Dako Autostainer/Autostainer Plus

FLEX
Polyclonal Rabbit
Anti-Human CD3
Ready-to-Use
(Dako Autostainer/Autostainer Plus)
Nr kat. IS503
Przeznaczenie
Do stosowania w diagnostyce in vitro.
Przeciwciała FLEX Polyclonal Rabbit Anti-Human CD3, Ready-to-Use, (Dako Autostainer/Autostainer Plus), są
przeznaczone do stosowania w immunohistochemii w aparatach Dako Autostainer/Autostainer Plus. Przeciwciała te
są przydatne w identyfikacji komórek T i związanych z nimi nowotworów (1, 2). Interpretacja kliniczna wystąpienia
lub braku barwienia musi być uzupełniona przez badania morfologiczne z wykorzystaniem odpowiednich prób
kontrolnych i powinna być przeprowadzana przez doświadczonego patologa z uwzględnieniem historii choroby
pacjenta i innych badań diagnostycznych.
Synonimy antygenu
T3, kompleks CD3 (3).
Streszczenie
i informacje ogólne
CD3 zawiera co najmniej cztery róŜne elementy (γ,δ,ε,ζ) ο masie cząsteczkowej od 20 do 28 kDa. Na powierzchni
limfocytów cząsteczka CD3 wiąŜe się wiązaniem niekowalencyjnym z receptorem komórek T (TCR). Przypuszcza
się, Ŝe elementy CD3 kompleksu TCR/CD3 biorą udział w transdukcji sygnałów podczas rozpoznawania antygenów
przez TCR (4).
CD3 wykazuje ekspresję w komórkach T w grasicy, szpiku kostnym, obwodowej tkance limfoidalnej i krwi (5, 6). Inne
prawidłowe komórki wykazujące znakowanie przeciwciał przeciwko CD3 to komórki Purkinjego w móŜdŜku (7).
Antygen CD3 jest wykrywalny najpierw we wczesnych tymocytach, a jego obecność najprawdopodobniej jest jednym
z pierwszych objawów przynaleŜności do linii komórkowej T (5). W niedojrzałych tymocytach ekspresja CD3 jest
wyłącznie cytoplazmatyczna, CD3 wykazujące odczyn błonowy występują po fazie dojrzewania komórek (5).
Antygen CD3 występuje w większości nowotworów z komórek T, podczas gdy brak ekspresji w nowotworach
złośliwych z komórek limfoidalnych innych niŜ komórek T (8). Zgodnie z odczynem syntezy antygenu
w prawidłowych tymocytach, cząsteczka CD3 jest najwcześniej wykrywalna w komórkach nowotworowych
w cytoplazmie (5). Cząsteczka CD3 uwaŜana jest za kluczowy marker do wstępnego rozpoznania przewlekłych
zaburzeń proliferacji limfocytów (9). Białaczkę z duŜymi ziarnistymi leukocytami z komórek typu T (T-LGL)
charakteryzuje immunofenotyp CD3+/CD57+/CD56 i reorganizacja klonalna genów receptora komórek T (10).
Zobacz dokument Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych firmy Dako lub następujące
części instrukcji do systemu detekcji IHC: 1) Zasady procedury, 2) Niezbędne materiały niedostarczone z zestawem,
3) Przechowywanie, 4) Przygotowanie preparatu, 5) Wykonanie odczynu, 6) Kontrola jakości, 7) Rozwiązywanie
problemów, 8) Interpretacja wyniku odczynu, 9) Ograniczenia metody.
Dostarczany
odczynnik
Gotowe do uŜycia poliklonalne przeciwciało królicze dostarczane w postaci płynnej w buforze zawierającym białko
stabilizujące i azydek sodu o stęŜeniu 0,015 mol/L.
Immunogen
Peptyd syntetyczny składający się z aminokwasów 156–168 z części cytoplazmatycznej ludzkiego łańcucha CD3ε
połączonego z tyreoglobuliną (1).
Swoistość
W testach Western blot przeciwciało wykrywa prąŜki odpowiadające oczekiwanej masie cząsteczkowej antygenów
CD3 (2). Przeciwciało rozpoznaje CD3ε w linii komórek T (Jurkat) oraz linii naturalnych komórek cytotoksycznych
(NK11), nie reaguje z lizatami przygotowanymi z kilku linii komórek B (Raji, Ramos i JY), liniami komórek szpikowych
(U937) ani liniami komórek raka okręŜnicy (Colo-205) (11).
