINK za pomocą przycisku ON. Przygotuj stację
roboczą do pracy w następujący sposób:
a.
Zaloguj się do systemu operacyjnego Windows® XP.
b.
Dwukrotnie kliknij ikonę programu AMPLILINK.
c.
Zaloguj się do programu AMPLILINK, wprowadzając przydzielony identyfikator
użytkownika i hasło.
A3.
Skontroluj stan odczynnika PG WR na ekranie Status i w razie potrzeby wymień go.
A4.
Wykonaj wszystkie czynności konserwacyjne wyszczególnione w zakładce Due. Aparat
COBAS® AmpliPrep automatycznie przepłucze system.
04898362049-02PL
15
Doc Rev. 2.0
Część B. Ładowanie kaset z odczynnikami
Uwaga: Wszystkie kasety odczynników należy wyjąć z miejsca przechowywania
®
o temperaturze 2–8°C, natychmiast załadować do aparatu COBAS AmpliPrep
i pozostawić do ogrzania do temperatury pokojowej wewnątrz aparatu na co
najmniej 30 minut przed rozpoczęciem przygotowywania pierwszej próbki. Nie
dopuszczać do ogrzania się kaset z odczynnikami do temperatury pokojowej poza
aparatem ze względu na możliwość skraplania pary na etykietach z kodem
kreskowym. W przypadku pojawienia się skroplonej pary nie ścierać jej z etykiet
z kodem kreskowym.
B1.
Umieść kasety CMV CS1 w statywie na odczynniki. Umieść kasety CMV CS2, CMV CS3
i CMV CS4 w osobnym statywie na odczynniki.
B2.
Włóż statyw na odczynniki zawierający CMV CS1 na pozycję A w aparacie COBAS®
AmpliPrep.
B3.
Włóż statyw na odczynniki zawierający CMV CS2, CMV CS3 i CMV CS4 na pozycję B, C, D
lub E w aparacie COBAS® AmpliPrep. Dodatkowe informacje przedstawiono w tabeli 1.
Część C. Ładowanie materiałów jednorazowych
Uwaga: Określ liczbę potrzebnych kaset odczynnikowych COBAS® AmpliPrep, zestawów
Sample Processing Units (SPU), probówek wejściowych próbki (S-tube), końcówek
K-tip oraz probówek K-tube. Każda próbka lub kontrola wymaga użycia jednej
jednostki SPU, jednej probówki wejściowej S, jednej końcówki K i jednej probówki K.
Aparat COBAS® AmpliPrep współpracujący z analizatorem COBAS® TaqMan® lub analizatorem
COBAS® TaqMan® 48 charakteryzuje się wieloma możliwościami ustawień przebiegu pracy.
Szczegółowe informacje — patrz tabela 1. W zależności od wybranego ustawienia przebiegu pracy
załaduj odpowiednią liczbę statywów z kasetami odczynników, statywów na próbki z probówkami
wejściowymi S, statywów z jednostkami SPU, statywów z końcówkami K, statywów z probówkami K
oraz nośników K w statywach na nośniki K na odpowiednie pozycje w aparacie COBAS® AmpliPrep
(dodatkowe informacje podano w tabeli 1).
C1.
Umieść jednostki SPU w statywach i załaduj statywy na odpowiednie pozycje J, K lub L
w aparacie COBAS® AmpliPrep.
C2.
W zależności od wybranego ustawienia przebiegu pracy włóż pełne statywy probówek K na
pozycje M, N, O lub P w aparacie COBAS® AmpliPrep.
C3.
Załaduj pełne statywy z końcówkami K na pozycje M, N, O lub P w aparacie COBAS®
AmpliPrep.
C4.
W przypadku wybranego przebiegu pracy nr 3 analizatora COBAS® TaqMan® 48 włóż
nośniki K do statywu na nośniki K w miejsca M, N, O lub P w aparacie COBAS® AmpliPrep.
04898362049-02PL
16
Doc Rev. 2.0
Tabela 1
®
Możliwości ustawień przebiegu pracy aparatu COBAS AmpliPrep
®
z analizatorem COBAS TaqMan® lub analizatorem COBAS® TaqMan® 48
Przebieg pracy
1
2
3
Aparat COBAS®
AmpliPrep plus
stacja dokująca
plus analizator
COBAS®
TaqMan®
Aparat COBAS®
AmpliPrep plus
analizator
COBAS®
TaqMan®
Aparat COBAS®
AmpliPrep plus
analizatory
COBAS®
TaqMan® 48
04898362049-02PL
Sposób przeniesienia
do analizatora
COBAS® TaqMan® lub
analizatora COBAS®
TaqMan® 48
Automatyczne
przenoszenie
nośnika K
Ręczne
przenoszenie
probówek K
w statywach na
próbki do
analizatora COBAS®
TaqMan®
Ręczne
przenoszenie
nośnika K za
pomocą statywów
na nośniki K do
analizatora COBAS®
TaqMan® 48
17
Statywy, zasobniki i materiały
jednorazowe
Probówki K w pełnych
statywach na probówki K
Końcówki K w pełnych
statywach na końcówki K
Probówki wejściowe S
zawierające próbki oraz
kontrole w statywach
na próbki
Jednostki SPU w statywach
na zestawy SPU
Odczynnik CS1 w statywie
na kasety
Odczynniki CS2, CS3, CS4
w statywie na kasety
Probówki K w pełnych
statywach na probówki K
Końcówki K w pełnych
statywach na końcówki K
Probówki wejściowe S
zawierające próbki oraz
kontrole w statywach
na próbki
Jednostki SPU w statywach
na zestawy SPU
Odczynnik CS1 w statywie
na kasety
Odczynniki CS2, CS3, CS4
w statywie na kasety
Po zakończeniu
przetwarzania próbki:
Probówki K w statywach na
próbki (gotowe do
przeniesienia ręcznego)
Probówki K w statywach
na próbki
Końcówki K w pełnych
statywach na końcówki K
Probówki wejściowe S
zawierające próbki oraz
kontrole w statywach
na próbki
Jednostki SPU w statywach
na zestawy SPU
Odczynnik CS1 w statywie
na kasety
Odczynniki CS2, CS3, CS4
w statywie na kasety
Puste nośniki K z kodem
kreskowym w statywie na
nośniki K
Po zakończeniu
przetwarzania próbki:
Probówki K w nośniku K
w statywie na zasobniki
Pozycja
w aparacie
COBAS®
AmpliPrep
M–P
M–P
F–H
J–L
A
B–E
M–P
M–P
F–H
J–L
A
B–E
Jak powyżej
(F–H)
F–H
M–P
F–H
J–L
A
B–E
M–P
Jak powyżej
(M–P)
Doc Rev. 2.0
Część D. Tworzenie zleceń i ładowanie próbek
D1.
