ENZYMY

Rozdział 3
ENZYMY
Aktywność katalityczna jest najważniejszą cechą białek, ściśle związaną z budową ich cząsteczek. Białka aktywne katalitycznie nazywane są enzymami (od grec.
en – wewnątrz, zym – zaczyn). Enzymy są katalizatorami, które zmieniają szybkość
reakcji, same nie ulegając zmianie. Pierwsze wiadomości o ich istnieniu uzyskano
podczas badania procesu hydrolizy skrobi przy użyciu wyciągu słodu (Kirchhoff,
1814). W 1836 r. J. Berzelius ogłosił klasyczną teorię katalizy chemicznej, a nieco
później Pasteur i Kühne rozwinęli prace nad katalizą enzymatyczną.
Reakcje katalizowane przez enzymy zazwyczaj przebiegają we względnie łagodnych warunkach (temperatura poniżej 100oC, ciśnienie atmosferyczne i pH ≈ 7)
w porównaniu z warunkami odpowiednich niekatalizowanych reakcji chemicznych. Przekształcenia substancji na drodze enzymatycznej stanowią materialną
i energetyczną istotę procesów życiowych. Enzymy są bodźcami wszystkich przekształceń chemicznych biorącymi udział w procesach regulacji przemian różnorodnych związków.
Obecnie znanych jest kilka tysięcy białek enzymatycznych, z których kilkaset
zostało wyizolowanych, oczyszczonych i zsekwencjonowanych. Szacuje się, że
żywa komórka może zawierać do 3.000 różnych enzymów, z których każdy katalizuje indywidualną reakcję chemiczną.
Enzymy jako specyficzne katalizatory biologiczne różnią się od katalizatorów
nieorganicznych, pomimo, że zarówno jedne, jak i drugie przyspieszają osiągnięcie
stanu równowagi w procesach chemicznych przebiegających samorzutnie ale bardzo powoli. Biokatalizatory podobnie jak katalizatory nieorganiczne nie wywołują
reakcji chemicznych, a jedynie je przyspieszają. Różnica między nimi polega na
tym, że w porównaniu z katalizatorami nieorganicznymi, enzymy działają efektywnie. Na przykład, hydrolityczny rozpad białka do aminokwasów w obecności
katalizatorów nieorganicznych (mocnych kwasów lub zasad) następuje w temperaturze 100°C albo wyższej, w ciągu kilkudziesięciu godzin. Ten sam proces przy
udziale enzymów przebiega w ciągu kilkudziesięciu minut w temperaturze
30-40°C. Hydroliza skrobi wymaga kilkugodzinnego ogrzewania w roztworze
kwasu, podczas gdy przy udziale odpowiedniego enzymu ten sam proces następuje
w ciągu kilku minut w temperaturze pokojowej.
Enzymy posiadają niezwykle wysoką specyficzność działania, czego nie mają
katalizatory nieorganiczne. Każdy enzym przyspiesza katalitycznie, reguły, jedną
reakcję chemiczną lub w skrajnym przypadku grupę reakcji jednego typu. Szereg
64
Podstawy biochemii
różnic pomiędzy enzymami i zwykłymi katalizatorami nieorganicznymi związanych jest z białkową naturą enzymów. Należą do nich: stabilność termiczna, zależność od pH środowiska, obecność aktywatorów lub inhibitorów i in.
Katalityczne działanie enzymów reguluje procesy hydrolizy, fosforolizy, utlenienia i redukcji, rozszczepienia i syntezy, izomeryzacji, przenoszenia grup funkcyjnych, takich jak rodniki metylowe lub reszty kwasu fosforowego. Zdecydowana
większość procesów chemicznych zachodzących w żywych organizmach przebiega
przy udziale enzymów przede wszystkim dlatego, że ich funkcja katalityczna stanowi podstawę procesów życiowych. Oddziaływanie enzymów na substancje lecznicze, np. na antybiotyki, prowadzi do zmian ich struktury, co umożliwia wyleczenie choroby. Odwrotnie, zmiana aktywności enzymatycznej pod wpływem toksyn
bakteryjnych i innych trucizn prowadzi do utrwalenia stanu chorobowego organizmu. Stymulowanie wzrostu roślin preparatami stosowanymi w rolnictwie w większości przypadków polega na zakłócaniu procesów biosyntezy przez wpływanie na
aktywność enzymów. Specyficzność enzymów decyduje o zróżnicowaniu gatunkowym organizmów, a zaburzenia ich biosyntezy mogą być przyczyną chorób
dziedzicznych.
Enzymy izolowane ze źródeł naturalnych nie tracą swych zdolności katalitycznych. Właściwość ta znalazła praktyczne zastosowanie w przemyśle lekkim, chemicznym, farmaceutycznym i przetwórczym. Szczególne znaczenie dla przemysłu
chemicznego ma specyficzność enzymów. Szacuje się, że ok. 80% strat w produkcji niektórych substancji chemicznych spowodowane jest oddzielaniem domieszek,
powstających jako produkty reakcji ubocznych. Proces technologiczny zostaje
znacznie przyspieszony, gdy reakcje syntezy przeprowadza się za pośrednictwem
wysoko wyspecjalizowanych enzymów, przyspieszających tylko reakcję powstawania żądanego produktu. Ponadto, enzymy umożliwiają przebieg wielu procesów,
których do tej pory nie udało się przeprowadzić tradycyjnymi metodami syntezy
organicznej. Przykładem może tu być otrzymywanie leków przeciwzapalnych drogą enzymatycznej transformacji sterydów.
3.1. Budowa enzymów
Enzymy mogą być jednoskładnikowymi, prostymi białkami lub białkami złożonymi. W wielu przypadkach enzym zawiera dodatkową grupę niebiałkową, tak
zwany koenzym.
W różnych okresach stosowano różne nazwy części białkowej i grupy dodatkowej. Wszystkie z nich (wymienione poniżej) stosowane są także obecnie, np.:
Enzym jako całość
Simpleks
Holoferment
Część białkowa
Feron (nośnik)
Apoenzymn
Grupa dodatkowa
Agon (grupa aktywna)
Koenzym
Rozdział 3. Enzymy
65
Grupa dodatkowa, która oddysocjowuje od części białkowej, nazywana jest grupą
prostetyczną, a grupa dodatkowa, łatwo ulegająca dysocjacji od apoenzymu i zdolna do samodzielnego funkcjonowania, nazywana jest koenzymem.
Budowa chemiczna najważniejszych koenzymów została opisana w latach 30.
XX wieku w pracach O. Warburga, R Kuhna, P. Karrera. Okazało się, że rolę koenzymów pełni większość witamin (E, K, Q, B1, B2, B6, C, H) lub związków zawierających witaminy (koenzym A, NAD+). Aktywność koenzymatyczną posiadają
także związki, takie jak: HS-glutation, liczna grupa nukleotydów i ich pochodnych
oraz estry fosforanowe niektórych sacharydów oraz jony metali.
Cechą charakterystyczną dwuskładnikowych enzymów jest to, że ani część
białkowa, ani grupa dodatkowa osobno nie posiadają aktywności katalitycznej.
Tylko ich kompleks posiada właściwość enzymu. W tym kompleksie białko wyraźnie podwyższa aktywność katalityczną grupy dodatkowej, natomiast grupa dodatkowa stabilizuje część białkową, czyniąc ją mniej podatną na czynniki denaturujące. W związku z tym, chociaż bezpośrednio funkcję katalityczną pełni grupa
prostetyczna, tworząca centrum katalityczne, nie jest ona aktywna bez części białkowych enzymu. Ponadto w apoenzymie występuje fragment o specyficznej budowie, który wybiórczo wiąże koenzym. Określany jest jako koenzym wiążący
domen, przy czym jego budowa u różnych apoenzymów, łączących się z tym samym koenzymem, jest podobna, jak np. struktury przestrzenne domen wiążących
nukleotydy domen szeregu dehydrogenaz.
Niektóre enzymy nie zawierają grupy dodatkowej, która może wchodzić w bezpośredni kontakt z przekształcanym związkiem. Funkcję tę pełni wówczas część
cząsteczki białkowej enzymu nazywana centrum katalitycznym. Centrum katalityczne enzymu jest unikalną konstrukcją przestrzenną zbudowaną z kilku reszt
aminokwasowych, zajmujących określony fragment cząsteczki białka.
W centrum katalitycznym tych enzymów występują najczęściej reszty ser, his,
try, arg, cys, asp, glu i tyr. Rodniki wymienionych aminokwasów pełnią w tym
przypadku funkcję odpowiadającą koenzymowi.
Reszty aminokwasów wchodzące w skład centrum katalitycznego enzymu
znajdują się w różnych miejscach łańcucha polipeptydowego, w związku z czym
centrum katalityczne może zostać utworzone, gdy cząsteczka białka przybiera charakterystyczną strukturę trzeciorzędową. Zmiany tej struktury pod wpływem określonych czynników prowadzą do deformacji centrum katalitycznego i zmiany aktywności enzymatycznej.
Oprócz centrum katalitycznego, utworzonego przez połączenie reszt aminokwasów i obecności koenzymu, w cząsteczkach enzymów wyróżnia się także inne domeny wiążące, jak np. centrum substratowe i allosteryczne.
Centrum substratowe będące częścią cząsteczki enzymu, która odpowiada za
przyłączenie substratu ulegającego przekształceniu enzymatycznemu, często nazywany jest „placem kotwicznym” enzymu, na którym substrat pełni rolę statku.
Ma ono wymiar przestrzenny i często tworzy zagłębienie lub szczelinę na po-
66
Podstawy biochemii
wierzchni białka, w której substrat wiązany jest licznymi słabymi oddziaływaniami. Proponowane są dwa modele wyjaśniające sposób, w jaki enzym wiąże swój
substrat: model zamka i klucza oraz model dopasowania indukowanego. Badania
prowadzone w ostatnich latach wykazały, że najważniejsze są siły elektrostatyczne,
siły oddziaływań hydrofobowych i wiązania wodorowe, powstające między rodnikami reszt aminokwasowych ośrodka substratowego enzymu a odpowiednimi grupami w cząsteczce substratu.
Centrum substratowe enzymu może być zlokalizowane w miejscu odpowiadającym centrum katalitycznemu (lub pokrywać się z nim), które może kształtować
się ostatecznie w trakcie dołączenia substratu. W związku z tym często mówi się
o centrum aktywnym enzymu łączącym właściwości centrum substratowego i centrum katalitycznego.
Centrum allosterycze stanowi fragment cząsteczki enzymu odpowiadający za
zmiany jego struktury trzeciorzędowej w wyniku przyłączania związków niskolub wysokocząsteczkowych, w wyniku czego następuje zmiana konfiguracji centrum aktywnego i obniżenie lub wzrost aktywności katalitycznej enzymu. Zjawisko
to jest podstawą tzw. regulacji allosterycznej aktywności katalitycznej enzymów.
Masy cząsteczkowe enzymów wynoszą od kilku tysięcy do kilku milionów daltonów. Kilkadziesiąt z nich to stosunkowo niewielkie cząsteczki (do 50.000 Da),
natomiast zdecydowana większość zbudowana jest z białek o większych masach
cząsteczkowych (rys. 3.1). Na przykład, katalaza (M = 252.000) zawiera 6 protomerów o masie jednostkowej wynoszącej 42000 Da. Cząsteczkę enzymu, katalizującego reakcję syntezy kwasów rybonukleinowych (polimeraza RNA,
M = 475.000), buduje pięć podjednostek o różnych masach cząsteczkowych. Cząsteczka dehydrogenazy glutaminianowej katalizująca proces utleniania kwasu glutaminowego (M = 475.000) składa się 6 podjednostek (M = 56.000).
Rys. 3.1. Budowa niektórych kompleksów enzymatycznych:
A – cząsteczka dehydrogenazy glutaminianowej, która zawiera 6 podjednostek (M = 56.000)
rozmieszczonych wzdłuż krawędzi tetraedru; masa cząsteczkowa enzymu równa jest 336.000;
B – model cząsteczki polimerazy RNA, zawierającej pięć podjednostek; dwie typu α
(M = 40.000), dwie typu β (M = 150.000) i β’ (M = 155.000) oraz σ-czynnik (M = 90.000); C – schemat budowy połówki cząsteczki katalazy; każda podjednostka wygląda jak dwa razy wygięta
pałeczka; D – kompleks polienzymatyczny, który przyspiesza reakcje dekarboksylowania utleniającego; E – karbamilotransferaza asparginianowa, która składa się z 6 katalitycznych
(M = 33.500, oznaczone jako C1 – C6) i 6 regulatorowych (M = 17.000, oznaczone jako R1 – R4; R5
i R6 nie są widoczne) podjednostek
Rozdział 3. Enzymy
67
Jak przedstawiono na rys. 3.1, różnorodne są sposoby łączenia protomerów
w multimery. Najważniejsze znaczenie ma fakt, że enzym zbudowany z podjednostek wykazuje maksymalną aktywność tylko w postaci multimeru, a dysocjacja na
protomery obniża jego aktywność. Obok protomerów aktywnych katalitycznie
w skład cząsteczek enzymów wchodzą też białka regulatorowe, jak np. w przypadku karbamilotransferazy asparaginianowej (rys. 3.1).
Wśród enzymów multimerycznych zdecydowaną przewagę stanowią dimery
i tetramery (jest ich kilkaset), mniej jest heksamerów i oktamerów (kilkadziesiąt),
a niezwykle rzadko spotyka się trimery i pentamery.
W wielu przypadkach multimeryczne cząsteczki enzymów składają się z podobnych podjednostek dwóch typów, oznaczonych jako A i B, przy czym niektóre
elementy ich struktury pierwszo- i trzeciorzędowej są różne. W zależności od stosunku protomerów typu A i B w multimerze protomer B może występować w postaci kilku izomerów nazywanych izozymami. Przy czterech podjednostkach możliwych jest 5 izomerów:
I
AAAA
II
AAAB
III
AABB
IV
ABBB
V
BBBB
Zjawisko to zostało zbadane w przypadku enzymu katalizującego odwracalną
przemianę w mięśniach kwasu mlekowego w kwas pirogronowy:
Utlenianie
CH3CH(OH)COOH
Kwas mlekowy
⇄
CH3COCOOH
Redukcja
Kwas pirogronowy
W związku z tym, że utlenianie kwasu mlekowego (acidium lacticum) zachodzi
w wyniku usunięcia jonu H-, enzym ten zwany jest dehydrogenazą mleczanową.
