ENZYMY
Transkrypt
ENZYMY
Rozdział 3 ENZYMY Aktywność katalityczna jest najważniejszą cechą białek, ściśle związaną z budową ich cząsteczek. Białka aktywne katalitycznie nazywane są enzymami (od grec. en – wewnątrz, zym – zaczyn). Enzymy są katalizatorami, które zmieniają szybkość reakcji, same nie ulegając zmianie. Pierwsze wiadomości o ich istnieniu uzyskano podczas badania procesu hydrolizy skrobi przy użyciu wyciągu słodu (Kirchhoff, 1814). W 1836 r. J. Berzelius ogłosił klasyczną teorię katalizy chemicznej, a nieco później Pasteur i Kühne rozwinęli prace nad katalizą enzymatyczną. Reakcje katalizowane przez enzymy zazwyczaj przebiegają we względnie łagodnych warunkach (temperatura poniżej 100oC, ciśnienie atmosferyczne i pH ≈ 7) w porównaniu z warunkami odpowiednich niekatalizowanych reakcji chemicznych. Przekształcenia substancji na drodze enzymatycznej stanowią materialną i energetyczną istotę procesów życiowych. Enzymy są bodźcami wszystkich przekształceń chemicznych biorącymi udział w procesach regulacji przemian różnorodnych związków. Obecnie znanych jest kilka tysięcy białek enzymatycznych, z których kilkaset zostało wyizolowanych, oczyszczonych i zsekwencjonowanych. Szacuje się, że żywa komórka może zawierać do 3.000 różnych enzymów, z których każdy katalizuje indywidualną reakcję chemiczną. Enzymy jako specyficzne katalizatory biologiczne różnią się od katalizatorów nieorganicznych, pomimo, że zarówno jedne, jak i drugie przyspieszają osiągnięcie stanu równowagi w procesach chemicznych przebiegających samorzutnie ale bardzo powoli. Biokatalizatory podobnie jak katalizatory nieorganiczne nie wywołują reakcji chemicznych, a jedynie je przyspieszają. Różnica między nimi polega na tym, że w porównaniu z katalizatorami nieorganicznymi, enzymy działają efektywnie. Na przykład, hydrolityczny rozpad białka do aminokwasów w obecności katalizatorów nieorganicznych (mocnych kwasów lub zasad) następuje w temperaturze 100°C albo wyższej, w ciągu kilkudziesięciu godzin. Ten sam proces przy udziale enzymów przebiega w ciągu kilkudziesięciu minut w temperaturze 30-40°C. Hydroliza skrobi wymaga kilkugodzinnego ogrzewania w roztworze kwasu, podczas gdy przy udziale odpowiedniego enzymu ten sam proces następuje w ciągu kilku minut w temperaturze pokojowej. Enzymy posiadają niezwykle wysoką specyficzność działania, czego nie mają katalizatory nieorganiczne. Każdy enzym przyspiesza katalitycznie, reguły, jedną reakcję chemiczną lub w skrajnym przypadku grupę reakcji jednego typu. Szereg 64 Podstawy biochemii różnic pomiędzy enzymami i zwykłymi katalizatorami nieorganicznymi związanych jest z białkową naturą enzymów. Należą do nich: stabilność termiczna, zależność od pH środowiska, obecność aktywatorów lub inhibitorów i in. Katalityczne działanie enzymów reguluje procesy hydrolizy, fosforolizy, utlenienia i redukcji, rozszczepienia i syntezy, izomeryzacji, przenoszenia grup funkcyjnych, takich jak rodniki metylowe lub reszty kwasu fosforowego. Zdecydowana większość procesów chemicznych zachodzących w żywych organizmach przebiega przy udziale enzymów przede wszystkim dlatego, że ich funkcja katalityczna stanowi podstawę procesów życiowych. Oddziaływanie enzymów na substancje lecznicze, np. na antybiotyki, prowadzi do zmian ich struktury, co umożliwia wyleczenie choroby. Odwrotnie, zmiana aktywności enzymatycznej pod wpływem toksyn bakteryjnych i innych trucizn prowadzi do utrwalenia stanu chorobowego organizmu. Stymulowanie wzrostu roślin preparatami stosowanymi w rolnictwie w większości przypadków polega na zakłócaniu procesów biosyntezy przez wpływanie na aktywność enzymów. Specyficzność enzymów decyduje o zróżnicowaniu gatunkowym organizmów, a zaburzenia ich biosyntezy mogą być przyczyną chorób dziedzicznych. Enzymy izolowane ze źródeł naturalnych nie tracą swych zdolności katalitycznych. Właściwość ta znalazła praktyczne zastosowanie w przemyśle lekkim, chemicznym, farmaceutycznym i przetwórczym. Szczególne znaczenie dla przemysłu chemicznego ma specyficzność enzymów. Szacuje się, że ok. 80% strat w produkcji niektórych substancji chemicznych spowodowane jest oddzielaniem domieszek, powstających jako produkty reakcji ubocznych. Proces technologiczny zostaje znacznie przyspieszony, gdy reakcje syntezy przeprowadza się za pośrednictwem wysoko wyspecjalizowanych enzymów, przyspieszających tylko reakcję powstawania żądanego produktu. Ponadto, enzymy umożliwiają przebieg wielu procesów, których do tej pory nie udało się przeprowadzić tradycyjnymi metodami syntezy organicznej. Przykładem może tu być otrzymywanie leków przeciwzapalnych drogą enzymatycznej transformacji sterydów. 3.1. Budowa enzymów Enzymy mogą być jednoskładnikowymi, prostymi białkami lub białkami złożonymi. W wielu przypadkach enzym zawiera dodatkową grupę niebiałkową, tak zwany koenzym. W różnych okresach stosowano różne nazwy części białkowej i grupy dodatkowej. Wszystkie z nich (wymienione poniżej) stosowane są także obecnie, np.: Enzym jako całość Simpleks Holoferment Część białkowa Feron (nośnik) Apoenzymn Grupa dodatkowa Agon (grupa aktywna) Koenzym Rozdział 3. Enzymy 65 Grupa dodatkowa, która oddysocjowuje od części białkowej, nazywana jest grupą prostetyczną, a grupa dodatkowa, łatwo ulegająca dysocjacji od apoenzymu i zdolna do samodzielnego funkcjonowania, nazywana jest koenzymem. Budowa chemiczna najważniejszych koenzymów została opisana w latach 30. XX wieku w pracach O. Warburga, R Kuhna, P. Karrera. Okazało się, że rolę koenzymów pełni większość witamin (E, K, Q, B1, B2, B6, C, H) lub związków zawierających witaminy (koenzym A, NAD+). Aktywność koenzymatyczną posiadają także związki, takie jak: HS-glutation, liczna grupa nukleotydów i ich pochodnych oraz estry fosforanowe niektórych sacharydów oraz jony metali. Cechą charakterystyczną dwuskładnikowych enzymów jest to, że ani część białkowa, ani grupa dodatkowa osobno nie posiadają aktywności katalitycznej. Tylko ich kompleks posiada właściwość enzymu. W tym kompleksie białko wyraźnie podwyższa aktywność katalityczną grupy dodatkowej, natomiast grupa dodatkowa stabilizuje część białkową, czyniąc ją mniej podatną na czynniki denaturujące. W związku z tym, chociaż bezpośrednio funkcję katalityczną pełni grupa prostetyczna, tworząca centrum katalityczne, nie jest ona aktywna bez części białkowych enzymu. Ponadto w apoenzymie występuje fragment o specyficznej budowie, który wybiórczo wiąże koenzym. Określany jest jako koenzym wiążący domen, przy czym jego budowa u różnych apoenzymów, łączących się z tym samym koenzymem, jest podobna, jak np. struktury przestrzenne domen wiążących nukleotydy domen szeregu dehydrogenaz. Niektóre enzymy nie zawierają grupy dodatkowej, która może wchodzić w bezpośredni kontakt z przekształcanym związkiem. Funkcję tę pełni wówczas część cząsteczki białkowej enzymu nazywana centrum katalitycznym. Centrum katalityczne enzymu jest unikalną konstrukcją przestrzenną zbudowaną z kilku reszt aminokwasowych, zajmujących określony fragment cząsteczki białka. W centrum katalitycznym tych enzymów występują najczęściej reszty ser, his, try, arg, cys, asp, glu i tyr. Rodniki wymienionych aminokwasów pełnią w tym przypadku funkcję odpowiadającą koenzymowi. Reszty aminokwasów wchodzące w skład centrum katalitycznego enzymu znajdują się w różnych miejscach łańcucha polipeptydowego, w związku z czym centrum katalityczne może zostać utworzone, gdy cząsteczka białka przybiera charakterystyczną strukturę trzeciorzędową. Zmiany tej struktury pod wpływem określonych czynników prowadzą do deformacji centrum katalitycznego i zmiany aktywności enzymatycznej. Oprócz centrum katalitycznego, utworzonego przez połączenie reszt aminokwasów i obecności koenzymu, w cząsteczkach enzymów wyróżnia się także inne domeny wiążące, jak np. centrum substratowe i allosteryczne. Centrum substratowe będące częścią cząsteczki enzymu, która odpowiada za przyłączenie substratu ulegającego przekształceniu enzymatycznemu, często nazywany jest „placem kotwicznym” enzymu, na którym substrat pełni rolę statku. Ma ono wymiar przestrzenny i często tworzy zagłębienie lub szczelinę na po- 66 Podstawy biochemii wierzchni białka, w której substrat wiązany jest licznymi słabymi oddziaływaniami. Proponowane są dwa modele wyjaśniające sposób, w jaki enzym wiąże swój substrat: model zamka i klucza oraz model dopasowania indukowanego. Badania prowadzone w ostatnich latach wykazały, że najważniejsze są siły elektrostatyczne, siły oddziaływań hydrofobowych i wiązania wodorowe, powstające między rodnikami reszt aminokwasowych ośrodka substratowego enzymu a odpowiednimi grupami w cząsteczce substratu. Centrum substratowe enzymu może być zlokalizowane w miejscu odpowiadającym centrum katalitycznemu (lub pokrywać się z nim), które może kształtować się ostatecznie w trakcie dołączenia substratu. W związku z tym często mówi się o centrum aktywnym enzymu łączącym właściwości centrum substratowego i centrum katalitycznego. Centrum allosterycze stanowi fragment cząsteczki enzymu odpowiadający za zmiany jego struktury trzeciorzędowej w wyniku przyłączania związków niskolub wysokocząsteczkowych, w wyniku czego następuje zmiana konfiguracji centrum aktywnego i obniżenie lub wzrost aktywności katalitycznej enzymu. Zjawisko to jest podstawą tzw. regulacji allosterycznej aktywności katalitycznej enzymów. Masy cząsteczkowe enzymów wynoszą od kilku tysięcy do kilku milionów daltonów. Kilkadziesiąt z nich to stosunkowo niewielkie cząsteczki (do 50.000 Da), natomiast zdecydowana większość zbudowana jest z białek o większych masach cząsteczkowych (rys. 3.1). Na przykład, katalaza (M = 252.000) zawiera 6 protomerów o masie jednostkowej wynoszącej 42000 Da. Cząsteczkę enzymu, katalizującego reakcję syntezy kwasów rybonukleinowych (polimeraza RNA, M = 475.000), buduje pięć podjednostek o różnych masach cząsteczkowych. Cząsteczka dehydrogenazy glutaminianowej katalizująca proces utleniania kwasu glutaminowego (M = 475.000) składa się 6 podjednostek (M = 56.000). Rys. 3.1. Budowa niektórych kompleksów enzymatycznych: A – cząsteczka dehydrogenazy glutaminianowej, która zawiera 6 podjednostek (M = 56.000) rozmieszczonych wzdłuż krawędzi tetraedru; masa cząsteczkowa enzymu równa jest 336.000; B – model cząsteczki polimerazy RNA, zawierającej pięć podjednostek; dwie typu α (M = 40.000), dwie typu β (M = 150.000) i β’ (M = 155.000) oraz σ-czynnik (M = 90.000); C – schemat budowy połówki cząsteczki katalazy; każda podjednostka wygląda jak dwa razy wygięta pałeczka; D – kompleks polienzymatyczny, który przyspiesza reakcje dekarboksylowania utleniającego; E – karbamilotransferaza asparginianowa, która składa się z 6 katalitycznych (M = 33.500, oznaczone jako C1 – C6) i 6 regulatorowych (M = 17.000, oznaczone jako R1 – R4; R5 i R6 nie są widoczne) podjednostek Rozdział 3. Enzymy 67 Jak przedstawiono na rys. 3.1, różnorodne są sposoby łączenia protomerów w multimery. Najważniejsze znaczenie ma fakt, że enzym zbudowany z podjednostek wykazuje maksymalną aktywność tylko w postaci multimeru, a dysocjacja na protomery obniża jego aktywność. Obok protomerów aktywnych katalitycznie w skład cząsteczek enzymów wchodzą też białka regulatorowe, jak np. w przypadku karbamilotransferazy asparaginianowej (rys. 3.1). Wśród enzymów multimerycznych zdecydowaną przewagę stanowią dimery i tetramery (jest ich kilkaset), mniej jest heksamerów i oktamerów (kilkadziesiąt), a niezwykle rzadko spotyka się trimery i pentamery. W wielu przypadkach multimeryczne cząsteczki enzymów składają się z podobnych podjednostek dwóch typów, oznaczonych jako A i B, przy czym niektóre elementy ich struktury pierwszo- i trzeciorzędowej są różne. W zależności od stosunku protomerów typu A i B w multimerze protomer B może występować w postaci kilku izomerów nazywanych izozymami. Przy czterech podjednostkach możliwych jest 5 izomerów: I AAAA II AAAB III AABB IV ABBB V BBBB Zjawisko to zostało zbadane w przypadku enzymu katalizującego odwracalną przemianę w mięśniach kwasu mlekowego w kwas pirogronowy: Utlenianie CH3CH(OH)COOH Kwas mlekowy ⇄ CH3COCOOH Redukcja Kwas pirogronowy W związku z tym, że utlenianie kwasu mlekowego (acidium lacticum) zachodzi w wyniku usunięcia jonu H-, enzym ten zwany jest dehydrogenazą mleczanową. Jedna cząsteczka enzymu (M = 140.000) składa się z 4 podjednostek (M = 35.000) umownie oznaczonych jako H i M (ang. heart – serce, muscle – mięsień), ponieważ izoenzymy dehydrogenazy mleczanowej typu I i V izolowane są z serca i mięśni szkieletowych. Na tej podstawie wyróżnia się następujące izoenzymy dehydrogenazy mleczanowej: I HHHH II HHHM III HHMM IV HMMM V MMMM Izozymy różnią się między sobą stopniem aktywności, własnościami fizycznymi, takimi jak masa cząsteczkowa i ruchliwość elektroforetyczna, oraz lokalizacją w tkankach i organach. W zależności od wieku i stanu fizjologicznego organizmu dochodzi do ustalenia ilości izoenzymów, której odpowiada określony poziom aktywności enzymu. Zmiana poziomu izoenzymów w organizmie lub w tkankach i organach jest więc jednym ze sposobów regulacji aktywności enzymów. Oprócz izoenzymów warunkowanych genetycznie, stwierdzono także ich występowanie będące wynikiem modyfikacji potranslacyjnych. 