Przygotowanie statywów na próbki: Do każdej pozycji statywu na próbki, gdzie zostanie
umieszczony materiał próbki (probówka S-tube), przymocuj klips opatrzony etykietą z kodem
kreskowym. Do każdej pozycji statywu na próbki, gdzie zostanie umieszczony materiał kontroli
(probówka S), przymocuj odpowiedni klips opatrzony etykietą z kodem kreskowym dla danej
kontroli [CMV (–) C, CMV L(+)C oraz CMV H(+)C]. Klipsy z kodami kreskowymi dla kontroli
powinny mieć takie same numery serii, jak numery serii fiolek kontroli w zestawie. Zwróć
uwagę, aby odpowiednie kontrole umieścić na pozycjach z odpowiednim klipsem z kodem
kreskowym kontroli. Na każdej pozycji oznaczonej klipsem z kodem kreskowym umieść jedną
probówkę wejściową S.
D2.
Utwórz zlecenia dla poszczególnych próbek i kontroli przy pomocy programu AMPLILINK
w oknie Orders w zakładce Sample. Wybierz odpowiedni plik definicji testu i zakończ
procedurę poprzez zapisanie.
D3.
W oknie Orders w zakładce Sample Rack przypisz zlecenia dla próbek i kontroli do pozycji
statywów na próbki. Należy wprowadzić numer statywu na próbki dla statywu przygotowanego
w punkcie D1.
D4.
Wydrukuj raport Sample Rack Order, który będzie służyć jako arkusz roboczy.
D5.
Przygotuj statywy na próbki i kontrole w miejscu pracy wyznaczonym do dodawania próbek
i kontroli, jak opisano poniżej. Umieść każdą próbkę i kontrolę [CMV (–) C, CMV L(+)C
i CMV H(+)C] na mieszadle wibracyjnym na 3–5 sekund. Unikaj zanieczyszczenia rękawic
podczas manipulacji próbkami i kontrolami.
D6.
Przenieś 500 µl każdej próbki i kontroli [CMV (–) C, CMV L(+)C oraz CMV H(+)C] do
odpowiedniej, oznaczonej kodem kreskowym probówki wejściowej S-tube za pomocą
mikropipetora z barierą aerozolową lub końcówkami dodatniego wypierania wolnych od
DNazy. Unikaj przenoszenia cząstek stałych i/lub skrzepów fibrynowych z oryginalnej
próbki do probówki wejściowej S. Próbki i kontrole należy przenieść na pozycje probówek
zgodnie z przygotowanym i zapisanym w punkcie D4 arkuszem roboczym. Klipsy z kodami
kreskowymi dla kontroli powinny mieć takie same numery serii, jak numery serii fiolek kontroli
w zestawie. Przypisz odpowiednie kontrole do właściwych pozycji z odpowiednim klipsem
z kodem kreskowym kontroli. Unikaj zanieczyszczenia górnej części probówek S
materiałem próbki lub kontroli.
D7.
W przypadku przebiegów pracy 1 i 2 statywy na próbki wypełnione probówkami wejściowymi S
®
umieść na pozycjach F, G lub H w aparacie COBAS AmpliPrep.
D8.
®
®
W przypadku przebiegu pracy 3 z użyciem analizatora COBAS TaqMan 48 statywy na
próbki z probówkami wejściowymi S oraz probówkami K (po jednej dla każdej z probówek
wejściowych S, umieszczonej w prawym położeniu i sąsiadującej z probówką wejściową)
umieść na pozycjach F, G lub H w aparacie COBAS® AmpliPrep.
Część E. Rozpoczęcie przebiegu pracy aparatu COBAS® AmpliPrep
E1.
Przy użyciu programu AMPLILINK uruchom aparat COBAS® AmpliPrep.
®
Część F. Zakończenie przebiegu pracy aparatu COBAS AmpliPrep i transfer do analizatora
COBAS® TaqMan® lub analizatora COBAS® TaqMan® 48 (dotyczy wyłącznie
ustawienia przebiegu pracy 2 i 3)
F1.
Sprawdź, czy nie pojawiły się oflagowania lub komunikaty o błędzie.
F2.
Usuń z aparatu COBAS® AmpliPrep przetworzone próbki i kontrole znajdujące się
w statywach na próbki (w przypadku analizatora COBAS® TaqMan® bez stacji dokującej) lub
w statywach na nośniki K (w przypadku analizatora COBAS® TaqMan® 48), w zależności od
ustawienia przebiegu pracy (szczegółowe informacje przedstawiono w części G).
04898362049-02PL
18
Doc Rev. 2.0
F3.
Usuń odpady z aparatu COBAS® AmpliPrep.
Uwaga: Przygotowanych próbek i kontroli nie należy wystawiać na działanie światła.
Amplifikacja i detekcja
Konfiguracja analizatora COBAS® TaqMan® lub analizatora COBAS® TaqMan® 48
Przebieg pracy analizatora COBAS® TaqMan® lub analizatora COBAS® TaqMan® 48 należy
rozpocząć w ciągu 120 minut od zakończenia przygotowywania próbki i kontroli.
Uwaga: Próbek i kontroli po obróbce nie zamrażać ani nie przechowywać w temperaturze
2–8°C.
Część G. Ładowanie przetworzonych próbek
G1.
W zależności od wybranej konfiguracji przebiegu pracy aparatu wykonaj odpowiednie
czynności w celu przeniesienia probówek K do analizatora COBAS® TaqMan® lub analizatora
COBAS® TaqMan® 48.
Przebieg pracy 1:
Automatyczne przenoszenie nośnika K przez stację dokującą do
analizatora COBAS® TaqMan®. Interwencja ręczna jest niepotrzebna.
Przebieg pracy 2:
Ręczne przenoszenie probówek K w statywach na próbki do analizatora
COBAS® TaqMan®.
Przebieg pracy 3:
Ręczny transfer nośnika K na statywie do nośników K do analizatora
®
®
COBAS TaqMan 48. Ręczne przenoszenie nośników K do analizatora
COBAS® TaqMan® 48 przy użyciu transportera nośników K.
®
®
®
Część H. Rozpoczęcie przebiegu pracy analizatora COBAS TaqMan lub analizatora COBAS
TaqMan® 48
H1.
Uruchom analizator COBAS® TaqMan® lub analizator COBAS® TaqMan® 48 przy użyciu
jednej z poniższych opcji, zależnie od wybranych konfiguracji przebiegu pracy.
