Autoreferat - Wydział Technologii Żywności

Transkrypt

Uniwersytet Rolniczy im. H. Kołłątaja w Krakowie
Wydział Technologii Żywności
Katedra Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej
Aleksandra Duda-Chodak
Załącznik II
Autoreferat
Załącznik II. Autoreferat
1.
Imię i Nazwisko: Aleksandra Duda-Chodak
Miejsce pracy: Uniwersytet Rolniczy w Krakowie,
Wydział Technologii Żywności,
Katedra Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Technicznej,
ul. Balicka 122, 30-149 Kraków
2.
Posiadane dyplomy, stopnie naukowe/ artystyczne - z podaniem nazwy, miejsca i
roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej.
1992-1997
studia magisterskie, kierunek Biologia, Wydział Biologii i Nauk o Ziemi,
Uniwersytet Jagielloński, Kraków,
czerwiec 1997
dyplom
magistra
biologii,
Wydział
Biologii
i
Nauk
o
Ziemi,
Uniwersytet Jagielloński, Kraków. Praca magisterska pt. Fenotyp leukocytów
w przebiegu choroby oparzeniowej dzieci, promotor prof. dr hab. Juliusz
Pryjma,
1997-1998
studia doktoranckie, Wydział Biologii i Nauk o Ziemi, Uniwersytet
Jagielloński, Kraków,
1998-2002
studia doktoranckie, Wydział Lekarski, Collegium Medicum, Uniwersytet
Jagielloński, Kraków,
19.04.2002
dyplom doktora nauk biologicznych, Wydział Lekarski, Collegium Medicum
UJ, Kraków. Rozprawa doktorska pt. Ekspresja cytokin i rola reaktywnych form
tlenu w uszkodzeniu wywołanym ischemią-reperfuzją w śluzówce żołądka
szczura,
promotor
pracy:
prof.
dr
hab.
med.
Stanisław
J. Konturek.
3.
Informacje
o
dotychczasowym
zatrudnieniu
w
jednostkach
naukowych/
artystycznych.
1998 - 2002
starszy referent inżynieryjno-techniczny, Katedra Fizjologii, Wydział
Lekarski CMUJ.
2003 - 2006
asystent
naukowo-dydaktyczny,
Katedra
Technologii
Fermentacji
i Mikrobiologii Technicznej, Wydział Technologii Żywności, Akademia
Rolnicza im. Hugona Kołłątaja w Krakowie.
2006 - obecnie
adiunkt
naukowo-dydaktyczny,
Katedra
Technologii
Fermentacji
i Mikrobiologii Technicznej, Wydział Technologii Żywności, Akademia
Rolnicza (od 2008 roku Uniwersytet Rolniczy) im. Hugona Kołłątaja w
Krakowie.
1
4.
Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o
stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki
(jednolity tekst Dz. U. grudzień 2014, poz. 1852)
Osiągnięciem naukowym wynikającym z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 roku o
stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki i stanowiącym
podstawę do ubiegania się o stopień naukowy doktora habilitowanego jest monografia pt.
Interakcje związków przeciwutleniających występujących w roślinach oraz suplementach
diety z bakteriami reprezentującymi mikrobiotę jelitową człowieka, której jestem autorem.
Praca została opublikowana w 2015 roku w Zeszytach Naukowych Uniwersytetu Rolniczego im.
Hugona Kołłątaja w Krakowie, w serii Rozprawy, numer 525, zeszyt 402, Wydawnictwo
Uniwersytetu Rolniczego w Krakowie.
Recenzenci rozprawy :
prof. dr hab. Zbigniew Czarnecki, Uniwersytet Przyrodniczy w Poznaniu
dr hab. inż. Agnieszka Filipiak-Florkiewicz, Uniwersytet Rolniczy w Krakowie
Omówienie celu naukowego w/w rozprawy, jak również osiągniętych wyników wraz z
omówieniem ich ewentualnego wykorzystania
Wprowadzenie i cel naukowy
Od wielu lat wiadomo o istotnej roli związków przeciwutleniających w zapobieganiu lub
wspomaganiu leczenia różnych chorób, powszechne są także badania wskazujące na ich zdolność
do hamowania wzrostu mikroorganizmów patogennych. Doniesienia te sprawiają, że coraz częściej
sięgamy po żywność wzbogacaną lub po suplementy diety zawierające różne przeciwutleniacze, w
tym polifenole. Jak dotąd jednak nie prowadzono zbyt wielu badań oceniających jak składniki
przeciwutleniające, obecne w żywności czy suplementach w znacznych stężeniach, wpływają na
skład jakościowy i ilościowy prawidłowej mikrobioty jelitowej (ang. intestinal microbiota, IM).