68 Podstawy biochemii Badania tzw. multienzymów, czyli enzymów katalizujących jednoczesny przebieg kilku reakcji chemicznych oraz dokonujących złożonych przekształceń substratu, pozwalają na określenie znaczenia ich budowy przestrzennej. Przykładem takiego związku jest multienzym katalizujący dekarboksylację kwasu pirogronowego. Ten wielofunkcyjny kompleks o M = 4.500.000 składa się z trzech rodzajów enzymów. Pierwszy (E1) katalizuje reakcję dekarboksylacji kwasu pirogronowego. W skład kompleksu wchodzi 12 dimerów (M = 192.000) (zob. rys. 3.1E) w postaci dużych jednostek ułożonych parami wzdłuż obwodu. Enzymy drugi i trzeci, które katalizują procesy redox zachodzące podczas utleniania kwasu pirogronowego, znajdują się wewnątrz kompleksu multienzymowego. Jeden z nich (E3), składa się z 6 dimerów (M = 112.000), a drugi (E2) z 24 protomerów (M = 70.000) (rys. 3.1D). W przypadku, gdy multienzymatyczny kompleks katalizuje jeden złożony proces przekształceń biochemicznych, nazywamy go metabolonem (od słowa metabolizm – przemiana materii). Na przykład metabolony glikolizy, biosyntezy szeregu aminokwasów czy cyklu kwasów dwu- i trójkarboksylowych. Skoordynowane działanie trzech rodzajów enzymów wchodzących w skład multienzymu zapewnia bardzo szybkie przekształcanie kwasu pirogronowego. Takie współdziałanie w procesie katalitycznym odróżnia biokatalizatory od nieorganicznych katalizatorów, i dlatego biokataliza ma wielokrotnie wyższą efektywność. Stosunkowo niedawno odkryto kolejną, charakterystyczną cechę budowy enzymów. Jest nią wielofunkcyjność, polegająca na wykazywaniu kilku rodzajów aktywności enzymatycznej przez jeden łańcuch polipeptydowy. Łańcuch ten tworzy kilka funkcjonalnie i przestrzennie wyodrębnionych elementów – domen, z których każda charakteryzuje się określoną aktywnością katalityczną. Najważniejszą cechą katalizy enzymatycznej tego typu jest przekazywanie produktów poszczególnych reakcji przez kolejne składniki układu katalitycznego do dalszych przekształceń bez ich uwalniania. 3.2. Mechanizm działania enzymów Główną rolę w mechanizmie katalizy enzymatycznej odgrywa tworzenie się kompleksów enzymatyczno-substratowych, na obecność których po raz pierwszy wskazał D. Brown (1902). W pierwszej fazie katalizy enzymatycznej pomiędzy substratem (lub substratami) a enzymem powstaje kompleks, w którym reagenty mogą tworzyć wiązanie jonowe, kowalencyjne lub supramolekuły związane słabymi oddziaływaniami. W drugiej fazie substrat pod wpływem przyłączonego do niego enzymu staje się podatny na odpowiednią reakcję chemiczną. W trzeciej fazie następuje reakcja chemiczna, a w czwartej fazie produkty reakcji uwalniają się z kompleksu enzymatycznego. Jeśli oznaczamy enzym przez E, a substrat przez S, produkt reakcji przez P, to możemy ułożyć następujący schemat procesu: Rozdział 3. Enzymy I II III 69 IV E + S ⇄ ES ⇄ ES* ⇄ EP ⇄ E + P Schemat ten został zaproponowany przez V. Henriego (1903), a następnie przez L. Michaelsa i M. Menten (1913) i został potwierdzony wydzieleniem kompleksów ES, ES* i EP. Przykładem katalizy enzymatycznej, zachodzącej według podanego schematu, jest reakcja hydrolizy acetylocholiny. Związek ten pośredniczy (mediator) w przekazywaniu impulsów nerwowych. Aby proces ten przebiegał nieprzerwanie, po każdym akcie przekazywania impulsu nerwowego wywołująca go dawka acetylocholiny (1-2 µg) powinna ulec całkowitemu rozkładowi. Jest to możliwe dzięki hydrolizie acetylocholiny z udziałem enzymu esterazy acetylocholinowej. Hydroliza przebiega z szybkością: 1-2 µg acetylocholiny w ciągu 0,1-0,2 ms: Esteraza acetylocholinowa CH3COOCH2CH2N+(CH3)3 + H2O Acetylocholina → CH3COOH + HOCH2CH2N+(CH3)3 Kwas octowy Cholina Esteraza acetylocholinowa nie zawiera koenzymu. W jego centrum aktywnym znajdują się co najmniej 4 reszty aminokwasowe – glu, ser, his, tyr, zapewniające odpowiedni przebieg katalizy enzymatycznej. Na początku pomiędzy enzymem (esteraza acetylocholinowa) i substratem (acetylocholina) dochodzi do utworzenia kompleksu enzym – substrat w wyniku oddziaływania elektrostatycznego pomiędzy ujemnie naładowaną grupą COO- reszty glu i dodatnio naładowanym atomem N cząsteczki acetylocholiny (rys. 3.2B). Po utworzeniu kompleksu enzym – substrat w reakcję zostają włączane pozostałe reszty aminokwasowe centrum aktywnego esterazy acetylocholinowej. W pierwszej kolejności powstaje wiązanie pomiędzy atomem węgla spolaryzowanej grupy CO acetylowego rodnika choliny a tlenem grupy OH w reszcie ser. Następnie w wyniku oddziaływania tlenu grupy estrowej cząsteczki acetylocholiny i grupy OH reszty tyr powstaje wiązanie wodorowe (rys. 3.2.C). Ułożenie cząsteczki acetylocholiny i reszt ser i tyr w centrum aktywnym enzymu powoduje osłabienie wiązania między grupą CO i atomem tlenu grupy estrowej cząsteczki acetylocholiny. Efekt ten prowadzi do tego, że rozpad cząsteczki acetylocholiny wymaga mniejszej energii, tzn. bariera energetyczna zostaje znacznie obniżona dzięki aktywacji cząsteczki acetylocholiny w kompleksie ES*. Dlatego pod wpływem reszty his, która przyciąga na siebie proton z grupy OH ser, utrwala się wiązanie estrowe między resztą ser i grupą acetylową, jednocześnie rozpada się wiązanie estrowe w cząsteczce acetylocholiny i proton z reszty tyr przechodzi na resztę choliny (rys. 3.2D). Proton ten uwalnia się z centrum aktywnego (rys. 3.2IV), a jego miejsce zajmuje cząsteczka wody. Tworzy ona wiązanie wodorowe z karbonylowym tlenem grupy acetylowej i tlenem tyr (na rysunku 3.2 etap 70 Podstawy biochemii ten nie jest zaznaczony). Następnie proton z reszty his wraca na atom tlenu grupy OH ser, a proton cząsteczki wody – do reszty fenolowej tyr. Jednocześnie powstaje drugi produkt reakcji – kwas octowy i odnawia się wolne centrum aktywne esterazy acetylocholinowej (rys. 3.2A) gotowe do następnego cyklu reakcji katalizy. CH 3 OH H 3C CO + O OH (CH 2) 2 N CH 2 OH OH I HN HN N N O CH 2 CH 3 CH 3 O CH 2 OOC (CH 2)2 CH 2 CH 3 H 3C P CO + O (CH 2)2 N OOC (CH 2)2 P CH 3 CH 3 OH OH + (CH 2)2 N A CH 2 CH 3 HO IV CH 3 CH 3 B CH 2 O CH 3COOH O H 2O OH C CH 2 CH 2 OH O CO CH 3 + HN HN N NH O II OH D CH 2 O CH 3 HO + CO CH 3 O (CH 2)2 N OOC (CH 2)2 P CH 3 CH 2 + (CH 2)2 N OOC (CH 2) 2 P CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 H O O III CH 2 CH 2 O O Rys. 3.2. Mechanizm działania esterazy acetylocholinowej: A – centrum aktywny enzymu; B – kompleks enzym – substrat; C – przygotowanie substratu do reakcji (aktywacja); D – kompleks produktów reakcji z enzymem (wyjaśnienie w tekście) W procesie tworzenia kompleksu enzym – substrat, jak również w dalszych etapach katalizy enzymatycznej, zachodzą niejednokrotnie zmiany trzeciorzędowej struktury enzymu prowadzące do zbliżenia reaktywnych grup z substratem. Zmiana trzeciorzędowej struktury białka nie jest możliwa bez udziału całego lub prawie całego łańcucha polipeptydowego tworzącego cząsteczkę białka, co świadczy o tym, że w katalizie enzymatycznej bierze udział cała lub prawie cała cząsteczka enzymu. Specyficzność substratu zapewnia wiązanie cząsteczki enzymu w innych domenach niż centrum aktywne. Do utrwalenia wiązania substratu z enzymem dochodzi w wyniku wielopunktowych kontaktów w formie słabych oddziaływań hydrofobowych i utworzenia wiązań wodorowych. Jednocześnie w centrum aktywnym enzymu stabilizowana jest część substratu biorąca udział w reakcji, która osiąga konfigurację bliską przejściowemu stanowi przekształcenia substratu w produkt. W rezultacie reagująca część cząsteczki substratu oraz katalityczne grupy enzymu Rozdział 3. Enzymy 71 tworzą kompleks przejściowy, w którym już częściowo zrealizowane są przejścia elektronowo-konformacyjne, niezbędne dla chemicznego stadium procesu enzymatycznego. Prowadzi to do obniżenia energii aktywacji niezbędnej do realizacji reakcji chemicznej, dzięki efektowi immobilizacji i utrwalenia ścisłej orientacji substratów w centrum aktywnym enzymu. W ten sposób każde ogniwo wieloetapowej reakcji enzymatycznej stwarza niemalże optymalne warunki dla przebiegu następnego etapu, w związku z czym reakcja katalizowana enzymatycznie przebiega wielokrotnie szybciej niż nie katalizowana. Zmiany energii swobodnej (Gibbsa) (∆G, kJ⋅mol-1) zachodzące w przebiegu reakcji biochemicznej przedstawia rys. 3.3. Rys. 3.3. Zmiany energii swobodnej (∆G, kJ⋅mol-1) podczas przebiegu reakcji biochemicznej: I – reakcja nie katalizowana enzymatycznie; II – reakcja katalizowana enzymatycznie; P – produkty reakcji, S – substraty, SP – stan przejściowy; ∆G# – energia aktywacji reakcji; ∆Go – sumaryczna zmiana energii reakcji. Na rysunku 3.3 przedstawiono przykład, dotyczący reakcji hydrolizy acetylocholiny, w którym sumaryczna zmiana energii reakcji (∆Go) czyni ją energetycznie korzystną (tzn. produkty mają niższy poziom energii niż substraty, a ∆Go ma wartość ujemną). Dla każdej reakcji istnieje bariera energetyczna, którą należy pokonać, aby umożliwić jej przebieg. Jest to ilość energii potrzebna do przeprowadzenia cząsteczek substratu w stan przejściowy (SP), który ma największą energię swobodną ze wszystkich związków na drodze reakcji. Energia swobodna (∆G#) równa jest różnicy energii swobodnej między stanem przejściowym a substratem (rys. 3.3). Enzym nie zmienia poziomu energii zarówno substratu, jak i produktu. Oznacza to, że enzym zwiększa szybkość przebiegu reakcji, ale nie wpływa na ogólną zmianę energii w reakcji (∆Go). 