Przebieg pracy 1:
Nie ma potrzeby przeprowadzania żadnych operacji.
Przebieg pracy 2:
Automatyczny start pracy analizatora COBAS® TaqMan® po załadowaniu
statywów na próbki.
Przebieg pracy 3:
Jeśli w nośniku K jest mniej niż 6 probówek K, wypełnij nośnik pustymi
probówkami K. Wypełnianiem steruje oprogramowanie AMPLILINK.
Otwórz pokrywę termocyklera, załaduj nośnik K i zamknij pokrywę.
Rozpocznij przebieg pracy analizatora COBAS® TaqMan® 48.
Część I. Zakończenie przebiegu pracy analizatora COBAS® TaqMan® lub analizatora COBAS®
TaqMan® 48
I1.
Po zakończeniu cyklu pracy analizatora COBAS® TaqMan® lub analizatora COBAS® TaqMan®
48 wydrukuj raport wyników. Sprawdź, czy w raporcie wyników nie pojawiły się oznaczenia lub
komunikaty o błędzie. Próbki oflagowane i opatrzone komentarzami należy interpretować
zgodnie z opisem w części „Wyniki”. Po zatwierdzeniu dane ulegają archiwizacji.
I2.
Usuń zużyte probówki K z analizatora COBAS® TaqMan® lub analizatora COBAS®
TaqMan® 48.
04898362049-02PL
19
Doc Rev. 2.0
WYNIKI
®
®
®
®
Analizatory COBAS TaqMan i COBAS TaqMan 48 automatycznie oznaczają stężenie DNA CMV
w próbkach i kontrolach. Stężenie DNA wirusa CMV jest wyrażane w kopiach (kp)/ml.
Współczynnik przeliczania między liczbą kopii DNA CMV w mililitrze (określonego na
podstawie testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® CMV) i jednostką międzynarodową
(IU)/ml wynosi 1,1 kp/IU [0,91 IU/kp] według pierwszego międzynarodowego standardu WHO
dla ludzkiego wirusa cytomegalii dla technologii opartych na amplifikacji kwasów
nukleinowych (NIBSC 09/162)40. Wspomniany współczynnik przeliczania pomiędzy „liczbą kopii”
a „IU” może się różnić w innych testach w kierunku DNA CMV.
Oprogramowanie AMPLILINK:
•
Określa wartość progową ilości cykli (Ct) dla DNA wirusa CMV oraz DNA standardu
CMV QS.
•
Określa stężenie DNA wirusa CMV na podstawie wartości Ct dla DNA wirusa CMV
i DNA standardu CMV QS oraz swoistych dla danej serii współczynników kalibracji
zapisanych w kodach kreskowych kasety.
•
Określa, czy obliczone i wyrażone w kp/ml wartości dla kontroli CMV L(+)C oraz
CMV H(+)C mieszczą się w określonych zakresach.
Walidacja przebiegu pracy — program AMPLILINK w wersji serii 3.3
Sprawdź okno wyników programu AMPLILINK lub wydruk w poszukiwaniu oflagowań i komentarzy,
aby się upewnić, że dana seria badań jest ważna. W przypadku zleceń dla próbek kontroli
przeprowadzana jest kontrola w celu określenia, czy wartość podana w kopiach/ml mieści się
w określonym przedziale. Jeśli wartość podana w kopiach/ml dla próbki kontroli nie mieści się
w odpowiednim zakresie, generowany jest ZNACZNIK sygnalizujący błąd kontroli.
Seria testowa jest uważana za ważną, jeśli żadna z kontroli [CMV (–) C, CMV L(+)C i CMV H(+)C]
nie została opatrzona znacznikiem błędu.
Seria testowa jest nieważna, jeżeli kontrole dla testu CMV zostały opatrzone którymkolwiek
z poniższych oznaczeń:
Kontrola ujemna
Znacznik
NC_INVALID
Wynik
Interpretacja
Invalid
Wynik nieważny albo „ważny”, lecz nieujemny pod
względem obecności docelowego CMV.
Próba kontrolna CMV nisko dodatnia
Znacznik
LPCINVALID
Wynik
Invalid
Interpretacja
Wynik nieważny lub kontrola poza zakresem
wartości.
Próba kontrolna CMV silnie dodatnia
Znacznik
HPCINVALID
Wynik
Invalid
Interpretacja
Wynik nieważny lub kontrola poza zakresem
wartości.
Jeśli seria testowa jest nieważna, należy ją w całości powtórzyć, łącznie z przygotowaniem próbek
i kontroli oraz amplifikacją i detekcją.
04898362049-02PL
20
Doc Rev. 2.0
Interpretacja wyników
W przypadku ważnej serii testowej sprawdź, czy poszczególne próbki nie zostały na wydruku
z wynikami opatrzone oflagowaniami lub komentarzami. Wyniki należy zinterpretować następująco:
•
Ważna seria testowa może zawierać zarówno ważne, jak i nieważne próbki, zależnie
od tego, czy poszczególne próbki zostały opatrzone oznaczeniami i/lub komentarzami.
Wyniki badania próbek interpretuje się w następujący sposób:
Wynik (miano)
Interpretacja
Target Not Detected
Podać wynik jako „Nie wykryto DNA wirusa CMV”.
<1.50E+02 cp/mL
Obliczone wartości w kp/ml są poniżej dolnej granicy oznaczalności
testu. Podać wyniki jako „Wykryto DNA wirusa CMV, mniej niż
150 kp/ml DNA wirusa CMV”.
≥1.50E+02 cp/mL
i ≤1.00E+07 cp/mL
Obliczone wyniki o wartości 150 kp/ml lub wyższej albo o wartości
1,00E+07 kp/ml lub niższej mieszczą się w zakresie liniowym testu.
>1.00E+07 cp/mL
Obliczone wartości w kp/ml są powyżej zakresu testu. Podać wyniki
jako „Powyżej 1,00E+07 kp DNA wirusa CMV/ml”. Jeśli żądane są
wyniki ilościowe, oryginalną próbkę należy rozcieńczyć CMV-ujemnym
ludzkim osoczem z dodatkiem EDTA, a następnie powtórzyć test.
Otrzymany wynik należy pomnożyć przez współczynnik rozcieńczenia.
Uwaga: Próbki o wynikach powyżej zakresu wartości testu dające wynik nieważny, opatrzony
oznaczeniem „QS_INVALID”, nie powinny być opisywane jako > 1,00E+07 kopii/ml.
Oryginalną próbkę należy rozcieńczyć CMV-ujemnym osoczem z dodatkiem EDTA,
a następnie powtórzyć test. Otrzymany wynik należy pomnożyć przez współczynnik
rozcieńczenia.
