CAG CAG CAG CAG CAG

Kurs „Neurogenetyka”
Warszawa IPiN, 30.11- 04.12.2015.
Interpretacja wyników badao molekularnych
w chorobie Huntingtona.
Wioletta Krysa
Pracownia Molekularnych Podstaw Chorób Neurodegeneracyjnych
Zakład Genetyki , IPiN
Choroba Huntingtona
- najważniejsze fakty
• George Huntington - w 1872 r. artykuł „ On chorea” w Medical and
Surgical Reporter
• postępująca neurodegeneracyjna choroba o późnym początku
• monogenowy (gen HTT), autosomalny (4p16.3), dominujący wzór
dziedziczenia
• częstość występowania 3 - 7 na 100.000 osób w populacji europejskiej
Podział objawów choroby Huntingtona
• Objawy fizyczne
› ruchy mimowolne, problemy z ruchami dowolnymi, zaburzenia chodu
› bradykinezja, dystonia, sztywność, dysfagia, dysartria
• Zaburzenia funkcji poznawczych
› demencja (otępienie podkorowe), spowolnienie myślenia i uczenia się
• Problemy emocjonalne i zmiany zachowania
› alienacja społeczna, depresja, apatia,
› rozhamowanie, urojenia, mania, zaburzenia schizofrenopodobne
• Neuropatologia w chorobie Huntingtona
› zaniki neuronów w obrębie jądra ogoniastego i zwojów podstawy
(prążkowie)
Podłoże genetyczne choroby Huntingtona
Czynnik etiologiczny: mutacja dynamiczna w obrębie genu HTT
polegająca na zwielokrotnieniu mikrosatelitarnej sekwencji CAG
poza zakres prawidłowy
W zakresie chorobotwórczym charakteryzuje się większą
niestabilnością w miarę wydłużania rejonu powtórzeń.
Niestabilność w przekazywaniu następnym pokoleniom prowadzi do
występowania w dziedziczeniu choroby zjawiska antycypacji.
Zakres prawidłowy liczby powtórzeń CAG w genie HTT
w grupie kontrolnej z polskiej populacji
45
40
frequency %
35
30
25
20
15
10
5
0
9 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 27 28 29 32
CAG repeats number
Rodzaje badań molekularnych w kierunku HD
DIAGNOSTYCZNE
wykonywane u osób z klinicznym rozpoznaniem HD
PRZEDOBJAWOWE
wykonywane na życzenie pełnoletnich osób z 50% jak i 25% ryzykiem
zachorowania z rodziny, w której wcześniej potwierdzono HD
na podstawie badań molekularnych
PRENATALNE
analiza DNA płodu jeżeli jedno z rodziców ma chorobotwórczy allel
(poprzedzone analizą DNA matki i ojca)
Badania dostępne poza IPiN
PREIMPLANTACYJNE
analiza DNA z komórek zarodka poprzedzająca jego transfer do
macicy – w procedurze zapłodnienia in-vitro
Diagnostyka molekularna w HD
- PCR obszaru I eksonu przy użyciu starterów łączących się z sekwencjami
flankującymi rejon powtórzeń (CAG)n
- rozdział elektroforetyczny produktów PCR
- ustalenie liczby powtórzeń (CAG) n
Ekson 1
Ekson 67
HD1
[ CAG CAG CAG CAG CAG ]
Gen HTT
HD3
(CAG)n=
wielkość produktu PCR (bp) - długość starterów HD1/HD3 (47 bp)
3
Uzupełniające badania molekularne w chorobie Huntingtona
Ekson 1
HD1
Ekson 67
[ CAG CAG CAG CAG CAG ]
HD3
HD1
[ CAG CAG CAG CAG CAG ] CAA CAG CCG CCA [CCG CCG CCG]
7-12
Hu3
Analiza liczby powtórzeń CAG w genie HTT
z wykorzystaniem znaczników fluorescencyjnych
metodami izotopowymi
17 / 17
15 / 20
17 / 40
Allele z zakresu
patogennego
19 / 41
17 / 42
17 / 49
Alle z zakresu normy
< 36 (CAG)n
22 / 38
Interpretacja wyników badań molekularnych w HD
9-26 (CAG)n - zakres prawidłowej liczby powtórzeń
> 36 (CAG)n - patogenna ekspansja
27-39 (CAG)n - problematyczna interpretacja wyników
allele pośrednie - zawierają 27-35 powtórzeń CAG, osoba z takim
allelem może przekazać do następnego pokolenia gen ze
zwiększoną, do zakresu patogennego, liczbą (CAG)n,
ale nie jest zagrożona zachorowaniem na HD
allele o „niekompletnej penetracji” - zawierają 36-39 (CAG)n
wysokie ryzyko zachorowania na HD, wynik wymaga
interpretacji w kontekście historii rodzinnej
RP-PCR (Repeat Primed PCR) – METODA JAKOŚCIOWA
CAGCAGCAG // CAGCAGCAG
5’
3’
P4GTC