72 Podstawy biochemii 3.3. Kinetyka reakcji enzymatycznych Kinetyka reakcji enzymatycznych bada zależność szybkości reakcji przebiegającej w obecności enzymu od natury chemicznej reagujących związków (substraty, enzym) i warunków przebiegu reakcji, takich jak stężenie, temperatura, pH środowiska i obecność aktywatorów lub inhibitorów. Zależność szybkości reakcji od temperatury, pH środowiska oraz wpływu inhibitorów i aktywatorów w znacznej mierze związana jest ze zmianami właściwości enzymu wynikającymi z jego struktury białkowej. W związku z tym omawiane prawidłowości określa natura i stężenie reagujących substancji oraz ich zmiany. Pierwszą fazą procesu katalitycznego jest utworzenie kompleksu enzym – substrat: k+1 E + S ⇄ ES k-1 Układ w stanie równowagi może być opisany odpowiednią stałą równowagi. Wielkość odwrotna do niej nazywa się stałą dysocjacji kompleksu enzym – substrat lub stałą substratową i oznaczana jest jako Ks: Ks = [E] [S] / [ES] Wielkość stałej Ks zależy od natury substratu i enzymu i wyraża stopień ich powinowactwa. Na przykład, dla sacharazy (enzymu przyspieszającego hydrolizę sacharozy) Ks = 0,0167 M, czyli stężenie kompleksu enzym – substrat ok. 60 razy przewyższa iloczyn stężeń wolnego enzymu i substratu. Im niższa wielkość Ks, tym wyższe powinowactwo enzymu do substratu. Ponieważ stężenie kompleksu enzym – substrat zmienia się na skutek przemiany substratu w produkt reakcji czemu towarzyszy regeneracja wolnego enzymu: k +2 ES → E + P, to wielkość Ks określa stosunek stałej prędkości reakcji przebiegającej w kierunku od lewej do prawej strony równania reakcji (k+1) do reakcji odwrotnej (k-1): Ks = k-1 / k+1. Do tego wniosku dochodzimy porównując szybkości reakcji przebiegającej w kierunku od lewej do prawej strony równania reakcji i odwrotnie. Wtedy można uzyskać wielkości charakterystyczne dla stanu równowagi systemu: v1 = k+1 [E] [S]; v2 = k-1 [ES]. Jeśli v1 = v2, to wtedy k+1 [E] [S] = k-1 [ES], tj. [E] [S] / [ES] = k-1 / k+1 = Ks. Stała substratowa lub stała dysocjacji kompleksu enzym – substrat (Ks) charakteryzuje proces katalityczny z punktu widzenia powinowactwa enzymu i substratu oraz stosunku stałej szybkości reakcji rozpadu i tworzenia się kompleksu enzym – substrat. Ponieważ jednocześnie z dysocjacją kompleksu enzym – substrat następu- Rozdział 3. Enzymy 73 je przekształcenie substratu w produkt i rozpad kompleksu enzym – produkt na tworzące go komponenty: k+1 k+2 E + S ⇄ ES →E + P k-1 dla pełnej charakterystyki procesu katalizy enzymatycznej wprowadzono pojęcie stałej Michaelsa (Km), którą określa stosunek stałych szybkości wszystkich trzech reakcji realizowanych w procesie katalizy enzymatycznej: Km = (k-1 + k+2)/k+1. Km zawsze jest większa niż Ks. W przypadku kompleksu sacharazy i sacharozy Ks = 0,0167 M, natomiast Km = 0,0280 M. Szybkość każdej reakcji chemicznej określa się liczbą moli substratu, które przereagowały w jednostce czasu. Ważne jest, aby warunki reakcji były standardowe, tzn. żeby reakcja przebiegała w określonej temperaturze, przy optymalnym pH i przy odpowiednim nasyceniu enzymu substratem. W takich warunkach szybkość reakcji enzymatycznej, oznaczaną jako Vmax, określa się maksymalną szybkością reakcji enzymatycznej, wyrażaną przez stężenie enzymu i stałą szybkości rozkładu kompleksu enzym – produkt: Vmax = k+2 [E]. Szybkość reakcji enzymatycznej obserwowana w warunkach niepełnego nasycenia substratu enzymem oznacza się jako v. Odpowiada ona stężeniu kompleksu enzym – substrat: v = k+2 [ES]. Ponieważ [ES] = k+1/k-1[E][S], a k+1/k-1 = 1/Ks, tzn. [ES] = [E][S]/Ks, to v = k+1[E][S]/Ks. W związku z tym obserwowana szybkość reakcji enzymatycznej zależy od stężeń enzymu i substratu oraz ich wzajemnego powinowactwa. Liczbowo Km jest równa stężeniu substratu (w mol/l), przy którym v = ½ V (rys. 3.4). V, mmol/min 0.25 0.20 Vmax= k +2 [E] 0.15 0.10 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 [S], mmol Rys. 3.4. Zależność szybkości reakcji enzymatycznej (v) od stężenia substratu (S) w warunkach stałego stężenia enzymu Po osiągnięciu stanu nasycenia enzymu przez substrat szybkość reakcji enzymatycznej v osiąga wielkość maksymalną 74 Podstawy biochemii Stężenie enzymu i substratu wyrażane jest zazwyczaj ilością mikromoli w litrze. Jednak w związku z tym, że dokładna masa cząsteczkowa i liczba katalitycznych centrów aktywnych dla większości enzymów nie są znane, stosuje się względny sposób określenia absolutnej ilości enzymu. Za jednostkę aktywności enzymu (oznaczaną jako E w języku niemieckim i rosyjskim oraz jako U w języku angielskim, francuskim, włoskim i hiszpańskim) przyjmuje się tę jego ilość, która w standardowych warunkach katalizuje przemianę 1 µmola substratu w ciągu 1 minuty (1 µmol/min). Przedstawiony system oznaczeń został wprowadzony w 1961 r. przez Komisję do Spraw Enzymów Międzynarodowej Unii Biochemicznej i stosowany jest obecnie. Zgodnie z danym systemem, szybkość reakcji enzymatycznej określa się liczbą mikromoli substratu ulegającego przemianie w ciągu 1 minuty. W roku 1972 zaproponowano zmianę jednostki aktywności enzymatycznej (E lub U), wprowadzając nową, zwaną katalem (kat), która określa ilość enzymu przekształcającą w ciągu 1 sekundy 1 mol substratu w warunkach standardowych. Ponieważ jednostka aktywności enzymatycznej wynosząca 1 kat, odpowiadająca szybkości reakcji równej 1mol/s, która nie jest obserwowana (przemiany chemiczne w takich układach zachodzą ze znacznie mniejszą szybkością), aktywność katalityczną w nowym systemie jednostek wyraża się w mikrokatalach (µkat), nanokatalach (nkat) lub pikokatalach (pkat), czemu odpowiadają prędkości reakcji w mikromolach, nanomolach i pikomolach na sekundę. Jednostkę E lub U równą 16,67 nkat, planuje się zastąpić w najbliższych latach, określając aktywność enzymatyczą w katalach. Stężenie enzymu w roztworze wyrażone w jednostce E określa ilość enzymu w 1 ml roztworu. W przypadku suchego preparatu enzymu podaje się ilość E w 1 mg. Jeżeli w preparacie enzymu określona została zawartość białka, to właściwa aktywność enzymu E, określana jest dla 1 mg białka. Ilość E w 1 mg czystego enzymu określana jest jako właściwa aktywność enzymu. Jeżeli znana jest masa molowa enzymu, to jako wielkość E w 1 µg enzymu, można obliczyć molekularną aktywność enzymu. Oznacza to, że wylicza się nie stężenie enzymu, a jego aktywność wyrażaną liczbą mikromoli substratu ulegających przemianie przez 1 mg enzymu w ciągu 1 min (właściwa aktywność enzymu), lub liczbę moli substratu ulegających przemianie w ciągu 1 min pod wpływem jednej cząsteczki enzymu (aktywność molekularna). Znając ilość centrów aktywnych cząsteczki enzymu, aktywność można określać liczbą cząsteczek substratu ulegających przemianie w jednym centrum aktywnym. Na przykład, aktywność molekularna katalazy równa jest 5 mln, natomiast aktywność jednego z jej czterech centrów katalitycznych stanowi tylko 1 mln 250 tys. cząsteczek H2O2. 3.4. Właściwości enzymów Jako białka, enzymy posiadają wszystkie właściwości tych związków i określone cechy specyficzne wynikające również z ich białkowego charakteru, które od- Rozdział 3. Enzymy 75 różniają enzymy od innych katalizatorów. Odnoszą się one do termalabilności enzymów, zależności ich działania od pH środowiska, specyficzności oraz podatności na działanie aktywatorów i inhibitorów. Termolabilmość enzymów charakteryzuje się tym, że podwyższenie temperatury prowadzi z jednej strony do denaturacji białka i obniżenia funkcji katalitycznej, zaś z drugiej – wpływa na szybkość reakcji tworzenia kompleksu enzym – substrat oraz na następne etapy tworzenia się produktu reakcji, co prowadzi do wzmocnienia katalizy. µ 0.10 A, % 100 0.05 50 0 20 40 0 60 T, C Rys. 3.5. Wpływ temperatury (T) na szybkość reakcji enzymatycznej (V) 0 7 14 pH Rys. 3.6. Wpływ pH środowiska na aktywność enzymu (A). (komentarz w tekście) Zależność aktywności katalitycznej enzymu od temperatury ma charakter krzywej przechodzącej przez maksima (rys. 3.5). Aktywność enzymu wzrasta średnio do 50ºC, przy czym na każde 10ºC prędkość przemiany substratu zwiększa się ok. 2 razy. Jednocześnie w wyniku denaturacji, stopniowo wzrasta ilość inaktywowanego enzymu. W temperaturze 50ºC następuje denaturacja białka enzymatycznego i chociaż prędkość przekształcania substratu rośnie, to aktywność enzymu, wyrażona ilością przekształconego substratu, ulega obniżeniu. Badania zależności zmian aktywności enzymów zależnych od temperatury wykazały, że mają one skomplikowany charakter. W wielu przypadkach nie obserwuje się na przykład dwukrotnego wzrostu aktywności enzymu wraz ze wzrostem temperatury o 10oC, czego główną przyczyną są zmiany konformacyjne cząsteczki enzymu. Temperatura odpowiadająca najwyższej aktywności katalitycznej określana jest jako temperatura optymalna. Jest ona różna dla różnych enzymów, przy czym najczęściej w przypadku enzymów pochodzenia zwierzęcego wynosi 40-50ºC, a roślinnego 50-60ºC. Enzymem o wyższej temperaturze optymalnej jest np. papaina (enzym roślinny katalizujący hydrolizę białka), którego temperatura optymalna stanowi 80ºC. Z kolei dla katalazy (enzymu przyspieszającego rozkład H2O2 do 76 Podstawy biochemii H2O i O2) temperatura optymalna wynosi 0-10ºC, gdyż w temperaturze wyższej następuje utlenienie i inaktywacja enzymu. Zależność aktywności enzymu od pH środowiska została opisana na początku XX wieku. Każdy enzym posiada optymalne pH, przy którym wykazuje maksymalną aktywność, przy czym dla większości z nich występuje ona w pH zbliżonym do obojętnego. Wielkość optymalnego pH odpowiada optymalnej jonizacji reszt centrum aktywacji enzymu. W środowisku kwaśnym lub zasadowym maksymalną aktywność wykazują tylko niektóre enzymy (tab. 3.1). Tabela 3.1. Optymalne wartości pH niektórych enzymów Enzym Rodzaj reakcji katalitycznej Pepsyna Lipaza (z nasion rącznika) Ureaza Trypsyna Arginaza pH Hydroliza białka Hydroliza tłuszczów Hydroliza mocznika Hydroliza białka Hydroliza argininy 1,5 – 2,5 4,7 – 5,0 7,0 7,8 9,5 – 9,9 Porównując z wartością optymalną, zmiana stężenia jonów wodorowych prowadzi do zaniku aktywności enzymu. Na rys. 3.6 linia krzywa przedstawia zależność aktywności katalitycznej enzymu od pH. Stężenie jonów wodorowych ma wpływ na aktywność katalityczną centrum aktywnego, które może ulegać jonizacji lub ekranowaniu przez sąsiadujące z nim fragmenty polipeptydowe enzymu. Ponadto pH zmienia stopień jonizacji substratu, kompleksu enzym – substrat, produktów reakcji oraz ilość centrów kationowych i anionowych decydujących o charakterystycznej trzeciorzędowej strukturze białka, niezbędnej do utworzenia kompleksu enzym – substrat. Jedną z najważniejszych właściwości enzymów jest ich specyficzność, odkryta już w XIX wieku podczas rozszczepienia wiązania estrowego izomerów przestrzennych α- i β-metyloglukozydów. Zaobserwowano, że strukturalnie podobne izomery przestrzenne są przekształcane na drodze reakcji z udziałem różnych enzymów: CH2OH H H OH CH2OH O H H OCH3 HO H H OH α-Metyloglukozyd (za pomocą enzymu ze słodu wiązanie eterowe ulega hydrolizie) H OH O OCH 3 H HO H H OH β-Metyloglukozyd (za pomocą enzymu z nasion migdalu gorzkiego wiązanie eterowe ulega hydrolizie) Enzymy mogą rozróżniać związki chemiczne różniące się niewielkimi szczegółami budowy cząsteczki, np. układem przestrzennym rodnika metoksylowego i atomu wodoru przy pierwszym atomie węgla w cząsteczce metyloglukozydu. Rozdział 3. Enzymy 77 Jak już wspomniano wyżej, funkcjonują dwa modele wyjaśniające, jak enzym może wiązać swój substrat. W modelu zamka i klucza, zaproponowanym w 1894 r. przez E. Fischera, kształt substratu i aktywnego miejsca enzymu pasują do siebie jak klucz do zamka, co wynika z badań specyficzności działania enzymu zależnej od struktury geometrycznej substratu i centrum aktywnego enzymu. W latach 50. XX wieku model ten został zastąpiony hipotezą D.E. Koshlanda o indukowanej zgodności enzymu z substratem, które mówi o komplementarności budowy przestrzennej