Liposomy – nośniki leków przeciwnowotworowych
Transkrypt
Liposomy – nośniki leków przeciwnowotworowych
Liposomy – nośniki leków przeciwnowotworowych mgr Patrycja Kozub „Projektowanie, synteza i badanie nanonośników liposomowych do transferu leków – (porfiryn, chloryn) do komórek nowotworowych” (prof. dr hab. Alicja Ratuszna). Wprowadzenie do technologii liposomowej Liposomy – z gr. ciałka lipidowe. Są to struktury powstające samoistnie z fosfolipidów. Mają postać pęcherzyków zbudowanych z kilku lub kilkunastu przestrzeni wodnych oddzielonych od siebie zamkniętymi koncentrycznie dwuwarstwami fosfolipidowymi. http://dolinabiotechnologiczna.pl Budowa liposomu http://ebiolog.pl/a-7-3.html Rodzaje fosfolipidów DSPC 18:0 - disterylofosfatydylocholina DPPC 16:0 - dipalmitylofosfatydylocholina DPPG 16:0 - dipalmitylofosfatydyloglicerol DSPG 18:0 - disterylofosfatydyloglicerol DSPE-PEG 2000 18:0 – disterylofosfatydyloetanoloamina -glikol polietylenowy DOTAP 18:1 - dioleoilometyloamoniopropan http://www.avantilipids.com/ HSPC – uwodorniona fosfatydylocholina Mechanizm powstawania liposomów A. Kozubek, Wstęp do technologii liposomowej, Wrocław 2004 Podział liposomów 1. Wielowarstwowe pęcherzyki (MLV) o wielkości od 200 nm do kilku mikronów. 2. Duże jednowarstwowe pęcherzyki (LUV) o wielkości od 100 nm do 400 nm. 3. Małe jednowarstwowe pęcherzyki o wielkości od 25 nm do 100 nm. A. Sharma, U.S. Sharma, Int. J. Pharm., 1997, 154, 123-140 Inne podziały • Ze względu na skład: konwencjonalne stabilne sferycznie modyfikowane • Ze względu na ładunek: Jonowo obojętne kationowe anionowe K. Stebelska et al., Adv. Clin. Med. 2002, 11, 2, 229-242 Preparatyka liposomów 1. Metoda cienkiego filmu fosfolipidowego. A. Kozubek, Wstęp do technologii liposomowej, Wrocław 2004 2. Modyfikacje metody 1. a) Sonikacja A. Kozubek, Wstęp do technologii liposomowej, Wrocław 2004 b) Kalibracja przez filtry poliwęglanowe o ściśle określonej wielkości porów. A. Kozubek, Wstęp do technologii liposomowej, Wrocław 2004 c) Prasa Frencha 2. Wstrzykiwanie roztworu etanolowego A. Kozubek, Wstęp do technologii liposomowej, Wrocław 2004 Wykorzystanie liposomów jako nośników leków w terapii fotodynamicznej A.C. Kübler, Med Laser Appl, 2005, 20, 37-45 Leki zamknięte w formulacjach liposomowych Substancja czynna Stosunek lipid:lek Skład liposomów Zastosowanie 1990 Amfoterycyna B 7:1 HSPC/Chol/DSPG -Alfa-tokoferol 4.26:1.04:1.68:0. 13 Poważne infekcje grzybicze Doxil 1995 Doksyrubicyna 8:1 HSPC/Chol/DSPE -PEG 2000 6.5:3.5:0.5 Leczenie mięsaka Kaposiego u pacjentów z AIDS ABELCET 1995 Amfoterycyna B 1:1 DMPC/DMPG 7:3 Poważne infekcje grzybicze DaunoXome 1996 Daunorubicyna 15:1 DSPC/Chol 2:1 Leczenie mięsaka Kaposiego u pacjentów z AIDS Visudyne 2000 Werteporfiryna - Zwyrodnienie plamki żółtej 2001 Chlorowodorek doksorubicyna 19:1 EPC/Chol 2.5:1 Leczenie kobiet z rakiem piersi z przerzutami Nazwa produktu AmBisome Myocet Rok zatwierdzenia DepoCyte 2002 cytarabina - Zapalenie opon mózgowych w wyniku przebiegu chłoniaka DepoDur 2004 Morfina - Ból po operacji Materiał badawczy Chloryna D Preparatyka liposomów – metoda cienkiego filmu fosfolipidowego Rodzaje badanych liposomów: 1. • • 2. • • 3. • • Obojętne: HSPC/Chol 7:3 