Wykazano natomiast, że zaburzenia w funkcjonowaniu IM uczestniczą w patogenezie licznych
chorób. Od dawna przyjmuje się, że mikrobiota jelitowa pełni istotną rolę w prawidłowym
funkcjonowaniu organizmu, między innymi jest wyposażona w olbrzymi zestaw enzymów
odpowiedzialnych za różnorodne przemiany składników pokarmowych, które docierają do jelita.
Z powodu ogromnej różnorodności gatunków tworzących IM u poszczególnych osobników, profil
powstających metabolitów oraz ich końcowy wpływ na organizm są bardzo zmienne w populacji
ludzkiej. Często zdarza się, że jedynie produkt bakteryjnego metabolizmu danego składnika może
2
ulec wchłonięciu w jelicie i wpłynąć korzystnie na zdrowie człowieka. Brak odpowiednich
gatunków bakterii w mikroflorze osobnika oznacza, że dany związek, mimo spożycia, nie będzie
mógł wywrzeć oczekiwanego efektu. Z drugiej strony, zdarza się też, że – na skutek metabolizmu
bakteryjnego – z obojętnego składnika obecnego w żywności powstają pochodne negatywnie
oddziałujące na zdrowie konsumenta.
Dlatego też, głównym celem prezentowanej monografii było poznanie interakcji pomiędzy
przeciwutleniającymi składnikami roślin i suplementów diety a bakteriami, będącymi
przedstawicielami mikroflory jelita ludzkiego. W pracy sformułowano 3 cele szczegółowe:
(1) ocena potencjału antyoksydacyjnego oraz składu polifenolowego wybranych surowców
roślinnych i suplementów diety o deklarowanym prozdrowotnym działaniu na organizm
człowieka; (2) określenie wpływu związków polifenolowych zawartych w ekstraktach z badanych
surowców i suplementach diety, a także w postaci czystych związków polifenolowych, na wybrane
gatunki mikrobioty jelitowej; (3) zbadanie wpływu poszczególnych gatunków bakterii jelitowych
na potencjał antyoksydacyjny i stężenie wybranych związków przeciwutleniających występujących
w badanych surowcach.
Sformułowano następujące hipotezy badawcze:
1)
naturalne
składniki
przeciwutleniające
i
związki
polifenolowe
zawarte
w surowcach roślinnych i suplementach diety nie wywierają hamującego wpływu na
bakterie będące przedstawicielami fizjologicznej mikrobioty jelitowej,
2)
gatunki
bakterii,
stanowiące
fizjologiczną
mikrobiotę
jelita
ludzkiego,
na skutek swojego metabolizmu zwiększają potencjał antyoksydacyjny składników
polifenolowych obecnych w surowcach roślinnych i suplementach diety.
Przebieg doświadczeń i metodyka badań
Formułując hipotezy, przyjęto założenie wyjściowe, że badane surowce roślinne oraz suplementy
diety zawierają składniki przeciwutleniające, w tym polifenole, w znaczących stężeniach.