substratu i centrum aktywnego enzymu pojawiającej się w momencie ich współdziałania. Deformacja niektórych kątów walencyjnych substratu i zmiany konformacyjne w cząsteczce enzymu umożliwiają przebieg reakcji. Hipoteza Koshlanda, zakładająca plastyczność centrum aktywnego, wyjaśnia aktywacji i osłabianie działania enzymów, czyli regulację ich aktywności pod wpływem czynników allosterycznych. Zmiany konformacyjne cząsteczki enzymu zależne od zmian jego aktywności Koshland porównywał z kołysaniem pajęczyny w chwili, gdy wpada do niej zdobycz (substrat), podkreślając w ten sposób znaczną labilność struktury enzymu w czasie reakcji katalitycznej. W ostatnim czasie hipoteza ta zastępowana jest stopniowo hipotezą topochemicznej odpowiedniości. Zachowując podstawowe założenia przedstawione przez Koshlanda, kładzie ona nacisk na rozpoznawanie przez enzym tej części substratu, która nie zmienia się w czasie katalizy. Pomiędzy nią i substartowym centrum enzymu występują liczne punktowe oddziaływania hydrofobowe oraz wiązania wodorowe. Nie ma więc wątpliwości, że specyficzność enzymów można tłumaczyć przede wszystkim dopasowaniem przestrzennej konfiguracji substratu i centrum aktywnego enzymu. Tylko wtedy, gdy dopasowanie to jest wystarczająco dokładne, może powstać kompleks enzym – substrat. Na przykład, w cząsteczce lizozymu, który katalizuje hydrolizę wiązań glikozydowych polisacharydów charakterystycznych dla komórek bakterii, znajduje się szczelina odpowiedzialna za przyłączenie substratu, do której dopasowuje się część cząsteczki substratu, odpowiadająca długości dokładnie sześciu sacharydów: H O Łańcuch H H OH A CH2OH CH3 CH3 CO CO CH2OH NH H O H O H O O H H3C CH COOH Reszta N-acetyloglukozaminy H H B H NH H3C CO O H H H O CH2OH CO CH2OH NH OH C H CH3 H H O H O O H D H NH H H3C CH COOH H3C CO O H H H OH E H H O CH2OH CH2OH NH O H O O H F H CH COOH H NH H H3C O Łańcuch H3C CO Reszta kwasu N-acetylomuraminowego Pozostała część substratu, zawierająca kilkaset reszt aminocukrów lub ich pochodnych, pozostaje wolna. Nie tylko kształt szczeliny cząsteczki lizozymu odpowiada parametrom dopasowującego się do niej substratu, ale i układ poszczególnych rodników aminokwasów w centrum substratowym jest komplementarny 78 Podstawy biochemii z rozmieszczeniem określonych atomów oraz ich grup w cząsteczce substratu. Pozwala to na utworzenie się wiązań wodorowych między lizozymem i polisacharydem, czyli powstawanie kompleksu enzym – substrat (tab. 3.2). Tabela 3.2. Wielopunktowe oddziaływanie fragmentu cząsteczki polisacharydu błony komórkowej bakterii z lizozymem Literowe oznaczenia ogniw polisachrydowych H V Energia asocjacji w kJ/mol 1 1 4 2 3 4 7 11 30 35 45 13 7,5 – 9,6 11,7 – 16,3 19,6 – 23,8 12,1 – 25,0 3,8 – 16,7 6,3 – 21,0 Liczba wiązań wodorowych (H) i oddziaływań Van der Vaalsa (V) A B C D E F Jednocześnie w centrum katalitycznym utworzonym przez reszty glu i asp, zajmujące położenie odpowiednio 35 oraz 52, w cząsteczce polisacharydu ustala się wiązanie glikozydowe ułożone przez pierścienie D i E substratu. Umożliwia to hydrolizę tego wiązania na skutek katalizy kwasowo-zasadowej: CH2OH Asp52 O H O O COO' + HOH H D H H3C H H CH COOH H3C O COOH O H D H3C CH COOH Glu35 H O O NH OH H NH H3C E H H H H H CH3 HOOC CO O OH H OH CO CH2OH CH2OH Asp52 NH H NH H H O H OH E H O CO H CH3 Glu35 O 'OOC CH2OH CO Badania specyficzności enzymów wykazały jej zróżnicowanie. Dla jednych enzymów, np. ureazy, specyficzność ma charakter absolutny, polegający na katalizowaniu tylko jednej reakcji. Inne enzymy są aktywne w reakcjach określonego typu, niezależnie od tego z jakimi substratami oddziałują. Ich podstawową cechą jest charakter tworzonego lub rozkładanego wiązania. Enzymy tego typu posiadają, tzw. specyficzność grupową. Spotykane są także enzymy wykazujące specyficzność stereochemiczną, polegającą na oddziaływaniu tylko na jeden z izomerów przestrzennych danego związku, a są to m.in. enzymy katalizujące reakcje rozszczepienia α- i β-metyloglukozydów. Rozdział 3. Enzymy 79 Wpływ aktywatorów i inhibitorów na przebieg reakcji enzymatycznych jako pierwszy opisał w XIX wieku A. Danilewski. Do czynników zwiększających aktywność enzymów zalicza się jony wielu metali i niektóre aniony. Najczęściej funkcję tę pełnią jony Mg2+, K+ i Co2+ oraz anionów Cl-. Na przykład, jony Mg2+ wchodzą w skład grupy prostetycznej enzymu, K+ ułatwiają tworzenie kompleksu enzym – substrat, Co2+ uczestniczą w przyłączaniu koenzymu do apoenzymu, a Clprzyczyniają się do tworzenia czwartorzędowej struktury enzymu. Silne działanie na aktywność enzymów wykazują aktywatory allosteryczne, które przyłączając się do allosterycznego centrum enzymu zmieniają trzeciorzędową strukturę jego cząsteczki. W centrum substratowym i katalitycznym dochodzi do zmian konfiguracji sprzyjających optymalnemu funkcjonowaniu enzymu. Inhibitory hamują działanie enzymów. Mechanizm ich działania może być różny w przypadku różnych enzymów, ale na ogół sprowadza się do dwóch typów, tzn. odwracalnego i nieodwracalnego hamowania reakcji. Podczas hamowania nieodwracalnego inhibitor o strukturze podobnej do substratu łączy się z enzymem trwale, zastępując substrat. Przykładem takiego typu działania może być zjawisko hamowania aktywności esterazy przez diizopropylofluorofosforan: F H3C CH H3C O P O CH3 O CH CH3 Diizopropylofluorofosforan Związek ten jest chyba najbardziej swoisty i najsilniejszy z odkrytych dotychczas inhibitorów. Hamuje on acetylocholinoesterazę w takim małym stężeniu, jak 10-10 mol⋅l-1. Diizopropylofosforan blokuje centrum aktywne acetylocholinoesterazy, fosforylując reszty bocznej aktywnej katalitycznie seryny (zob. rys. 3.2). Utworzona diizopropylofosfoseryna jest bardziej stabilna niż acetyloseryna i ulegając bardzo powolnemu rozkładowi. Zablokowanie aktywnej seryny prowadzi do hamowania aktywności centrum enzymatycznego. Aktywne pochodne kwasu fosforowego są neurotoksynami. W wyniku zablokowania hydrolizy acetylocholiny hamują działalność układu nerwowego. Należy do nich wiele insektycydów oraz bojowych środków trujących. W przypadku nieodwracalnego hamowania działania enzymu inhibitor nie musi mieć budowy podobnej do substratu i dlatego może modyfikować enzym poza jego centrum aktywnym. Zmienia jednak aktywność katalityczną zarówno w wyniku przekształcenia konformacji enzymu, jak i jego centrum aktywnego. Sytuacja taka ma miejsce np. przy alkilowaniu reszt tiolowych enzymu: E-SH + ICH2CONH2 → E-S-CH2CONH2 + HI Enzym Jodacetamid (odczynnik alkilujący) Zalkilowany enzym 80 Podstawy biochemii Niedawno wykryto nieodwracalne inaktywatory enzymów, powstające z nieaktywnych związków po ich reakcji z centrum katalitycznym, np.: R-C≡C-CH2-CO-R’ → R-CH=C=CH-CO-R’ Związek nieaktywny Inhibitor nieodwracalny Inhibitor powstający w procesie katalizy enzymatycznej przyłącza się do centrum aktywnego blokując reakcję. Odwracalna inhibicja enzymów może być konkurencyjna i niekonkurencyjna. Klasycznym przykładem konkurencyjnej inhibicji aktywności enzymatycznej jest hamowanie dehydrogenazy kwasu bursztynowego kwasami dikarboksylowymi, np. malonowym lub glutarowym. Związki o podobnej strukturze do kwasu bursztynowego konkurują z nim o centrum aktywne enzymu. Podczas inhibicji niekonkurencyjnej inhibitor reaguje z apoenzymem lub grupą prostetyczną, w następstwie czego enzym traci swoją aktywność. Jedną z odmian hamowania tego typu może być blokowanie enzymów związkami metali ciężkich, rtęci, ołowiu lub arsenu, które łączą się z grupami wodorosiarczkowymi łańcucha polipeptydowego enzymu. Kolejną grupą związków o podobnym działaniu są sole kwasu cyjanowodorowego, tlenek węgla (II), które łączą się grupami prostetycznymi zawierającymi żelazo. Innym rodzajem niekonkurencyjnego działania hamującego jest inhibicja allosteryczna. W ostatnich latach dużo uwagi poświęca się inhibitorom pochodzenia białkowego. Blokują one enzym poprzez oddziaływanie typu białko-białko, ograniczając dostęp inhibitorom do centrum aktywnego. Inhibitory białkowe regulują działanie proteinaz komórkowych, co wpływa na regulację ogólnej przemiany materii na przykład w związku z zahamowaniem przekształceń proenzymów w enzymy, odszczepieniem peptydów sygnałowych czy innych fragmentów peptydowych podczas dojrzewania białek, blokowaniem reakcji proteolizy, w wyniku której powstają biologicznie aktywne peptydy (np. hormony o naturze peptydowej). Białkowy inhibitor, α1-antytrypsyna, która jest glikoproteiną o masie 52.000 Da, otrzymywaną z komórek drożdżowych metodami inżynierii genetycznej, stosuje się do leczenia rozedmy płuc. Jej aktywność polega na blokowaniu działania elastazy wydzielanej przez neutrofilne komórki płucne. W leczeniu rozedmy płuc u osób palących papierosy wystarczy α1-antytrypsyny w ilości 2-4 gramy na całą kurację. Działanie aktywatorów i inhibitorów związane jest z regulowaniem działania enzymów rozumianym jako ciąg reakcji katalitycznych dotyczących określonych procesów. Stwierdzono, że końcowy, a niekiedy przejściowy produkt wieloetapowego procesu katalizy, może być inhibitorem allosterycznym jednej z pierwszych reakcji tego typu. 3.5. Klasyfikacja enzymów i ich charakterystyka Początkowo enzymy dzielono na 2 grupy, tzn. hydrolazy, katalizujące reakcje hydrolityczne, i desmolazy, przyspieszające reakcje rozpadu niehydrolitycznego. Rozdział 3. Enzymy 81 Ze względu na liczbę substratów uczestniczących w reakcji wyróżnia się 3 grupy enzymów: 1) katalizujące jednoczesną przemianę dwóch substratów w obu kierunkach: A + B ⇄ C + D, 2) katalizujące przemianę dwóch substratów w reakcji przebiegającej w kierunku od lewej do prawej strony równania reakcji i tylko jednego w kierunku reakcji odwrotnej: A + B ⇄ C, 3) katalizujące przemianę jednego substratu zarówno w reakcji przebiegającej w kierunku od lewej do prawej strony równania, jak i w reakcji odwrotnej: A ⇄ B. W celu ujednolicenia nazw enzymów opracowano międzynarodowy system ich nazewnictwa (Enzyme Comission – EC). System ten dzieli wszystkie enzymy na sześć głównych klas, opartych na typie prowadzonej reakcji (tab. 3.3). Klasa główna dzieli się na podklasy, oznaczone w tej numeracji drugą liczbą i określające grupy w klasach 1 i 2, typ wiązania w klasach 3, 4 i 6 i rodzaj izomeryzacji w klasie 5. Każda podklasa dzieli się na podpodklasy grupujące enzymy katalizujące reakcje poszczególnych grup substratów lub akceptorów i oznaczone trzecią liczbą w systemie numeracji. Wreszcie czwarta liczba stanowi numer kolejny enzymu w danej podpodklasie. Tabela 3.3. Międzynarodowa klasyfikacja enzymów Klasa Nazwa 2 3 4 Oksydoreduktazy Transferazy Hydrolazy Liazy 5 Izomerazy 6 Ligazy (syntetazy) 1 Typ katalizowanej reakcji Schemat reakcji Przenoszenie elektronów A- + B → A + B- Przenoszenie grup funkcyjnych Reakcje hydrolizy Rozszczepianie wiązań C-C, C-O, C-N i in., tworzenie wiązania podwójnego Przenoszenie grup w obrębie cząsteczki A–B + C→ A + B–C A–B + H2O → A–H + B–OH A–B → A=B + X–Y I I XY A–B → A–B I I I I XY Y X A + B → A–B Tworzenie wiązań sprzężone z hydrolizą ATP Przykład Dehydrogenaza alkoholowa Heksokinaza Trypsina Dekarboksylaza pirogronianowa Izoimeraza maleinianowa Karboksylaza pirogronianowa Każdy enzym zostaje zidentyfikowany przez czteroliczbowy numer. Na przykład trypsyna ma numer (EC) 3.4.21.4, pierwsza liczba (3) oznacza, że jest ona hydrolazą, druga liczba (4) oznacza, że jest proteazą, która hydrolizuje wiązanie peptydowe, trzecia liczba (21) oznacza, że enzym ten jest proteazą serynową, mającą w miejscu aktywnym krytyczną resztę seryny, a czwarta – (4) wskazuje, że jest to czwarty enzym historycznie przypisany do tej klasy. Dla porównania: chromotrypsyna ma numer EC 3.4.21.1, a elastaza 3.4.21.36. Ureaza ma numer 3.5.1.5, co oznacza, że należy tak także do klasy (3), której enzymy katalizują reakcję hydrolizy. Druga liczba (5) oznacza, że przyspiesza hydrolizę wiązania C-N, które nie jest peptydowym. Trzecia liczba (1) wskazuje, że przyspiesza hydrolizę liniowych amidów, a ostatnia liczba oznacza numer ureazy na liście w tej podklasie. 