„Nowe inhibitory DNA metylotransferazy” Beata Patrycja Plitta

„Nowe inhibitory DNA metylotransferazy”
Beata Patrycja Plitta
Stypendystka projektu pt. „Wsparcie stypendialne dla doktorantów na kierunkach uznanych za
strategiczne z punktu widzenia rozwoju Wielkopolski”, Poddziałanie 8.2.2 Programu
Operacyjnego Kapitał Ludzki
Informacja dotycząca budowy i funkcjonowania organizmu zakodowana jest w DNA. W
zależności od typu komórki i aktualnego etapu jej rozwoju, geny ulegają specyficznej
ekspresji. Sekwencja genomu w większości komórek danego organizmu jest identyczna, co
oznacza, że ich zróżnicowanie nie jest wynikiem gromadzenia się mutacji w sekwencji DNA.
Stwierdzono również, że czynniki transkrypcyjne nie są jedynymi regulatorami tego procesu.
Muszą zatem istnieć dodatkowe elementy odgrywające rolę w aktywowaniu i hamowaniu
ekspresji genów.
Epigenetyka jest nauką o dziedziczeniu pozagenowym, a głównym przedmiotem jej
badań są czynniki regulujące aktywność genów. Tworzą one charakterystyczny dla danego
organizmu kod epigenetyczny (epigenom). Jego elementami są kowalencyjne modyfikacje
DNA (metylacja cytozyny w pozycji 5 w DNA) i histonów oraz niekodujące RNA.
Analiza DNA komórek nowotworowych wskazała na obniżenie poziomu globalnej
metylacji DNA (hipometylacja) z jednoczesnym podwyższeniem ilości 5-metylocytozyny
(m5C) w obrębie promotorów regulatorów cyklu komórkowego (hipermetylacja), co prowadzi
do wyciszenia ich aktywności. Istotny udział mutacji epigenetycznych (epimutacji), a
jednocześnie ich odwracalny charakter sprawiły, że stały się celem poszukiwań związków o
potencjalnym znaczeniu w terapii.
Wiedza na temat metylacji DNA, analiza zmian jej wzoru i poziomu oraz skorelowanie
tych zjawisk z procesem nowotworzenia, doprowadziły do ukształtowania nowego podejścia
w leczeniu i diagnostyce nowotworów.
W przeciwieństwie do obecnie stosowanej chemioterapii, celem terapii epigenetycznej
nie jest wywołanie śmierci komórki, ale odtworzenie prawidłowego wzoru metylacji, a tym
samym uruchomienie naturalnych mechanizmów hamujących rozwój nowotworu. Czynniki
demetylujące nie powodują szybkiej śmierci komórek nowotworowych, lecz wpływają na
wydłużenie cyklu komórkowego wywołane aktywacją sygnałów regulujących. Dlatego uważa
Praca doktorska współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach
Europejskiego Funduszu Społecznego
się, że terapia epigenetyczna będzie bardziej specyficzna, mniej toksyczna i bardziej
efektywna niż standardowa chemioterapia.
Ponad 30 lat temu wykazano, że dwie pochodne cytozyny (5-azacytydyna, 2’deoksy5-azacytydyna) są modulatorami epigenetycznymi i hamują aktywność DNMT1 (DNA
metylotransferaza 1) enzymu metylującego cytozynę w DNA po każdej rundzie replikacji.
Są one stosowane w leczeniu, jednak ich efektem ubocznym jest wysoka toksyczność.
Celem mojej pracy było wyselekcjonowanie inhibitorów procesu metylacji o
potencjalnym znaczeniu w terapii epigenetycznej. Znacząca większość badanych
pochodnych
to
związki
nowo
zsyntetyzowane
o
nie
analizowanych
wcześniej
właściwościach biologicznych. W ramach realizowanej pracy badawczej opracowałam test
inhibicji metylacji in vitro pozwalający na selekcję związków pod względem ich aktywności
inhibitorowej względem modelowej DNA metylotransferazy SssI. Dzięki temu wykonałam
analizy kinetyczne określające wartość stałej inhibicji (Ki) i typ inhibicji dla 52 pochodnych
cytozyny,
adeniny,
uracylu
oraz
związków
nienukleozydowych.
Wynikiem
tych
eksperymentów jest wskazanie inhibitora kompetycyjnego o wysokiej aktywności (N4furfurylo-5,6-dihydro-5-azacytozyna),
którego
Ki
wynosi
0,7µM.
Potwierdziłam,
że
wyselekcjonowana pochodna hamuje aktywność także ludzkiej DNMT1 (IC50 = 22µM).
Badane przeze mnie związki okazały się być także niskotoksyczne i nie powodujące
trwałych uszkodzeń w DNA w postaci pęknięć nici czy pojawiania się markera stresu
oksydacyjnego - 8-okso-7,8-dihydro-2’deoksyguanozyny.
Określiłam także wpływ wyselekcjonowanego związku na poziom globalnej metylacji
DNA w liniach komórkowych. Wyniki wskazują, że obniża ona poziom metylacji w sposób
zależny od stężenia.
Wydaje się, że N4-furfurylo-5,6-dihydro-5-azacytozyna jako związek wiodący (lead
compound) stanowi dobry punkt wyjścia do planowania i syntezy kolejnych pochodnych.
Związek ten cechuje się wysoką aktywnością w teście inhibicji metylacji in vitro, a
dodatkowo wykazuje bardzo niską cytotoksyczność. Jest to pożądaną cechą inhibitorów
epigenetycznych,
które
aby
uzyskać
oczekiwany
efekt
muszą
być
stosowane
długoterminowo.
Brak skutecznych i bezpiecznych terapeutyków przeciwnowotworowych sprawia, że
prowadzone przez mnie badania są aktualne i odpowiadają na potrzeby współczesnego
świata. Temat mojej rozprawy doktorskiej wpisuje się w założenia Regionalnej Strategii
Innowacji dla Wielkopolski na lata 2010-2020. Jej celem jest podniesienie konkurencyjności i
innowacyjności regionu. Wymaga to działań systemowych różnych podmiotów, w tym
jednostek naukowo-badawczych. Badania naukowe są jednym z elementów cyklicznego
Praca doktorska współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach
Europejskiego Funduszu Społecznego
modelu innowacji, a nowo zsyntetyzowane związki posiadające ciekawe właściwości
biologiczne i mogące potencjalnie zostać wykorzystane w leczeniu nowotworów są
przykładem innowacji produktowych.
Praca doktorska współfinansowana ze środków Unii Europejskiej w ramach
Europejskiego Funduszu Społecznego