W testach immunoprecypitacji z lizatów Nonidet P40 limfoblastów T powierzchniowo jodanowanych przeciwciało
wytrąca łańcuch γ (26 kDa), δ (21 kDa) i ε (19 kDa) cząsteczki CD3 w sposób zbliŜony do wytrącania za pomocą
dobrze scharakteryzowanych przeciwciał monoklonalnych mysich skierowanych przeciwko ludzkiej CD3, klon
UCHT1 (1).
W testach wykonywanych metodą ELISA przeciwciało znakuje peptyd CD3 w charakterze immunogenu.
Środki ostroŜności
1. Odczynniki przeznaczone dla przeszkolonych UŜytkowników.
2. Opisywany produkt zawiera silnie toksyczny związek – azydek sodu (NaN3), w czystej postaci. StęŜenie NaN3
występujące w produkcie nie jest klasyfikowane jako niebezpieczne. Jednak w wyniku reakcji NaN3 z ołowiem lub
miedzią, wchodzącymi w skład instalacji kanalizacyjnych, mogą powstawać silnie wybuchowe azydki metali. Przy
usuwaniu resztek odczynnika uŜywać duŜych ilości wody do przepłukiwania, aby uniknąć gromadzenia się
azydków w instalacji kanalizacyjnej.
3. Podobnie jak w przypadku kaŜdego produktu otrzymywanego z materiału biologicznego, naleŜy stosować
odpowiednie procedury postępowania.
4. NaleŜy stosować właściwe wyposaŜenie ochronne, zabezpieczające przed kontaktem odczynnika ze skórą bądź
oczami.
5. Niewykorzystany odczynnik naleŜy usuwać zgodnie ze stosownymi przepisami lokalnymi i krajowymi.
(116602-002)
Dako Denmark A/S
IS503/PL/MNI/2009.12.04 s. 1/3
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
Przechowywanie
Przechowywać w temperaturze 2–8°C. Nie stosowa ć po upływie terminu waŜności podanego na opakowaniu. JeŜeli
odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŜ podane na ulotce dołączanej do opakowania, UŜytkownik
powinien je zweryfikować. Nie ma jednoznacznych oznak świadczących o niestabilności tego produktu. Z tego
względu jednocześnie z badaniem próbek pochodzących od pacjentów, naleŜy wykonywać dodatnie i ujemne próby
kontrolne. W wypadku nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach
laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem z przeciwciałem, naleŜy się skontaktować z działem wsparcia
technicznego firmy Dako.
Przygotowanie
próbek i materiały
dodatkowe
wymagane, ale
niedostarczane
Przeciwciała mogą być wykorzystane do znakowania utrwalonych formaliną skrawków zatapianych w parafinie.
Preparaty tkankowe naleŜy pociąć na skrawki o wymiarach około 4 µm.
Wymagane jest poddanie cieplnemu odmaskowaniu antygenu (HIER) z uŜyciem Dako PT Link (nr kat.
PT100/PT101). Szczegółowe instrukcje zawiera Instrukcja uŜytkownika aparatu PT Link. Optymalne wyniki uzyskuje
się w wyniku wstępnej obróbki tkanek przy uŜyciu roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH
(50x) (nr kat. K8000/K8004).
Skrawki zatapiane w parafinie: Do obróbki wstępnej utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków
tkankowych, zalecana jest procedura 3 w 1 z uŜyciem odczynnika Dako PT Link. Postępować według procedury
wstępnej obróbki tkanek, zamieszczonej w ulotce roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x)
(nr kat. K8000/K8004). Uwaga: Po przeprowadzeniu barwienia skrawki muszą być odwodnione, oczyszczone
zakryte za pomocą środka do trwałego zatapiania.
Odparafinowane skrawki: Do obróbki wstępnej utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków
tkankowych, zalecane jest uŜycie odczynnika Dako PT Link i przeprowadzenie procedury opisane dla skrawków
parafinowych. Po zakończeniu barwienia szkiełka naleŜy zatopić w wodnym lub trwałym środku do zatapiania.