Jedna cząsteczka enzymu (M = 140.000) składa się z 4 podjednostek (M = 35.000)
umownie oznaczonych jako H i M (ang. heart – serce, muscle – mięsień), ponieważ
izoenzymy dehydrogenazy mleczanowej typu I i V izolowane są z serca i mięśni
szkieletowych. Na tej podstawie wyróżnia się następujące izoenzymy dehydrogenazy mleczanowej:
I
HHHH
II
HHHM
III
HHMM
IV
HMMM
V
MMMM
Izozymy różnią się między sobą stopniem aktywności, własnościami fizycznymi, takimi jak masa cząsteczkowa i ruchliwość elektroforetyczna, oraz lokalizacją
w tkankach i organach. W zależności od wieku i stanu fizjologicznego organizmu
dochodzi do ustalenia ilości izoenzymów, której odpowiada określony poziom
aktywności enzymu. Zmiana poziomu izoenzymów w organizmie lub w tkankach
i organach jest więc jednym ze sposobów regulacji aktywności enzymów. Oprócz
izoenzymów warunkowanych genetycznie, stwierdzono także ich występowanie
będące wynikiem modyfikacji potranslacyjnych.
68
Podstawy biochemii
Badania tzw. multienzymów, czyli enzymów katalizujących jednoczesny przebieg kilku reakcji chemicznych oraz dokonujących złożonych przekształceń substratu, pozwalają na określenie znaczenia ich budowy przestrzennej. Przykładem
takiego związku jest multienzym katalizujący dekarboksylację kwasu pirogronowego. Ten wielofunkcyjny kompleks o M = 4.500.000 składa się z trzech rodzajów
enzymów. Pierwszy (E1) katalizuje reakcję dekarboksylacji kwasu pirogronowego.
W skład kompleksu wchodzi 12 dimerów (M = 192.000) (zob. rys. 3.1E) w postaci
dużych jednostek ułożonych parami wzdłuż obwodu. Enzymy drugi i trzeci, które
katalizują procesy redox zachodzące podczas utleniania kwasu pirogronowego,
znajdują się wewnątrz kompleksu multienzymowego. Jeden z nich (E3), składa się
z 6 dimerów (M = 112.000), a drugi (E2) z 24 protomerów (M = 70.000)
(rys. 3.1D).
W przypadku, gdy multienzymatyczny kompleks katalizuje jeden złożony proces przekształceń biochemicznych, nazywamy go metabolonem (od słowa metabolizm – przemiana materii). Na przykład metabolony glikolizy, biosyntezy szeregu
aminokwasów czy cyklu kwasów dwu- i trójkarboksylowych.
Skoordynowane działanie trzech rodzajów enzymów wchodzących w skład
multienzymu zapewnia bardzo szybkie przekształcanie kwasu pirogronowego.
Takie współdziałanie w procesie katalitycznym odróżnia biokatalizatory od nieorganicznych katalizatorów, i dlatego biokataliza ma wielokrotnie wyższą efektywność.
Stosunkowo niedawno odkryto kolejną, charakterystyczną cechę budowy enzymów. Jest nią wielofunkcyjność, polegająca na wykazywaniu kilku rodzajów
aktywności enzymatycznej przez jeden łańcuch polipeptydowy. Łańcuch ten tworzy kilka funkcjonalnie i przestrzennie wyodrębnionych elementów – domen, z których każda charakteryzuje się określoną aktywnością katalityczną.
Najważniejszą cechą katalizy enzymatycznej tego typu jest przekazywanie produktów poszczególnych reakcji przez kolejne składniki układu katalitycznego do
dalszych przekształceń bez ich uwalniania.
3.2. Mechanizm działania enzymów
Główną rolę w mechanizmie katalizy enzymatycznej odgrywa tworzenie się
kompleksów enzymatyczno-substratowych, na obecność których po raz pierwszy
wskazał D. Brown (1902). W pierwszej fazie katalizy enzymatycznej pomiędzy
substratem (lub substratami) a enzymem powstaje kompleks, w którym reagenty
mogą tworzyć wiązanie jonowe, kowalencyjne lub supramolekuły związane słabymi oddziaływaniami. W drugiej fazie substrat pod wpływem przyłączonego do
niego enzymu staje się podatny na odpowiednią reakcję chemiczną. W trzeciej
fazie następuje reakcja chemiczna, a w czwartej fazie produkty reakcji uwalniają
się z kompleksu enzymatycznego. Jeśli oznaczamy enzym przez E, a substrat przez
S, produkt reakcji przez P, to możemy ułożyć następujący schemat procesu:
Rozdział 3. Enzymy
I
II
III
69
IV
E + S ⇄ ES ⇄ ES* ⇄ EP ⇄ E + P
Schemat ten został zaproponowany przez V. Henriego (1903), a następnie przez
L. Michaelsa i M. Menten (1913) i został potwierdzony wydzieleniem kompleksów
ES, ES* i EP.
Przykładem katalizy enzymatycznej, zachodzącej według podanego schematu,
jest reakcja hydrolizy acetylocholiny. Związek ten pośredniczy (mediator) w przekazywaniu impulsów nerwowych. Aby proces ten przebiegał nieprzerwanie, po
każdym akcie przekazywania impulsu nerwowego wywołująca go dawka acetylocholiny (1-2 µg) powinna ulec całkowitemu rozkładowi. Jest to możliwe dzięki
hydrolizie acetylocholiny z udziałem enzymu esterazy acetylocholinowej. Hydroliza przebiega z szybkością: 1-2 µg acetylocholiny w ciągu 0,1-0,2 ms:
Esteraza
acetylocholinowa
CH3COOCH2CH2N+(CH3)3 + H2O
Acetylocholina
→
CH3COOH + HOCH2CH2N+(CH3)3
Kwas octowy
Cholina
Esteraza acetylocholinowa nie zawiera koenzymu. W jego centrum aktywnym
znajdują się co najmniej 4 reszty aminokwasowe – glu, ser, his, tyr, zapewniające
odpowiedni przebieg katalizy enzymatycznej.
Na początku pomiędzy enzymem (esteraza acetylocholinowa) i substratem (acetylocholina) dochodzi do utworzenia kompleksu enzym – substrat w wyniku oddziaływania elektrostatycznego pomiędzy ujemnie naładowaną grupą COO- reszty
glu i dodatnio naładowanym atomem N cząsteczki acetylocholiny (rys. 3.2B).
Po utworzeniu kompleksu enzym – substrat w reakcję zostają włączane pozostałe reszty aminokwasowe centrum aktywnego esterazy acetylocholinowej.
W pierwszej kolejności powstaje wiązanie pomiędzy atomem węgla spolaryzowanej grupy CO acetylowego rodnika choliny a tlenem grupy OH w reszcie ser. Następnie w wyniku oddziaływania tlenu grupy estrowej cząsteczki acetylocholiny
i grupy OH reszty tyr powstaje wiązanie wodorowe (rys. 3.2.C).
Ułożenie cząsteczki acetylocholiny i reszt ser i tyr w centrum aktywnym enzymu powoduje osłabienie wiązania między grupą CO i atomem tlenu grupy estrowej
cząsteczki acetylocholiny. Efekt ten prowadzi do tego, że rozpad cząsteczki acetylocholiny wymaga mniejszej energii, tzn. bariera energetyczna zostaje znacznie
obniżona dzięki aktywacji cząsteczki acetylocholiny w kompleksie ES*. Dlatego
pod wpływem reszty his, która przyciąga na siebie proton z grupy OH ser, utrwala
się wiązanie estrowe między resztą ser i grupą acetylową, jednocześnie rozpada się
wiązanie estrowe w cząsteczce acetylocholiny i proton z reszty tyr przechodzi na
resztę choliny (rys. 3.2D). Proton ten uwalnia się z centrum aktywnego
(rys. 3.2IV), a jego miejsce zajmuje cząsteczka wody. Tworzy ona wiązanie wodorowe z karbonylowym tlenem grupy acetylowej i tlenem tyr (na rysunku 3.2 etap
70
Podstawy biochemii
ten nie jest zaznaczony). Następnie proton z reszty his wraca na atom tlenu grupy
OH ser, a proton cząsteczki wody – do reszty fenolowej tyr. Jednocześnie powstaje
drugi produkt reakcji – kwas octowy i odnawia się wolne centrum aktywne esterazy acetylocholinowej (rys. 3.2A) gotowe do następnego cyklu reakcji katalizy.
CH 3
OH
H 3C
CO
+
O
OH
(CH 2) 2 N
CH 2
OH
OH
I
HN
HN
N
N
O
CH 2
CH 3 CH 3
O
CH 2
OOC (CH 2)2
CH 2
CH 3
H 3C
P
CO
+
O
(CH 2)2 N OOC (CH 2)2 P
CH 3 CH 3
OH
OH
+
(CH 2)2 N
A
CH 2
CH 3
HO
IV
CH 3 CH 3
B
CH 2
O
CH 3COOH O
H 2O
OH
C
CH 2
CH 2
OH
O
CO
CH 3
+
HN
HN
N
NH
O
II
OH
D
CH 2
O
CH 3
HO
+
CO
CH 3
O
(CH 2)2 N OOC (CH 2)2 P
CH 3
CH 2
+
(CH 2)2 N OOC (CH 2) 2 P
CH 3 CH 3
CH 3 CH 3
H
O
O
III
CH 2
CH 2
O
O
Rys. 3.2. Mechanizm działania esterazy acetylocholinowej:
A – centrum aktywny enzymu; B – kompleks enzym – substrat; C – przygotowanie substratu do
reakcji (aktywacja); D – kompleks produktów reakcji z enzymem (wyjaśnienie w tekście)
W procesie tworzenia kompleksu enzym – substrat, jak również w dalszych etapach katalizy enzymatycznej, zachodzą niejednokrotnie zmiany trzeciorzędowej
struktury enzymu prowadzące do zbliżenia reaktywnych grup z substratem. Zmiana
trzeciorzędowej struktury białka nie jest możliwa bez udziału całego lub prawie całego łańcucha polipeptydowego tworzącego cząsteczkę białka, co świadczy o tym, że
w katalizie enzymatycznej bierze udział cała lub prawie cała cząsteczka enzymu.
Specyficzność substratu zapewnia wiązanie cząsteczki enzymu w innych domenach niż centrum aktywne. Do utrwalenia wiązania substratu z enzymem dochodzi
w wyniku wielopunktowych kontaktów w formie słabych oddziaływań hydrofobowych i utworzenia wiązań wodorowych. Jednocześnie w centrum aktywnym
enzymu stabilizowana jest część substratu biorąca udział w reakcji, która osiąga
konfigurację bliską przejściowemu stanowi przekształcenia substratu w produkt.
W rezultacie reagująca część cząsteczki substratu oraz katalityczne grupy enzymu
Rozdział 3. Enzymy
71
tworzą kompleks przejściowy, w którym już częściowo zrealizowane są przejścia
elektronowo-konformacyjne, niezbędne dla chemicznego stadium procesu enzymatycznego. Prowadzi to do obniżenia energii aktywacji niezbędnej do realizacji reakcji chemicznej, dzięki efektowi immobilizacji i utrwalenia ścisłej orientacji substratów w centrum aktywnym enzymu. W ten sposób każde ogniwo wieloetapowej
reakcji enzymatycznej stwarza niemalże optymalne warunki dla przebiegu następnego etapu, w związku z czym reakcja katalizowana enzymatycznie przebiega wielokrotnie szybciej niż nie katalizowana. Zmiany energii swobodnej (Gibbsa)
(∆G, kJ⋅mol-1) zachodzące w przebiegu reakcji biochemicznej przedstawia rys. 3.3.
Rys. 3.3. Zmiany energii swobodnej (∆G, kJ⋅mol-1) podczas przebiegu reakcji biochemicznej: I – reakcja nie katalizowana enzymatycznie; II – reakcja katalizowana
enzymatycznie; P – produkty reakcji, S – substraty, SP – stan przejściowy; ∆G# – energia aktywacji reakcji; ∆Go – sumaryczna zmiana energii reakcji.
Na rysunku 3.3 przedstawiono przykład, dotyczący reakcji hydrolizy acetylocholiny, w którym sumaryczna zmiana energii reakcji (∆Go) czyni ją energetycznie
korzystną (tzn. produkty mają niższy poziom energii niż substraty, a ∆Go ma wartość ujemną). Dla każdej reakcji istnieje bariera energetyczna, którą należy pokonać, aby umożliwić jej przebieg. Jest to ilość energii potrzebna do przeprowadzenia
cząsteczek substratu w stan przejściowy (SP), który ma największą energię swobodną ze wszystkich związków na drodze reakcji. Energia swobodna (∆G#) równa
jest różnicy energii swobodnej między stanem przejściowym a substratem
(rys. 3.3). Enzym nie zmienia poziomu energii zarówno substratu, jak i produktu.
Oznacza to, że enzym zwiększa szybkość przebiegu reakcji, ale nie wpływa na
ogólną zmianę energii w reakcji (∆Go).
72
Podstawy biochemii
3.3. Kinetyka reakcji enzymatycznych
Kinetyka reakcji enzymatycznych bada zależność szybkości reakcji przebiegającej w obecności enzymu od natury chemicznej reagujących związków (substraty,
enzym) i warunków przebiegu reakcji, takich jak stężenie, temperatura, pH środowiska i obecność aktywatorów lub inhibitorów. Zależność szybkości reakcji od
temperatury, pH środowiska oraz wpływu inhibitorów i aktywatorów w znacznej
mierze związana jest ze zmianami właściwości enzymu wynikającymi z jego struktury białkowej. W związku z tym omawiane prawidłowości określa natura i stężenie reagujących substancji oraz ich zmiany.
Pierwszą fazą procesu katalitycznego jest utworzenie kompleksu enzym – substrat:
k+1
E + S ⇄ ES
k-1
Układ w stanie równowagi może być opisany odpowiednią stałą równowagi.
Wielkość odwrotna do niej nazywa się stałą dysocjacji kompleksu enzym – substrat lub stałą substratową i oznaczana jest jako Ks:
Ks = [E] [S] / [ES]
Wielkość stałej Ks zależy od natury substratu i enzymu i wyraża stopień ich
powinowactwa. Na przykład, dla sacharazy (enzymu przyspieszającego hydrolizę
sacharozy) Ks = 0,0167 M, czyli stężenie kompleksu enzym – substrat ok. 60 razy
przewyższa iloczyn stężeń wolnego enzymu i substratu. Im niższa wielkość Ks, tym
wyższe powinowactwo enzymu do substratu.
Ponieważ stężenie kompleksu enzym – substrat zmienia się na skutek przemiany substratu w produkt reakcji czemu towarzyszy regeneracja wolnego enzymu:
k +2
ES → E + P,
to wielkość Ks określa stosunek stałej prędkości reakcji przebiegającej w kierunku
od lewej do prawej strony równania reakcji (k+1) do reakcji odwrotnej (k-1):
Ks = k-1 / k+1.
