Izolacja i charakterystyka wzrostu celululitycznych - Eko-DOk

Bakterie celulolityczne, Luteimonas compoti, wzrost bakterii,
Anna KILISZCZYK, Stefan RUSSEL*
IZOLACJA I CHARAKTERYSTYKA WZROSTU
CELULULITYCZNYCH BAKTERII Z GATUNKU LUTEIMONAS
COMPOSTI
Niektóre gatunki drobnoustrojów stanowią źródło cennych i powszechnie wykorzystywanych w różnych gałęziach przemysłu enzymów celulolitycznych. Przedstawione badania miały na celu wyizolowanie oraz scharakteryzowanie celulolitycznego szczepu bakterii. Mikroorganizmy wyselekcjonowano spośród bakterii izolowanych z oczka wodnego zlokalizowanego w miejscowości Borowice
w Sudetach Zachodnich. Wybrany szczep oznaczono na podstawie sekwencji 16S rRNA, a następnie
oceniono jego wzrost na podłożu stałym oraz w podłożu płynnym o odczynie w zakresie 5-11 pH
oraz przy temperaturze inkubacji wynoszącej od 20-40°C. Analiza sekwencji molekularnej 16S rRNA
wykazała, że badany organizm należy do gatunku Luteimonas composti. i charakteryzuję się zróżnicowanym tempem wzrostu w zastosowanych warunkach hodowli.
1. WSTĘP
Celuloza należy do trudno rozkładalnych wielocukrów, gromadzących się w środowisku w postaci biomasy roślinnej. Zdolność hydrolizy celulozy, która związana
jest z wytwarzaniem enzymów celulolitycznych, została wykształcona równolegle
przez różne grupy organizmów należących do bakterii, grzybów, a nawet bezkręgowców [6].
Celuloza jest roślinnym polisacharydem zbudowanym z łańcuchów jednostek β-Dglukozy połączonych wiązaniami β-1,4-glikozydowymi. Do całkowitej hydrolizy tego
polisacharydu do glukozy lub oligosacharydów niezbędny jest kompleks składający
się z trzech enzymów: celulazy (endo-β-1,4-glukanazy), która hydrolizuje wiązania
β-1,4-glikozydowe w łańcuchu celulozy, egzo-β-1,4-glukanazy odszczepiające jednostki celobiozy lub glukozy od nieredukujących końców celulozy, β-glukozydazy
(celobiazy) (EC.3.2.1.21), która katalizuję reakcję rozkładu celobiozy do dwóch czą__________
* Instytut Technologiczno-Przyrodniczy w Falentach, [email protected].
270
A. KILISZCZYK, S. RUSSEL
steczek glukozy i odszczepia cząsteczki glukozy od nieredukujących końców celooligosacharydów. Jak wykazano, wiele organizmów posiada enzymy o właściwościach
endocelulaz natomiast nie stwierdzono u nich aktywności egzocelulolitycznych, Ponadto, u wielu badanych drobnoustrojów stwierdzono niedobory ß-glukozydazy [4,8].
Aktywność celulolitycznych mikroorganizmów jest niezwykle istotna ze względów
środowiskowych takich jak uwalnianie energii zmagazynowanej w trudno rozkładalnej biomasie roślinnej [7]. Celulazy wykorzystywane są ponadto w licznych dziedzinach działalności człowieka do których należy między innymi: przemysł tekstylny,
papierniczym, spożywczy czy farmaceutyczny. Na uwagę zasługuje również możliwość zastosowania drobnoustrojów celulolitycznych w celu poprawy strawności pasz
podawanych przeżuwaczom [3]. Ze względu na tak szeroki zakres możliwości wykorzystania celulaz istnieje potrzeba eksploracji różnorodnych środowisk, w celu izolacji
mikroorganizmów zdolnych do wydajnej hydrolizy celulozy.
Celem pracy jest wstępna charakterystyka szczepu Luteimonas composti, wybranego z pośród celulolitycznych bakterii izolowanych z oczka wodnego zlokalizowanego
w pobliżu miejscowości Borowice w Sudetach Zachodnich.