Aby zweryfikować to założenie oraz poszczególne hipotezy, na pierwszym etapie badań określono
wyjściowy potencjał antyoksydacyjny [Duda-Chodak i in. 2011] oraz skład polifenolowy [Duda-Chodak
i in. 2010, 2011] surowców roślinnych i komercyjnie dostępnych suplementów diety. Jako źródło
polifenoli i przeciwutleniaczy wybrano surowce o znanych właściwościach prozdrowotnych i/lub
długoletniej tradycji stosowania w medycynie naturalnej różnych krajów: świeże owoce maliny (M),
czarnego bzu (BEZ), żurawiny (Z), borówki brusznicy (B), pigwowca japońskiego (P) i derenia (D),
suszone owoce goji (G) i cytryńca chińskiego (CCH), czerwoną cebulę (CC), czosnek niedźwiedzi (CN),
pokrzywę (PO), zieloną herbatę (GT) i nasiona soi (S), a także suplementy diety o deklarowanym
3
prozdrowotnym działaniu na organizm człowieka: spirulinę (SP, wysuszona biomasa sinic Spirulina
platensis), Citrosept (CIT, ekstrakt z miąższu i pestek grejpfruta) i sok z noni (NO). Wszystkie
wymienione
surowce
i
suplementy
zawierają
antyoksydanty,
w
tym
różne
polifenole,
i są wykorzystywane (często równocześnie) do leczenia rozmaitych schorzeń jako preparaty dostępne bez
recepty, a zatem poza wszelką kontrolą. Ponieważ ich dawkowanie, sposób przyrządzania i stosowania
zależą od leczonego schorzenia oraz od tradycji w danym regionie świata, postanowiono – w celu
ujednolicenia i uproszczenia porównań uzyskanych wyników – przygotować z wszystkich surowców
jednakowe 10% ekstrakty etanolowe (nie dotyczyło to gotowych suplementów w płynie, tj. soku z
noni i Citroseptu).
W doświadczeniach zostały także zastosowane, w postaci pojedynczych związków,
najczęściej spożywane z dietą polifenole: (+)-katechina (CAT), kwercetyna (Q), rutyna (RUT),
naringenina (N), naringina (NR), hesperydyna (HR), hesperetyna (H), kemferol (KMP) i florydzyna
(PHL), będące przedstawicielami różnych klas flawonoidów, oraz rezweratrol (RS) – reprezentant
stilbenów. Polifenole stosowano jako roztwory w DMSO o stężeniu 25 mg/ml, z wyjątkiem
kwercetyny i kemferolu, dla których stężenie wynosiło 5 mg/ml.
Drugi etap prac miał na celu określenie wpływu badanych surowców oraz poszczególnych
związków polifenolowych na wybrane gatunki mikrobioty jelitowej. Do doświadczeń wykorzystano
czyste kultury siedmiu różnych gatunków, będących przedstawicielami najważniejszych rodzajów
bakterii tworzących fizjologiczną mikrobiotę jelitową człowieka: Escherichia coli (DSM 1116, EC),
Bacteroides galacturonicus (DSM 3978, BAC), Eubacterium cylindroides (DSM 3983, EUB),
Bifidobacterium catenulatum (DSM 16992, BF), Enterococcus caccae (DSM 19114, EN), Lactobacillus
sp. (DSM 20059, LCB) oraz Ruminococcus gauvreauii (DSM 19829, RUMI). Wszystkie badane
szczepy zostały zakupione w niemieckiej kolekcji czystych kultur mikroorganizmów i linii
komórkowych DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)
i zgodnie z kartami charakterystyk zostały one wyizolowane z jelita ludzkiego.
Wpływ ekstraktów i suplementów diety oraz pojedynczych związków polifenolowych na
poszczególne bakterie oceniano na podstawie zmian liczebności ich komórek po 24-godzinnej
inkubacji (37°C) z ekstraktami, suplementami lub polifenolami dodanymi do medium w różnym
stężeniu. Stężenie końcowe ekstraktów i suplementów wynosiło 1,0, 2,5 i 5,0%, zaś stężenie
polifenoli wynosiło 20, 100 oraz 250 µg/ml (lub 4, 20 oraz 50 µg/ml dla kwercetyny i kemferolu).
Liczebność komórek określano na podstawie pomiarów zmętnienia zawiesiny przy użyciu
densytometru wyskalowanego w jednostkach McFarlanda. W przypadku wykazania działania
hamującego rozwój bakterii wyznaczano wartość minimalnego stężenia hamującego (MIC) dla
danego składnika.