Do tego wniosku dochodzimy porównując szybkości reakcji przebiegającej
w kierunku od lewej do prawej strony równania reakcji i odwrotnie. Wtedy można
uzyskać wielkości charakterystyczne dla stanu równowagi systemu: v1 = k+1 [E]
[S]; v2 = k-1 [ES]. Jeśli v1 = v2, to wtedy k+1 [E] [S] = k-1 [ES], tj. [E] [S] / [ES] = k-1 /
k+1 = Ks.
Stała substratowa lub stała dysocjacji kompleksu enzym – substrat (Ks) charakteryzuje proces katalityczny z punktu widzenia powinowactwa enzymu i substratu
oraz stosunku stałej szybkości reakcji rozpadu i tworzenia się kompleksu enzym –
substrat. Ponieważ jednocześnie z dysocjacją kompleksu enzym – substrat następu-
Rozdział 3. Enzymy
73
je przekształcenie substratu w produkt i rozpad kompleksu enzym – produkt na
tworzące go komponenty:
k+1
k+2
E + S ⇄ ES →E + P
k-1
dla pełnej charakterystyki procesu katalizy enzymatycznej wprowadzono pojęcie
stałej Michaelsa (Km), którą określa stosunek stałych szybkości wszystkich trzech
reakcji realizowanych w procesie katalizy enzymatycznej: Km = (k-1 + k+2)/k+1. Km
zawsze jest większa niż Ks. W przypadku kompleksu sacharazy i sacharozy Ks =
0,0167 M, natomiast Km = 0,0280 M.
Szybkość każdej reakcji chemicznej określa się liczbą moli substratu, które
przereagowały w jednostce czasu. Ważne jest, aby warunki reakcji były standardowe, tzn. żeby reakcja przebiegała w określonej temperaturze, przy optymalnym
pH i przy odpowiednim nasyceniu enzymu substratem. W takich warunkach szybkość reakcji enzymatycznej, oznaczaną jako Vmax, określa się maksymalną szybkością reakcji enzymatycznej, wyrażaną przez stężenie enzymu i stałą szybkości rozkładu kompleksu enzym – produkt: Vmax = k+2 [E].
Szybkość reakcji enzymatycznej obserwowana w warunkach niepełnego nasycenia substratu enzymem oznacza się jako v. Odpowiada ona stężeniu kompleksu
enzym – substrat: v = k+2 [ES]. Ponieważ [ES] = k+1/k-1[E][S], a k+1/k-1 = 1/Ks, tzn.
[ES] = [E][S]/Ks, to v = k+1[E][S]/Ks.
W związku z tym obserwowana szybkość reakcji enzymatycznej zależy od stężeń enzymu i substratu oraz ich wzajemnego powinowactwa. Liczbowo Km jest
równa stężeniu substratu (w mol/l), przy którym v = ½ V (rys. 3.4).
V, mmol/min
0.25
0.20
Vmax= k +2 [E]
0.15
0.10
0.05
0.1
0.2
0.3
0.4 [S], mmol
Rys. 3.4. Zależność szybkości reakcji enzymatycznej (v) od stężenia substratu (S)
w warunkach stałego stężenia enzymu
Po osiągnięciu stanu nasycenia enzymu przez substrat szybkość reakcji enzymatycznej v osiąga
wielkość maksymalną
74
Podstawy biochemii
Stężenie enzymu i substratu wyrażane jest zazwyczaj ilością mikromoli w litrze.
Jednak w związku z tym, że dokładna masa cząsteczkowa i liczba katalitycznych
centrów aktywnych dla większości enzymów nie są znane, stosuje się względny
sposób określenia absolutnej ilości enzymu. Za jednostkę aktywności enzymu
(oznaczaną jako E w języku niemieckim i rosyjskim oraz jako U w języku angielskim, francuskim, włoskim i hiszpańskim) przyjmuje się tę jego ilość, która w standardowych warunkach katalizuje przemianę 1 µmola substratu w ciągu 1 minuty
(1 µmol/min). Przedstawiony system oznaczeń został wprowadzony w 1961 r.
przez Komisję do Spraw Enzymów Międzynarodowej Unii Biochemicznej i stosowany jest obecnie. Zgodnie z danym systemem, szybkość reakcji enzymatycznej
określa się liczbą mikromoli substratu ulegającego przemianie w ciągu 1 minuty.
W roku 1972 zaproponowano zmianę jednostki aktywności enzymatycznej (E lub
U), wprowadzając nową, zwaną katalem (kat), która określa ilość enzymu przekształcającą w ciągu 1 sekundy 1 mol substratu w warunkach standardowych. Ponieważ jednostka aktywności enzymatycznej wynosząca 1 kat, odpowiadająca szybkości reakcji równej 1mol/s, która nie jest obserwowana (przemiany chemiczne w
takich układach zachodzą ze znacznie mniejszą szybkością), aktywność katalityczną
w nowym systemie jednostek wyraża się w mikrokatalach (µkat), nanokatalach
(nkat) lub pikokatalach (pkat), czemu odpowiadają prędkości reakcji w mikromolach, nanomolach i pikomolach na sekundę. Jednostkę E lub U równą 16,67 nkat,
planuje się zastąpić w najbliższych latach, określając aktywność enzymatyczą
w katalach.
Stężenie enzymu w roztworze wyrażone w jednostce E określa ilość enzymu
w 1 ml roztworu. W przypadku suchego preparatu enzymu podaje się ilość E w 1 mg.
Jeżeli w preparacie enzymu określona została zawartość białka, to właściwa aktywność enzymu E, określana jest dla 1 mg białka. Ilość E w 1 mg czystego enzymu
określana jest jako właściwa aktywność enzymu. Jeżeli znana jest masa molowa enzymu, to jako wielkość E w 1 µg enzymu, można obliczyć molekularną aktywność
enzymu. Oznacza to, że wylicza się nie stężenie enzymu, a jego aktywność wyrażaną
liczbą mikromoli substratu ulegających przemianie przez 1 mg enzymu w ciągu 1 min
(właściwa aktywność enzymu), lub liczbę moli substratu ulegających przemianie
w ciągu 1 min pod wpływem jednej cząsteczki enzymu (aktywność molekularna).
Znając ilość centrów aktywnych cząsteczki enzymu, aktywność można określać
liczbą cząsteczek substratu ulegających przemianie w jednym centrum aktywnym.
Na przykład, aktywność molekularna katalazy równa jest 5 mln, natomiast aktywność jednego z jej czterech centrów katalitycznych stanowi tylko 1 mln 250 tys.
cząsteczek H2O2.
3.4. Właściwości enzymów
Jako białka, enzymy posiadają wszystkie właściwości tych związków i określone cechy specyficzne wynikające również z ich białkowego charakteru, które od-
Rozdział 3. Enzymy
75
różniają enzymy od innych katalizatorów. Odnoszą się one do termalabilności enzymów, zależności ich działania od pH środowiska, specyficzności oraz podatności
na działanie aktywatorów i inhibitorów.
Termolabilmość enzymów charakteryzuje się tym, że podwyższenie temperatury prowadzi z jednej strony do denaturacji białka i obniżenia funkcji katalitycznej,
zaś z drugiej – wpływa na szybkość reakcji tworzenia kompleksu enzym – substrat
oraz na następne etapy tworzenia się produktu reakcji, co prowadzi do wzmocnienia katalizy.
µ
0.10
A, %
100
0.05
50
0
20
40
0
60 T, C
Rys. 3.5. Wpływ temperatury (T) na
szybkość reakcji enzymatycznej (V)
0
7
14 pH
Rys. 3.6. Wpływ pH środowiska na
aktywność enzymu (A).
(komentarz w tekście)
Zależność aktywności katalitycznej enzymu od temperatury ma charakter krzywej przechodzącej przez maksima (rys. 3.5). Aktywność enzymu wzrasta średnio
do 50ºC, przy czym na każde 10ºC prędkość przemiany substratu zwiększa się ok.
2 razy. Jednocześnie w wyniku denaturacji, stopniowo wzrasta ilość inaktywowanego enzymu. W temperaturze 50ºC następuje denaturacja białka enzymatycznego
i chociaż prędkość przekształcania substratu rośnie, to aktywność enzymu, wyrażona ilością przekształconego substratu, ulega obniżeniu. Badania zależności
zmian aktywności enzymów zależnych od temperatury wykazały, że mają one
skomplikowany charakter. W wielu przypadkach nie obserwuje się na przykład
dwukrotnego wzrostu aktywności enzymu wraz ze wzrostem temperatury o 10oC,
czego główną przyczyną są zmiany konformacyjne cząsteczki enzymu.
Temperatura odpowiadająca najwyższej aktywności katalitycznej określana jest
jako temperatura optymalna. Jest ona różna dla różnych enzymów, przy czym najczęściej w przypadku enzymów pochodzenia zwierzęcego wynosi 40-50ºC, a roślinnego 50-60ºC. Enzymem o wyższej temperaturze optymalnej jest np. papaina
(enzym roślinny katalizujący hydrolizę białka), którego temperatura optymalna
stanowi 80ºC. Z kolei dla katalazy (enzymu przyspieszającego rozkład H2O2 do
76
Podstawy biochemii
H2O i O2) temperatura optymalna wynosi 0-10ºC, gdyż w temperaturze wyższej
następuje utlenienie i inaktywacja enzymu.
Zależność aktywności enzymu od pH środowiska została opisana na początku
XX wieku. Każdy enzym posiada optymalne pH, przy którym wykazuje maksymalną aktywność, przy czym dla większości z nich występuje ona w pH zbliżonym
do obojętnego. Wielkość optymalnego pH odpowiada optymalnej jonizacji reszt
centrum aktywacji enzymu. W środowisku kwaśnym lub zasadowym maksymalną
aktywność wykazują tylko niektóre enzymy (tab. 3.1).
Tabela 3.1. Optymalne wartości pH niektórych enzymów
Enzym
Rodzaj reakcji katalitycznej
Pepsyna
Lipaza (z nasion rącznika)
Ureaza
Trypsyna
Arginaza
pH
Hydroliza białka
Hydroliza tłuszczów
Hydroliza mocznika
Hydroliza białka
Hydroliza argininy
1,5 – 2,5
4,7 – 5,0
7,0
7,8
9,5 – 9,9
Porównując z wartością optymalną, zmiana stężenia jonów wodorowych prowadzi do zaniku aktywności enzymu. Na rys. 3.6 linia krzywa przedstawia zależność aktywności katalitycznej enzymu od pH.
Stężenie jonów wodorowych ma wpływ na aktywność katalityczną centrum aktywnego, które może ulegać jonizacji lub ekranowaniu przez sąsiadujące z nim
fragmenty polipeptydowe enzymu. Ponadto pH zmienia stopień jonizacji substratu,
kompleksu enzym – substrat, produktów reakcji oraz ilość centrów kationowych
i anionowych decydujących o charakterystycznej trzeciorzędowej strukturze białka,
niezbędnej do utworzenia kompleksu enzym – substrat.
Jedną z najważniejszych właściwości enzymów jest ich specyficzność, odkryta
już w XIX wieku podczas rozszczepienia wiązania estrowego izomerów przestrzennych α- i β-metyloglukozydów. Zaobserwowano, że strukturalnie podobne
izomery przestrzenne są przekształcane na drodze reakcji z udziałem różnych enzymów:
CH2OH
H
H
OH
CH2OH
O H
H
OCH3
HO
H
H
OH
α-Metyloglukozyd
(za pomocą enzymu ze słodu
wiązanie eterowe ulega hydrolizie)
H
OH
O OCH
3
H
HO
H
H
OH
β-Metyloglukozyd
(za pomocą enzymu z nasion migdalu
gorzkiego wiązanie eterowe ulega hydrolizie)
Enzymy mogą rozróżniać związki chemiczne różniące się niewielkimi szczegółami budowy cząsteczki, np. układem przestrzennym rodnika metoksylowego
i atomu wodoru przy pierwszym atomie węgla w cząsteczce metyloglukozydu.
Rozdział 3. Enzymy
77
Jak już wspomniano wyżej, funkcjonują dwa modele wyjaśniające, jak enzym
może wiązać swój substrat. W modelu zamka i klucza, zaproponowanym w 1894 r.
przez E. Fischera, kształt substratu i aktywnego miejsca enzymu pasują do siebie
jak klucz do zamka, co wynika z badań specyficzności działania enzymu zależnej
od struktury geometrycznej substratu i centrum aktywnego enzymu. W latach 50.
XX wieku model ten został zastąpiony hipotezą D.E. Koshlanda o indukowanej
zgodności enzymu z substratem, które mówi o komplementarności budowy przestrzennej substratu i centrum aktywnego enzymu pojawiającej się w momencie ich
współdziałania. Deformacja niektórych kątów walencyjnych substratu i zmiany
konformacyjne w cząsteczce enzymu umożliwiają przebieg reakcji. Hipoteza
Koshlanda, zakładająca plastyczność centrum aktywnego, wyjaśnia aktywacji
i osłabianie działania enzymów, czyli regulację ich aktywności pod wpływem
czynników allosterycznych. Zmiany konformacyjne cząsteczki enzymu zależne od
zmian jego aktywności Koshland porównywał z kołysaniem pajęczyny w chwili,
gdy wpada do niej zdobycz (substrat), podkreślając w ten sposób znaczną labilność
struktury enzymu w czasie reakcji katalitycznej.
W ostatnim czasie hipoteza ta zastępowana jest stopniowo hipotezą topochemicznej
odpowiedniości. Zachowując podstawowe założenia przedstawione przez Koshlanda,
kładzie ona nacisk na rozpoznawanie przez enzym tej części substratu, która nie zmienia się w czasie katalizy. Pomiędzy nią i substartowym centrum enzymu występują
liczne punktowe oddziaływania hydrofobowe oraz wiązania wodorowe.