W trakcie przygotowywania oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny
wyschnąć. W celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych, zaleca się stosowanie
szkiełek FLEX IHC Microscope Slides (nr kat. K8020).
Wykonanie odczynu
oraz materiały
wymagane, ale
niedostarczane
Zalecanym systemem wizualizacji jest EnVision FLEX, High pH, (Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat.
K8010). W oprogramowaniu Autostainer/Autostainer Plus firmy Dako wstępnie zaprogramowano etapy odczynu
i czasy inkubacji, które są aktywne podczas korzystania z następujących protokołów:
Protokół wzorcowy: FLEXRTU2 (dawka odczynnika 200 µL) lub FLEXRTU3 (dawka odczynnika 300 µL)
Autoprogram: CD3 (bez barwienia kontrastowego) lub CD3H (z barwieniem kontrastowym)
Dla etapu „Auxiliary” naleŜy ustawić opcję „rinse buffer” w programach barwienia ≤10 szkiełek. W przypadku
programów barwienia >10 szkiełek etap Auxiliary naleŜy ustawić na „none”. Zapewnia to porównywalne czasy
płukania.
Wszystkie procedury inkubacji naleŜy równieŜ przeprowadzać w temperaturze pokojowej. Szczegółowe informacje
zawiera instrukcja obsługi odpowiedniego aparatu. Jeśli protokoły nie są dostępne w uŜywanym aparacie Dako
Autostainer, naleŜy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako.
Optymalne warunki mogą się zmieniać w zaleŜności od rodzaju materiału oraz sposobów jego przygotowania
i powinny być określone indywidualnie w kaŜdym laboratorium. Aby moŜliwe było wykonanie oceny przez patologów
z róŜnym nasileniem odczynu preparatów, naleŜy skontaktować się z działem obsługi/obsługą techniczną firmy Dako
w celu uzyskania informacji dotyczącej zmiany programowania protokołu. NaleŜy upewnić się, Ŝe działanie
zmodyfikowanego protokołu jest prawidłowe – w tym celu naleŜy ocenić, czy odczyn jest taki jak opisany w części
„Charakterystyka wydajnościowa”.
Zalecane jest barwienie kontrastowe hematoksyliną przy uŜyciu EnVision FLEX Hematoxylin, (Dako
Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. K8018). Zaleca się stosowanie niewodnego, trwałego środka do zatapiania.
Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów naleŜy wykonywać dodatnie i ujemne próby
kontrolne z uŜyciem identycznego protokołu. Dodatnia kontrola tkankowa powinna obejmować migdałki, natomiast
we wszystkich dodatnich preparatach komórki/struktury powinny wskazywać odczyn reakcji taki jak opisany dla tej
tkanki w części „Charakterystyka wydajnościowa”. Zalecana kontrola ujemna to FLEX Negative Control, Rabbit,
(Dako Autostainer/Autostainer Plus) (nr kat. IS600).
Interpretacja odczynu
Komórki znakowane przeciwciałem wykazują odczyn błonowy i/lub cytoplazmatyczny.
Charakterystyka
wydajnościowa
Tkanki prawidłowe: Przeciwciała dają odczyn w komórkach T w przypadku róŜnych rodzajów tkanek, w tym
komórkach migdałków i okręŜnicy. Komórki T w międzygrudkowych obszarach migdałków wykazują umiarkowany
lub silny odczyn, a komórki T w ośrodkach rozmnaŜania migdałków i nabłonku okręŜnicy wykazują słaby lub
umiarkowany odczyn.
Tkanki nieprawidłowe: Przeciwciało znakowało 73/96 przypadków nowotworów z komórek T, w tym 7/9 przypadków
limfoblastycznych, 25/35 przypadków wielopostaciowych, 5/5 przypadków immunoblastycznych, 5/5 przypadków
angioimmunoblastycznego uogólnionego powiększenia węzłów chłonnych, 2/2 przypadki chłoniaków strefy T,
19/19 przypadków ziarniniaka grzybiastego/zespołu Sezary’ego, 2/3 przypadki chłoniaków Lennerta,
4/13 przypadków chłoniaków anaplastycznych z duŜych komórek wykazujących ekspresję antygenu Ki-1,
3/4 przypadki chłoniaka papulosis, 1/1 przypadek chłoniaka związanego z trzewiami (1). Przeciwciało znakowało
149/149 przypadków ostrych białaczek limfoblastycznych z prekursorowych komórek T (ALL)/chłoniaków.