Uwaga: Wynik miana „Failed”. Interpretacja: próbka nie została właściwie przetworzona.
Uwaga: Wynik miana „Invalid”. Interpretacja: wynik nieważny.
KONTROLA JAKOŚCI
W każdej serii testowej należy co najmniej raz powtórzyć oznaczenia kontroli: kontrola ujemna
®
®
COBAS TaqMan , kontrola CMV nisko dodatnia oraz kontrola CMV wysoko dodatnia. Seria testowa
jest uważana za ważną, jeśli żadna z kontroli [CMV (–) C, CMV L(+)C i CMV H(+)C] nie została
opatrzona znacznikiem błędu.
Sprawdź, czy na wydruku przebiegu pracy znajdują się oznaczenia i komentarze, aby się upewnić,
że seria jest ważna.
Kontrola ujemna
Kontrola CMV (–) C musi dawać wynik „Target Not Detected”. Jeśli kontrola CMV (–) C jest
oznaczona jako nieważna, to cała seria testowa jest także nieważna. Należy powtórzyć cały proces
(przygotowanie próbek i kontroli, amplifikację i detekcję). Jeśli wyniki kontroli CMV (–) C
w powtarzanych seriach są stale nieważne, skontaktuj się z miejscowym przedstawicielstwem firmy
Roche w celu uzyskania pomocy technicznej.
04898362049-02PL
21
Doc Rev. 2.0
Kontrole dodatnie
Akceptowalne zakresy wartości miana kontroli CMV L(+)C i CMV H(+)C są zapisane w kodach
®
®
®
kreskowych kasety odczynników testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV.
Stężenia DNA wirusa CMV w kp/ml dla kontroli CMV L(+)C i CMV H(+)C powinny mieścić się
w akceptowalnych przedziałach miana. Jeśli jedna lub obie kontrole dodatnie są oznaczone jako
nieważne, to cała seria testowa jest także nieważna. Należy powtórzyć cały proces (przygotowanie
próbek i kontroli, amplifikację i detekcję). Jeżeli miano DNA wirusa CMV dla jednej lub obu kontroli
dodatnich stale mieści się poza akceptowalnym zakresem w powtórzonych seriach, należy zwrócić
się do regionalnego przedstawicielstwa firmy Roche w celu uzyskania pomocy technicznej.
ŚRODKI OSTROŻNOŚCI DOTYCZĄCE PROCEDURY
Jak w przypadku każdej procedury testowej dla prawidłowego przeprowadzenia badania kluczowe
znaczenie ma zachowanie zasad dobrej praktyki laboratoryjnej.
OGRANICZENIA METODY
1.
Ten test został zatwierdzony wyłącznie do badania ludzkiego osocza pobranego do środka na
EDTA jako antykoagulant. Badanie innych rodzajów próbek może dawać nieprawidłowe
wyniki.
2.
Uzyskanie wiarygodnych wyników zależy od właściwego pobrania próbki, transportu,
przechowywania oraz procedur przetwarzania.
3.
Obecność enzymu AmpErase w odczynniku Master Mix testu COBAS® AmpliPrep/COBAS®
TaqMan® CMV zmniejsza ryzyko skażenia amplikonu. Jednak zanieczyszczenia materiałem
pochodzącym z CMV-dodatnich kontroli i próbek klinicznych można uniknąć jedynie dzięki
stosowaniu zasad dobrej praktyki laboratoryjnej i uważnemu wykonywaniu procedur opisanych
w niniejszej ulotce dołączonej do opakowania zestawu.
4.
Tego produktu powinny używać wyłącznie osoby wykwalifikowane w technikach PCR.
5.
Produkt jest przeznaczony wyłącznie do użytku w aparacie COBAS
analizatorze COBAS® TaqMan® lub analizatorze COBAS® TaqMan® 48.
6.
Mutacje w obrębie wysoko konserwatywnych regionów genomu wirusa, z którymi wiążą się
primery i/lub sonda używane w teście COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® CMV, chociaż
występują rzadko, mogą spowodować zaniżenie wyniku oznaczenia ilościowego wirusa lub
jego niewykrycie.
7.
Detekcja DNA CMV zależy od liczby cząsteczek wirusa obecnych w próbce, na którą wpływać
mogą metody pobierania próbek oraz czynniki związane z pacjentem (tj. wiek, obecność
objawów i/lub faza zakażenia).
8.
Z uwagi na różnice pomiędzy technologiami zaleca się, aby przed zmianą stosowanych metod
użytkownik przeprowadził w laboratorium badanie korelacji stosowanych metod w celu
określenia ilościowych różnic występujących pomiędzy nimi.
04898362049-02PL
22
®
AmpliPrep oraz
Doc Rev. 2.0
SUBSTANCJE WPŁYWAJĄCE NA WYNIK TESTU
Wykazano, że podwyższone poziomy trójglicerydów (do 3300 mg/dl), bilirubiny sprzężonej (do
20 mg/dl), bilirubiny niesprzężonej (do 20 mg/dl), hemoglobiny (do 200 mg/dl) i ludzkiego DNA (do
0,4 mg/dl) w próbkach, a także obecność chorób autoimmunizacyjnych lub odpowiadających im
markerów immunologicznych, takich jak np. toczeń rumieniowaty układowy (SLE), reumatoidalne
zapalenie stawów (RA) oraz obecność przeciwciał przeciwjądrowych (ANA) nie wpływają na wyniki
oznaczeń ilościowych DNA CMV ani nie zaburzają swoistości testu COBAS® AmpliPrep/COBAS®
TaqMan® CMV. Badanie zostało przeprowadzone zgodnie z wytycznymi CLSI Guideline EP7-A241,
z użyciem jednego zestawu odczynników testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® CMV.