Nie ma więc wątpliwości, że specyficzność enzymów można tłumaczyć przede
wszystkim dopasowaniem przestrzennej konfiguracji substratu i centrum aktywnego enzymu. Tylko wtedy, gdy dopasowanie to jest wystarczająco dokładne, może
powstać kompleks enzym – substrat. Na przykład, w cząsteczce lizozymu, który
katalizuje hydrolizę wiązań glikozydowych polisacharydów charakterystycznych
dla komórek bakterii, znajduje się szczelina odpowiedzialna za przyłączenie substratu, do której dopasowuje się część cząsteczki substratu, odpowiadająca długości
dokładnie sześciu sacharydów:
H
O
Łańcuch
H
H
OH
A
CH2OH
CH3
CH3
CO
CO
CH2OH
NH
H
O
H
O
H
O
O
H
H3C CH
COOH
Reszta
N-acetyloglukozaminy
H
H
B H
NH
H3C CO
O
H
H
H
O
CH2OH
CO
CH2OH
NH
OH
C
H
CH3
H
H
O
H
O
O
H
D H
NH
H
H3C CH
COOH
H3C
CO
O
H
H
H
OH
E
H
H
O
CH2OH
CH2OH
NH
O
H
O
O
H
F H
CH
COOH
H
NH
H
H3C
O
Łańcuch
H3C
CO
Reszta kwasu
N-acetylomuraminowego
Pozostała część substratu, zawierająca kilkaset reszt aminocukrów lub ich pochodnych, pozostaje wolna. Nie tylko kształt szczeliny cząsteczki lizozymu odpowiada parametrom dopasowującego się do niej substratu, ale i układ poszczególnych rodników aminokwasów w centrum substratowym jest komplementarny
78
Podstawy biochemii
z rozmieszczeniem określonych atomów oraz ich grup w cząsteczce substratu.
Pozwala to na utworzenie się wiązań wodorowych między lizozymem i polisacharydem, czyli powstawanie kompleksu enzym – substrat (tab. 3.2).
Tabela 3.2. Wielopunktowe oddziaływanie fragmentu cząsteczki polisacharydu błony komórkowej bakterii z lizozymem
Literowe oznaczenia
ogniw polisachrydowych
H
V
Energia
asocjacji
w kJ/mol
1
1
4
2
3
4
7
11
30
35
45
13
7,5 – 9,6
11,7 – 16,3
19,6 – 23,8
12,1 – 25,0
3,8 – 16,7
6,3 – 21,0
Liczba wiązań wodorowych (H)
i oddziaływań Van der Vaalsa (V)
A
B
C
D
E
F
Jednocześnie w centrum katalitycznym utworzonym przez reszty glu i asp, zajmujące położenie odpowiednio 35 oraz 52, w cząsteczce polisacharydu ustala się
wiązanie glikozydowe ułożone przez pierścienie D i E substratu. Umożliwia to
hydrolizę tego wiązania na skutek katalizy kwasowo-zasadowej:
CH2OH
Asp52
O
H
O
O
COO' + HOH
H
D H
H3C
H
H
CH
COOH
H3C
O
COOH
O
H
D
H3C
CH
COOH
Glu35
H
O
O
NH
OH
H
NH
H3C
E
H
H
H
H
H
CH3
HOOC
CO
O OH
H
OH
CO
CH2OH
CH2OH
Asp52
NH
H
NH
H
H
O
H
OH
E
H
O
CO
H
CH3
Glu35
O
'OOC
CH2OH
CO
Badania specyficzności enzymów wykazały jej zróżnicowanie. Dla jednych enzymów, np. ureazy, specyficzność ma charakter absolutny, polegający na katalizowaniu tylko jednej reakcji. Inne enzymy są aktywne w reakcjach określonego
typu, niezależnie od tego z jakimi substratami oddziałują. Ich podstawową cechą
jest charakter tworzonego lub rozkładanego wiązania. Enzymy tego typu posiadają,
tzw. specyficzność grupową. Spotykane są także enzymy wykazujące specyficzność stereochemiczną, polegającą na oddziaływaniu tylko na jeden z izomerów
przestrzennych danego związku, a są to m.in. enzymy katalizujące reakcje rozszczepienia α- i β-metyloglukozydów.
Rozdział 3. Enzymy
79
Wpływ aktywatorów i inhibitorów na przebieg reakcji enzymatycznych jako
pierwszy opisał w XIX wieku A. Danilewski. Do czynników zwiększających aktywność enzymów zalicza się jony wielu metali i niektóre aniony. Najczęściej
funkcję tę pełnią jony Mg2+, K+ i Co2+ oraz anionów Cl-. Na przykład, jony Mg2+
wchodzą w skład grupy prostetycznej enzymu, K+ ułatwiają tworzenie kompleksu
enzym – substrat, Co2+ uczestniczą w przyłączaniu koenzymu do apoenzymu, a Clprzyczyniają się do tworzenia czwartorzędowej struktury enzymu. Silne działanie
na aktywność enzymów wykazują aktywatory allosteryczne, które przyłączając się
do allosterycznego centrum enzymu zmieniają trzeciorzędową strukturę jego cząsteczki. W centrum substratowym i katalitycznym dochodzi do zmian konfiguracji
sprzyjających optymalnemu funkcjonowaniu enzymu.
Inhibitory hamują działanie enzymów. Mechanizm ich działania może być różny w przypadku różnych enzymów, ale na ogół sprowadza się do dwóch typów,
tzn. odwracalnego i nieodwracalnego hamowania reakcji. Podczas hamowania
nieodwracalnego inhibitor o strukturze podobnej do substratu łączy się z enzymem
trwale, zastępując substrat. Przykładem takiego typu działania może być zjawisko
hamowania aktywności esterazy przez diizopropylofluorofosforan:
F
H3C
CH
H3C
O
P
O
CH3
O
CH
CH3
Diizopropylofluorofosforan
Związek ten jest chyba najbardziej swoisty i najsilniejszy z odkrytych dotychczas inhibitorów. Hamuje on acetylocholinoesterazę w takim małym stężeniu, jak
10-10 mol⋅l-1.
Diizopropylofosforan blokuje centrum aktywne acetylocholinoesterazy, fosforylując reszty bocznej aktywnej katalitycznie seryny (zob. rys. 3.2). Utworzona
diizopropylofosfoseryna jest bardziej stabilna niż acetyloseryna i ulegając bardzo
powolnemu rozkładowi. Zablokowanie aktywnej seryny prowadzi do hamowania
aktywności centrum enzymatycznego. Aktywne pochodne kwasu fosforowego są
neurotoksynami. W wyniku zablokowania hydrolizy acetylocholiny hamują działalność układu nerwowego. Należy do nich wiele insektycydów oraz bojowych
środków trujących.
W przypadku nieodwracalnego hamowania działania enzymu inhibitor nie musi
mieć budowy podobnej do substratu i dlatego może modyfikować enzym poza jego
centrum aktywnym. Zmienia jednak aktywność katalityczną zarówno w wyniku
przekształcenia konformacji enzymu, jak i jego centrum aktywnego. Sytuacja taka
ma miejsce np. przy alkilowaniu reszt tiolowych enzymu:
E-SH + ICH2CONH2 → E-S-CH2CONH2 + HI
Enzym
Jodacetamid
(odczynnik alkilujący)
Zalkilowany enzym
80
Podstawy biochemii
Niedawno wykryto nieodwracalne inaktywatory enzymów, powstające z nieaktywnych związków po ich reakcji z centrum katalitycznym, np.:
R-C≡C-CH2-CO-R’ → R-CH=C=CH-CO-R’
Związek nieaktywny
Inhibitor nieodwracalny
Inhibitor powstający w procesie katalizy enzymatycznej przyłącza się do centrum aktywnego blokując reakcję.
Odwracalna inhibicja enzymów może być konkurencyjna i niekonkurencyjna.
Klasycznym przykładem konkurencyjnej inhibicji aktywności enzymatycznej jest
hamowanie dehydrogenazy kwasu bursztynowego kwasami dikarboksylowymi, np.
malonowym lub glutarowym. Związki o podobnej strukturze do kwasu bursztynowego konkurują z nim o centrum aktywne enzymu.
Podczas inhibicji niekonkurencyjnej inhibitor reaguje z apoenzymem lub grupą
prostetyczną, w następstwie czego enzym traci swoją aktywność. Jedną z odmian
hamowania tego typu może być blokowanie enzymów związkami metali ciężkich,
rtęci, ołowiu lub arsenu, które łączą się z grupami wodorosiarczkowymi łańcucha
polipeptydowego enzymu. Kolejną grupą związków o podobnym działaniu są sole
kwasu cyjanowodorowego, tlenek węgla (II), które łączą się grupami prostetycznymi zawierającymi żelazo. Innym rodzajem niekonkurencyjnego działania hamującego jest inhibicja allosteryczna.
W ostatnich latach dużo uwagi poświęca się inhibitorom pochodzenia białkowego. Blokują one enzym poprzez oddziaływanie typu białko-białko, ograniczając
dostęp inhibitorom do centrum aktywnego. Inhibitory białkowe regulują działanie
proteinaz komórkowych, co wpływa na regulację ogólnej przemiany materii na
przykład w związku z zahamowaniem przekształceń proenzymów w enzymy, odszczepieniem peptydów sygnałowych czy innych fragmentów peptydowych podczas dojrzewania białek, blokowaniem reakcji proteolizy, w wyniku której powstają biologicznie aktywne peptydy (np. hormony o naturze peptydowej). Białkowy
inhibitor, α1-antytrypsyna, która jest glikoproteiną o masie 52.000 Da, otrzymywaną z komórek drożdżowych metodami inżynierii genetycznej, stosuje się do leczenia rozedmy płuc. Jej aktywność polega na blokowaniu działania elastazy wydzielanej przez neutrofilne komórki płucne. W leczeniu rozedmy płuc u osób palących
papierosy wystarczy α1-antytrypsyny w ilości 2-4 gramy na całą kurację.
Działanie aktywatorów i inhibitorów związane jest z regulowaniem działania
enzymów rozumianym jako ciąg reakcji katalitycznych dotyczących określonych
procesów. Stwierdzono, że końcowy, a niekiedy przejściowy produkt wieloetapowego procesu katalizy, może być inhibitorem allosterycznym jednej z pierwszych
reakcji tego typu.
3.5. Klasyfikacja enzymów i ich charakterystyka
Początkowo enzymy dzielono na 2 grupy, tzn. hydrolazy, katalizujące reakcje
hydrolityczne, i desmolazy, przyspieszające reakcje rozpadu niehydrolitycznego.
Rozdział 3. Enzymy
81
Ze względu na liczbę substratów uczestniczących w reakcji wyróżnia się 3 grupy
enzymów: 1) katalizujące jednoczesną przemianę dwóch substratów w obu kierunkach: A + B ⇄ C + D, 2) katalizujące przemianę dwóch substratów w reakcji przebiegającej w kierunku od lewej do prawej strony równania reakcji i tylko jednego
w kierunku reakcji odwrotnej: A + B ⇄ C, 3) katalizujące przemianę jednego substratu zarówno w reakcji przebiegającej w kierunku od lewej do prawej strony
równania, jak i w reakcji odwrotnej: A ⇄ B.
W celu ujednolicenia nazw enzymów opracowano międzynarodowy system ich
nazewnictwa (Enzyme Comission – EC). System ten dzieli wszystkie enzymy na
sześć głównych klas, opartych na typie prowadzonej reakcji (tab. 3.3). Klasa główna dzieli się na podklasy, oznaczone w tej numeracji drugą liczbą i określające
grupy w klasach 1 i 2, typ wiązania w klasach 3, 4 i 6 i rodzaj izomeryzacji w klasie 5. Każda podklasa dzieli się na podpodklasy grupujące enzymy katalizujące
reakcje poszczególnych grup substratów lub akceptorów i oznaczone trzecią liczbą
w systemie numeracji. Wreszcie czwarta liczba stanowi numer kolejny enzymu
w danej podpodklasie.
Tabela 3.3. Międzynarodowa klasyfikacja enzymów
Klasa
Nazwa
2
3
4
Oksydoreduktazy
Transferazy
Hydrolazy
Liazy
5
Izomerazy
6
Ligazy
(syntetazy)
1
Typ katalizowanej reakcji
Schemat reakcji
Przenoszenie elektronów
A- + B → A + B-
Przenoszenie grup funkcyjnych
Reakcje hydrolizy
Rozszczepianie wiązań C-C,
C-O, C-N i in., tworzenie
wiązania podwójnego
Przenoszenie grup w obrębie
cząsteczki
A–B + C→ A + B–C
A–B + H2O → A–H + B–OH
A–B → A=B + X–Y
I I
XY
A–B → A–B
I I
I I
XY
Y X
A + B → A–B
Tworzenie wiązań sprzężone
z hydrolizą ATP
Przykład
Dehydrogenaza
alkoholowa
Heksokinaza
Trypsina
Dekarboksylaza
pirogronianowa
Izoimeraza
maleinianowa
Karboksylaza
pirogronianowa
Każdy enzym zostaje zidentyfikowany przez czteroliczbowy numer. Na przykład trypsyna ma numer (EC) 3.4.21.4, pierwsza liczba (3) oznacza, że jest ona
hydrolazą, druga liczba (4) oznacza, że jest proteazą, która hydrolizuje wiązanie
peptydowe, trzecia liczba (21) oznacza, że enzym ten jest proteazą serynową, mającą w miejscu aktywnym krytyczną resztę seryny, a czwarta – (4) wskazuje, że
jest to czwarty enzym historycznie przypisany do tej klasy. Dla porównania: chromotrypsyna ma numer EC 3.4.21.1, a elastaza 3.4.21.36.
Ureaza ma numer 3.5.1.5, co oznacza, że należy tak także do klasy (3), której
enzymy katalizują reakcję hydrolizy. Druga liczba (5) oznacza, że przyspiesza
hydrolizę wiązania C-N, które nie jest peptydowym. Trzecia liczba (1) wskazuje,
że przyspiesza hydrolizę liniowych amidów, a ostatnia liczba oznacza numer ureazy na liście w tej podklasie.
82
Podstawy biochemii
1. Oksydoreduktazy. Do klasy tej należą enzymy katalizujące reakcje utleniania –
redukcji, a więc przemiany związane z przeniesieniem protonów, elektronów i tlenu. W przenoszeniu tych składników uczestniczą zwykle charakterystyczne koenzymy. Ogólny schemat przedstawia się następująco:
Oksydoreduktaza
⇄
Substrat + Akceptor
Substrat utleniony + Akceptor zredukowany
Ponadto oksydoreduktazy biorą udział w reakcjach chemicznych z uwolnieniem
energii, która następnie jest zużywana w procesach syntezy.