2. MATERIAŁY I METODY
2.1. IZOLACJA BAKTERII CELULOLITYCZNYCH
Celulolityczne bakterie wyizolowano z porośniętego roślinnością oczka wodnego
zlokalizowanego w pobliżu miejscowości Borowice w Sudetach.
Bakterie izolowano wsiewając po 1ml próby na szalkę zawierającą zestalone podłożę o składzie: NaNO3 2.5g; KH2PO4 2g; MgSO4, 0.2g; NaCl 0.2g; CaCl2*6H2O 0.1g
15g agaru na 1000 ml wody destylowanej (pH 6.8–7.2) na które wykładano krążek
bibuły filtracyjnej Whatman Nr 1. W celu ograniczenia wzrostu grzybów stosowano
nystatynę w ilości 25 µg/ml. Hodowle inkubowano w temperaturze 30 °C. Po 7 oraz
14 dniach bakterie pojedyncze kolonie przeszczepiano na podłoże zawierające
KH2PO4 0.5g, MgSO4 0.25g, celulozę 2.0g, agar 15g, żelatynę 2g oraz 1000ml wody
destylowanej (pH 6.8–7.2) i inkubowano przez 7 dni w temperaturze 30 °C. Uzyskane
szczepy kilkakrotnie pasażowano.
2.2. SELEKCJA WYIZOLOWANYCH SZCZEPÓW
W celu potwierdzenia właściwości celuloitycznych uzyskane szczepy pasażowano
na pożywki z karboksymetylocelulozą zawierające czerwień kongo jako wskaźnik
rozkładu celulozy. Po tygodniowej inkubacji w 30°C wokół kolonii bakterii o właściwościach celulolitycznych obserwowano odbarwienie podłoża. Selekcję szczepów
Izolacja i charakterystyka wzrostu celulolitycznych bakterii z gatunku Luteimonas composti
271
przeprowadzono na podstawie intensywności oraz wielkości obszaru zmiany barwy
podłoża wywołanej aktywnością drobnoustrojów.
2.2. IDENTYFIKACJA SZCZEPU BAKTERII
Identyfikacja wybranego szczepu została przeprowadzona na podstawie analizy
sekwencji genu kodującego 16S rRNA. Fragment kodujący podjednostkę 16S rRNA
zamplifikowano na matrycy genomowego DNA podczas reakcji PCR. Do reakcji użyto uniwersalnych starterów o następujących sekwencjach nukleotydów: 27 F
AGAGTTTGATCATGGCTCAG oraz 1492 R GGTTACCTTGTTACGACTT. Uzyskano fragmenty DNA o długości około 1400 pz., które następnie zsekwencjonowano.
Otrzymaną sekwencje porównano z sekwencjami 16S rDNA znajdującymi się w bazie danych serwisu NCBI- National Center for Biotechnology Information
[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/], z wykorzystaniem narzędzia BLAST (Basic Local
Alignment Search Tool).
2.3. CHARAKTERYSTYKA WZROSTU BADANEGO SZCZEPU
Wzrost wyizolowanego szczepu obserwowano po przeszczepieniu na podłoże pełne (bulion wzbogacony). Hodowle inkubowano w temperaturze 30°C przez dwa tygodnie codziennie dokonując obserwacji.
Wpływ pH oraz temperatury na wzrost drobnoustrojów badano na podłożu pełnym
(bulion wzbogacony).
Inkubację hodowli w podłożu o pH 7 prowadzono w temperaturach 10, 20, 30,
40°C, natomiast w podłożu o pH 5, 9, 11 w temperaturze 20°C.
Ponadto oceniano wzrost Luteimonas composti na podłożu zawierającym 0,5 oraz
1% karboksymetylocelulozy (CMC) (pozostałe składniki podłoża: pepton 1g, ekstrakt
drożdżowy 2g, K2HPO4 0,5g, MgSO4*7H2O 0,5g, NaCl 0,5g, FeSO4·7H2O 0,01g).
Wzrost drobnoustrojów oceniano poprzez pomiar gęstości optycznej zawiesiny
bakteryjnej co 8 godzin w ciągu 8 dni przy długości fali 600nm.
3. WYNIKI BADAŃ
Analiza uzyskanej w wyniku rekcji PCR sekwencji 16 rDNA wykazała ze zgodnością 97%, że wyizolowany szczep bakterii należy do gatunku Luteimonas composti.