82 Podstawy biochemii 1. Oksydoreduktazy. Do klasy tej należą enzymy katalizujące reakcje utleniania – redukcji, a więc przemiany związane z przeniesieniem protonów, elektronów i tlenu. W przenoszeniu tych składników uczestniczą zwykle charakterystyczne koenzymy. Ogólny schemat przedstawia się następująco: Oksydoreduktaza ⇄ Substrat + Akceptor Substrat utleniony + Akceptor zredukowany Ponadto oksydoreduktazy biorą udział w reakcjach chemicznych z uwolnieniem energii, która następnie jest zużywana w procesach syntezy. Zidentyfikowano około 500 indywidualnych oksydoreduktaz. Oksydoreduktazy podzielono na 6 grup: dehydrogenazy, reduktazy, oksydazy, oksygenazy, hydroksylazy oraz peroksydazy. Dehydrogenazy przenoszą protony i elektrony z substratu na koenzymy lub odwrotnie, a czasem i tlen (dehydrogenazy tlenowe). Reduktazy katalizują przenoszenie protonów i elektronów lub samych elektronów z przenośników (np. łańcucha oddechowego) na dalsze uklady oksydoredukcyjne. Oksydazy są to enzymy katalizujące odłączenie wodoru od substratu w reakcji, w której akceptorem wodoru jest tlen. Aktywują one tlen cząsteczkowy przez przenoszenie nań elektronów, wskutek czego może się on łączyć z protonami i tworzyć cząsteczkę H2O lub rzadziej – H2O2. Oksygenazy katalizują bezpośrednie przenoszenie i włączenie tlenu w cząsteczki substratu: dioksygenazy katalizują włączenie obu atomów tlenu (A + O2 → AO2), a monooksygenazy – jednego atomu z cząsteczki tlenu. Wreszcie hydroksylazy katalizują przyłączenie tlenu do związków organicznych z przenoszeniem protonów i elektronów, a peroksydazy działają utleniająco na związki organiczne z udziałem H2O2. Najczęściej występują oksydoreduktazy, których grupą aktywną jest dinukleotyd nikotynaminoadeninowy (NAD+): NH2 NH2 N N N O CH2 N H P O + H: H OH O O HO P O C O CH2 + N O H NH2 - H-: H OH Utleniona odmiana NAD (NAD+) N O H H OH OH H H HO P O H O HO P O O CH2 H H OH CH2 H OH N N O O H HO N O H C N O H H OH OH H H Zredukowana odmiana NAD (NADH) NH2 Rozdział 3. Enzymy 83 + Ponad połowa znanych oksyreduktaz zawiera NAD jako koenzym. Pewne koenzymy, takie jak NAD+, są wiązane i uwalniane przez enzym w czasie jego cyklu katalitycznego i dlatego działają one właściwie jako kosubstraty. Oprócz NAD+, koenzymem oksyreduktaz jest także fosforan dinukleotydu nikotynaminoadeninowego (NADP+). Jest on pochodną NAD+, w której wodór grupy OH drugiego atomu węgla adenozyny rybozy został zastąpiony resztą kwasu fosforowego. Oba te koenzymy pełnią jedną z podstawowych funkcji, jaką jest przenoszenie elektronów i udział w reakcjach oksydoredukcyjnych. NAD+ jest częściej używany w reakcjach katabolicznych (rozkładu), natomiast NADP+ jest używany w reakcjach anabolicznych (biosyntezy). Mechanizm utleniania z udziałem NADP+ jako koenzymem jest analogiczny do mechanizmu utleniania z udziałem NAD+. Ponadto NADH i NADP+, jak i NADPH i NAD+, w obecności transhydrogenazy mają zdolność wymiany jonów wodorowych: NAD(P)+ NADPH + NAD+ ⇄ NADP+ + NADH Transhydrogenaza Oksydazami aminokwasowymi są samoutleniające się flawoproteiny (FP). Takim FP jest np. enzym posiadający grupę aktywną w postaci fosforylowanej witaminy B2. Utleniona forma tej flawoproteiny (M = 52.000) posiada żółtą barwę. Każda cząsteczka enzymu przenosi ryboflawinfosforan lub mononukleotyd flawinowy FMN, zdolny do przekazania dwóch protonów wraz z dwoma elektronami na atomy N w pierścieniu izoalloksazynowym: Odmiana barwna (utleniona) Odmiana bezbarwna (zredukowana) 84 Podstawy biochemii Dinukleotyd flawinoadeinowy (FAD) również jest przenośnikiem elektronów i ma podobną do FMN strukturę chemiczną: OH CH2 O P (CHOH)3 O OH O P N C H O N H H NH N N N O CH2 N H3C N O CH2 H3C NH2 O H OH OH O Dinukleotyd flawinonianowy (FAD) FMN oraz FAD zawierają jednostkę mononukleotydu flawinowego, która ma miejsce reaktywne. FAD ma dodatkową grupę cukrową i zasadę adeninową, powiększające jego strukturę. Oba te enzymy reagują z dwoma protonami oraz dwoma elektronami, oscylując między stanem utlenionym i zredukowanym: FMN + 2H+ + 2e- ↔ FAMH2 Koenzymami oksydoreduktaz są także chinony. Ubichinony w połączeniu z białkiem tworzą ubichinonproteinę, stanowiącą składową oksydoreduktaz przenoszących protony i elektrony. Związki te są pochodnymi benzochinonu i posiadają łańcuch boczny składający się z wielu reszt izoprenoidowych: CH3 O H 3C H 3C CHH3 2C O C CH OH CH2 n CH3 O O Reszta podstawionego benzochinonu Łańcuch boczny poliizoprenoidowy Liczba fragmentów izoprenoidowych w łańcuchu bocznym (n) wynosi od 6 do 10. Stwierdzono, że ubichinony biorą udział w procesach utleniania-redukcji: Rozdział 3. Enzymy 85 U roślin funkcję tę pełni podobny do ubichinonu, plastochinon: Najbardziej złożonym, ale i najbardziej rozpowszechnionym wariantem reakcji utleniania-redukcji komórkowej jest utlenianie za pośrednictwem cytochromów. Cytochromy są hemoproteinami zawierającymi żelazo, w których atom żelaza w czasie utleniania i redukcji oscyluje między Fe3+ a Fe2+. 2. Transferazy. Do tej klasy należą enzymy katalizujące reakcje przenoszenia grup funkcyjnych pomiędzy związkami. Znanych jest około 500 enzymów tego typu. W zależności od rodzaju przenoszonych grup wyróżnia się fosfotransferazy, aminotransferazy, glukozylotransferazy, acylotransferazy oraz transferazy, które przenoszą rodniki zawierające jeden atom węgla, takie jak metylotransferazy czy formylotransferazy. Fosfotransferazy. Enzymy zaliczane do tej grupy katalizują przeniesienie reszty kwasu fosforowego. Reakcja ta ma wyjątkowe znaczenie dla procesów życiowych organizmu, umożliwiając przekształcenie szeregu związków organicznych w wysoce aktywne i łatwo reagujące estry fosforanowe. Grupy fosforanowe przenoszone są na reszty alkoholowe, karboksylowe, aminowe i fosforanowe. Zależnie od rodzaju reagującej grupy wyróżnia się kilka podklas fosforotransferaz. Donorem reszt fosforanowych w większości wypadków jest kwas adenozynotrójfosforowy (ATP), chociaż mogą one pochodzić także i z innych źródeł. Do 86 Podstawy biochemii fosfotransferaz należy np. heksokinaza, która przenosi reszty kwasu fosforowego z cząsteczki ATP na glukozę, co na ogół zapoczątkowuje procesy przekształcenie glukozy: Cząsteczka dobrze zbadanej heksokinazy drożdży składa się z czterech podjednostek o łącznej masie 96.000 Da. Tetramer zachowuje trwałość przy pH 5, natomiast przy zmianach pH roztworu ulega rozpadowi na cztery protomery o masach 24.000 Da, które nie wykazują aktywności fosfotransferazowej. W multimerach wykryto 5 izozymów heksokinazy. Przekształcenia wielu cukrów prostych początkuje ich fosforylacja z udziałem fosfotransferaz. Dotyczy to m.in. β-D-fruktozy i β-D-rybozy, a także cząsteczek innych cukrów. Szczególnie interesujące są fosfotransfery przenoszące reszty fosforanowe z ATP na białka, tzn. kinazy proteinowe. Przenoszą one resztę fosforanu na rodniki – ser, tre, tyr, lyz i his wielu białek, w wyniku czego dochodzi do zmian ich aktywności biologicznej, co z kolei wpływa na intensywność wymiany materii w organizmie (zob. rozdział 13). Aminotransferazy. Enzymy katalizujące reakcje transaminacji mają duże znaczenie w biosyntezie aminokwasów. W procesie tym grupy α-aminowe większości aminokwasów są przenoszone na α-ketoglutaran, co prowadzi do powstawania glutaminianu i odpowiedniego α-ketokwasu: α-aminokwas + α-ketoglutargin ⇄ α-ketokwas + glutaminian Rozdział 3. Enzymy 87 Enzymy katalizujące te reakcje są nazywane aminotransferazami (transaminazami) i u ssaków występują głównie w wątrobie. Koenzymem (grupą prostetyczną) wszystkich aminotransferaz jest fosforan pirydoksalu, pochodna pirydoksyny, ulegający podczas transaminacji przejściowemu przekształceniu w fosforan pirydoksaminy (rys. 3.5). O P + NH3 O O C O CH2 H O O O OH P O CH2 CH2 OH O + CH3 N + N H CH3 H a) b) Rys. 3.5. Wzory strukturalne fosforanu pirydoksalu (a) i fosforanu pirydoksaminy (b) Przy braku substratu grupa aldehydowa tworzy kowalencyjne połączenie typu zasady Schiffa (wiązanie iminowe) z grupą aminową łańcucha bocznego określonej reszty lizyny w centrum aktywnym enzymu. Po dodaniu substratu grupa α-aminowa wchodzącego aminokwasu wypiera grupę aminową lizyny w centrum aktywnym i powstaje nowe połączenie typu zasady Schiffa z aminokwasem będącym substratem. Aminokwas tworzący z fosforanem pirydoksalu zasadę Schiffa pozostaje ściśle związany z enzymem poprzez liczne oddziaływania niekowalencyjne. Reakcję transaminacji opisali w 1937 r. A. Braustein i M. Kritzman. Dla uproszczenia kompleks enzym – pirydoksal przedstawiono jako strukturę OHC – enzym, zachowując tylko aldehydową grupę, która pełni rolę grupy funkcjonalnej dla koenzymu. W pierwszym etapie katalizy grupa prostetyczna enzymu (dla uproszczenia przedstawiono ją jako wolną) reaguje z aminokwasem ulegającym transaminacji. Reakcja przebiega z udziałem grupy aminowej i grupy aldehydowej reszty fosforanu pirydoksalu: COOH CH NH2 CH2 COOH O + COOH Kwas asparaginowy H C enzym CH N CH enzym + H2O CH2 COOH Kompleks enzym-substrat W drugim etapie katalizy następuje przekształcenie substratu, polegające w tym przypadku na przegrupowaniem tautomerycznym, ułatwianym przez rezonansowe efekty z pierścieniem pirydynowym: 88 Podstawy biochemii COOH CH COOH N CH enzym C CH2 enzym N CH2 CH2 COOH COOH W przegrupowaniu biorą udział rodniki imidazolu reszt his wchodzących w skład centrum katalitycznego enzymu, które pełni rolę zasady odszczepiającej proton z węgla α aminokwasu: łańcuch polipeptydowy CH32 CH COOH CH2 N: CH3 OH + COOH H C H3C CH 2 HN CH H 3C3 COOH + CH CH32 NH N N N H CH O P O łańcuch polipeptydowy CH2 H OH Apoenzym OH O O P CH2 C COOH :N łańcuch H3C polipeptydowy CH2 N N N H CH2 H O CH2 OH O N CH3 N Apoenzym CH3 Następnie w wyniku reakcji hydrolizy powstaje ketokwas i koenzym przekształcany jest do pirydoksaminy: COOH C N COOH CH2 enzym + H2O CO + H2N CH2 CH2 COOH COOH CH2 enzym Kwas szczawiooctowy Pomiędzy pirydoksaminą i innym ketokwasem zostaje utworzony kompleks enzym – substrat: COOH COOH (CH2) 2 (CH2) 2 C O + H2N COOH CH2 enzym C N CH2 enzym + H2O COOH Kwas α-ketoglutarowy W kompleksie substrat ulega przekształceniu tautomerycznemu: Rozdział 3. Enzymy 89 Powstający związek ulega hydrolizie z utworzeniem nowego aminokwasu: COOH COOH (CH2) 2 (CH2) 2 CH N CH enzym + H2O COOH CH NH2 O + COOH H C enzym Kwas glutaminowy W wyniku serii reakcji z naprzemiennym tworzeniem kompleksów enzym – substrat kwas asparaginowy zostaje przekształcony w kwas szczawiooctowy, a kwas α-ketoglutarowy w kwas glutaminowy, co przedstawia sumaryczne równanie reakcji: Pirydoksalenzym HOOCCH2CH(NH2)COOH + HOOCCO(CH2)2COOH ⇄ HOOCCH2COCOOH + HOOCCH(NH2)(CH2)2COOH Zasadniczą rolę w procesie katalizie w obecności pirydoksalu odgrywa przemieszczenie elektronów w kompleksie enzym-substrat: W rezultacie osłabione zostaje wiązanie α-atomu węgla reszty aminokwasu z podstawnikiem, którym może być azot lub grupa COOH, skutkiem czego dochodzi do rozpadu odpowiednich wiązań. Ponieważ aminotransferaza asparaginianowa składa się z dwóch