W 131/149 przypadków odczyn dodatni wykazywało 100% komórek; w 14 przypadkach odczyn dodatni wykazywało
50–90% komórek; a w 4 przypadkach odczyn dodatni wykazywało mniej niŜ 50% komórek. Nie stwierdzono odczynu
w 68/68 przypadkach ostrych białaczek limfoblastycznych z prekursorowymi limfocytami B (ALL), oprócz
reaktywnych naciekowych komórek T (2).
(116602-002)
Dako Denmark A/S
IS503/PL/MNI/2009.12.04 s. 2/3
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17
Piśmiennictwo
1.
Mason DY, Cordell J, Brown M, Pallesen G, Ralfkiaer E, Rothbard J, et al. Detection of cells in paraffin wax
embedded tissue, using antibodies against a peptide sequence from the CD3 antigen. J Clin Pathol 1989;
42:1194–1200.
2.
Pilozzi E, Pulford K, Jones M, Müller-Hermelink H-K, Falini B, Ralfkiaer E, et al. Co-expression of CD79a
(JCB117) and CD3 by lymphoblastic lymphoma. J Pathol 1988; 186:140–3.
3.
CD guide In: Kishimoto T, Kikutani H, von dem Borne AEG, Goyert SM, Mason DY, Miyasaka M, et al., editors.
Leucocyte typing VI. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 6th International Workshop and
Conference; 1996 Nov 10–14; Kobe, Japan. New York, London: Garland Publishing Inc.; 1997. p. 1111.
4.
Jacobs H. Pre-TCR/CD3 and TCR/CD3 complexes: decamers with differential signalling properties? Immunol
Today 1997; 18:565–9.
5.
Campana D, Thompson JS, Amlot P, Brown S, Janossy G. The cytoplasmic expression of CD3 antigens in
normal and malignant cells of the T lymphoid lineage. J Immunol 1987; 138:648–55.
6.
Tunnacliffe HA, Olsson C, Traunecker A, Krissansen GW, Karjalainen K, De la Hera A. The majority of CD3
epitopes are conferred by the epsilon chain. In: Knapp W, Dörken B, Gilks WR, Rieber EP, Schmidt RE, Stein
H, et al., editors. Leukocyte typing IV. White cell differentiation antigens. Proceedings of the 4th International
Workshop and Conference; 1989 Feb 21–25; Vienna, Austria. Oxford, New York, Tokyo: Oxford University
Press; 1989. p. 295–6.
7.
Garson JA, Beverley PC, Coakham HB, Harper EI. Monoclonal antibodies against human T lymphocytes label
Purkinje neurones of many species. Nature 1982; 298:375–7.
8.
Erber WN, Mynheer LC, Mason DY. APAAP labeling of blood and bone-marrow samples for phenotyping
leukaemia. Lancet 1986; i:761-5.
9.
Braylan RC, Orfao A, Borowitz MJ, Davis BH. Optimal number of reagents required to evaluate hematolymphoid
neoplasias: results of an international consensus meeting. Cytometry 2001; 46:23–7.
10. Kingreen D, Siegert W. Chronic lymphatic leukemias of T and NK cell type. Leukemia 1997; 11 Suppl 2:S46–9.
11. Lanier LL, Chang C, Spitz H, Pillips JH. Expression of cytoplasmic CD3 proteins in activated human adult
natural killer (NK) cells and CD3γ, δ, ε complexes in fetal NK cells. Implications for the relationship of NK and T
lymphocytes. J Immunol 1992; 149:1876–80.
Objaśnienie symboli
Numer katalogowy
Temperatura przechowywania
ZuŜyć przed
Wyrób medyczny do
diagnostyki in vitro
Zawartość wystarcza na <n>
testów
Producent
Sprawdzić w instrukcji
stosowania
Numer serii
(116602-002)
Dako Denmark A/S
IS503/PL/MNI/2009.12.04 s. 3/3
| Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17