•
zmodyfikowana reakcja PCR –
trzy startery:
HD1, P4GTC, P3R (10:1:10)
HD1
GTCGTCGTC// GTCGTCGTC
•
potwierdzenie bądź wykluczenie
ekspansji powtórzeń CAG
w genie HTT
3’
5’
P3R
3’
P3R
5’
P3R
P3R
RP-PCR dla HD - obraz rozdziału elektroforetycznego produktów
Zjawisko antycypacji
genetycznej
obserwowane w dziedziczeniu niektórych chorób genetycznie
uwarunkowanych cechujące się wcześniejszym występowaniem
objawów choroby i cięższym jej przebiegiem w kolejnych pokoleniach
Antycypacja odojcowska w HD
*
DNA
*
II-1
43/14
*
III-1
DNA
III-2
44/24
*
DNA
III-3
24/17
II-2
*
III-4
47/16
DNA
II-3
41/17
*
III-5
77/16
DNA
DNA
II-4
*
III-6
17/15
DNA
II-5
*
III-7
43/23
DNA
III-13
49/28
*
IV-1
53/17
DNA
Antycypacja odmatczyna w HD
I-1
I-2
DNA
*
II-2
II-1
II-3
II-4
62/15
*
III-1
III-2
III-3
*
III-4
III-5
65 / 17
85 / 17
Mutacja „de novo” jako wynik niestabilności (CAG)n
w allelu „pośrednim” u ojca
DNA
DNA
DNA
DNA
DNA
DNA
DNA
DNA
Charakterystyka molekularna postaci dziecięcej/młodzieńczej choroby
Huntingtona (Juvenile HD)
• silnie zaznaczona odwrotna korelacja między liczbą powtórzeń
CAG w genie HTT a wiekiem zachorowania
› postać młodzieńcza
- wiek zachorowania poniżej 20 r.ż.
- liczba powtórzeń sekwencji CAG powyżej 50
Negatywna korelacja między liczbą (CAG)n
a ekspresją kliniczną w HD
CAG < 50 (r = - 0,56; p<0.000001)
Wiek zachorowania
CAG > 50 (r = - 0,72; p<0.000001)
80
70
60
50
40
30
20
10
0
30
40
50
60
70
80
90
100
Liczba powt. CAG
110
EHDN Grupa Robocza
GENETIC TESTING AND COUNSELLING GROUP
• jakość i standardy diagnostyki molekularnej
• procedury w poradnictwie genetycznym HD
Wymogi przedanalityczne – badanie diagnostyczne
Identyfikacja pacjenta (Zlecenie badania laboratoryjnego)
nazwisko i imię
imiona rodziców
data urodzenia
płeć
rodzaj materiału do badania
Wywiad kliniczny (Wskazania do wykonania badania)
wiek zachorowania
obraz kliniczny
wywiad rodzinny
rodowód, dane o innych członkach rodziny dotkniętych chorobą
ŚWIADOMA ZGODA PACJENTA NA BADANIA GENETYCZNE
(podpisana przez pacjenta lub jego opiekuna i lekarza)
Rozporządzenie Ministra Zdrowia z 21 stycznia 2009
Zmieniające rozporządzenie w sprawie standardów jakości dla medycznych laboratoriów diagnostycznych i
mikrobiologicznych. Dz.U. 09.22.128 z 11 lutego 2009
Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 19 sierpnia 2015 r. zmieniające rozporządzenie w sprawie standardów jakości dla
medycznych laboratoriów diagnostycznych i mikrobiologicznych
Wymogi przedanalityczne – badanie
przedobjawowe
REKOMENDACJE
Badania przedobjawowe – procedura prowadzona wyłącznie
przez Poradnię Genetyczną
Procedura poradnictwa w takich przypadkach:
 Minimum 3 wizyty (pobranie próbki na 2 wizycie),
 Pobranie dwóch niezależnych próbek krwi
 Wcześniej stwierdzona mutacja u kogoś z rodziny – proband
(dostęp do próbki lub wyniku z akredytowanego laboratorium)
Wymogi przedanalityczne – badanie prenatalne
Wymagane informacje
informacja o rodzicu-nosicielu mutacji (diagnoza)
kopia wyniku badania genetycznego
próbki DNA od obojga rodziców
zgoda na badania
* laboratorium powinno otrzymać próbkę krwi po urodzeniu/usunięciu ciąży
w celach wewnętrznej kontroli jakości
Rekomendacje dla laboratoriów genetycznych –
standardy i procedury
• laboratorium powinno się upewnić czy skierowanie na badania
przedobjawowe pochodzi od genetyka klinicznego, który zna standardy
poradnictwa w HD
• wynik badania powinien być zawsze wysyłany do lekarza kierującego,
który podczas wizyty w Poradni Genetycznej omawia wszelkie jego aspekty
Rozporządzenie Ministra Zdrowia z 21 stycznia 2009
Zmieniające rozporządzenie w sprawie standardów jakości dla medycznych laboratoriów
diagnostycznych i mikrobiologicznych.