Wykazano, że przedstawione poniżej związki chemiczne przebadane w stężeniach 3-krotnie
wyższych niż maksymalne stężenie w osoczu (Cmax) nie wpływają na wyniki oznaczeń ilościowych
DNA wirusa CMV ani nie zaburzają swoistości testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® CMV:
Lek immunosupresyjny
Antybiotyk
Azatiopryna
Sulfametoksazol
Cyklosporyna
Trimetoprim
Mykofenolan mofetylu
Cefotetan
Mykofenolan sodu
Piperacylina
Sirolimus
Tazobaktam sodu
Takrolimus
Klawulanian potasu
Ewerolimus
Tikarcylina disodowa
Prednizon
Wankomycyna
Leki przeciwko CMV
Leki przeciwgrzybicze
Gancyklowir
Flukonazol
Valgancyklowir
Cidofowir
Foskarnet
OCENA SKUTECZNOŚCI W BADANIACH NIEKLINICZNYCH
A. Granica wykrywalności
®
®
®
Granica wykrywalności dla testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV została określona
poprzez badanie próbki zawierającej DNA CMV i drugorzędowy standard RMS CMV rozcieńczone
w ludzkim osoczu ujemnym dla CMV z dodatkiem EDTA. Przygotowano dla tych 2 materiałów
źródłowych CMV 6 niezależnych serii rozcieńczeń w ludzkim osoczu z dodatkiem EDTA ujemnym dla
CMV, stanowiących 6 różnych jednostek od dawców. Seria rozcieńczeń próbek klinicznych
zawierających DNA wirusa CMV obejmowała 6 stężeń (47, 93, 140, 186, 280 i 373 kp/ml); seria
rozcieńczeń drugorzędowego standardu RMS CMV obejmowała 6 stężeń (50, 100, 150, 200, 300
i 400 kp/ml). Dla danego stężenia przebadano co najmniej 208 powtórzeń po podliczeniu powtórzeń
dla paneli próbek zawierających DNA wirusa CMV i drugorzędowy standard RMS CMV. Granica
wykrywalności została określona dla 3 zestawów odczynników i wszystkich 3 przebiegów pracy
(COBAS® AmpliPrep podłączony do COBAS® TaqMan®, COBAS® AmpliPrep w połączeniu
®
®
®
®
®
z COBAS TaqMan i COBAS AmpliPrep w połączeniu z COBAS TaqMan 48). Badanie zostało
przeprowadzone zgodnie z wytycznymi CLSI Guideline EP17-A Protocols for Determination of Limits
42
of Detection and Limits of Quantitation; Approved Guideline .
Stężenie DNA wirusa CMV, jakie można oznaczyć ze wskaźnikiem dodatniości powyżej 95%
określonym na podstawie analizy PROBIT, wynosi 56 IU/ml (95% przedział ufności: 50–66 IU/ml) lub
61 kp/ml (95% przedział ufności: 55–72 kp/ml). Łączne wyniki dla wszystkich 3 serii odczynników
przedstawiono w tabeli 2.
04898362049-02PL
23
Doc Rev. 2.0
Tabela 2
®
®
®
Granica wykrywalności i analiza PROBIT testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV
z zastosowaniem próbki i standardu drugorzędowego RMS CMV
Nominalne stężenie
wejściowe
(DNA wirusa CMV IU/ml)
Nominalne stężenie
wejściowe
(DNA wirusa CMV kp/ml)
Liczba
powtórzeń
Standard
Standard
Próbka
Próbka
drugorzędowy
drugorzędowy
kliniczna
kliniczna
RMS CMV
RMS CMV
Liczba
wyników
dodatnich
Odsetek
wyników
dodatnich
364
339
400
373
208
208
100%
273
255
300
280
210
210
100%
182
169
200
186
209
209
100%
137
127
150
140
210
210
100%
91
85
100
93
210
209
99,50%
46
43
50
47
210
188
89,50%
0
0
0
0
210
0
0%
56 IU/ml (95% przedział ufności:
50–66 IU/ml)
61 kp/ml (95% przedział ufności:
55–72 kp/ml)
PROBIT 95% odsetek trafień
B. Precyzja
Dokładność testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® CMV określono na podstawie analizy
panelu składającego się z 8 elementów. Panel został przygotowany z próbek zawierających DNA
wirusa CMV w dolnej granicy zakresu dynamicznego, a w środkowej części i górnej granicy zakresu
dynamicznego, ze względu na niedostępność materiału o bardzo wysokim mianie, z rozcieńczeń
hodowli CMV (szczep AD169). Materiał z obu źródeł rozcieńczono w osoczu ujemnym dla CMV
z dodatkiem EDTA. Składający się z 8 elementów panel obejmował zakres od 2,00E+02 kp/ml DNA
wirusa CMV do 1,00E+07 kp/ml DNA wirusa CMV.
Każdy element panelu był badany w 2 powtórzeniach na przebieg, przeprowadzano 2 przebiegi
dziennie przez przynajmniej 12 dni i dla każdego z 2 przebiegów pracy (COBAS® AmpliPrep
z COBAS® TaqMan® i COBAS® AmpliPrep z COBAS® TaqMan® 48), uzyskując ogółem 96 powtórzeń
na element panelu z równą liczbą powtórzeń w 3 seriach zestawów i 4 systemach COBAS®
®
®
AmpliPrep/COBAS TaqMan wykonanych przez przynajmniej 2 operatorów. Każda próbka
przechodziła przez całą procedurę testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® CMV obejmującą
przygotowanie próbki, amplifikację i detekcję. Dlatego podana dokładność odzwierciedla wszystkie
aspekty procedury badawczej. Wyniki dla każdego z zestawów odczynników oraz łączne wyniki dla
3 zestawów przedstawiono w tabeli 3.
04898362049-02PL
24
Doc Rev. 2.0
Tabela 3
®
®
®
Dokładność testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV
Wszystkie trzy serie
połączone
Miano
Całkowity %
Całkowite
Całkowite
Całkowite
Całkowite
(kp/ml)
współczynnik
Liczba SD jako Liczba SD jako Liczba SD jako Liczba SD jako
wariancji
log10
log10
log10
log10
(CV)
Hodowla CMV (szczep AD169)
1,00E+07
32
0,10
32
0,08
32
0,12
96
0,12
28%
1,00E+06
32
0,10
32
0,05
32
0,07
96
0,09
20%
1,00E+05
32
0,10
32
0,08
32
0,10
96
0,10
24%
2,00E+04
32
0,14
32
0,15
32
0,08
96
0,13
30%
5,00E+02
32
0,22
32
0,23
32
0,26
96
0,24
59%
Próbka
1,00E+03
32
0,11
32
0,12
32
0,10
96
0,12
29%
3,20E+02
32
0,17
32
0,16
32
0,13
96
0,16
39%
2,00E+02
32
0,21
32
0,20
32
0,20
96
0,21
53%
Seria nr 1
Seria nr 2
Seria nr 3
C. Zakres liniowości
Zakres liniowości testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® CMV określono na podstawie analizy
panelu składającego się z 10 elementów. Panel został przygotowany z próbek klinicznych
zawierających DNA CMV w dolnej granicy zakresu dynamicznego, a w środkowej części i górnej
granicy zakresu dynamicznego, ze względu na niedostępność materiału klinicznego o bardzo
wysokim mianie, z rozcieńczeń hodowli CMV (szczep AD169). Materiał z obu źródeł rozcieńczono
w osoczu ujemnym dla CMV z dodatkiem EDTA. Składający się z 10 elementów panel obejmował
zakres od 5,0E+01 kp/ml DNA wirusa CMV do 2,0E+07 kp/ml DNA wirusa CMV.