podjednostek i zawiera dwie reszty fosforanu pirydoksalu, podjednostki aktywne w reakcji transaminacji działają po kolei wykorzystując energię niezbędną do przemiany chemicznej. Zasadnicze znaczenie w przebiegu procesu katalitycznego ma zatem dimeryczna struktura enzymu. Glikozylotransferazy. Katalizują reakcje przenoszenia reszt glikozylowych z cząsteczek estrów fosforanowych lub innych związków na cząsteczki monosacharydów, polisacharydów lub innych substancji, umożliwiając jednocześnie przebieg syntezy i rozpadu oligo- i polisacharydów organizmów roślin i zwierząt. Poniżej przedstawiono równanie reakcji rozpadu sacharozy przy udziale α-glukozylotransferazy ortofosforanowej i fosforylazy sacharozowej: 90 Podstawy biochemii CH2OH CH2OH H O H H OH H H OH CH2OH O H HO O HO OH H + H3PO4 CH2OH Glukozylotransferaza H ortofosforanowa HO H O H H OH H H OH + O P O HO OH H CH2OH OH H OH α-D-Glukopironozo1-fosforan Sacharoza (α-D-glukopironozyloβ-D-fruktofuranozyd CH2OH O HO H β-D-Fruktofuranoza Podobną aktywność wykazuje fosforylaza glikogenowa i inne transferazy glikozydowe. Proces przenoszenia reszt glikozylowych na H3PO4 jest nazywany fosforolizą. Zachodzi analogicznie do hydrolizy, ale zamiast reszty wody w miejscu rozpadu mostka tlenowego przyłączeniu ulega wodór i grupa fosforylowa kwasu fosforowego. Przenoszenie reszt glikozylowych zachodzi stosunkowo łatwo w obecności enzymów danej grupy, gdy substratem jest monosacharyd nukleozydodifosforanu. Reakcja ta jest prawdopodobnie głównym sposobem naturalnej syntezy oligo- i polisacharydów (zob. rozdział 8). Acylotransferazy. Katalizują przeniesienie rodników acylowych, czyli reszt kwasów karboksylowych, na aminokwasy, aminy, alkohole i inne związki. Uniwersalnym źródłem tych grup jest acylokoenzym A, który można traktować jako grupę aktywną acylotransferaz. Najczęściej przeniesieniu ulega rodnik acylowy kwasu octowego, tzn. rodnik acetylowy (CH3CO-). Koenzym A, łącząc się z resztą acetylową, tworzy reaktywny tioester, acetylokoenzym A, który jest kofaktorem danej reakcji. Przykładem reakcji transacylowania jest synteza acetylocholiny: Transferaza cholinoacetylowa CH3COSCoA + HOCH2CH2N+(CH3)2 Acetylokoenzym A Cholina → CH3COOCH2CH2N+(CH3)2 + HSCoA Acetylocholina Koenzym A Ważne znaczenie wśród transferaz mają enzymy uczestniczące w przenoszeniu rodników jednowęglowych, metylowych, oksymetylowych, formylowych, a także nukleotydotransferazy, katalizujące przenoszenie reszt nukleotydowych w procesie syntezy kwasów nukleinowych. Mechanizm ich działania opisano poniżej. 3. Hydrolazy. Do klasy hydrolaz należą enzymy uczestniczące w reakcjach rozszczepiania, a niekiedy też syntezy związków organicznych z udziałem wody: R' R" + HOH ⇔ R' H + R"OH. W zależności od charakteru substratu, ulegającego hydrolizie, w klasie hydrolaz wyróżnia się podklasy, wśród których najważniejsze to: esterazy, katalizujące reakcje hydrolizy estrów; glikozydazy, katalizujące reakcje hydrolizy glikozydów i policukrów, proteazy, katalizujące reakcje hydrolizy oraz w niektórych przypadkach syntezy białek, peptydów i innych związków zawierających wiązania pepty- Rozdział 3. Enzymy 91 dowe oraz tzw. amidazy działające na wiązania C-N różniące się od wiązań peptydowych. Łącznie do klasy hydrolaz zalicza się około 500 enzymów. Esterazy. Enzymy katalizujące reakcje hydrolizy estrów kwasów organicznych i nieorganicznych. Najważniejszymi podpodklasami esteraz są hydrolazy estrów kwasów karboksylowych i fosfatazy. Do pierwszej z podpodklas należy lipaza, która hydrolizuje zewnętrzne, tzn. α-estrowe wiązania w cząsteczkach trójacylogicerynów (tłuszcze): CH2 CH O O CH2 C15H31 CO C15H31 + 2H2O CO CO O Lipaza CH2 CH OH O CH2 C15H31 C15H31 + 2C15H31COOH CO OH β-Palmitylogliceryna Trójpalmitynian glicerylu Kwas palmitynowy Fosfatazy katalizują hydrolizę estrów fosforanowych. Szczególnie rozpowszechnione są fosfatazy, działające na estry kwasu fosforowego i węglowodanów, jak np. fosfataza glukozowa: CH2OH H H OH CH2OH O H H HO O P OH H H Fosfohydrolaza OH O + H 2O D-glukozo1-fosforanowa O H H OH H H OH HO OH OH Glukozo-1-fosforan + H3PO4 Glukoza Fosfatazy są aktywne w szerokim zakresie pH, od 3 do 9, a większość z nich charakteryzuje silna specyficzność substratowa. Szczególnie ważne w regulacji procesów metabolicznych są fosfatazy odszczepiające fosforany od ufosforylowanych białek, wskutek czego zmienia się ich aktywność biologiczna, w szczególności enzymatyczna. Glikozydazy. Katalizujące reakcje hydrolizy glikozydów, w zależności od izomerycznej budowy substratów α lub β należą do α- lub β-glikozydaz. Są więc enzymami, które charakteryzuje specyficzność przestrzenna, czyli stereochemiczna. Poza glikozydami zawierającymi jako aglikony reszty alkoholi jednowodorotlenowych, ich substratami mogą być oligo- i polisacharydy. Glikozydazą rozkładającą maltozę jest maltaza (α-glikozydaza), a sacharozę – sacharaza (β-glikozydaza): CH2OH H H OH O H CH2OH O H HO H HO O H OH H + H 2O CH2OH OH H Sacharoza (α-D-glikopirazydoβ-D-fruktofuranozyd) β−Fruktofuranozydaza (sacharaza) CH2OH H O H H OH H H OH HO + OH Glukoza (α-D-glukopiranoza) CH2OH O H HO HO OH H CH2OH H Fruktoza (β-D-glukopiranoza) 92 Podstawy biochemii CH2OH H CH2OH O H H OH H H H OH CH2OH O H H O HO OH H + H 2O OH H Maltoza (α-D-glikopirazydo1,4-D-glukopiranoza) OH α−Glukozydaza (maltaza) H 2 O H H OH H H OH HO OH Glukoza (α-D-glukopiranoza) Glikozydazami rozkładającymi polisacharydy są m.in. amylazy hydrolizujące wiązania glikozydowe w cząsteczce skrobi, z utworzeniem glukozy, maltozy lub oligosacharydów. Hydroliza naturalnych poliglikozydów, takich jak: celuloza, inulina lub ksylan, zachodzi również w obecności glikozydaz. Ponadto enzymy tej grupy jako transglikozydazy, katalizują reakcje przenoszenia reszt glikozylowych. Hydrolazy peptydowe. Enzymy zaliczane do tej podklasy hydrolizują wiązania peptydowe białek i peptydów, a w określonych warunkach uczestniczą również w ich tworzeniu, chociaż reakcja nie odpowiada stanowi fizjologicznemu. Reakcję hydrolizy białek i peptydów przy udziale hydrolaz peptydowych można przedstawić za pomocą schematu: Hydrolaza peptydowa ⇄ H2NCH(R’)CO[NHCHRCO]nNHCH(R”)COOH + (n+1)H2O H2NCH(R’)COOH + nH2NCH(R)COOH + H2NCH(R”)COOH Hydrolazy peptydowe, tzw. proteinazy albo hydrolazy peptydylo-peptydowe, katalizujące hydrolizę wewnętrznych wiązań cząsteczek białka nazywa się jako endopeptydazami, w odróżnieniu od egzopeptydaz, które katalizują odszczepianie od łańcucha peptydowego aminokwasów końcowych. Hydrolazy katalizujące hydrolizę peptydów, w wyniku której jednym z substratów jest wolny aminokwas, nazywamy aminopeptydazami oraz karboksypeptydazami. Aminopeptydazy hydrolizują końcowe wiązania peptydowe przy wolnej grupie aminowej łańcucha polipeptydowego. Karboksypeptydazy są egzopeptydazami hydrolizującymi końcowe wiązanie peptydowe od końca karboksylowego łańcucha polipeptydowego Charakteryzują się one wysoką specyficznością odszczepiając ściśle określone N- lub C-końcowe aminokwasy. Trzecią podklasę peptydaz reprezentują hydralazy dipeptydowe, zwane dipeptydazami, które są aktywne w końcowym etapie hydrolizy białka. Ostatnio wyróżniono dwie dodatkowe podpodklasy peptydaz. Są to hydrolazy dipeptydylo-peptydowe, odszczepiające dipeptyd od N-końcowego polipeptydu oraz hydrolazy peptydylo-dipeptydowe, odszczepiające dipeptyd od polipeptydu C-końcowego. Amidazy. Są to enzymy hydrolizujące amidy kwasowe, wśród których w procesach biochemicznych ważną funkcję pełni ureaza, asparaginaza i glutaminaza. Rozdział 3. Enzymy 93 Ureaza była jednym z pierwszych białek enzymatycznych otrzymanych w stanie krystalicznym (D. Samner, 1926). Jest to enzym jednoskładnikowy o masie 480.000 Da, którego globularna cząsteczka składa się z 8 równych podjednostek. Ureaza hydrolizuje mocznik do NH3 i CO2. Asparaginaza i glutaminaza to enzymy hydrolizujące amidy kwasów dikarboksylowych, asparaginowego i glutaminowego: Asparaginaza → HCOOCH(NH2)CH2CONH2 + H2O HOOCCH(NH2)CH2COOH + NH3 Asparagina Kwas asparaginowy Do hydrolaz rozszczepiających wiązania C–N, różniące się od wiązań peptydowych, należą enzymy katalizujące hydrolizę wiązań amidynowych (HNC-NH), których przedstawicielem jest arginaza. W jej obecności arginina hydrolizuje do ornityny i mocznika: Arginaza → H2NC(NH)NH(CH2)3CH(NH2)COOH + H2O Arginina H2NCONH2 + H2N(CH2)3CH(NH2)COOH Mocznik Ornityna Ponieważ w procesie hydrolizy argininy zostaje odszczepiony mocznik, systematyczna nazwa arginazy brzmi: α-arginino-ureohydrolaza. Ta często występująca w przyrodzie reakcja stanowi ostatnie stadium biosyntezy mocznika, który jest jednym z końcowych produktów rozpadu związków zawierających azot. Zarówno arginaza, jak i ureaza są regioselektywne i specyficzne substratowo. 4. Liazy. Do tej klasy należą enzymy katalizujące niehydrolityczny rozpad związków zawierających wiązania C–C, C–N, C–O. Podczas reakcji dochodzi do utworzenia wiązań podwójnych z wydzieleniem takich związków, jak: CO2, H2O lub NH3. Niektóre z tych reakcji są odwracalne i odpowiednie enzymy w sprzyjających warunkach katalizują także reakcje syntezy, w związku z czym nazwa tej klasy enzymów nie zawsze odpowiada katalizowanym procesom. Ważniejszą z grup enzymów tej klasy są liazy wiązań węgiel-węgiel (C-Cliazy), wśród których szczególne znaczenie przypisywane jest liazom karboksylowym (dekarboksylazy) i aldehydowym. Powszechnie występujące dekarboksylazy ketokwasów i aminokwasów, katalizują reakcje zgodnie z poniższym schematem: Dekarboksylaza H3CCOCOOH → pirogronianowa H3CCHO + CO2 Kwas pirowinogronowy Dekarboksylaza kwasu HOOCCH2COCOOH → szczawiooctowego H3CCOCOOH + CO2 Kwas szczawiooctowy Dekarboksylaza H2NCH2(CH2)3CH(NH2)COOH Lizyna → lizyny H2N(CH2)5NH2 + CO2 Kadaweryna 94 Podstawy biochemii Są to enzymy, których grupami prostetycznymi są często estry fosforowe witamin rozpuszczalnych w wodzie, takie jak tiamina (B1), występująca w karboksyliazach ketokwasów, oraz pirydoksal (B6), spotykany w karboksyliazach aminokwasów. Mechanizm reakcji dekarboksylacji aminokwasów w obecności karboksyliazy, której koenzymem jest pirydoksalofosforan, jest podobny do tego, który przebiega w procesie transaminacji aminokwasów. W tym przypadku również powstaje zasada Schiffa, której gęstość elektronowa atomu węgla α aminokwasu jest bardzo mała. Osłabione wiązanie węgla α z grupą karboksylową sprzyja jej łatwemu odszczepieniu od cząsteczki. Charakterystycznym przedstawicielem liaz aldehydowych jest aldolaza katalizująca odwracalną reakcję rozszczepienia fruktozo-1,6-difosforanu, z utworzeniem fosfotrioz: OH O P O CH2 H OH OH O OH OH H CH2 HO O H P Aldolaza O CH2OH C CH2 OH O C + OH O P O O H CHOH CH2 OH O Fosfodihydroksyaceton O OH OH Fruktofuranozo-1,6-difosforan P Aldehyd 3-fosfoglicerynowy Reakcja ta ma duże znaczenie w przekształceniu węglowodanów. Analogicznie do aldolazy działają inne liazy aldehydowe. Następną ważną grupę tej klasy stanowią liazy rozkładające wiązanie C-O, czyli przyłączające lub odrywające cząsteczkę wody (np. hydroliaza jabłczanu), tzn. katalizujące reakcje hydratacji i dehydratacji. Przykładem hydroliazy jest również hydrataza fumaranowa: Dehydratacja HOOCCH(OH)CH2COOH Kwas jabłkowy ⇄ Hydratacja HOOC-CH=CH-COOH + H2O Kwas fumarowy Reakcje hydratacji i dehydratacji zachodzą w sposób ciągły podczas rozpadu i syntezy węglowodanów oraz wyższych kwasów tłuszczowych, dlatego enzymy biorące w nich udział odgrywają olbrzymią rolę w procesach przemian metabolicznych. Przykładem liazy węgiel-azot jest liaza asparginianowa, występująca w komórkach bakterii i roślin, która katalizuje reakcję bezpośredniej deanimacji kwasu asparaginowego: Liaza asparaginianowa HOOCCH(NH2)CH2COOH Kwas asparaginowy ⇄ HOOC-CH=CH-COONH4 Fumaran amonowy Rozdział 3. Enzymy 95 Liazy katalizują nie tylko reakcje rozpadu, ale i syntezy, jak np. wyizolowana z komórek drożdży L-seryno-hydro-liaza, odszczepiająca od seryny wodę i przyłączająca siarkowodór, w wyniku czego dochodzi do syntezy cysteiny: Syntetaza cysteinowa HOCH2CH(NH2)COOH + H2S → HSCH2CH(NH2)COOH + H2O Dla odróżnienia liaz syntetyzujących od klasy ligaz, które katalizują tylko reakcje syntezy, enzymy te nazywa się też syntazami. 