Ostatni etap prac dotyczył oceny wpływu bakterii jelitowych na związki polifenolowe. Aby
ocenić, jak przedstawiciele mikrobioty jelita ludzkiego wpływają na składniki przeciwutleniające
4
obecne w diecie, oznaczono zmiany potencjału antyoksydacyjnego (AOX) w podłożach z dodatkiem
polifenoli, ekstraktów roślinnych i suplementów diety po inkubacji z poszczególnymi gatunkami
bakterii jelitowych. Dla ułatwienia porównań między poszczególnymi drobnoustrojami lub
badanymi substancjami wprowadzono pojęcie współczynnika interakcji (WI), zdefiniowanego jako
stosunek AOX medium z bakteriami do AOX takiego samego medium (tzn. ta sama pożywka, takie
samo stężenie związku polifenolowego/ekstraktu, te same warunki inkubacji), ale bez dodatku
bakterii. WI jest równy 1 jeśli bakterie w żaden sposób nie wpływają na zdolność zmiatania rodnika
ABTS przez obecne w tej pożywce związki. Wartości WI>1 oznaczają, że pod wpływem dodanego
gatunku bakterii doszło do takich zmian w składzie pożywki, które zwiększyły zdolność wygaszania
rodnika, a wartość WI<1 – zmiany pod wpływem bakterii zmniejszyły potencjał antyoksydacyjny.
Aby ustalić, czy wykazane zmiany potencjału antyoksydacyjnego są zależne od przemian związków
polifenolowych obecnych w badanych próbach pod wpływem bakterii jelitowych, zbadano zmiany
w stężeniu najważniejszych związków polifenolowych pod wpływem bakterii (metodą HPLC)
[Duda-Chodak i in. 2010].
Wyniki i dyskusja
Spośród badanych związków polifenolowych najwyższy potencjał antyoksydacyjny
wykazały kemferol, naringenina i rezweratrol (wszystkie powyżej 4000 mmol równoważników
troloksu
(TE)/100
g
substancji).
Słabszymi
zmiataczami
rodnika
ABTS
okazały
się
kwercetyna i (+)-katechina. Najniższy potencjał przeciwrodnikowy miały glikozydy – hesperydyna
(578,0±3,5 mmol TE/100 g) i naringina (881,0±12,1 mmol TE/100 g). Porządkując polifenole
analizowane w tej pracy w kolejności rosnącego potencjału przeciwrodnikowego (wyrażonego w
mmol TE/mol), uzyskano szereg: HR < H < NR < RS ≤ CAT < PHL < N ≤ Q ≤ KMP ≤ RUT.
W prezentowanej pracy przedyskutowano wpływ budowy chemicznej na zdolność wygaszania
różnych rodników. Stwierdzono, że kluczowe znaczenie dla zdolności zmiatania rodnika ABTS
przez dany związek ma równoczesna obecność grupy –OH w pozycji C4’, C5 i C7 oraz grupy
ketonowej przy C4.
Wśród analizowanych surowców na szczególną uwagę zasługuje Citrosept, czyli gotowy,
komercyjny ekstrakt z miąższu i pestek grejpfruta. Bardzo wysoka aktywność antyoksydacyjna
(21269,7±3601,1 mg troloksu/100 ml) tego suplementu diety korespondowała z dużą zawartością
polifenoli ogółem (2577,2±14,7 mg w przeliczeniu na katechinę/100 ml). Analiza profilu polifenoli
w Citrosepcie wykazała, że najważniejszymi składnikami są naringina (1018,0±131,1 mg/l) oraz jej
aglikon – naringenina (19,8±12,3), a zatem składniki charakterystyczne dla grejpfrutów. Na uwagę
zasługuje także duże stężenie hesperydyny (463,0±96,9 mg/l) i obecność jej aglikonu –
hesperetyny (19,9±1,07). W Citrosepcie wykryto również kwercetynę oraz kwasy fenolowe
(głównie p-kumarowy, chlorogenowy i galusowy), choć obecne w znacznie mniejszym stężeniu.
5
Na tle badanych surowców wyróżniał się także ekstrakt z zielonej herbaty, o bardzo wysokiej
aktywności antyoksydacyjnej (10998,3±282,3 mg troloksu/100 ml) i zawartości polifenoli ogółem
(9549,0±46,0 mg katechiny/100 g liści). Analiza HPLC wykazała, że stężenie (-)-epigalokatechiny w
herbacie użytej do badań było duże i wynosiło 5022,3 mg w przeliczeniu na 100 g liści,
(-)-epikatechiny – 1116,5 mg/100 g, a galusanu (-)-epigalokatechiny – 2876,1 mg/100 g (w sumie
wykryto 9064,3 mg flawanoli/100 g herbaty). W analizowanej zielonej herbacie wykryto ponadto
obecność takich związków polifenolowych, jak kwas galusowy, apigenina, kemferol, rutyna,
glukozyd kwercetyny i kwercetyna.