Zidentyfikowano około 500 indywidualnych oksydoreduktaz. Oksydoreduktazy
podzielono na 6 grup: dehydrogenazy, reduktazy, oksydazy, oksygenazy, hydroksylazy oraz peroksydazy. Dehydrogenazy przenoszą protony i elektrony z substratu
na koenzymy lub odwrotnie, a czasem i tlen (dehydrogenazy tlenowe). Reduktazy
katalizują przenoszenie protonów i elektronów lub samych elektronów z przenośników (np. łańcucha oddechowego) na dalsze uklady oksydoredukcyjne. Oksydazy są to enzymy katalizujące odłączenie wodoru od substratu w reakcji, w której
akceptorem wodoru jest tlen. Aktywują one tlen cząsteczkowy przez przenoszenie
nań elektronów, wskutek czego może się on łączyć z protonami i tworzyć cząsteczkę H2O lub rzadziej – H2O2. Oksygenazy katalizują bezpośrednie przenoszenie i włączenie tlenu w cząsteczki substratu: dioksygenazy katalizują włączenie
obu atomów tlenu (A + O2 → AO2), a monooksygenazy – jednego atomu z cząsteczki tlenu. Wreszcie hydroksylazy katalizują przyłączenie tlenu do związków
organicznych z przenoszeniem protonów i elektronów, a peroksydazy działają
utleniająco na związki organiczne z udziałem H2O2.
Najczęściej występują oksydoreduktazy, których grupą aktywną jest dinukleotyd nikotynaminoadeninowy (NAD+):
NH2
NH2
N
N
N
O
CH2
N
H
P
O
+ H:
H
OH
O
O
HO
P
O
C
O
CH2
+
N
O
H
NH2
- H-:
H
OH
Utleniona odmiana NAD
(NAD+)
N
O
H
H
OH
OH
H
H
HO
P
O
H
O
HO
P
O
O
CH2
H
H
OH
CH2
H
OH
N
N
O
O
H
HO
N
O
H
C
N
O
H
H
OH
OH
H
H
Zredukowana odmiana NAD
(NADH)
NH2
Rozdział 3. Enzymy
83
+
Ponad połowa znanych oksyreduktaz zawiera NAD jako koenzym. Pewne koenzymy, takie jak NAD+, są wiązane i uwalniane przez enzym w czasie jego cyklu
katalitycznego i dlatego działają one właściwie jako kosubstraty.
Oprócz NAD+, koenzymem oksyreduktaz jest także fosforan dinukleotydu nikotynaminoadeninowego (NADP+). Jest on pochodną NAD+, w której wodór grupy
OH drugiego atomu węgla adenozyny rybozy został zastąpiony resztą kwasu fosforowego. Oba te koenzymy pełnią jedną z podstawowych funkcji, jaką jest przenoszenie elektronów i udział w reakcjach oksydoredukcyjnych. NAD+ jest częściej
używany w reakcjach katabolicznych (rozkładu), natomiast NADP+ jest używany
w reakcjach anabolicznych (biosyntezy).
Mechanizm utleniania z udziałem NADP+ jako koenzymem jest analogiczny do
mechanizmu utleniania z udziałem NAD+. Ponadto NADH i NADP+, jak i NADPH
i NAD+, w obecności transhydrogenazy mają zdolność wymiany jonów wodorowych:
NAD(P)+
NADPH + NAD+
⇄
NADP+ + NADH
Transhydrogenaza
Oksydazami aminokwasowymi są samoutleniające się flawoproteiny (FP). Takim FP jest np. enzym posiadający grupę aktywną w postaci fosforylowanej witaminy B2. Utleniona forma tej flawoproteiny (M = 52.000) posiada żółtą barwę.
Każda cząsteczka enzymu przenosi ryboflawinfosforan lub mononukleotyd flawinowy FMN, zdolny do przekazania dwóch protonów wraz z dwoma elektronami na
atomy N w pierścieniu izoalloksazynowym:
Odmiana barwna
(utleniona)
Odmiana bezbarwna
(zredukowana)
84
Podstawy biochemii
Dinukleotyd flawinoadeinowy (FAD) również jest przenośnikiem elektronów
i ma podobną do FMN strukturę chemiczną:
OH
CH2 O
P
(CHOH)3
O
OH
O
P
N
C
H
O
N
H
H
NH
N
N
N
O
CH2
N
H3C
N
O
CH2
H3C
NH2
O
H
OH
OH
O
Dinukleotyd flawinonianowy (FAD)
FMN oraz FAD zawierają jednostkę mononukleotydu flawinowego, która ma miejsce reaktywne. FAD ma dodatkową grupę cukrową i zasadę adeninową, powiększające jego strukturę. Oba te enzymy reagują z dwoma protonami oraz dwoma
elektronami, oscylując między stanem utlenionym i zredukowanym:
FMN + 2H+ + 2e- ↔ FAMH2
Koenzymami oksydoreduktaz są także chinony. Ubichinony w połączeniu
z białkiem tworzą ubichinonproteinę, stanowiącą składową oksydoreduktaz przenoszących protony i elektrony. Związki te są pochodnymi benzochinonu i posiadają łańcuch boczny składający się z wielu reszt izoprenoidowych:
CH3
O
H 3C
H 3C
CHH3 2C
O
C
CH
OH
CH2
n
CH3
O
O
Reszta
podstawionego
benzochinonu
Łańcuch boczny
poliizoprenoidowy
Liczba fragmentów izoprenoidowych w łańcuchu bocznym (n) wynosi od 6 do
10. Stwierdzono, że ubichinony biorą udział w procesach utleniania-redukcji:
Rozdział 3. Enzymy
85
U roślin funkcję tę pełni podobny do ubichinonu, plastochinon:
Najbardziej złożonym, ale i najbardziej rozpowszechnionym wariantem reakcji
utleniania-redukcji komórkowej jest utlenianie za pośrednictwem cytochromów.
Cytochromy są hemoproteinami zawierającymi żelazo, w których atom żelaza
w czasie utleniania i redukcji oscyluje między Fe3+ a Fe2+.
2. Transferazy. Do tej klasy należą enzymy katalizujące reakcje przenoszenia grup
funkcyjnych pomiędzy związkami. Znanych jest około 500 enzymów tego typu.
W zależności od rodzaju przenoszonych grup wyróżnia się fosfotransferazy, aminotransferazy, glukozylotransferazy, acylotransferazy oraz transferazy, które przenoszą rodniki zawierające jeden atom węgla, takie jak metylotransferazy czy formylotransferazy.
Fosfotransferazy. Enzymy zaliczane do tej grupy katalizują przeniesienie reszty
kwasu fosforowego. Reakcja ta ma wyjątkowe znaczenie dla procesów życiowych
organizmu, umożliwiając przekształcenie szeregu związków organicznych w wysoce aktywne i łatwo reagujące estry fosforanowe. Grupy fosforanowe przenoszone
są na reszty alkoholowe, karboksylowe, aminowe i fosforanowe. Zależnie od rodzaju reagującej grupy wyróżnia się kilka podklas fosforotransferaz.
Donorem reszt fosforanowych w większości wypadków jest kwas adenozynotrójfosforowy (ATP), chociaż mogą one pochodzić także i z innych źródeł. Do
86
Podstawy biochemii
fosfotransferaz należy np. heksokinaza, która przenosi reszty kwasu fosforowego
z cząsteczki ATP na glukozę, co na ogół zapoczątkowuje procesy przekształcenie
glukozy:
Cząsteczka dobrze zbadanej heksokinazy drożdży składa się z czterech podjednostek o łącznej masie 96.000 Da. Tetramer zachowuje trwałość przy pH 5, natomiast przy zmianach pH roztworu ulega rozpadowi na cztery protomery o masach
24.000 Da, które nie wykazują aktywności fosfotransferazowej. W multimerach
wykryto 5 izozymów heksokinazy.
Przekształcenia wielu cukrów prostych początkuje ich fosforylacja z udziałem
fosfotransferaz. Dotyczy to m.in. β-D-fruktozy i β-D-rybozy, a także cząsteczek
innych cukrów.
Szczególnie interesujące są fosfotransfery przenoszące reszty fosforanowe z ATP
na białka, tzn. kinazy proteinowe. Przenoszą one resztę fosforanu na rodniki – ser,
tre, tyr, lyz i his wielu białek, w wyniku czego dochodzi do zmian ich aktywności
biologicznej, co z kolei wpływa na intensywność wymiany materii w organizmie
(zob. rozdział 13).
Aminotransferazy. Enzymy katalizujące reakcje transaminacji mają duże znaczenie w biosyntezie aminokwasów. W procesie tym grupy α-aminowe większości
aminokwasów są przenoszone na α-ketoglutaran, co prowadzi do powstawania
glutaminianu i odpowiedniego α-ketokwasu:
α-aminokwas + α-ketoglutargin ⇄ α-ketokwas + glutaminian
Rozdział 3. Enzymy
87
Enzymy katalizujące te reakcje są nazywane aminotransferazami (transaminazami)
i u ssaków występują głównie w wątrobie. Koenzymem (grupą prostetyczną)
wszystkich aminotransferaz jest fosforan pirydoksalu, pochodna pirydoksyny, ulegający podczas transaminacji przejściowemu przekształceniu w fosforan pirydoksaminy (rys. 3.5).
O
P
+
NH3
O
O
C
O
CH2
H
O
O
O
OH
P
O
CH2
CH2
OH
O
+
CH3
N
+
N
H
CH3
H
a)
b)
Rys. 3.5. Wzory strukturalne fosforanu pirydoksalu (a) i fosforanu pirydoksaminy (b)
Przy braku substratu grupa aldehydowa tworzy kowalencyjne połączenie typu
zasady Schiffa (wiązanie iminowe) z grupą aminową łańcucha bocznego określonej reszty lizyny w centrum aktywnym enzymu. Po dodaniu substratu grupa
α-aminowa wchodzącego aminokwasu wypiera grupę aminową lizyny w centrum
aktywnym i powstaje nowe połączenie typu zasady Schiffa z aminokwasem będącym substratem. Aminokwas tworzący z fosforanem pirydoksalu zasadę Schiffa
pozostaje ściśle związany z enzymem poprzez liczne oddziaływania niekowalencyjne.
Reakcję transaminacji opisali w 1937 r. A. Braustein i M. Kritzman.
Dla uproszczenia kompleks enzym – pirydoksal przedstawiono jako strukturę
OHC – enzym, zachowując tylko aldehydową grupę, która pełni rolę grupy funkcjonalnej dla koenzymu.
W pierwszym etapie katalizy grupa prostetyczna enzymu (dla uproszczenia
przedstawiono ją jako wolną) reaguje z aminokwasem ulegającym transaminacji.
Reakcja przebiega z udziałem grupy aminowej i grupy aldehydowej reszty fosforanu pirydoksalu:
COOH
CH
NH2
CH2
COOH
O
+
COOH
Kwas asparaginowy
H
C
enzym
CH
N
CH
enzym + H2O
CH2
COOH
Kompleks enzym-substrat
W drugim etapie katalizy następuje przekształcenie substratu, polegające w tym
przypadku na przegrupowaniem tautomerycznym, ułatwianym przez rezonansowe
efekty z pierścieniem pirydynowym:
88
Podstawy biochemii
COOH
CH
COOH
N
CH
enzym
C
CH2 enzym
N
CH2
CH2
COOH
COOH
W przegrupowaniu biorą udział rodniki imidazolu reszt his wchodzących
w skład centrum katalitycznego enzymu, które pełni rolę zasady odszczepiającej
proton z węgla α aminokwasu:
łańcuch
polipeptydowy
CH32
CH
COOH
CH2
N:
CH3
OH
+
COOH
H C
H3C
CH
2
HN
CH
H
3C3
COOH
+
CH
CH32
NH
N
N
N
H
CH
O P O
łańcuch
polipeptydowy
CH2
H
OH
Apoenzym
OH
O
O
P
CH2
C
COOH
:N
łańcuch
H3C
polipeptydowy
CH2
N
N
N
H
CH2
H
O
CH2
OH
O
N
CH3
N
Apoenzym
CH3
Następnie w wyniku reakcji hydrolizy powstaje ketokwas i koenzym przekształcany jest do pirydoksaminy:
COOH
C
N
COOH
CH2
enzym
+ H2O
CO
+ H2N
CH2
CH2
COOH
COOH
CH2
enzym
Kwas szczawiooctowy
Pomiędzy pirydoksaminą i innym ketokwasem zostaje utworzony kompleks enzym – substrat:
COOH
COOH
(CH2) 2
(CH2) 2
C
O
+
H2N
COOH
CH2
enzym
C
N
CH2
enzym + H2O
COOH
Kwas α-ketoglutarowy
W kompleksie substrat ulega przekształceniu tautomerycznemu:
Rozdział 3. Enzymy
89
Powstający związek ulega hydrolizie z utworzeniem nowego aminokwasu:
COOH
COOH
(CH2) 2
(CH2) 2
CH
N
CH
enzym
+
H2O
COOH
CH
NH2
O
+
COOH
H
C
enzym
Kwas glutaminowy
W wyniku serii reakcji z naprzemiennym tworzeniem kompleksów enzym – substrat
kwas asparaginowy zostaje przekształcony w kwas szczawiooctowy, a kwas
α-ketoglutarowy w kwas glutaminowy, co przedstawia sumaryczne równanie reakcji:
Pirydoksalenzym
HOOCCH2CH(NH2)COOH + HOOCCO(CH2)2COOH ⇄ HOOCCH2COCOOH + HOOCCH(NH2)(CH2)2COOH
Zasadniczą rolę w procesie katalizie w obecności pirydoksalu odgrywa przemieszczenie elektronów w kompleksie enzym-substrat:
W rezultacie osłabione zostaje wiązanie α-atomu węgla reszty aminokwasu
z podstawnikiem, którym może być azot lub grupa COOH, skutkiem czego dochodzi do rozpadu odpowiednich wiązań.
Ponieważ aminotransferaza asparaginianowa składa się z dwóch podjednostek
i zawiera dwie reszty fosforanu pirydoksalu, podjednostki aktywne w reakcji transaminacji działają po kolei wykorzystując energię niezbędną do przemiany chemicznej. Zasadnicze znaczenie w przebiegu procesu katalitycznego ma zatem dimeryczna struktura enzymu.
Glikozylotransferazy. Katalizują reakcje przenoszenia reszt glikozylowych z cząsteczek estrów fosforanowych lub innych związków na cząsteczki monosacharydów,
polisacharydów lub innych substancji, umożliwiając jednocześnie przebieg syntezy
i rozpadu oligo- i polisacharydów organizmów roślin i zwierząt. Poniżej przedstawiono równanie reakcji rozpadu sacharozy przy udziale α-glukozylotransferazy
ortofosforanowej i fosforylazy sacharozowej:
90
Podstawy biochemii
CH2OH
CH2OH
H
O H
H
OH
H
H
OH
CH2OH O
H
HO
O
HO
OH
H
+ H3PO4
CH2OH
Glukozylotransferaza
H
ortofosforanowa HO
H
O H
H
OH
H
H
OH
+
O
P
O
HO
OH
H
CH2OH
OH
H
OH
α-D-Glukopironozo1-fosforan
Sacharoza (α-D-glukopironozyloβ-D-fruktofuranozyd
CH2OH O
HO
H
β-D-Fruktofuranoza
Podobną aktywność wykazuje fosforylaza glikogenowa i inne transferazy glikozydowe. Proces przenoszenia reszt glikozylowych na H3PO4 jest nazywany fosforolizą. Zachodzi analogicznie do hydrolizy, ale zamiast reszty wody w miejscu
rozpadu mostka tlenowego przyłączeniu ulega wodór i grupa fosforylowa kwasu
fosforowego.