Każdy element panelu był badany w 2 powtórzeniach na przebieg, przeprowadzano 2 przebiegi
dziennie przez przynajmniej 12 dni i dla każdego z 2 przebiegów pracy (COBAS® AmpliPrep
z COBAS® TaqMan® i COBAS® AmpliPrep z COBAS® TaqMan® 48), uzyskując ogółem 96 powtórzeń
na element panelu z równą liczbą powtórzeń w 3 seriach zestawów i 4 systemach COBAS®
AmpliPrep/COBAS® TaqMan® wykonanych przez przynajmniej 2 operatorów. Każda próbka
przechodziła przez całą procedurę testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® CMV obejmującą
przygotowanie próbki, amplifikację i detekcję. Jak pokazano na rysunku 6, zgodnie z CLSI EP6-A test
COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® CMV wykazał liniowość w zakresie od 5,0E+01 kp/ml DNA
wirusa CMV do 2,0E+07 kp/ml DNA wirusa CMV. Uwzględniając dolną granicę oznaczalności
wynoszącą 1,5E+02 DNA CMV kp/ml, zakres liniowości wynosi od 1,5E+02 kp/ml DNA wirusa CMV
do 1,0E+07 kp/ml DNA wirusa CMV.
04898362049-02PL
25
Doc Rev. 2.0
Log10 (DNA CMV kp/ml) wartości średniej
Wyniki testu COBAS® AmpliPrep/
COBAS® TaqMan® CMV
Rysunek 6
®
®
®
Liniowość testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV
8
7
6
5
4
3
2
y = 1,0555x - 0,4197
R2 = 0,9987
1
Słupki błędu = 1 odchylenie standardowe
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Stężenie nominalne
Log10 (DNA CMV kp/ml)
Uwaga:
Puste i wypełnione punkty oznaczają odpowiednio średnie wartości log10 miana dla
rozcieńczeń próbek klinicznych i hodowli szczepu AD169 CMV.
®
®
®
D. Skuteczność przeprowadzania testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV na
próbkach niezawierających IgG przeciwko CMV
Działanie testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® CMV określono przy użyciu 2 serii
odczynników na podstawie analizy próbek osocza ujemnego dla IgG przeciwko CMV z dodatkiem
EDTA pobranych od biorców przeszczepu nerki, gdzie dawca (+)/biorca (–) w badaniach
®
®
serologicznych przed przeprowadzeniem przeszczepu. Stosując test COBAS AmpliPrep/COBAS
TaqMan® CMV, uzyskano ujemne wyniki dla DNA wirusa CMV dla stu pięćdziesięciu jeden (151)
spośród 157 próbek osocza z dodatkiem EDTA pobranych od 156 pacjentów. Przeprowadzono
dalsze badania dotyczące uzyskanych w teście 6 dodatnich wyników DNA wirusa CMV. Pobierano
od tego samego pacjenta kolejne próbki na przestrzeni czasu i stwierdzono wcześniejsze lub
niedawne zakażenie CMV. Ponadto niezależny test PCR na CMV potwierdził obecność DNA wirusa
CMV w 5 spośród 6 niezgodnych wyników. W wyniku badań rozstrzygających 151 spośród
152 próbek niezawierających IgG przeciwko CMV w testach serologicznych, dało ujemne wyniki na
DNA wirusa CMV ze swoistością 99,3% (95% przedział ufności: 96,4–100,0%).
04898362049-02PL
26
Doc Rev. 2.0
E. Swoistość analityczna
®
®
®
Swoistość analityczną testu COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV T zbadano przez dodanie
hodowanych mikroorganizmów (wirusów, bakterii, grzybów) w stężeniu wejściowym 1,0E+06 cząstek/ml
do CMV-ujemnego osocza z dodatkiem EDTA i do CMV-dodatniego osocza (7,5E+02 kp/ml CMV)
z dodatkiem EDTA (patrz tabela 4).
Żaden z badanych mikroorganizmów nie wykazał występowania reakcji krzyżowej z testem COBAS®
AmpliPrep/COBAS® TaqMan® CMV. Próbki zawierające CMV dały wyniki miana w granicach
± 0,3 log10 z kontroli dodatniej CMV.
Tabela 4
Próbki użyte do oceny swoistości analitycznej
Ludzkie herpeswirusy
Wirus opryszczki pospolitej typu 1
Wirus opryszczki pospolitej typu 2
Wirus ospy wietrznej
Wirus Epsteina–Barr
Ludzki herpeswirus 6
Ludzki herpeswirus 7
Ludzki herpeswirus 8
Inne wirusy
Poliomawirus BK
Poliomawirus JC
Wirus zapalenia wątroby typu A
Wirus zapalenia wątroby typu B
Wirus zapalenia wątroby typu C
HIV typu 1
Adenowirus 5
Parwowirus B19
Grzyby
Bakterie
Mycoplasma pneumoniae
Propionibacterium acnes
Salmonella typhimurium
Staphylococcus aureus
Streptococcus pneumoniae
04898362049-02PL
Aspergillus niger
Candida albicans
Cryptococcus
27
Doc Rev. 2.0
F. Porównanie metod testów COBAS® AMPLICOR CMV MONITOR i LightCycler® CMV Quant
Działanie testów COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® CMV i COBAS® AMPLICOR CMV
MONITOR porównano, analizując zebrane prospektywnie, nierozcieńczone CMV-dodatnie 52 próbki
kliniczne. Spośród obu wartości liniowych dwóch porównywanych testów do analizy regresji Deminga
brano pod uwagę jedynie ważne pary mian (patrz rysunek 7).
Porównano też skuteczność testu COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® CMV z testem
LightCycler® CMV Quant, analizując zebrane prospektywnie, nierozcieńczone CMV-dodatnie
52 próbki kliniczne. Spośród obu wartości liniowych dwóch porównywanych testów do analizy regresji
Deminga brano pod uwagę jedynie ważne pary mian (patrz rysunek 8).