Jako stosunkowo bogate źródło przeciwutleniaczy na uwagę zasługują także sok z noni
(424,5±39,5 mg troloksu/100 ml) oraz ekstrakty z derenia, pigwowca, czarnego bzu i czosnku
niedźwiedziego
(259–283
mg
troloksu/100
ml).
Z
kolei
bardzo
niską
aktywnością
przeciwrodnikową charakteryzowały się ekstrakty ze spiruliny (24,1±1,2), czerwonej cebuli
(43,2±2,9), cytryńca chińskiego (54,0±4,1) i soi (66,0±9,0). Bardzo dużą zawartość polifenoli,
oprócz Citroseptu i ekstraktu z zielonej herbaty, wykazano dla ekstraktu z czarnego bzu
(883,1±119 mg katechiny/100 g wyjściowego surowca). W owocach tych dominowały flawonoidy,
w szczególności rutyna (89,32±30,14 mg/100 g ś.m.), procyjanidyna B1 (ok. 26,6), florydzyna (ok.
13,5) i izokwercetyna (ok. 10,3). Wykryto także kwasy fenolowe, przede wszystkim kwas galusowy
(ok. 11 mg/100 g) oraz kwasy p-kumarowy, chlorogenowy i elagowy. Dużą zawartością polifenoli
cechowały się także ekstrakty z jagód goji i ziela pokrzywy (odpowiednio 810,6 i 618,9 mg
katechiny/100 g wyjściowego surowca). Najmniej polifenoli ogółem oznaczono w ekstrakcie z
czerwonej cebuli (90,5 mg katechiny/100 g), który miał także jedną z najniższych spośród
badanych surowców aktywność antyoksydacyjną.
Wyniki prezentowanej pracy wykazały zaskakująco silny, dawkozależny wpływ etanolu na
niektóre z badanych gatunków bakterii. W przypadku większości badanych bakterii niskie stężenia
(0,1–1,0%) lekko stymulowały wzrost drobnoustrojów, choć tylko w przypadku E. cylindroides
(końcowe stężenie etanolu 0,1–1,0%), Lactobacillus sp. (stężenie 1%) oraz B. galacturonicus
(0,4% i 1%) efekt był istotny statystycznie. Przy wyższych stężeniach dodatek etanolu do medium
powodował zahamowanie wzrostu wszystkich badanych bakterii, choć w różnym stopniu.
Najmocniejszy, o zupełnie niespodziewanej sile, efekt inhibitorowy zanotowano dla B. catenulatum
– już przy stężeniu 2% EtOH liczebność populacji malała do niespełna 30% wartości kontrolnej, zaś
obecność w medium 3% i więcej etanolu powodowała zmniejszenie liczebności populacji tej
bakterii o co najmniej 95%. Wzrost E. cylindroides w obecności 3% etanolu był zahamowany o
nieco ponad 30%, zaś przy stężeniu 5% EtOH – całkowicie. Z kolei EC i BAC przeżywały w stężeniu
5% EtOH, jednak liczebność ich populacji była niższa prawie 10-krotnie w porównaniu z kontrolą.
Wykazano, że kwercetyna i kemferol już w stężeniu 20 µg/ml działały hamująco na
wszystkie badane gatunki bakterii, przy czym w przypadku BF i EN siła hamowania była
6
porównywalna do efektu działania kontrolnego antybiotyku – chloramfenikolu. Naringenina
działała bakteriobójczo wobec EN, RUMI, LCB, BAC i BF, a bakteriostatycznie na pozostałe bakterie,
jednak dopiero w stężeniu powyżej 100 µg/ml. Hesperetyna w najwyższym stężeniu ograniczała
wzrost wszystkich badanych gatunków z wyjątkiem LCB, przy czym przeważnie było to
zmniejszenie liczebności populacji o kilkanaście procent w stosunku do kontroli pozytywnej, czyli
liczebności bakterii w medium bez polifenolu. Bakteriostatyczny efekt hesperetyny był wyraźnie
widoczny w przypadku Ruminococcus i Enterococcus, a liczebność populacji tych bakterii po
zastosowaniu 250 µg hesperetyny/ml wynosiła odpowiednio 27% i 38% wartości kontrolnej.