Przenoszenie reszt glikozylowych zachodzi stosunkowo łatwo w obecności enzymów danej grupy, gdy substratem jest monosacharyd nukleozydodifosforanu.
Reakcja ta jest prawdopodobnie głównym sposobem naturalnej syntezy oligo- i polisacharydów (zob. rozdział 8).
Acylotransferazy. Katalizują przeniesienie rodników acylowych, czyli reszt
kwasów karboksylowych, na aminokwasy, aminy, alkohole i inne związki. Uniwersalnym źródłem tych grup jest acylokoenzym A, który można traktować jako
grupę aktywną acylotransferaz.
Najczęściej przeniesieniu ulega rodnik acylowy kwasu octowego, tzn. rodnik
acetylowy (CH3CO-). Koenzym A, łącząc się z resztą acetylową, tworzy reaktywny
tioester, acetylokoenzym A, który jest kofaktorem danej reakcji. Przykładem reakcji transacylowania jest synteza acetylocholiny:
Transferaza
cholinoacetylowa
CH3COSCoA + HOCH2CH2N+(CH3)2
Acetylokoenzym A
Cholina
→
CH3COOCH2CH2N+(CH3)2 + HSCoA
Acetylocholina
Koenzym A
Ważne znaczenie wśród transferaz mają enzymy uczestniczące w przenoszeniu
rodników jednowęglowych, metylowych, oksymetylowych, formylowych, a także
nukleotydotransferazy, katalizujące przenoszenie reszt nukleotydowych w procesie
syntezy kwasów nukleinowych. Mechanizm ich działania opisano poniżej.
3. Hydrolazy. Do klasy hydrolaz należą enzymy uczestniczące w reakcjach rozszczepiania, a niekiedy też syntezy związków organicznych z udziałem wody:
R' R" + HOH ⇔ R' H + R"OH.
W zależności od charakteru substratu, ulegającego hydrolizie, w klasie hydrolaz
wyróżnia się podklasy, wśród których najważniejsze to: esterazy, katalizujące reakcje hydrolizy estrów; glikozydazy, katalizujące reakcje hydrolizy glikozydów
i policukrów, proteazy, katalizujące reakcje hydrolizy oraz w niektórych przypadkach syntezy białek, peptydów i innych związków zawierających wiązania pepty-
Rozdział 3. Enzymy
91
dowe oraz tzw. amidazy działające na wiązania C-N różniące się od wiązań peptydowych. Łącznie do klasy hydrolaz zalicza się około 500 enzymów.
Esterazy. Enzymy katalizujące reakcje hydrolizy estrów kwasów organicznych
i nieorganicznych. Najważniejszymi podpodklasami esteraz są hydrolazy estrów
kwasów karboksylowych i fosfatazy. Do pierwszej z podpodklas należy lipaza,
która hydrolizuje zewnętrzne, tzn. α-estrowe wiązania w cząsteczkach trójacylogicerynów (tłuszcze):
CH2
CH
O
O
CH2
C15H31
CO
C15H31 + 2H2O
CO
CO
O
Lipaza
CH2
CH
OH
O
CH2
C15H31
C15H31 + 2C15H31COOH
CO
OH
β-Palmitylogliceryna
Trójpalmitynian
glicerylu
Kwas
palmitynowy
Fosfatazy katalizują hydrolizę estrów fosforanowych. Szczególnie rozpowszechnione są fosfatazy, działające na estry kwasu fosforowego i węglowodanów, jak np. fosfataza glukozowa:
CH2OH
H
H
OH
CH2OH
O H
H
HO
O
P
OH
H
H
Fosfohydrolaza
OH
O
+
H 2O
D-glukozo1-fosforanowa
O H
H
OH
H
H
OH
HO
OH
OH
Glukozo-1-fosforan
+
H3PO4
Glukoza
Fosfatazy są aktywne w szerokim zakresie pH, od 3 do 9, a większość z nich
charakteryzuje silna specyficzność substratowa. Szczególnie ważne w regulacji
procesów metabolicznych są fosfatazy odszczepiające fosforany od ufosforylowanych białek, wskutek czego zmienia się ich aktywność biologiczna, w szczególności enzymatyczna.
Glikozydazy. Katalizujące reakcje hydrolizy glikozydów, w zależności od izomerycznej budowy substratów α lub β należą do α- lub β-glikozydaz. Są więc enzymami, które charakteryzuje specyficzność przestrzenna, czyli stereochemiczna. Poza
glikozydami zawierającymi jako aglikony reszty alkoholi jednowodorotlenowych,
ich substratami mogą być oligo- i polisacharydy. Glikozydazą rozkładającą maltozę
jest maltaza (α-glikozydaza), a sacharozę – sacharaza (β-glikozydaza):
CH2OH
H
H
OH
O H
CH2OH O
H
HO
H
HO
O
H
OH
H
+ H 2O
CH2OH
OH
H
Sacharoza (α-D-glikopirazydoβ-D-fruktofuranozyd)
β−Fruktofuranozydaza
(sacharaza)
CH2OH
H
O H
H
OH
H
H
OH
HO
+
OH
Glukoza
(α-D-glukopiranoza)
CH2OH O
H
HO
HO
OH
H
CH2OH
H
Fruktoza
(β-D-glukopiranoza)
92
Podstawy biochemii
CH2OH
H
CH2OH
O H
H
OH
H
H
H
OH
CH2OH
O H
H
O
HO
OH
H
+ H 2O
OH
H
Maltoza (α-D-glikopirazydo1,4-D-glukopiranoza)
OH
α−Glukozydaza
(maltaza)
H
2
O H
H
OH
H
H
OH
HO
OH
Glukoza
(α-D-glukopiranoza)
Glikozydazami rozkładającymi polisacharydy są m.in. amylazy hydrolizujące
wiązania glikozydowe w cząsteczce skrobi, z utworzeniem glukozy, maltozy lub
oligosacharydów.
Hydroliza naturalnych poliglikozydów, takich jak: celuloza, inulina lub ksylan,
zachodzi również w obecności glikozydaz. Ponadto enzymy tej grupy jako
transglikozydazy, katalizują reakcje przenoszenia reszt glikozylowych.
Hydrolazy peptydowe. Enzymy zaliczane do tej podklasy hydrolizują wiązania
peptydowe białek i peptydów, a w określonych warunkach uczestniczą również
w ich tworzeniu, chociaż reakcja nie odpowiada stanowi fizjologicznemu. Reakcję
hydrolizy białek i peptydów przy udziale hydrolaz peptydowych można przedstawić za pomocą schematu:
Hydrolaza
peptydowa
⇄
H2NCH(R’)CO[NHCHRCO]nNHCH(R”)COOH + (n+1)H2O
H2NCH(R’)COOH + nH2NCH(R)COOH + H2NCH(R”)COOH
Hydrolazy peptydowe, tzw. proteinazy albo hydrolazy peptydylo-peptydowe,
katalizujące hydrolizę wewnętrznych wiązań cząsteczek białka nazywa się jako
endopeptydazami, w odróżnieniu od egzopeptydaz, które katalizują odszczepianie
od łańcucha peptydowego aminokwasów końcowych.
Hydrolazy katalizujące hydrolizę peptydów, w wyniku której jednym z substratów jest wolny aminokwas, nazywamy aminopeptydazami oraz karboksypeptydazami. Aminopeptydazy hydrolizują końcowe wiązania peptydowe przy wolnej
grupie aminowej łańcucha polipeptydowego. Karboksypeptydazy są egzopeptydazami hydrolizującymi końcowe wiązanie peptydowe od końca karboksylowego
łańcucha polipeptydowego
Charakteryzują się one wysoką specyficznością odszczepiając ściśle określone
N- lub C-końcowe aminokwasy. Trzecią podklasę peptydaz reprezentują hydralazy
dipeptydowe, zwane dipeptydazami, które są aktywne w końcowym etapie hydrolizy białka. Ostatnio wyróżniono dwie dodatkowe podpodklasy peptydaz. Są to
hydrolazy dipeptydylo-peptydowe, odszczepiające dipeptyd od N-końcowego polipeptydu oraz hydrolazy peptydylo-dipeptydowe, odszczepiające dipeptyd od polipeptydu C-końcowego.
Amidazy. Są to enzymy hydrolizujące amidy kwasowe, wśród których w procesach biochemicznych ważną funkcję pełni ureaza, asparaginaza i glutaminaza.
Rozdział 3. Enzymy
93
Ureaza była jednym z pierwszych białek enzymatycznych otrzymanych w stanie krystalicznym (D. Samner, 1926). Jest to enzym jednoskładnikowy o masie
480.000 Da, którego globularna cząsteczka składa się z 8 równych podjednostek.
Ureaza hydrolizuje mocznik do NH3 i CO2.
Asparaginaza i glutaminaza to enzymy hydrolizujące amidy kwasów dikarboksylowych, asparaginowego i glutaminowego:
Asparaginaza
→
HCOOCH(NH2)CH2CONH2 + H2O
HOOCCH(NH2)CH2COOH + NH3
Asparagina
Kwas asparaginowy
Do hydrolaz rozszczepiających wiązania C–N, różniące się od wiązań peptydowych, należą enzymy katalizujące hydrolizę wiązań amidynowych (HNC-NH),
których przedstawicielem jest arginaza. W jej obecności arginina hydrolizuje do
ornityny i mocznika:
Arginaza
→
H2NC(NH)NH(CH2)3CH(NH2)COOH + H2O
Arginina
H2NCONH2 + H2N(CH2)3CH(NH2)COOH
Mocznik
Ornityna
Ponieważ w procesie hydrolizy argininy zostaje odszczepiony mocznik, systematyczna nazwa arginazy brzmi: α-arginino-ureohydrolaza. Ta często występująca
w przyrodzie reakcja stanowi ostatnie stadium biosyntezy mocznika, który jest
jednym z końcowych produktów rozpadu związków zawierających azot. Zarówno
arginaza, jak i ureaza są regioselektywne i specyficzne substratowo.
4. Liazy. Do tej klasy należą enzymy katalizujące niehydrolityczny rozpad związków zawierających wiązania C–C, C–N, C–O. Podczas reakcji dochodzi do utworzenia wiązań podwójnych z wydzieleniem takich związków, jak: CO2, H2O lub
NH3. Niektóre z tych reakcji są odwracalne i odpowiednie enzymy w sprzyjających
warunkach katalizują także reakcje syntezy, w związku z czym nazwa tej klasy
enzymów nie zawsze odpowiada katalizowanym procesom.
Ważniejszą z grup enzymów tej klasy są liazy wiązań węgiel-węgiel (C-Cliazy), wśród których szczególne znaczenie przypisywane jest liazom karboksylowym (dekarboksylazy) i aldehydowym. Powszechnie występujące dekarboksylazy
ketokwasów i aminokwasów, katalizują reakcje zgodnie z poniższym schematem:
Dekarboksylaza
H3CCOCOOH
→
pirogronianowa
H3CCHO + CO2
Kwas
pirowinogronowy
Dekarboksylaza kwasu
HOOCCH2COCOOH
→
szczawiooctowego
H3CCOCOOH + CO2
Kwas szczawiooctowy
Dekarboksylaza
H2NCH2(CH2)3CH(NH2)COOH
Lizyna
→
lizyny
H2N(CH2)5NH2 + CO2
Kadaweryna
94
Podstawy biochemii
Są to enzymy, których grupami prostetycznymi są często estry fosforowe witamin
rozpuszczalnych w wodzie, takie jak tiamina (B1), występująca w karboksyliazach
ketokwasów, oraz pirydoksal (B6), spotykany w karboksyliazach aminokwasów.
Mechanizm reakcji dekarboksylacji aminokwasów w obecności karboksyliazy,
której koenzymem jest pirydoksalofosforan, jest podobny do tego, który przebiega
w procesie transaminacji aminokwasów. W tym przypadku również powstaje zasada Schiffa, której gęstość elektronowa atomu węgla α aminokwasu jest bardzo
mała. Osłabione wiązanie węgla α z grupą karboksylową sprzyja jej łatwemu odszczepieniu od cząsteczki.
Charakterystycznym przedstawicielem liaz aldehydowych jest aldolaza katalizująca odwracalną reakcję rozszczepienia fruktozo-1,6-difosforanu, z utworzeniem
fosfotrioz:
OH
O
P
O
CH2
H
OH
OH
O
OH
OH
H
CH2
HO
O
H
P
Aldolaza
O
CH2OH
C
CH2
OH
O
C
+
OH
O
P
O
O
H
CHOH
CH2
OH
O
Fosfodihydroksyaceton
O
OH
OH
Fruktofuranozo-1,6-difosforan
P
Aldehyd 3-fosfoglicerynowy
Reakcja ta ma duże znaczenie w przekształceniu węglowodanów. Analogicznie
do aldolazy działają inne liazy aldehydowe.
Następną ważną grupę tej klasy stanowią liazy rozkładające wiązanie C-O, czyli
przyłączające lub odrywające cząsteczkę wody (np. hydroliaza jabłczanu), tzn.
katalizujące reakcje hydratacji i dehydratacji. Przykładem hydroliazy jest również
hydrataza fumaranowa:
Dehydratacja
HOOCCH(OH)CH2COOH
Kwas jabłkowy
⇄
Hydratacja
HOOC-CH=CH-COOH + H2O
Kwas fumarowy
Reakcje hydratacji i dehydratacji zachodzą w sposób ciągły podczas rozpadu
i syntezy węglowodanów oraz wyższych kwasów tłuszczowych, dlatego enzymy
biorące w nich udział odgrywają olbrzymią rolę w procesach przemian metabolicznych.