Rysunek 7
Korelacja wyników testów COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® CMV
i COBAS® AMPLICOR CMV MONITOR
Test CAP/CTM CMV, Log10 miana (DNA CMV kp/ml)
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
Y = 1,203 X - 0,832
R2 = 0,9343
N = 52
1,0
0,0
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
Test COBAS® AMPLICOR CMV MONITOR, Log10 miana (DNA CMV kp/ml)
04898362049-02PL
28
Doc Rev. 2.0
Rysunek 8
®
®
®
Korelacja wyników testów COBAS AmpliPrep/COBAS TaqMan CMV
i LightCycler® CMV Quant
Test CAP/CTM CMV, Log10 miana (DNA CMV kp/ml)
7
6
5
4
3
2
Y = 0,893 X - 0,027
R2 = 0,8490
N = 52
1
0
0
1
2
3
4
5
6
7
Test LightCycler® CMV Quant, Log10 miana (kp/ml)
04898362049-02PL
29
Doc Rev. 2.0
PIŚMIENNICTWO
1.
Griffiths PD. 2000. Cytomegalovirus. In Principles and Practice of Clinical Virology. eds.
Zuckerman, A.J., Banatvala, J.E. and Pattison, J.R. John Wiley and Sons, London. 79-116.
2.
Pass R.F. 2001. Cytomegalovirus. In: Fields Virology. eds. Knipe, D., Howley, P. Lippincott,
Williams and Wilkins, Philadelphia. 2675-2706.
3.
Kapranos N., Petrakou E, Anastasiadou C, Kotronias D. 2003. Detection of herpes simplex
virus, cytomegalovirus, and Epstein-Barr virus in the semen of men attending an infertility
clinic. Fertility and Sterility 79:48-52.
4.
Forbes BA. 1989. Acquisition of cytomegalovirus infection: an update. Clinical Microbiological
Reviews 2:204-216.
5.
Numazaki, K. 1997. Human cytomegalovirus infection of breast milk. FEMS Immunology and
Medical Microbiology, 18:2:91-98.
6.
Vochem M, Hamprecht K, Jahn G, Speer CP. 1998. Transmission of cytomegalovirus to
preterm infants through breast milk. Pediatric Infectious Disease Journal. 17:55-53.
7.
Souza IE, Nicholson D, Matthey S, et al. 1994. Detection of human cytomegalovirus in
peripheral blood leukocytes by polymerase chain reaction and a nonradioactive probe.
Diagnostic Microbiology Infectious Disease 20:13-19.
8.
Alford CA, Brill WJ. 1990. Cytomegalovirus. In: Virology, Vol. 2, 2nd ed., eds. Fields, B.N.
Knipe, D.M. Raven Press, New York, NY. 1981-2010.
9.
Yasuda A, Kimura H, Hayakawa M, Ohshiro M, et al. 2003. Evaluation of cytomegalovirus
infections transmitted via breast milk in preterm infants with a real-time polymerase chain
reaction assay. Pediatrics. 111:1333-6.
10.
Jordan MC. 1983. Latent infection and the elusive cytomegalovirus. Reviews in Infectious
Diseases 5:205-215.
11.
Drew WL. 1989. Other virus infections in AIDS: I: Cytomegalovirus. Immunology and Serology
44:507-534.
12.
Drew WL. 1992. Nonpulmonary manifestations of Cytomegalovirus infection in
immunocompromised patients. Clinical Microbiology Review 5:204-210.
13.
Mocarski ES, Courcelle CT. 2001. Cytomegaloviruses and their replication. In: Fields Virology.
eds. Knipe D and Howley P. Lippincott, Williams and Wilkins, Philadelphia. 2629-2674.
14.
Fedorko DP,Yan SS. 2002. Recent advances in laboratory diagnosis of human
Cytomegalovirus infection. Clinical and Immunological Reviews 2:155-167.
15.
Schafer P, Tenschert W, Gutensohn K, Laufs R. Minimal effect of delayed sample processing
on results of quantitative PCR for cytomegalovirus DNA in leukocytes compared to results of
an antigenemia assay. Journal of Clinical Microbiology 1997 35: 741-744.
16.
Bowen EF, Sabin CA, Wilson P, et al. 1997. Cytomegalovirus (CMV) viraemia detected by
polymerase chain reaction identifies a group of HIV-positive patients at high risk of CMV
disease. AIDS 11:889-893.
17.
Gor D, Sabin C, Prentice HG, et al. 1998. Longitudinal fluctuations in cytomegalovirus load in
bone marrow transplant patients: relationship between peak virus load, donor/recipient
serostatus, acute GVHD and CMV disease. Bone Marrow Transplantation 21:597-605.
18.
Hassan-Walker AF, Kidd IM, Sabin C, et al. 1999. Quantity of human cytomegalovirus (CMV)
DNAemia as a risk factor for CMV disease in renal allograft recipients: Relationship with
donor/recipient CMV serostatus, receipt of augmented methylprednisolone and antithymocyte
globulin (ATG). Journal of Medical Virology 58:182-187.
19.
Sanchez JL, Kruger RM, Paranjothi S, et al. 2001. Relationship of cytomegalovirus viral load in
blood to pneumonitis in lung transplant recipients. Transplantation 2001 72:733-735.
04898362049-02PL
30
Doc Rev. 2.0
20.
Humar A, Mazzulli T, Moussa G, Razonable RR, Paya CV, Pescovitz MD, Covington E,
Alecock E; Valganciclovir Solid Organ Transplant Study Group. Clinical utility of
cytomegalovirus (CMV) serology testing in high-risk CMV D+/R- transplant recipients. Am J
Transplant. 2005 May; 5(5):1065-701
21.
Griffiths P, Whitley R, Snydman DR, Singh N, Boeckh M; International Herpes Management
Forum. Contemporary management of cytomegalovirus infection in transplant recipients:
guidelines from an IHMF workshop, 2007. Herpes. 2008 Oct; 15(1):4-12.
22.
Kotton CN, Kumar D, Caliendo AM, Asberg A, Chou S, Snydman DR, Allen U, Humar A;
Transplantation Society International CMV Consensus Group. International consensus
guidelines on the management of cytomegalovirus in solid organ transplantation.
Transplantation. 2010 Apr 15; 89(7):779-95.
23.
Marenzi, R., Cinque, P., Ceresa, D., et. al. 1996. Serum polymerase chain reaction for
cytomegalovirus DNA for monitoring ganciclovir treatment in AIDS patients. Scandanavian
Journal of Infectious Disease 28:347-351.
24.
Rasmussen, L., Zipeto, D., Wolitz, R.A., et al. 1997. Risk for retinitis in patients with AIDS can
be assessed by quantitation of threshold levels of cytomegalovirus DNAburden in blood.
Journal of Infectious Disease 176:1146-1155.
25.
Shinkai M, Bozzette SA, Powderly W, et al. 1997. Utility of urine and leucocyte cultures and
plasma DNA polymerase chain reaction for identification of AIDS patients at risk for developing
human cytomegalovirus disease. Journal of Infectious Disease 175:3029308.