HSPC/DSPE-PEG 2000 9.5:0.5 Kationowe HSPC/DOTAP/Chol 6:1:3 HSPC/DOTAP/DSPE-PEG 2000 8.5:1:0.5 Anionowe DPPC/DPPG 9:1 HSPC/DSPG/DSPE-PEG 2000 8.5:1:0.5 Stężenie chloryny w 1 mL zawiesiny liposomów 100 μM. Ocena stopnia miejsca zamykania się związku w liposomach Mikroskop fluorescencyjny Nikon Eclipsce 90i Wykonanie zdjęć • Seria 4 zdjęć: film lipidowy przed wzbudzenie film lipidowy po wzbudzeniu film lipidowy po podgrzaniu film lipidowy po podgrzaniu i wzbudzeniu Do wzbudzenia oraz obserwacji fluorescencji używano filtru TRITC (wzbudzenie – światło zielone, emisja – światło czerwone). HSPC/DOTAP/DSPE-PEG 2000 z chloryną D 100 µm Film lipidowy po wzbudzeniem Film lipidowy przed wzbudzeniem 100 µm HSPC/DOTAP/Chol z chloryną D 100 µm Film lipidowy po podgrzaniu i wzbudzeniu Film lipidowy po podgrzaniu 100 µm HSPC/DOTAP/DSPE-PEG 2000 z chloryną D 100 µm Film lipidowy po podgrzaniu i wzbudzeniu Film lipidowy po podgrzaniu 100 µm Analizator wielkości cząstek Zetasizer Nano ZS firmy Malver – określenie wielkości pęcherzyków, ich stabilności oraz ocena polidyspersyjności. Wykonanie pomiarów • Kuweta polistyrenowa, cztery ścianki czynne optycznie. • Źródło światła oświetlającego – laser 633 nm. • Detekcja światła wstecznie rozproszonego pod kątem 173o. • Pomiar wykonywany w temperaturze 25oC. • Wyniki uśredniano z 5 pomiarów. Pomiar średnicy pęcherzyków HSPC/DOTAP/Chol Średnica: 217±6.21 PDI:0.21±0.02 HSPC/DOTAP/DSPEPEG 2000 Średnica: 121.8±2.58 PDI:0.12±0.01 Stabilność 0,25 HSPC/DOTAP/Chol z chl D 200 0,2 150 0,15 PDI d [nm] 250 100 0,05 0 0 48 h 72 h Po 3 miesiącach 24 h 150 HSPC/DOTAP/DSPE-PEG 2000 z chl D 72 h Po 3 miesiącach chl D 0,2 100 50 48 h 0,25 HSPC/DOTAP/DSPE-PEG 2000 z PDI d [nm] 0,1 50 24 h HSPC/DOTAP/Chol z chl D 0,15 0,1 0,05 0 24 h 0 48 h 72 h Po 3 miesiącach 24 h 48 h 72 h Po 3 miesiącach Test MTS – ocena przeżywalności komórek Płytka kontrolna k k k Płytka naświetlana 1uM 1uM 1uM 1uM 1uM 1uM 2uM 2uM 2uM 2uM 2uM 2uM 2.5 uM 2.5 uM 2.5 uM 2.5 uM 2.5 uM 2.5 uM 5uM 5uM 5uM 5uM 5uM 5uM Oświetlacz halogenowy wyposażony w 4 żarówki o mocach 250 W oraz filrt odcinający długości fali poniżej 630 nm. k k k Wykonanie eksperymentu Kontrola 1 μM 1.5 μM 2 μM 5 μM 20 J/cm2 12 J/cm2 4 J/cm2 20 J/cm2 12 J/cm2 4 J/cm2 20 J/cm2 12 J/cm2 4 J/cm2 20 J/cm2 12 J/cm2 4 J/cm2 20 J/cm2 12 J/cm2 4 J/cm2 Frakcja przeżywająca [%] 120 HSPC/DOTAP/CHOL z chloryną D 100 80 60 40 20 0 10 μM 0 Kontrola 1 μM 1.5 μM 2 μM 5 μM 20 J/cm2 12 J/cm2 4 J/cm2 20 J/cm2 12 J/cm2 4 J/cm2 2 μM 20 J/cm2 12 J/cm2 4 J/cm2 20 J/cm2 12 J/cm2 4 J/cm2 20 J/cm2 12 J/cm2 Frakcja przeżywająca [%] 140 HSPC/DOTAP/DSPE-PEG 2000 z chloryną D 120 100 80 60 40 20 10 μM Podsumowanie • Mikroskop fluorescencyjny – związek zamyka się w dwuwarstwie fosfolipidowej. • Średnica badanych typów liposomów jest w okolicy 100 nm za wyjątkiem liposomów kationowych z cholesterolem. • Pod kątem zmian średnicy cząsteczek w czasie liposomy są stabilne, jednakże występują zmiany wartości współczynnika polidyspersyjności (PDI < 0.3). • Efekt PDT – około 20% komórek nowotworowych przeżywa terapię. • Cytotoksyczność ciemna występuje w przypadku podania związku zamkniętego w liposomach, ale dopiero powyżej stężenia 2µM. Dziękuję za uwagę.