Dz.U. 09.22.128 z 11 lutego 2009
Rozporządzenie Ministra Zdrowia z dnia 19 sierpnia 2015 r. zmieniające rozporządzenie w sprawie
standardów jakości dla medycznych laboratoriów diagnostycznych i mikrobiologicznych
European Journal of Human Genetics (2013) 21, 480–486
EMQN/CMGS best practice guidelines for the molecular genetic testing
of Huntington disease.
Working Group - Genetic Testing and Counselling
Clin Genet. 2013 Mar;83(3):221-31. doi: 10.1111/j.1399-0004.2012.01900.x. Epub 2012 Jul 30.
Special Feature
Recommendations for the predictive genetic test in Huntington's disease.
MacLeod R, Tibben A, Frontali M, Evers-Kiebooms G, Jones A, Martinez-Descales A, Roos RA;
Editorial Committee and Working Group ‘Genetic TestingCounselling’ of the European Huntington
Disease Network.
Rozporządzenie Ministra Zdrowia z 21 stycznia 2009
Załącznik 3.
Standardy jakości w zakresie czynności laboratoryjnej genetyki medycznej, oceny ich
jakości i wartości diagnostycznej oraz laboratoryjnej interpretacji i autoryzacji wyniku badao.
1.1. Laboratorium opracowuje, wdraża i stosuje procedurę zlecania badao laboratoryjnych
oraz udostępnia ją zleceniodawcom, którzy potwierdzają zapoznanie się z tą procedurą.
Wszyscy zleceniodawcy zlecają wykonanie badao przez laboratorium zgodnie z tą procedurą.
1.2. Procedury zlecania badao laboratoryjnych określają w szczególności formularze zlecenia
badania laboratoryjnego.
1.3. Formularz zlecenia badania laboratoryjne zawiera w szczególności pola:
- dane osobowe
- wywiad rodzinny, w tym informacja o obciążeniach genetycznych w rodzinie !!!!
4.2. Laboratorium sprawdza zgodnośd danych na zleceniu z oznakowaniem materiału oraz
ocenia przydatnośd materiału do badania.
4.3. W przypadku stwierdzenia przez laboratorium niezgodności otrzymanego materiału do
badao z wymaganiami dotyczącymi pobierania lub transportu, lub jakiegokolwiek innego
rodzaju nieprawidłowości powodującej, że materiał nie może byd wykorzystany do badania,
pracownik zgłasza to kierownikowi laboratorium lub osobie przez niego upoważnionej,
którzy w razie potwierdzenia niezgodności mogą zakwalifikowad materiał jako niezdatny do
badania i odmówid wykonania badania. Odmowę wykonania badania odnotowuje się w
dokumentacji i zawiadamia się o tym fakcie zleceniodawcę. Dalsze postępowanie z
materiałem laboratorium uzgadnia ze zleceniodawcą.
7.8. Laboratorium bierze stały udział w krajowych lub międzynarodowych programach
zewnętrznej oceny jakości.
7.9. Laboratorium stosuje się do następujących warunków dobrego uczestnictwa w
programach zewnętrznej oceny jakości:
1) realizuje badania w otrzymanym materiale kontrolnym w sposób identyczny z normalnie
przyjętą praktyką postępowania z próbkami pacjentów;
2) poddaje ocenie zewnętrznej wyłącznie wyniki uzyskane przy wykorzystaniu aparatury
pomiarowo–badawczej stanowiącej jego wyposażenie oraz wymienionych w procedurze
metody badawczej wyrobów medycznych stosowanych do diagnostyki in vitro;
3) uczestniczy w programach zewnętrznej oceny jakości z właściwą częstością, określaną
przez organizatora tych programów;
4) dokonuje oceny poprawności wszystkich rodzajów badao wykonywanych w laboratorium
i dostępnych w konkretnym programie zewnętrznej oceny jakości;
5) analizuje wszystkie wyniki uzyskane w programach oceny zewnętrznej i podejmuje
działania korygujące i zapobiegawcze w przypadku uzyskania niezadowalających wyników.
8.4. Laboratorium opracowuje, wdraża i stosuje procedury wydawania sprawozdao z badao
laboratoryjnych ze szczególnym uwzględnieniem laboratoryjnej interpretacji wyniku.
Procedury wydawania sprawozdao określają w szczególności formularze sprawozdao z
badania laboratoryjnego.