Przykładem liazy węgiel-azot jest liaza asparginianowa, występująca w komórkach bakterii i roślin, która katalizuje reakcję bezpośredniej deanimacji kwasu
asparaginowego:
Liaza
asparaginianowa
HOOCCH(NH2)CH2COOH
Kwas asparaginowy
⇄
HOOC-CH=CH-COONH4
Fumaran amonowy
Rozdział 3. Enzymy
95
Liazy katalizują nie tylko reakcje rozpadu, ale i syntezy, jak np. wyizolowana
z komórek drożdży L-seryno-hydro-liaza, odszczepiająca od seryny wodę i przyłączająca siarkowodór, w wyniku czego dochodzi do syntezy cysteiny:
Syntetaza
cysteinowa
HOCH2CH(NH2)COOH + H2S
→
HSCH2CH(NH2)COOH + H2O
Dla odróżnienia liaz syntetyzujących od klasy ligaz, które katalizują tylko reakcje syntezy, enzymy te nazywa się też syntazami.
5. Izomerazy. Jest to klasa stosunkowo nieliczna, zawierająca około 90 eznymów,
które katalizują geometryczne lub strukturalne przekształcenia jednej cząsteczki.
Mogą one polegać na wewnątrzcząsteczkowym przeniesieniu atomu wodoru, grup
fosforylowych i acylowych, na zmianie przestrzennego położenia grup atomów lub
też, na zmianie ułożenia wiązań podwójnych.
Najważniejsze z nich to: izomeraza trójizofosforylowa, fosfomutaza fosfoglicerynianowa, aldozomutarotaza i izomeraza izopentenylo-pirofosforanowa.
Izomerza trójizofosforylowa przenosi atomy H w procesie przekształcenia w reakcji odwracalnej aldehydu 3-fosfoglicerynowego do fosfodihydroksyacetonu:
C
O
H
CHOH
CH2
Izomeraza
OH
O
P
O
OH
Aldehyd
3-fosforglicerynowy
triizofosforanowa
CH2OH
C
O
CH2
OH
O
P
O
OH
Fosfodihydroksyaceton
Fosfomutaza fosfoglicerynianowa przekształca kwas 2-fosfoglicerynowy do
kwasu 3-fosfoglicerynowego:
2-Fosforglicerynian
3-Fosforglicerynian
Procesy te odgrywają znaczną rolę w metabolizmie cukrów, ponieważ biorą
udział w najważniejszym stadium rozpadu i syntezy węglowodanów.
Mutarotaza należąca do stereoizomeraz katalizuje przekształcenia α-D-glukopiranozy w β-D-glukopiranozę:
96
Podstawy biochemii
CH2OH
H
CH2OH
O H
H
OH
H
HO
H
Aldozomutarotaza
OH
H
OH
O OH
H
HO
OH
H
α-D-Glukopironaza
H
OH
H
β- D-Glukopironaza
Stereoizomerazy uczestniczą we wzajemnej przemianie wielu izomerów przestrzennych monosacharydów, przy czym niekiedy reakcje z ich udziałem są jedyną
możliwą drogą syntezy cząsteczek cukrów. Do stereoizomeraz należą również cistrans-izomerazy, w tym np. izomeraza retinenowa, która przekształca trans-retinol
w cis-retinol.
Izomeraza izopentenylo-pirofosforanowa katalizuje reakcję przebudowy izopentenylopirofosforanu do dimetyloallilopirofosforanu, czyli przesunięcia wiązania
podwójnego C=C z atomu węgla C2 na C3:
O
CH3
H2C
C
CH2
CH2
O
O
P
O
OH
P
+ HS enzym
(Izomeraza izopentylopirofosforanowa)
OH
OH
Izopentenylopirofosforan
O
CH3
H3C
C
CH2
S
enzym
CH2
O
CH3
H3C
C
CH
CH2
O
P
O
O
P
OH
OH
O
O
P
O
OH
P
OH
OH
+ HS
enzym
OH
Dimetyloallilopirofosforan
Izomeraza izopentenylo-pirofosforanowa zawiera wolne grupy sulfhydrylowe cystein. Powyższa reakcja jest pierwszym etapem syntezy poliizoprenoidów i steroli.
6. Ligazy (syntetazy). Ich specyficzne właściwości poznano stosunkowo niedawno,
w wyniku znaczących sukcesów w badaniach nad mechanizmem syntezy tłuszczów, białek i węglowodanów. Okazało się, że dawne poglądy na temat tworzenia
się tych związków, zgodnie z którymi powstają one podczas odwrócenia reakcji
hydrolizy, nie odpowiadają rzeczywistości. Syntetyzowane są w organizmach w inny sposób.
Do ligaz zaliczane są enzymy katalizujące wzajemne łączenie dwóch cząsteczek
sprzężone z hydrolizą wiązania pirofosforanowego w cząsteczce ATP lub innego
Rozdział 3. Enzymy
97
nukleozydotrójfosforanu. Ich właściwością jest sprzężenie syntezy z rozpadem
związków, dostarczających energię niezbędną w procesach biosyntezy. Jednym
z takich związków jest ATP. Podczas odłącznia od jego cząsteczki jednej lub
dwóch końcowych reszt kwasu fosforowego, w obecności ligaz, następuje wydzielanie dużej ilości energii, zużywanej następnie do aktywowania reagujących
związków. Ligazy katalitycznie przyspieszają syntezę związków organicznych
z naturalnych substratów aktywowanych kosztem rozpadu ATP.
Mechanizm działania ligaz jest bardzo złożony. W wielu przypadkach, z jednego ze związków uczestniczących w podstawowej reakcji, powstaje początkowo
związek pośredni, zawierający fragment uwalniany w trakcie rozpadu ATP, który
następnie oddziałuje z drugim partnerem podstawowej reakcji chemicznej z utworzeniem produktu końcowego.
Przykładem aktywności ligazy jest synteza kwasu pantotenowego z β-alaniny
i kwasu α,γ-dihydroksy-β,β-dimetylomasłowego:
NH2
N
H3C
HO
O
CH2 C
CH
H3C
OH
COOH + H2N
CH2
CH2
COOH + O
P
O
O
OH
O
P
O
N
P
OH
O
CH2
OH
H
H
OH
OH
H
β−Alanina
ATP
NH2
N
Syntetaza
pantotenianowa
O
H 3C
HO
CH2 C
CH
H 3C
OH
CO
NH
CH2
CH2
COOH + HO
P
P
N
O
O
H
OH
+ HO
H
H
Kwas pantotenowy
N
N
O
N
O
H
Kwas α,γ-Dihydroksyβ,β−dimetylomasłowy
N
H
OH
P
OH
O
O
P
OH
OH
OH
AMP
Syntetaza pantotenianowa, jak wynika z podanego powyżej równania reakcji,
należy do grupy ligaz katalizujących reakcję syntezy wiązań C-N, do której zalicza
się około 40 enzymów. W chwili obecnej znanych jest około 75 różnych ligaz sterujących najważniejszymi procesami syntetycznymi w komórkach roślin i zwierząt.
Oprócz udziału w reakcji syntezy wiązań C-N, szczególnie wiązań peptydowych,
ligazy katalizują powstawanie wiązań C-C, C-O i C-S. Do grupy ligaz syntetyzujących wiązania C-C należą karboksylazy, odpowiedzialne za karboksylację szeregu
związków. W wyniku takich reakcji wydłużane zostają łańcuchy węglowe. Jedną
z najważniejszych karboksylaz jest karboksylaza pirogronianowa, przyspieszająca
tworzenie kwasu szczawiooctowego z kwasu pirogronowego i tlenku węgla (IV):
98
Podstawy biochemii
OH
HO
P
OH
O
P
O
CH3 CO
COOH
O
O
+ CO2
N
O
P
O
ATP
N
N
CH2
+
Kwas pirogronowy
NH2
OH
N
Karboksylaza
pirogronianowa
O
H
H
OH
OH
H
H
NH2
N
O
HOOC
CH2
CO
COOH + HO
O
P
O
OH
Kwas szczawiooctowy
N
N
P
O
CH2
H
OH
+
H
H
ADP
N
O
H3PO4
H
OH
OH
Reakcja ta ma wyjątkowe znaczenie w przemianie materii poprzez pośredniczenie w przemianie węglowodanów i białek oraz wiązanie CO2.
Ligazom katalizującym syntezę wiązań C–O przypada najważniejsza rola
w biosyntezie białek. Uczestniczą one w reakcjach aktywowania aminokwasów
niezbędnych do syntezy peptydów. Jedną z reakcji tego typu jest tworzenie aminoacyloadenylanów:
NH2
N
O
O
CH3
CH
COOH + HO
NH2
P
O
OH
P
O
O
P
N
O
CH2
H
H
Alanina
N
O
H
OH
OH
N
H
OH
OH
NH2
N
O
CH3
CH
CO
NH2
Adenyloadenylan
O
P
N
N
O
CH2
OH
N
O
O
H
H
OH
OH
H
+
H
HO
P
OH
O
O
P
OH
OH
Pirofosforan
Z aminoacyloadenylanów aminokwasy przenoszone są na tRNA i tworzą aminoacylo-tRNA, biorące bezpośredni udział w syntezie polipeptydów (zob. rozdział 7).
Rozdział 3. Enzymy
99
Ponadto ligaza używając jako substratu acetylo-koenzymu A, katalizuje reakcję
tworzenia wiązań C–S. Tworzenie acetylo-koenzymu A z kwasu octowego i koenzymu A przebiega w sprzężeniu z rozpadem ATP:
CH3
COOH
+ HS
CoA + ATP
Syntetaza acetylo-CoA
O
CH3
CO
S
CoA + AMP + HO
P
OH
Acetylo-koenzym A
O
O
P
OH
OH
Pirofosforan
Acetylo-CoA uczestniczy w reakcji transacylowania. W układach ożywionych
aktywność ligaz i acylotransferaz jest ze sobą ściśle powiązana, przy czym analogiczne zależności zachodzą także pomiędzy innymi enzymami.
3.6. Zastosowanie enzymów
Enzymy wykazują zdolności katalityczne także i poza komórką. Mimo że w naturalnym środowisku charakteryzuje je większa aktywność, to wyizolowane zachowują swoje właściwości. W związku z tym wiele preparatów enzymatycznych
wykorzystywanych jest w praktyce.
Praktyczne zastosowanie enzymów w gospodarce stale wzrasta. W przemyśle
piekarniczym stosuje się otrzymywane z grzyba Aspergillus, preparaty enzymatyczne zawierające amylazę i proteinazę, które dodane w ilości 20-25 g na 1 tonę
mąki, poprawiają jakość i aromat pieczywa, przyspieszają o 30% dojrzewanie ciasta, zwiększają o 20% porowatość miękiszu i objętość chleba, zmniejszając przy
tym dwukrotnie zużycie cukru w produkcji bułek.
W browarnictwie i przemyśle spirytusowym stosuje się amylazy przyspieszające scukrzanie skrobi. Ekonomiczne efekty stosowania amylaz są znaczące. Zastosowanie preparatów enzymatycznych w browarnictwie pozwala oszczędzić 165
g jęczmienia na każdy dekalitr wyprodukowanego piwa. Stosowanie amylazy w
produkcji spirytusu daje możliwość rezygnacji ze słodu, a jednocześnie zwiększenie o 1,5% uzyskiwania alkoholu z materiału wyjściowego, przy obniżeniu kosztów własnych dekalitra spirytusu. Szerokie perspektywy ma stosowanie enzymów
w produkcji wina. Enzymy pektynolityczne zwiększają o 15-20% ilość soków uzyskanych z owoców i o 5-7% z winogron. Katalaza i glukozohydroksydaza przedłużają trwałość bukietu win białych i różowych.
W przemyśle garbarskim i futrzarskim stosowanie preparatów pozakomórkowch proteinaz Streptomyces (proteliny i protofradyny), przyspiesza oddzielanie
sierści od skóry i zmiękczanie surowych skór. Proces produkcji ulega kilkakrotnemu
skróceniu, przy czym poprawia się jakość produktów i polepszają się warunki pracy.
W przemyśle włókienniczym zastosowanie enzymów pochodzących z grzybów
100
Podstawy biochemii
i bakterii zwiększa 7-10 razy proces rozklejania się tkanin. Te same preparaty są
stosowane do uwalniania serycyny podczas rozwijania kokonów jedwabnika przy
produkcji jedwabiu naturalnego. Peptydohydrolazy (protelina i pronaza) stosowane
do obróbki mięsa przed gotowaniem polepszają jego jakość. W przemyśle mięsnym
enzymy proteolityczne stosowane są również do dojrzewania mięsa oraz polepszenia
jego jakości. Przemysł mleczarski wykorzystuje proteazy w procesach dojrzewania
serów, obniżając przy tym koszt ich wytwarzania o 10%.
Enzymy mają także zastosowanie w produkcji środków czystości i innych preparatów chemii gospodarczej. Proteazy roślinne, odporne na temperaturę do 90°C,
wchodzą w skład proszków do prania i środków myjących. Proszki do prania zawierają α-amylazę, glukozohydroksydazę i lipoksygenazę, a hydroksydaza moczanowa przyczynia się do usuwania plam tłuszczu. Enzymy, takie jak glukozohydroksydaza czy katalaza, są składnikiem past do zębów, chroniąc je przed działaniem bakteriami i tworzeniem osadów.
Produkcja glukozy z odpadów celulozy przy udziale enzymów celulolitycznych oraz glukozy ze skrobi w obecności glukaminazy wykorzystywana jest na
skalę przemysłową. Obróbka surowca zestawem enzymów proteolitycznych izolowanych z wątroby krabów, zwanym degystazą, zwiększa o 30% wydajność produkowanego kawioru.
Enzymy mają ogromne zastosowanie w medycynie. Pepsynę, trypsynę, chemotrypsynę, lipazę i amylazę w postaci preparatów enzymycznych oraz ich mieszaniny (betacyd, abomina, festal, panzinorm i in.) stosuje się w leczeniu chorób układu
pokarmowego. Gialouronidazę produkowaną jako lidaza i ronidaza, która depolimeryzuje kwas hialuronowy i pomaga we wnikaniu leków do narażonej tkanki,
wykorzystywano do leczenia zapalenia stawów, obrzmień, urazów i krwiaków.
Inne enzymy proteolityczne, plazminę (fibrynolizyna) i aktywujące je streptokinazę i urokinazę, stosuje się przy rozpuszczaniu skrzepów w naczyniach krwionośnych. Dezoksyrybonukleaza, izolowana z trzustki lub Streptococcus (streptodornaza), jest stosowana w leczeniu górnych dróg oddechowych oraz rogówki oka, jak
również w usuwaniu zanieczyszczeń z ran. Asparaginazę katalizującą dezaminację
asparaginy włącza się do leczenia niektórych rodzajów raka, lizozym do leczenia
zapalenia spojówek, cytochrom do usuwania niedotleniania w chorobach serca,
elastazę do leczenia stwardnienia tętnic, β-galaktozydazę do wspomagania trawienia mleka przy braku tego enzymu, galoktokinazę do wyeliminowania z tkanek
galaktozy podczas jej gromadzenia patologicznego, liazę fenyloalaninową do obniżania poziomu fenyloalaniny we krwi w przypadku zaburzeń jej przemian, lizoamidazę do leczenia chorób bakteryjnych (Staphylococcus, Strepcoccus).