5. Izomerazy. Jest to klasa stosunkowo nieliczna, zawierająca około 90 eznymów, które katalizują geometryczne lub strukturalne przekształcenia jednej cząsteczki. Mogą one polegać na wewnątrzcząsteczkowym przeniesieniu atomu wodoru, grup fosforylowych i acylowych, na zmianie przestrzennego położenia grup atomów lub też, na zmianie ułożenia wiązań podwójnych. Najważniejsze z nich to: izomeraza trójizofosforylowa, fosfomutaza fosfoglicerynianowa, aldozomutarotaza i izomeraza izopentenylo-pirofosforanowa. Izomerza trójizofosforylowa przenosi atomy H w procesie przekształcenia w reakcji odwracalnej aldehydu 3-fosfoglicerynowego do fosfodihydroksyacetonu: C O H CHOH CH2 Izomeraza OH O P O OH Aldehyd 3-fosforglicerynowy triizofosforanowa CH2OH C O CH2 OH O P O OH Fosfodihydroksyaceton Fosfomutaza fosfoglicerynianowa przekształca kwas 2-fosfoglicerynowy do kwasu 3-fosfoglicerynowego: 2-Fosforglicerynian 3-Fosforglicerynian Procesy te odgrywają znaczną rolę w metabolizmie cukrów, ponieważ biorą udział w najważniejszym stadium rozpadu i syntezy węglowodanów. Mutarotaza należąca do stereoizomeraz katalizuje przekształcenia α-D-glukopiranozy w β-D-glukopiranozę: 96 Podstawy biochemii CH2OH H CH2OH O H H OH H HO H Aldozomutarotaza OH H OH O OH H HO OH H α-D-Glukopironaza H OH H β- D-Glukopironaza Stereoizomerazy uczestniczą we wzajemnej przemianie wielu izomerów przestrzennych monosacharydów, przy czym niekiedy reakcje z ich udziałem są jedyną możliwą drogą syntezy cząsteczek cukrów. Do stereoizomeraz należą również cistrans-izomerazy, w tym np. izomeraza retinenowa, która przekształca trans-retinol w cis-retinol. Izomeraza izopentenylo-pirofosforanowa katalizuje reakcję przebudowy izopentenylopirofosforanu do dimetyloallilopirofosforanu, czyli przesunięcia wiązania podwójnego C=C z atomu węgla C2 na C3: O CH3 H2C C CH2 CH2 O O P O OH P + HS enzym (Izomeraza izopentylopirofosforanowa) OH OH Izopentenylopirofosforan O CH3 H3C C CH2 S enzym CH2 O CH3 H3C C CH CH2 O P O O P OH OH O O P O OH P OH OH + HS enzym OH Dimetyloallilopirofosforan Izomeraza izopentenylo-pirofosforanowa zawiera wolne grupy sulfhydrylowe cystein. Powyższa reakcja jest pierwszym etapem syntezy poliizoprenoidów i steroli. 6. Ligazy (syntetazy). Ich specyficzne właściwości poznano stosunkowo niedawno, w wyniku znaczących sukcesów w badaniach nad mechanizmem syntezy tłuszczów, białek i węglowodanów. Okazało się, że dawne poglądy na temat tworzenia się tych związków, zgodnie z którymi powstają one podczas odwrócenia reakcji hydrolizy, nie odpowiadają rzeczywistości. Syntetyzowane są w organizmach w inny sposób. Do ligaz zaliczane są enzymy katalizujące wzajemne łączenie dwóch cząsteczek sprzężone z hydrolizą wiązania pirofosforanowego w cząsteczce ATP lub innego Rozdział 3. Enzymy 97 nukleozydotrójfosforanu. Ich właściwością jest sprzężenie syntezy z rozpadem związków, dostarczających energię niezbędną w procesach biosyntezy. Jednym z takich związków jest ATP. Podczas odłącznia od jego cząsteczki jednej lub dwóch końcowych reszt kwasu fosforowego, w obecności ligaz, następuje wydzielanie dużej ilości energii, zużywanej następnie do aktywowania reagujących związków. Ligazy katalitycznie przyspieszają syntezę związków organicznych z naturalnych substratów aktywowanych kosztem rozpadu ATP. Mechanizm działania ligaz jest bardzo złożony. W wielu przypadkach, z jednego ze związków uczestniczących w podstawowej reakcji, powstaje początkowo związek pośredni, zawierający fragment uwalniany w trakcie rozpadu ATP, który następnie oddziałuje z drugim partnerem podstawowej reakcji chemicznej z utworzeniem produktu końcowego. Przykładem aktywności ligazy jest synteza kwasu pantotenowego z β-alaniny i kwasu α,γ-dihydroksy-β,β-dimetylomasłowego: NH2 N H3C HO O CH2 C CH H3C OH COOH + H2N CH2 CH2 COOH + O P O O OH O P O N P OH O CH2 OH H H OH OH H β−Alanina ATP NH2 N Syntetaza pantotenianowa O H 3C HO CH2 C CH H 3C OH CO NH CH2 CH2 COOH + HO P P N O O H OH + HO H H Kwas pantotenowy N N O N O H Kwas α,γ-Dihydroksyβ,β−dimetylomasłowy N H OH P OH O O P OH OH OH AMP Syntetaza pantotenianowa, jak wynika z podanego powyżej równania reakcji, należy do grupy ligaz katalizujących reakcję syntezy wiązań C-N, do której zalicza się około 40 enzymów. W chwili obecnej znanych jest około 75 różnych ligaz sterujących najważniejszymi procesami syntetycznymi w komórkach roślin i zwierząt. Oprócz udziału w reakcji syntezy wiązań C-N, szczególnie wiązań peptydowych, ligazy katalizują powstawanie wiązań C-C, C-O i C-S. Do grupy ligaz syntetyzujących wiązania C-C należą karboksylazy, odpowiedzialne za karboksylację szeregu związków. W wyniku takich reakcji wydłużane zostają łańcuchy węglowe. Jedną z najważniejszych karboksylaz jest karboksylaza pirogronianowa, przyspieszająca tworzenie kwasu szczawiooctowego z kwasu pirogronowego i tlenku węgla (IV): 98 Podstawy biochemii OH HO P OH O P O CH3 CO COOH O O + CO2 N O P O ATP N N CH2 + Kwas pirogronowy NH2 OH N Karboksylaza pirogronianowa O H H OH OH H H NH2 N O HOOC CH2 CO COOH + HO O P O OH Kwas szczawiooctowy N N P O CH2 H OH + H H ADP N O H3PO4 H OH OH Reakcja ta ma wyjątkowe znaczenie w przemianie materii poprzez pośredniczenie w przemianie węglowodanów i białek oraz wiązanie CO2. Ligazom katalizującym syntezę wiązań C–O przypada najważniejsza rola w biosyntezie białek. Uczestniczą one w reakcjach aktywowania aminokwasów niezbędnych do syntezy peptydów. Jedną z reakcji tego typu jest tworzenie aminoacyloadenylanów: NH2 N O O CH3 CH COOH + HO NH2 P O OH P O O P N O CH2 H H Alanina N O H OH OH N H OH OH NH2 N O CH3 CH CO NH2 Adenyloadenylan O P N N O CH2 OH N O O H H OH OH H + H HO P OH O O P OH OH Pirofosforan Z aminoacyloadenylanów aminokwasy przenoszone są na tRNA i tworzą aminoacylo-tRNA, biorące bezpośredni udział w syntezie polipeptydów (zob. rozdział 7). Rozdział 3. Enzymy 99 Ponadto ligaza używając jako substratu acetylo-koenzymu A, katalizuje reakcję tworzenia wiązań C–S. Tworzenie acetylo-koenzymu A z kwasu octowego i koenzymu A przebiega w sprzężeniu z rozpadem ATP: CH3 COOH + HS CoA + ATP Syntetaza acetylo-CoA O CH3 CO S CoA + AMP + HO P OH Acetylo-koenzym A O O P OH OH Pirofosforan Acetylo-CoA uczestniczy w reakcji transacylowania. W układach ożywionych aktywność ligaz i acylotransferaz jest ze sobą ściśle powiązana, przy czym analogiczne zależności zachodzą także pomiędzy innymi enzymami. 3.6. Zastosowanie enzymów Enzymy wykazują zdolności katalityczne także i poza komórką. Mimo że w naturalnym środowisku charakteryzuje je większa aktywność, to wyizolowane zachowują swoje właściwości. W związku z tym wiele preparatów enzymatycznych wykorzystywanych jest w praktyce. Praktyczne zastosowanie enzymów w gospodarce stale wzrasta. W przemyśle piekarniczym stosuje się otrzymywane z grzyba Aspergillus, preparaty enzymatyczne zawierające amylazę i proteinazę, które dodane w ilości 20-25 g na 1 tonę mąki, poprawiają jakość i aromat pieczywa, przyspieszają o 30% dojrzewanie ciasta, zwiększają o 20% porowatość miękiszu i objętość chleba, zmniejszając przy tym dwukrotnie zużycie cukru w produkcji bułek. W browarnictwie i przemyśle spirytusowym stosuje się amylazy przyspieszające scukrzanie skrobi. Ekonomiczne efekty stosowania amylaz są znaczące. Zastosowanie preparatów enzymatycznych w browarnictwie pozwala oszczędzić 165 g jęczmienia na każdy dekalitr wyprodukowanego piwa. Stosowanie amylazy w produkcji spirytusu daje możliwość rezygnacji ze słodu, a jednocześnie zwiększenie o 1,5% uzyskiwania alkoholu z materiału wyjściowego, przy obniżeniu kosztów własnych dekalitra spirytusu. Szerokie perspektywy ma stosowanie enzymów w produkcji wina. Enzymy pektynolityczne zwiększają o 15-20% ilość soków uzyskanych z owoców i o 5-7% z winogron. Katalaza i glukozohydroksydaza przedłużają trwałość bukietu win białych i różowych. W przemyśle garbarskim i futrzarskim stosowanie preparatów pozakomórkowch proteinaz Streptomyces (proteliny i protofradyny), przyspiesza oddzielanie sierści od skóry i zmiękczanie surowych skór. Proces produkcji ulega kilkakrotnemu skróceniu, przy czym poprawia się jakość produktów i polepszają się warunki pracy. W przemyśle włókienniczym zastosowanie enzymów pochodzących z grzybów 100 Podstawy biochemii i bakterii zwiększa 7-10 razy proces rozklejania się tkanin. Te same preparaty są stosowane do uwalniania serycyny podczas rozwijania kokonów jedwabnika przy produkcji jedwabiu naturalnego. Peptydohydrolazy (protelina i pronaza) stosowane do obróbki mięsa przed gotowaniem polepszają jego jakość. W przemyśle mięsnym enzymy proteolityczne stosowane są również do dojrzewania mięsa oraz polepszenia jego jakości. Przemysł mleczarski wykorzystuje proteazy w procesach dojrzewania serów, obniżając przy tym koszt ich wytwarzania o 10%. Enzymy mają także zastosowanie w produkcji środków czystości i innych preparatów chemii gospodarczej. Proteazy roślinne, odporne na temperaturę do 90°C, wchodzą w skład proszków do prania i środków myjących. Proszki do prania zawierają α-amylazę, glukozohydroksydazę i lipoksygenazę, a hydroksydaza moczanowa przyczynia się do usuwania plam tłuszczu. Enzymy, takie jak glukozohydroksydaza czy katalaza, są składnikiem past do zębów, chroniąc je przed działaniem bakteriami i tworzeniem osadów. Produkcja glukozy z odpadów celulozy przy udziale enzymów celulolitycznych oraz glukozy ze skrobi w obecności glukaminazy wykorzystywana jest na skalę przemysłową. Obróbka surowca zestawem enzymów proteolitycznych izolowanych z wątroby krabów, zwanym degystazą, zwiększa o 30% wydajność produkowanego kawioru. Enzymy mają ogromne zastosowanie w medycynie. Pepsynę, trypsynę, chemotrypsynę, lipazę i amylazę w postaci preparatów enzymycznych oraz ich mieszaniny (betacyd, abomina, festal, panzinorm i in.) stosuje się w leczeniu chorób układu pokarmowego. Gialouronidazę produkowaną jako lidaza i ronidaza, która depolimeryzuje kwas hialuronowy i pomaga we wnikaniu leków do narażonej tkanki, wykorzystywano do leczenia zapalenia stawów, obrzmień, urazów i krwiaków. Inne enzymy proteolityczne, plazminę (fibrynolizyna) i aktywujące je streptokinazę i urokinazę, stosuje się przy rozpuszczaniu skrzepów w naczyniach krwionośnych. Dezoksyrybonukleaza, izolowana z trzustki lub Streptococcus (streptodornaza), jest stosowana w leczeniu górnych dróg oddechowych oraz rogówki oka, jak również w usuwaniu zanieczyszczeń z ran. Asparaginazę katalizującą dezaminację asparaginy włącza się do leczenia niektórych rodzajów raka, lizozym do leczenia zapalenia spojówek, cytochrom do usuwania niedotleniania w chorobach serca, elastazę do leczenia stwardnienia tętnic, β-galaktozydazę do wspomagania trawienia mleka przy braku tego enzymu, galoktokinazę do wyeliminowania z tkanek galaktozy podczas jej gromadzenia patologicznego, liazę fenyloalaninową do obniżania poziomu fenyloalaniny we krwi