8.5. Formularz sprawozdania z badania laboratoryjnego zawiera w szczególności pola:
1) data wydruku i wykonania badania oraz numer identyfikacyjny badania;
2) rodzaj badania;
3) rodzaj badanego materiału;
4) dane pacjenta:
5) miejsce przesłania sprawozdania z badania lub dane osoby upoważnionej do odbioru sprawozdania;
6) dane laboratorium wykonującego badanie;
7) data i godzina pobrania materiału do badao;
8) data i godzina przyjęcia materiału do badao;
9) wyniki badania w formie zgodnej z obowiązującym w genetyce klinicznej zapisem;
10) laboratoryjna interpretacja wyników badao;
11) informacje dotyczące widocznych zmian właściwości próbki, które mogą mied wpływ na
wynik badania;
12) podpis i pieczęd osoby upoważnionej do jego autoryzacji.
Dodatkowo formularz wyniku PMPCN
13.UWAGI: np. brak probanda z weryfikacją molekularną HD;
pobrano próbki krwi rodzeostwa na tej samej wizycie
EMQN/CMGS best practice guidelines for the
molecular genetic testing of Huntington disease.
PRESYMPTOMATIC TESTING
1. „According to the international guidelines, predictive testing for HD
should only be requested by a clinical geneticist”.
2. „Presymptomatic testing can be offered to individuals at an a priori 50 or 25% risk”.
3. „Confirmation of HD at the molecular level in at least one family member
with HD is advisable”.
4. „Presymptomatic testing of minors (18 years of age) is considered appropriate only
in exceptional circumstances.”
5. „Comprehensive genetic counseling is required, and informed consent must
be provided in accordance with local practices”.
2. Access to the test
REC. 2.8
All laboratories are expected to comply with the Organization for Economic Co-operation and Development
(OECD) Guidelines for Quality Assurance in Molecular Testing by providing and practicing genetic testing under a
quality assurance framework, meet rigorous standards of accuracy, participating in external quality assessment
(EQA) schemes and working towards certification and accreditation.
REC 2.8.1
Laboratories should be cognizant of the limitations of the methodologies used (including, e.g. the possibility of
missing a very large expansion, the risk of error that might lead to a non-carrier result if an affected relative has
not been tested), and should indicate these clearly in reports issued, along with margins of error.
Reasons for the changes 2.8 and 2.8.1
Since 1994 several guidelines for best laboratory practice in genetic testing have been issued.
Quality control and accreditation of laboratories have become essential requirements since 1994.
One of the basic principles according to the OECD guidelines is that predictive genetic tests should be accompanied
by genetic counselling, and laboratories should ensure that this is the case.
Several limitations and an error estimate of CAG repeat sizing have been reported in the last 15 years, which should be
mentioned in the report.
3. Support during the test process
REC 3
The participant should be encouraged to select a companion to accompany him/her throughout all the
different stages: the pre-test, the taking of the test, the delivery of the results and the post-test stage.
4. Recommendation on communication of information
REC 4
Testing and counselling should be provided by genetic counselling units knowledgeable about molecular
genetic issues in Huntington's disease. These centres should work in close collaboration with the lay
organization(s) of the country.
Diagnostyka różnicowa
GeneReviews® [Internet].
Niedziedziczne choroby z objawem pląsawicy:
późna dyskineza, nadczynnośd tarczycy, choroby naczyniowe mózgu, toczeo mózgu,
policytemia.
Dziedziczne choroby z pląsawicą w obrazie klinicznym - AD autsomal diminant, AR autosomal
recessive, X-linked
Huntington disease-like 1 (HDL1) (OMIM 603218) AD HDL1 is caused by a specific mutation
(8 extra octapeptide repeats) in the prion protein (PrP) gene, PRNP, on chr. 20p.
Huntington disease-like 2 (HDL2) AD The causative mutation is a CTG/CAG repeat expansion in the junctophilin-3
gene (JPH3). The prevalence of HDL2 is highest among (and perhaps exclusive to) individuals of African descent.
Chorea-acanthocytosis (ChAc) AR VPS13A, which encodes chorein, is the only gene in which mutation is currently
known to cause ChAc.
McLeod neuroacanthocytosis syndrome (MLS) X-linked XK is the only gene in which mutation
is known to cause MLS.
Spinocerebellar ataxia type 17 (SCA17) AD - TBP gene
Dentatorubral-pallidoluysian atrophy (DRPLA) AD
Benign hereditary chorea (OMIM 118700) AD
Hereditary cerebellar ataxia (see Ataxia Overview).
Creutzfeld-Jakob disease (see Genetic Prion Diseases).
Early-onset familial Alzheimer disease
Familial frontotemporal dementia with parkinsonism-17 (FTDP-17)