Zastosowanie w medycynie posiada diagnostyka enzymatyczna. Choroba każdego organu może być diagnozowana na podstawie poziomu enzymu lub jego izozymów we krwi lub moczu. Dehydrogenaza mleczanowa (LDG), aminotransferaza
asparaginianowa (AspAT), kinaza kreatynowa, dehydrogenaza izocytrynianowa
i fruktozo-1,6-fosforano-aldolaza są pomocne w diagnozowaniu stanów zawało-
Rozdział 3. Enzymy
101
wych, LDG, AspAT i aminotransferaza alaninowa w leczeniu chorób wątroby,
transferaza γ-glutamylowa jest wskaźnikiem odrzucania przeszczepów podczas
transplantacji organów, fosfataza zasadowa w leczeniu żółtaczki, a fosfataza kwaśna przy zaburzeniach funkcji gruczołu krokowego.
Zastosowanie enzymów do produkcji środków chemicznych staje się w ostatnich latach zjawiskiem masowym, przy czym w większości przypadków w różnych
procesach stosowane są enzymy immobilizowane, tzn. umocowane na nośniku.
Technologie tego rodzaju pozwalają na wielokrotne stosowanie tych samych preparatów.
Ze względu na dostępność i niski koszt, mniejszy o około 100 razy od enzymów
roślinnych i zwierzęcych, do celów przemysłowych unieruchamia się głównie enzymy drobnoustrojów. Charakteryzują się one bowiem uniezależnieniem od czasu
wegetacji roślin lub terminu hodowania zwierząt, co przy krótkim okresie kumulacji masy bakteryjnej, zwiększa atrakcyjność enzymów drobnoustrojowych. Immobilizacji towarzyszy z reguły, wzrost stabilności enzymów, nawet rzędu kilka tysięcy. Stwarza to warunki do ich wykorzystania w postaci katalizatorów heterogenicznych. Dodatkowo, odpowiedni dobór matrycy, na której unieruchomiony jest
enzym, daje możliwość zmiany jego aktywności i poznania zasad działania naturalnych układów mechaniczno-chemicznych.
Obecnie większość enzymów immobilizowana jest na żywicach lub w lipidach
membran biologicznych.
Spośród około 2000 znanych obecnie enzymów znaczna ich część została immobilizowana i jest wykorzystywana w inżynierii enzymologicznej. Są to głównie
hydroksyreduktazy, hydrolazy i transferazy. Optymalną metodą immobilizacji jest
przyłączanie enzymów do nośników na zasadzie adsorpcji lub kowalencyjnego.
Rozpowszechnione jest również włączenie enzymów do membran i mikrokapsułkowanie. Inne metody wykorzystywane są sporadycznie.
Do procesów chemicznych z udziałem immobilizowanych enzymów stosuje się
reaktory kolumnowe, rurowe, płytowe, dwufazowe i zbiornikowe o różnej pojemności i wydajności. Pierwszym reaktorem, w którym wykorzystano immobilizowany enzym na skalę przemysłową, był reaktor rozdzielający racemiczne mieszaniny
D- i L-aminokwasów. Uruchomiony został w Japonii w roku 1969, i zawierał aminoacylazy immobilizowane na DEAE-sephadeksie:
2R
CH
NH
COOH + H2O
CO
R'
Acylo D,L-aminokwasy
Aminoacylaza
R
(hydrolaza wyłącznie
acylo L-aminokwasów)
CH
COOH + R
NH2
L-aminokwas
Racemizacja
CH
COOH + R'OH
NH
CO
R'
Acylo D-aminokwas
102
Podstawy biochemii
Jednocześnie przy pomocy immobilizowanej β-frukto-furanoidazy uruchomiono
produkcję cukru inwertowanego stanowiącego mieszaninę glukozy i fruktozy, powstającą w wyniku hydrolizy sacharozy. Obecnie ten sposób produkcji jest bardzo
rozpowszechniony. Inwertaza immobilizowana jest bardzo stabilna, a jej aktywność
w okresie dziesięcioletniej eksploatacji reaktorów zmniejszyła się tylko o 10%.
Duże znaczenie przemysłowe ma także proces otrzymywania równomolowej
mieszaniny glukozy i fruktozy, czyli przekształcania glukozy we fruktozę przy
pomocy immobilizowanej glukozoizomerazy. Procesy te prowadzone są od 1972 r.
w USA oraz w Niemczech, Danii i Holandii.
W 1974 roku w Japonii uruchomiono produkcję kwasu L-asparaginowego, wykorzystując liazę asparginianową, immobilizowaną na żywicy fenolowoformaldehydowej. Przy wysokim stopniu przemiany (99%) fumaranu amonu do
kwasu L-asparaginowego enzym ten jest mniej stabilny niż w immobilizowanych
komórkach. Czas życia enzymu wynosi 18 dni. Również w Japonii produkuje się
L-tryptofan z indolu i seryny, używając syntazy tryptofanu i L-tyrozyny, używając
immobilizowanej liazy tyrozyno-fenolowej.
W przemyśle farmaceutycznym bardzo duże znaczenie ma wykorzystanie
w produkcji immobilizowanej penicylinoamidazy. Umożliwia syntezę analogów
penicyliny poprzez acylowanie aminokwasu 6-aminopenicylinowego różnymi
kwasami. Niżej podany jest schemat syntezy kwasu 6-aminopenicylinowego:
S
CH2
CO
NH
CH3
+
CH
CH
C
C
N
CH3
CH COOH
H2O
Amidaza
penicylinowa
O
Benzylopenicylina
CH2
COOH
S
+
H2N
CH
C
CH3
CH
C
N
CH3
CH COOH
O
Kwas
fenylooctowy
Kwas
penicylanowy
Poprzez przyłączenie do grupy amidowej tego kwasu rodników innych niż benzylowy, otrzymywane są penicyliny o pożądanych specyficznych właściwościach.
Przytoczone przykłady nie wyczerpują listy substancji chemicznych, wytwarzanych przy zastosowaniu osiągnięć inżynierii enzymologicznej. Jednocześnie z wykorzystywaniem immobilizowanych enzymów rozwija się przekształcanie surowców chemicznych przez mikroorganizmy, które w tym przypadku są rodzajem
Rozdział 3. Enzymy
103
żywego laboratorium zawierającego enzymy. Najstarszym rodzajem produkcji tego
typu jest otrzymywanie alkoholu drogą fermentacji, w którym to procesie enzymy
obecne w komórkach drożdży intensywnie przekształcają glukozę w alkohol etylowy. Obecnie coraz częściej przechodzi się od klasycznych metod fermentacyjnych do nowych technologii charakteryzujących się wykorzystywaniem immobilizowanych komórek różnych mikroorganizmów. Etanol otrzymuje się z glukozy za
pomocą immobilizowanych w żelu poliakryloamidowym komórek Saccharomyces
cerevisiae.
Pierwszy na świecie przemysłowy 1000-litrowy reaktor typu przepływowego
do syntezy kwasu L-asparaginowego z fumaranu amonu został uruchomiony w Japonii (1973). Wykorzystano w nim immobilizowane komórki pałeczki jelitowej
(Esherichia coli), zawierające liazę asparaginianową:
Liaza
asparaginianowa
HOOC-CH=CH-COONH4
Fumaran amonowy
⇄
HOOC-CH2-CH(NH2)COOH
Kwas asparaginowy
Wydajność tego aparatu wynosiła 1915 kg kwasu L-asparginowego na dobę.
Stopień przemiany substratu w produkt wynosił 95%. W środowisku kwaśnym
(pH 2,8) i w temperaturze 15oC, kwas asparaginowy wykrystalizowuje w postaci
preparatu analitycznie czystego. Immobilizowane komórki pałeczki jelitowej zachowują aktywność amoniako-liazy asparaginianowej na poziomie 80% przez
okres 120 dni, a na poziomie 50% – w ciągu 600 dni pracy reaktora, podczas gdy
komórki nieimmobilizowane – na poziomie 25% w ciągu 10 dni.
Innym produkowanym aminokwasem jest L-izoleucyna, syntetyzowana z treoniny i glukozy za pośrednictwem immobilizowanych komórek Serratia marcescens. W analogiczny sposób otrzymano też L-lizynę:
Mikrobakterium
ammoniaphilum
HOOCCH(NH2)(CH2)3CH(NH2)COOH ⇄ H2NCH2(CH2)3CH(NH2)COOH + CO2
Kwas diaminopimelinowy
Lizyna
Używając immobilizowanych komórek Corynobacterium glutamicum produkuje się z glukozy kwas L-glutaminowy; Esherichia coli otrzymuje L-tryptofan z indolu, a stosując komórki Streptococcus feccalis L-ornitynę z L-argininy. Tak więc
aminokwasy szeregu L niezbędne jako dodatki w żywieniu człowieka i hodowli
zwierząt produkowane są obecnie praktycznie tylko w reaktorach posiadających
immobilizowane komórki.
Za pomocą immobilizowanych w żelu komórek Brevibacterium ammoniagens,
od 1974 r. produkuje się w Japonii kwas jabłkowy z kwasu fumarowego. W Rosji
z kwasów: propionowego, octowego i pirogronowego otrzymuje się glukozę, laktozę oraz mleczan sodowy. Używając immobilizowanych komórek różnych mikroorganizmów opracowano także metody syntezy ATP, NADP, glukozo-6-fosforanu,
104
Podstawy biochemii
glutationu, kwasów glukonowego i 2-ketoglukonowego, fruktozy (poprzez izomeryzację glukozy), mieszaniny glukozy i fruktozy w wyniku hydrolizy sacharozy
oraz koenzymu A i acetylo-CoA. Stosując immobilizowane enzymy, japońscy
naukowcy opracowali proces przekształcenia propylenu do tlenku propylenu w wyniku bezpośredniego utlenienia tlenem.
W przemyśle farmaceutycznym immobilizowane komórki stosuje się w syntezie hormonów steroidowych i ich pochodnych, w otrzymywaniu penicylin o przedłużonym działaniu oraz w produkcji wielu innych preparatów leczniczych. Metodami inżynierii genetycznej otrzymano komórki zdolne do produkcji leków białkowych o dużym znaczeniu, tj. insuliny, interferonu, czy α1-antytrypsyny.
Zastosowaniem enzymów zajmuje się również chemia analityczna. Polega ono
na wytwarzaniu elektrod pokrytych immobilizowanymi enzymami. Przy pomocy
elektrody platynowej z immobilizowaną glukozohydroksydazą można wyznaczyć
stężenie glukozy metodą amperometryczną:
HOCH2
H
H
OH H
C
C
C
OH OH H
Glukoza
HOCH2
O
C
+ O2 + H2O
C
OH
H
H
H
OH H
C
C
C
C
OH OH H OH
Kwas glukonowy
Oksydaza
glukozowa
O
C
+ H2O2
OH
Oznaczenie ilości powstającego H2O2 trwa 1 minutę. Na bazie tej elektrody enzymatycznej produkowany jest analizator glukozy. Za pomocą elektrod enzymatycznych określane są ilości sacharozy, mocznika, etanolu oraz poziom pestycydów w środowisku naturalnym.
Należy przypuszczać, że stosowanie enzymów przyczyni się do pozyskiwania
nowych źródeł energii. Dziś wskazuje się na dwie możliwości realizacji tego zadania. Pierwsza dotyczy bezpośredniego przekształcania energii chemicznej w elektryczną za pomocą ogniw paliwowych. W urządzeniach tych wykorzystuje się
enzymy, takie jak: oksydaza glukozowa, ureaza, hydrogenaza, dehydrogenaza mleczanowa i alkoholowa (substraty, odpowiednio, glukoza, mocznik, wodór, kwas
mrówkowy i etanol). W przypadku dehydrogenazy alkoholowej schemat przekształcenia energii chemicznej w elektryczną jest następujący:
Rozdział 3. Enzymy
C2H5OH + NAD+
Dehydrogenaza
alkoholowa
→
105
CH3CHO + NADH + H+
H
N
+
NADH + H +
N
SO4
+
N
CH3
2-
SO42-
NAD +
N
CH3
2
Fenazynometylosiarczan
utleniony (FMS)
2
Fenazynometylosiarczan
zredukowany (FMS⋅H2)
Na powierzchni
FMS⋅H2
+
→
elektrody platynowej
FMS + 2H+ + 2e
Drugi sposób polega na wykorzystaniu jako źródła energii produktów reakcji
enzymatycznej, np. wodoru, który produkowany jest za pomocą energii słonecznej
(rys. 3.6).
2H2O
O2
hv
Chloroplastry
immobilizowane
+
2( NADFH + H )
Hydrogenaza
immobilizowana
+
2( NADF )
2H2
Rys. 3.6. Schemat wykorzystania energii słonecznej do rozkładu wody i produkcji
paliwa gazowego
Przeprowadzone obliczenia wykazały, że kwadrat o wymiarach 200 x 200 [km2],
gdzie ulokowane są akceptory energii słonecznej, w tym przypadku immobilizowane
chloroplasty, zabezpieczyłyby pełne zapotrzebowanie Polski w energią elektryczną.
Co istotne byłaby to technologia przyjazna dla środowiska.
W wielu ośrodkach naukowych badany jest mechanizm katalizy enzymatycznej,
poznanie którego zaowocuje z pewnością rozwojem nowych technologii w prze-
106
Podstawy biochemii
myśle chemicznym. Przyczynią się one do zwiększenia wydajności produkcji
i ograniczenia reakcji ubocznych. Poznanie mechanizmów procesów enzymatycznych, fotosyntezy, biosyntezy białek, wiązania azotu cząsteczkowego oraz opracowanie na ich podstawie technologii będzie mieć z pewnością ogromny wpływ na
życie człowieka.
Ilość procesów chemicznych katalizowanych enzymatycznie jest bardzo duża.
W przyrodzie dochodzi do wielu przekształceń enzymatycznych niemożliwych do
przeprowadzenia w warunkach laboratoryjnych, co jest dowodem ogromnego znaczenia związków enzymatycznych w procesach życiowych. Nieustanne badania
prowadzące do poznania budowy, właściwości oraz udziału cząsteczek enzymatycznych w różnorodnych reakcjach chemicznych, pozwolą na dalszy rozwój biochemii dynamicznej, której problemy omawiane są w następnych rozdziałach podręcznika.