Badane mikroorganizmy na bogatym podłożu rosły powierzchniowo w postaci
śluzowych, błyszczących kolonii o gładkich brzegach i żółtej barwie. Po około
7 dniach w centrum kolonii obserwowano agregaty intensywnego brunatno-żółtego
272
A. KILISZCZYK, S. RUSSEL
barwnika. Podczas wzrostu na pożywce zawierającej czerwień kongo drobnoustroje
powodowały intensywne odbarwienie podłoża.
Fot. 1. Rozjaśnienie podłoża zawierającego czerwień kongo widoczne wokół kolonii Luteimonas composti po tygodniowej inkubacji
Ocena wzrostu badanych drobnoustrojów w podłożu o pH w zakresie od 5 do 11
wykazała najszybszy wzrost badanych bakterii przy obojętnym odczynie (Rys. 1.).
Najintensywniejsze zmiany w gęstości płynu hodowlanego w podłożu o pH 7 zaobserwowano od 40 do 64 godziny. Po stacjonarnym okresie wzrostu, który trwał do
około 88 godziny, nastąpiła faza zamierania badanego szczepu. W podłożu o pH 9
faza intensywnego wzrostu wystąpiła z około 8 godzinnym opóźnieniem w stosunku
do obojętnego odczynu, natomiast w przypadku podłoża o pH 11 najszybszy w zrost
odnotowano po 96 godzinach. Przy odczynie wynoszącym 5 zaobserwowano jedynie
niewielki wzrost bakterii.
Rys. 1. Wzrost bakterii z gatunku Luteimonas composti w zależności od pH podłoża
Izolacja i charakterystyka wzrostu celulolitycznych bakterii z gatunku Luteimonas composti
273
Z analizy wpływu temperatury na wzrost bakterii wynika, że organizmy te fazę intensywnego wzrostu najszybciej osiągają w temperaturze 20°C (Rys. 2). Inkubacja
hodowli w temperaturze 30 i 40°C powoduje wyraźne spowolnienie wzrostu Luteimonas composti. Przy hodowli prowadzonej w temperaturze wynoszącej 10°C badany
szczep wykazał nieznaczny wzrost.
Rys. 2. Wzrost bakterii z gatunku Luteimonas composti w zależności od temperatury inkubacji hodowli.
Rys. 3. Wzrost bakterii z gatunku Luteimonas composti w zależności od zawartości w podłożu płynnym
karboksymetylocelulozy CMC.
Bakterie Luteimonas composti wykazały silniejszy wzrost oraz nieco krótszą fazę
zastoju w podłożu zawierającym 1% CMC w porównaniu do wzrostu na podłożu
z CMC o stężeniu 0,5% (Rys. 3).
274
A. KILISZCZYK, S. RUSSEL
3. DYSKUSJA
Enzymy celulolityczne wykorzystywane są powszechnie przy wytwarzaniu biopaliw, papieru czy utylizacji odpadów roślinnych. Ze względu na użyteczność tych enzymów w znaczących, intensywnie rozwijających się gałęziach przemysłu istnieje
stale wrastające zapotrzebowanie na produkcję celulaz, których źródło stanowią drobnoustroje [1].
W toku przeprowadzonych badań wyizolowano i wstępnie scharakteryzowano,
wykazującą właściwości celulolityczne, bakterię należącą do gatunku Luteimonas
composi. Badany drobnoustrój został po raz pierwszy opisany w 2007 roku. Luteimonas composi należy do gram ujemnych bakterii, o kształcie pałeczki zdolnych do syntezy intensywno żółtego barwnika [9].
Analiza wpływu pH podłoża na wzrost bakterii wykazała, że opisywany szczep,
tak jak większość mikroorganizmów izolowanych ze środowiska naturalnego, preferuje odczyn obojętny. Charakteryzowany szczep potrafi w stosunkowo krótkim czasie
zaadaptować się do warunków bardziej zasadowych (pH 11), natomiast znacznie gorzej toleruje środowisko kwaśne. Wyniki te nie są sprzeczne z dotychczasową wiedzą,
ponieważ pomimo iż większość celulaz najwyższą aktywność wykazuje przy pH
w zakresie 5-7, jednak liczne organizmy celulolityczne najintensywniej rozmnażają
się w środowisku, którego odczyn jest obojętny [3].