26.
Spector SA, Wong R, Hsia K, et al. 1998. Plasma cytomegalovirus (CMV) DNA load predicts
CMV disease and survival in AIDS patients. Journal of Clinical Investigation 101:497-502.
27.
Cope AV, Sweny P, Sabin C, et al. 1997. Quantity of cytomegalovirus viruria is a major risk
factor for cytomegalovirus disease after renal transplantation. Journal of Medical Virology
52:200-205.
28.
Gor D, Sabin C, Prentice HG, et al. 1998. Longitudinal fluctuations in cytomegalovirus load in
bone marrow transplant patients: relationship between peak virus load, donor/recipient
serostatus, acute GVHD and CMV disease. Bone Marrow Transplantation 21:579-605.
29.
Einsele, H., Ehninger, G., Steidle, M., et al. 1991. Polymerase chain reaction to evaluate
antiviral therapy for cytomegalovirus disease. Lancet 338:1170-1172.
30.
Bowen EF, Wilson P, Cope A. et al. 1996. Cytomegalovirus retinitis in AIDS patients: influence
of cytomegaloviral load on response to ganciclovir, time to recurrence and survival. AIDS
10:1515-1520.
31.
Lanari M, Lazzarotto T, Venturi V, Papa I, Gabrielli L, Guerra B, Landini MP, Faldella G.
Neonatal cytomegalovirus blood load and risk of sequelae in symptomatic and asymptomatic
congenitally infected newborns. Pediatrics. 2006 Jan; 117(1):e76-83.
32.
Eid AJ, Arthurs SK, Deziel PJ, Wilhelm MP, Razonable RR. Emergence of drug-resistant
cytomegalovirus in the era of valganciclovir prophylaxis: therapeutic implications and
outcomes. Clin Transplant. 2008 Mar-Apr; 22(2):162-170.
33.
Ljungman P, de la Camara R, Cordonnier C, Einsele H, Engelhard D, Reusser P, Styczynski
J, Ward K; European Conference on Infections in Leukemia. Management of CMV, HHV-6,
HHV-7 and Kaposi-sarcoma herpesvirus (HHV-8) infections in patients with hematological
malignancies and after SCT. Bone Marrow Transplant. 2008 Aug; 42(4):227-240.
34.
Smith ES, Li AK, Wang AM, Gelfand DH, Myers TM. 2003. Amplification of RNA: HighTemperature Reverse Transcription and DNA Amplification with a Magnesium-Activated
Thermostable DNA Polymerase. In PCR Primer: A Laboratory Manual, 2nd Edition,
Dieffenbach C.W. and Dveksler G.S., Eds. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, New York, pp. 211-219.
35.
Longo MC, Berninger MS, Hartley JL. 1990. Use of uracil DNA glycosylase to control carryover contamination in polymerase chain reactions. Gene 93:125-128.
36.
Higuchi R, Dollinger G, Walsh PS, Griffith R. 1992. Simultaneous amplification and detection
of specific DNA sequences. Biotechnology (N Y). 10:413-417.
04898362049-02PL
31
Doc Rev. 2.0
37.
Heid CA, Stevens J, Livak JK, Williams PM. 1996. Real time quantitative PCR. Genome
Research 6:986-994.
38.
Richmond JY, McKinney RW. eds. 1999. Biosafety in Microbiological and Biomedical
Laboratories. HHS Publication Number (CDC) 93-8395.
39.
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protection of Laboratory Workers from
Occupationally Acquired Infections. Approved Guideline-Third Edition. CLSI Document M29A3 Wayne, PA:CLSI, 2005.
40.
International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st Edition. 2000.
704 pp.
41.
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Interference Testing in Chemisty; Approved
Guideline—Second Edition. CLSI Document EP7-A2. CSLI, 940 West Valley Road, Suite
1400, Wayne, Pennsylvannia 19087-1898 USA, 2004.
42.
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protocols for Determination of Limits of
Detection and Limits of Quantitation; Approved Guideline. CLSI Document EP17-A [ISBN 156238-551-8]. CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvannia 19087-1898
USA, 2004.
04898362049-02PL
32
Doc Rev. 2.0
Informacje dotyczące wersji dokumentu
Doc Rev. 2.0
03/2011
Pierwsza publikacja.
Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ 08876 USA
Członek Grupy Roche
Roche Diagnostics (Schweiz) AG
Industriestrasse 7
6343 Rotkreuz, Switzerland
Roche Diagnostics GmbH
Sandhofer Straße 116
68305 Mannheim, Germany
Roche Diagnostics SL
Avda Generalitat, 171-173
E-08174 Sant Cugat del Vallès
Barcelona, Spain
Roche Diagnostica Brasil Ltda.
Av. Engenheiro Billings, 1729
Jaguaré, Building 10
05321-010 São Paulo, SP Brazil
Roche Diagnostics
201, boulevard Armand-Frappier
H7V 4A2 Laval, Québec, Canada
(For Technical Assistance call:
Pour toute assistance technique,
appeler le: 1-877 273 3433)
Roche Diagnostics
2, Avenue du Vercors
38240 Meylan, France
Distributore in Italia:
Roche Diagnostics S.p.A.
Viale G. B. Stucchi 110
20052 Monza, Milano, Italy
Distribuidor em Portugal:
Roche Sistemas de Diagnósticos Lda.
Estrada Nacional, 249-1
2720-413 Amadora, Portugal
ROCHE, AMPERASE, AMPLICOR, AMPLILINK, COBAS, COBAS P, AMPLIPREP oraz TAQMAN są
znakami towarowymi firmy Roche.
Inne nazwy produktów i znaki towarowe są własnością odpowiednich podmiotów.
Barwniki cyjaninowe zawarte w produkcie są objęte prawami patentowymi firmy GE Healthcare
Bio-Sciences Corp. oraz Carnegie Mellon University i udostępniane są firmie Roche na zasadzie
licencji w celu ich włączenia do składników zestawów badawczych oraz zestawów do diagnostyki
in vitro. Wszelkie wykorzystanie takich zestawów do celów innych niż badawcze lub związane
z diagnostyką in vitro wymaga uzyskania podlicencji od firmy GE Healthcare Bio-Sciences Corp.,
Piscataway, New Jersey, USA, oraz Carnegie Mellon University, Pittsburgh, Pensylwania, USA.
© 2011 Roche Molecular Systems, Inc. Wszystkie prawa zastrzeżone.
3/2011
(04898362001-02ENGL)
Doc Rev. 2.0
04898362049-02PL
04898362049-02
33
Doc Rev. 2.0