w przypadku zaburzeń jej przemian, lizoamidazę do leczenia chorób bakteryjnych (Staphylococcus, Strepcoccus). Zastosowanie w medycynie posiada diagnostyka enzymatyczna. Choroba każdego organu może być diagnozowana na podstawie poziomu enzymu lub jego izozymów we krwi lub moczu. Dehydrogenaza mleczanowa (LDG), aminotransferaza asparaginianowa (AspAT), kinaza kreatynowa, dehydrogenaza izocytrynianowa i fruktozo-1,6-fosforano-aldolaza są pomocne w diagnozowaniu stanów zawało- Rozdział 3. Enzymy 101 wych, LDG, AspAT i aminotransferaza alaninowa w leczeniu chorób wątroby, transferaza γ-glutamylowa jest wskaźnikiem odrzucania przeszczepów podczas transplantacji organów, fosfataza zasadowa w leczeniu żółtaczki, a fosfataza kwaśna przy zaburzeniach funkcji gruczołu krokowego. Zastosowanie enzymów do produkcji środków chemicznych staje się w ostatnich latach zjawiskiem masowym, przy czym w większości przypadków w różnych procesach stosowane są enzymy immobilizowane, tzn. umocowane na nośniku. Technologie tego rodzaju pozwalają na wielokrotne stosowanie tych samych preparatów. Ze względu na dostępność i niski koszt, mniejszy o około 100 razy od enzymów roślinnych i zwierzęcych, do celów przemysłowych unieruchamia się głównie enzymy drobnoustrojów. Charakteryzują się one bowiem uniezależnieniem od czasu wegetacji roślin lub terminu hodowania zwierząt, co przy krótkim okresie kumulacji masy bakteryjnej, zwiększa atrakcyjność enzymów drobnoustrojowych. Immobilizacji towarzyszy z reguły, wzrost stabilności enzymów, nawet rzędu kilka tysięcy. Stwarza to warunki do ich wykorzystania w postaci katalizatorów heterogenicznych. Dodatkowo, odpowiedni dobór matrycy, na której unieruchomiony jest enzym, daje możliwość zmiany jego aktywności i poznania zasad działania naturalnych układów mechaniczno-chemicznych. Obecnie większość enzymów immobilizowana jest na żywicach lub w lipidach membran biologicznych. Spośród około 2000 znanych obecnie enzymów znaczna ich część została immobilizowana i jest wykorzystywana w inżynierii enzymologicznej. Są to głównie hydroksyreduktazy, hydrolazy i transferazy. Optymalną metodą immobilizacji jest przyłączanie enzymów do nośników na zasadzie adsorpcji lub kowalencyjnego. Rozpowszechnione jest również włączenie enzymów do membran i mikrokapsułkowanie. Inne metody wykorzystywane są sporadycznie. Do procesów chemicznych z udziałem immobilizowanych enzymów stosuje się reaktory kolumnowe, rurowe, płytowe, dwufazowe i zbiornikowe o różnej pojemności i wydajności. Pierwszym reaktorem, w którym wykorzystano immobilizowany enzym na skalę przemysłową, był reaktor rozdzielający racemiczne mieszaniny D- i L-aminokwasów. Uruchomiony został w Japonii w roku 1969, i zawierał aminoacylazy immobilizowane na DEAE-sephadeksie: 2R CH NH COOH + H2O CO R' Acylo D,L-aminokwasy Aminoacylaza R (hydrolaza wyłącznie acylo L-aminokwasów) CH COOH + R NH2 L-aminokwas Racemizacja CH COOH + R'OH NH CO R' Acylo D-aminokwas 102 Podstawy biochemii Jednocześnie przy pomocy immobilizowanej β-frukto-furanoidazy uruchomiono produkcję cukru inwertowanego stanowiącego mieszaninę glukozy i fruktozy, powstającą w wyniku hydrolizy sacharozy. Obecnie ten sposób produkcji jest bardzo rozpowszechniony. Inwertaza immobilizowana jest bardzo stabilna, a jej aktywność w okresie dziesięcioletniej eksploatacji reaktorów zmniejszyła się tylko o 10%. Duże znaczenie przemysłowe ma także proces otrzymywania równomolowej mieszaniny glukozy i fruktozy, czyli przekształcania glukozy we fruktozę przy pomocy immobilizowanej glukozoizomerazy. Procesy te prowadzone są od 1972 r. w USA oraz w Niemczech, Danii i Holandii. W 1974 roku w Japonii uruchomiono produkcję kwasu L-asparaginowego, wykorzystując liazę asparginianową, immobilizowaną na żywicy fenolowoformaldehydowej. Przy wysokim stopniu przemiany (99%) fumaranu amonu do kwasu L-asparaginowego enzym ten jest mniej stabilny niż w immobilizowanych komórkach. Czas życia enzymu wynosi 18 dni. Również w Japonii produkuje się L-tryptofan z indolu i seryny, używając syntazy tryptofanu i L-tyrozyny, używając immobilizowanej liazy tyrozyno-fenolowej. W przemyśle farmaceutycznym bardzo duże znaczenie ma wykorzystanie w produkcji immobilizowanej penicylinoamidazy. Umożliwia syntezę analogów penicyliny poprzez acylowanie aminokwasu 6-aminopenicylinowego różnymi kwasami. Niżej podany jest schemat syntezy kwasu 6-aminopenicylinowego: S CH2 CO NH CH3 + CH CH C C N CH3 CH COOH H2O Amidaza penicylinowa O Benzylopenicylina CH2 COOH S + H2N CH C CH3 CH C N CH3 CH COOH O Kwas fenylooctowy Kwas penicylanowy Poprzez przyłączenie do grupy amidowej tego kwasu rodników innych niż benzylowy, otrzymywane są penicyliny o pożądanych specyficznych właściwościach. Przytoczone przykłady nie wyczerpują listy substancji chemicznych, wytwarzanych przy zastosowaniu osiągnięć inżynierii enzymologicznej. Jednocześnie z wykorzystywaniem immobilizowanych enzymów rozwija się przekształcanie surowców chemicznych przez mikroorganizmy, które w tym przypadku są rodzajem Rozdział 3. Enzymy 103 żywego laboratorium zawierającego enzymy. Najstarszym rodzajem produkcji tego typu jest otrzymywanie alkoholu drogą fermentacji, w którym to procesie enzymy obecne w komórkach drożdży intensywnie przekształcają glukozę w alkohol etylowy. Obecnie coraz częściej przechodzi się od klasycznych metod fermentacyjnych do nowych technologii charakteryzujących się wykorzystywaniem immobilizowanych komórek różnych mikroorganizmów. Etanol otrzymuje się z glukozy za pomocą immobilizowanych w żelu poliakryloamidowym komórek Saccharomyces cerevisiae. Pierwszy na świecie przemysłowy 1000-litrowy reaktor typu przepływowego do syntezy kwasu L-asparaginowego z fumaranu amonu został uruchomiony w Japonii (1973). Wykorzystano w nim immobilizowane komórki pałeczki jelitowej (Esherichia coli), zawierające liazę asparaginianową: Liaza asparaginianowa HOOC-CH=CH-COONH4 Fumaran amonowy ⇄ HOOC-CH2-CH(NH2)COOH Kwas asparaginowy Wydajność tego aparatu wynosiła 1915 kg kwasu L-asparginowego na dobę. Stopień przemiany substratu w produkt wynosił 95%. W środowisku kwaśnym (pH 2,8) i w temperaturze 15oC, kwas asparaginowy wykrystalizowuje w postaci preparatu analitycznie czystego. Immobilizowane komórki pałeczki jelitowej zachowują aktywność amoniako-liazy asparaginianowej na poziomie 80% przez okres 120 dni, a na poziomie 50% – w ciągu 600 dni pracy reaktora, podczas gdy komórki nieimmobilizowane – na poziomie 25% w ciągu 10 dni. Innym produkowanym aminokwasem jest L-izoleucyna, syntetyzowana z treoniny i glukozy za pośrednictwem immobilizowanych komórek Serratia marcescens. W analogiczny sposób otrzymano też L-lizynę: Mikrobakterium ammoniaphilum HOOCCH(NH2)(CH2)3CH(NH2)COOH ⇄ H2NCH2(CH2)3CH(NH2)COOH + CO2 Kwas diaminopimelinowy Lizyna Używając immobilizowanych komórek Corynobacterium glutamicum produkuje się z glukozy kwas L-glutaminowy; Esherichia coli otrzymuje L-tryptofan z indolu, a stosując komórki Streptococcus feccalis L-ornitynę z L-argininy. Tak więc aminokwasy szeregu L niezbędne jako dodatki w żywieniu człowieka i hodowli zwierząt produkowane są obecnie praktycznie tylko w reaktorach posiadających immobilizowane komórki. Za pomocą immobilizowanych w żelu komórek Brevibacterium ammoniagens, od 1974 r. produkuje się w Japonii kwas jabłkowy z kwasu fumarowego. W Rosji z kwasów: propionowego, octowego i pirogronowego otrzymuje się glukozę, laktozę oraz mleczan sodowy. Używając immobilizowanych komórek różnych mikroorganizmów opracowano także metody syntezy ATP, NADP, glukozo-6-fosforanu, 104 Podstawy biochemii glutationu, kwasów glukonowego i 2-ketoglukonowego, fruktozy (poprzez izomeryzację glukozy), mieszaniny glukozy i fruktozy w wyniku hydrolizy sacharozy oraz koenzymu A i acetylo-CoA. Stosując immobilizowane enzymy, japońscy naukowcy opracowali proces przekształcenia propylenu do tlenku propylenu w wyniku bezpośredniego utlenienia tlenem. W przemyśle farmaceutycznym immobilizowane komórki stosuje się w syntezie hormonów steroidowych i ich pochodnych, w otrzymywaniu penicylin o przedłużonym działaniu oraz w produkcji wielu innych preparatów leczniczych. Metodami inżynierii genetycznej otrzymano komórki zdolne do produkcji leków białkowych o dużym znaczeniu, tj. insuliny, interferonu, czy α1-antytrypsyny. Zastosowaniem enzymów zajmuje się również chemia analityczna. Polega ono na wytwarzaniu elektrod pokrytych immobilizowanymi enzymami. Przy pomocy elektrody platynowej z immobilizowaną glukozohydroksydazą można wyznaczyć stężenie glukozy metodą amperometryczną: HOCH2 H H OH H C C C OH OH H Glukoza HOCH2 O C + O2 + H2O C OH H H H OH H C C C C OH OH H OH Kwas glukonowy Oksydaza glukozowa O C + H2O2 OH Oznaczenie ilości powstającego H2O2 trwa 1 minutę. Na bazie tej elektrody enzymatycznej produkowany jest analizator glukozy. Za pomocą elektrod enzymatycznych określane są ilości sacharozy, mocznika, etanolu oraz poziom pestycydów w środowisku naturalnym. Należy przypuszczać, że stosowanie enzymów przyczyni się do pozyskiwania nowych źródeł energii. Dziś wskazuje się na dwie możliwości realizacji tego zadania. Pierwsza dotyczy bezpośredniego przekształcania energii chemicznej w elektryczną za pomocą ogniw paliwowych. W urządzeniach tych wykorzystuje się enzymy, takie jak: oksydaza glukozowa, ureaza, hydrogenaza, dehydrogenaza mleczanowa i alkoholowa (substraty, odpowiednio, glukoza, mocznik, wodór, kwas mrówkowy i etanol). W przypadku dehydrogenazy alkoholowej schemat przekształcenia energii chemicznej w elektryczną jest następujący: Rozdział 3. Enzymy C2H5OH + NAD+ Dehydrogenaza alkoholowa → 105 CH3CHO + NADH + H+ H N + NADH + H + N SO4 + N CH3 2- SO42- NAD + N CH3 2 Fenazynometylosiarczan utleniony (FMS) 2 Fenazynometylosiarczan zredukowany (FMS⋅H2) Na powierzchni FMS⋅H2 + → elektrody platynowej FMS + 2H+ + 2e Drugi sposób polega na wykorzystaniu jako źródła energii produktów reakcji enzymatycznej, np. wodoru, który produkowany jest za pomocą energii słonecznej (rys. 3.6). 2H2O O2 hv Chloroplastry immobilizowane + 2( NADFH + H ) Hydrogenaza immobilizowana + 2( NADF ) 2H2 Rys. 3.6. Schemat wykorzystania energii słonecznej do rozkładu wody i produkcji paliwa gazowego Przeprowadzone obliczenia wykazały, że kwadrat o wymiarach 200 x 200 [km2], gdzie ulokowane są akceptory energii słonecznej, w tym przypadku immobilizowane chloroplasty, zabezpieczyłyby pełne zapotrzebowanie Polski w energią elektryczną. Co istotne byłaby to technologia przyjazna dla środowiska. W wielu ośrodkach naukowych badany jest mechanizm katalizy enzymatycznej, poznanie którego zaowocuje z pewnością rozwojem nowych technologii w prze- 106 Podstawy biochemii myśle chemicznym. Przyczynią się one do zwiększenia wydajności produkcji i ograniczenia reakcji ubocznych. Poznanie mechanizmów procesów enzymatycznych, fotosyntezy, biosyntezy białek, wiązania azotu cząsteczkowego oraz opracowanie na ich podstawie technologii będzie mieć z pewnością ogromny wpływ na życie człowieka. Ilość procesów chemicznych katalizowanych enzymatycznie jest bardzo duża. W przyrodzie dochodzi do wielu przekształceń enzymatycznych niemożliwych do przeprowadzenia w warunkach laboratoryjnych, co jest dowodem ogromnego znaczenia związków enzymatycznych w procesach życiowych. Nieustanne badania prowadzące do poznania budowy, właściwości oraz udziału cząsteczek enzymatycznych w różnorodnych reakcjach chemicznych, pozwolą na dalszy rozwój biochemii dynamicznej, której problemy omawiane są w następnych rozdziałach podręcznika.