Przeprowadzone analizy wykazały, że optymalna dla wzrostu Luteimonas compos
temperatura wynosi 20°C, natomiast temperatura 10 °C wpływa hamująco na rozwój
szczepu. Uzyskane wyniki częściowo potwierdzają z obserwację Young i in.[9] zgodnie z którymi badane mikroorganizmy wykazują wzrost w temperaturze 20-45°C.
Przeprowadzone badania pozwoliły na wyizolowanie, zidentyfikowanie oraz
wstępną charakterystykę słabo poznanego, celulolitycznego gatunku bakterii. W celu
określenia możliwości praktycznego wykorzystania opisanego szczepu, należy przeprowadzić dalsze badania ukierunkowane na charakterystykę właściwości celulolitycznych Luteimonas compos.
LITERATURA
[1]
[2]
[3]
CLINTON B., Examination of Cellulolytic activity in Activated sludge, Leading to Elucidation of
the Role of ß-1,4-endoglucanase enzyme in Aeromonas sp.YS3, Submitted in total fulfilment of the
requirements of the degree of Doctor of Philosophy, 2007.
EMTIAZI G., POOYAN M., SHAMALNASAB M., Cellulase Activities in Nitrogen Fixing
Paenibacillus Isolated from Soil in N-free Media, World Journal of Agricultural Sciences 2007, 3
(5), 602-608.
OTAJEVWO F. D.; ALUYI H. S. A., Cultural conditions necessary for optimal cellulase yield by
cellulolytic bacterial organisms as they relate to residual sugars released in broth medium Modern
Applied Science, 2011,Vol. 5, No. 3, 141-152.
Izolacja i charakterystyka wzrostu celulolitycznych bakterii z gatunku Luteimonas composti
[4]
[5]
[6]
[7]
[8]
[9]
275
ROBSON L.M., CHAMBLISS G.H., 1989 Cellulases of bacterial origin. Enzyme and Microbial,
Technology, Vol. 11, 626-644.
RUSSEL S., GÓRSK E., WYCZÓŁKOWSKI A., Enzymy biorące udział w hydrolizie celulozy,
Acta Agrophysica, Rozprawy i Monografie, 2005 Vol. 3, 27-36.
SANGBRIBA R.U, DUAN C.J AND TANG J.L., Isolation and characterization of mesophilic
Bacillus species cellulase genes from black liquor. Bioresource Technology, 2006, Vol. 14, 2727–
2733.
PIRIYA P.S.., VASAN P.T., PADMA V.S, VIDHYADEVI U., ARCHANA K., VENNISON S.J.,.
Cellulosic ethanol production by recombinant cellulolytic bacteria harbouring pdc and adh II genes
of Zymomonas mobilis, Biotechnology Research International, Vol. 2012, Article ID 817549, 8
pages
WANG C.M., SHYU C.L.,HO, S.P., Characterization of a novel thermophilic cellulose degrading
bacterium – Paenibacillus spp strain B39. Letters in Applied Microbiology, 2008, Vol. 47, 46–
53.
YOUNG CC, KÄMPFER P, CHEN WM, YEN WS, ARUN AB, LAI WA, SHEN FT, REKHA PD,
LIN KY, CHOU JH., Luteimonas composti sp. nov., a moderately thermophilic bacterium isolated
from food waste, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2007, Vol. 57,
741–744.
ISOLATION AND CHARACTERISTICS OF BACTERIA GROWTH OF SPECIES CELLULOLYTIC
LUTEIMONAS COMPOSTI
Bacteria are a source of valuable and widely used in various industries cellulolytic enzymes. The study
aimed to isolate and characterize the microbial cellulose-degrading strain selected from among the bacteria isolated from the pond located in the Western Sudetes Borowice. The selected strain was determined
by sequencing the PCR-amplified 16S rRNA genes and then evaluated the growth on the solid medium
and in liquid medium with a pH scale ranges from 5-11, and incubated at a temperature from 20-40°C.
Sequence analysis of polar molecules 16s rRNA showed that the test organism belongs to the species
Luteimonas composti and is characterized by varying the rate of growth in the culture conditions used.