E. cylindroides to jedyna bakteria, spośród badanych, niewrażliwa na rezweratrol. Wobec
pozostałych bakterii związek ten działał bakteriobójczo (EN,
RUMI,
LCB, BAC)
lub
bakteriostatycznie (EC, BF) i to już w stężeniu 100 µg/ml. Ani (+)-katechina, ani rutyna nie
wpływały znacząco na badane bakterie, z wyjątkiem E. caccae, którego liczebność była nieznacznie
ograniczona w obecności tych związków. Z kolei florydzyna powodowała lekką stymulację wzrostu
LCB, BF, EC i EUB, a efekt inhibitorowy wykazywała jedynie wobec EN. Wyznaczone wartości MIC
dla poszczególnych polifenoli w odniesieniu do konkretnych gatunków wahały się od 20 do ponad
250 µg/ml i były z reguły wyższe od MIC dla chloramfenikolu.
Porównując budowę chemiczną badanych polifenoli, zaobserwowano kilka ciekawych
prawidłowości. Stwierdzono, że dla właściwości przeciwbakteryjnych badanych związków
kluczowa jest jednoczesna obecność niepodstawionych grup –OH w pozycji C5, C7 i C4’ oraz grupy
ketonowej przy C4. Nie stwierdzono, by obecność grupy –OH przy C3 oraz wiązania podwójnego
C2=C3 znacząco wpływała na aktywność antybakteryjną flawonoidów. Potwierdzono natomiast, że
aglikony są silniejszymi inhibitorami niż ich glikozydy, tracące potencjał antybakteryjny
prawdopodobnie na skutek zawady sterycznej, jaka występuje po przyłączeniu cząsteczek cukrów.
Tę wzmożoną aktywność aglikonów należy mieć na uwadze w przypadku przyjmowania związków
polifenolowych w postaci preparatów farmaceutycznych, gdzie związki te występują w wysokich
stężeniach i głównie w postaci aglikonów, podczas gdy w surowcach roślinnych dominują formy
glikozydowe. Dokładne mechanizmy działania polifenoli na poszczególne bakterie nie zostały jak
dotąd rozpoznane. Bakterie zawierają metaloenzymy, a ponieważ flawonoidy silnie wiążą jony
metali, ich działanie może doprowadzić do różnych zaburzeń metabolicznych (zahamowania
enzymów, upośledzenia funkcji kanałów jonowych) lub niedoboru żelaza w przewodzie
pokarmowym, co wpłynie na wrażliwsze populacje bakteryjne i zmieni skład mikrobioty jelitowej.
Wśród innych proponowanych mechanizmów aktywności bakteriobójczej flawonoidów należy
wymienić zahamowanie aktywności enzymów i generowanie reaktywnych form tlenu przez EGCG
czy zahamowanie aktywności gyrazy DNA przez kwercetynę [Cushnie i Lamb 2005, Boots i in.
2008]. W związku z tym nadmierna ilość polifenoli, jakie dotrą do jelita, może spowodować
zahamowanie wzrostu i zmniejszenie liczebności dobroczynnej, pożytecznej części mikrobioty,
7
która odpowiada za biokonwersję składników diety oraz zwiększenie ich biodostępności
i bioprzyswajalności. Z tego powodu suplementacja diety preparatami zawierającymi wysokie
stężenia pojedynczych składników, zwykle w formie aglikonów, może – zamiast pomóc – wywołać
efekt niekorzystny dla zdrowia. Szczególnie silny hamujący wpływ na pożyteczne bakterie z
rodzaju Lactobacillus wykazano dla rezweratrolu i naringeniny, a na bakterie Bifidobacterium – dla
kwercetyny. O negatywnym wpływie polifenoli należy także pamiętać, przyjmując leki, gdyż wiele
polifenoli wchodzi w interakcję z enzymami odpowiadającymi za metabolizm ksenobiotyków,
głównie z cytochromem P450 (CYP3A4), powodując zmniejszenie lub zwiększenie siły
oddziaływania leku na organizm, co w każdym przypadku może być niebezpieczne [Ho i in. 2001].
Wpływ ekstraktów był znacznie mniej spektakularny niż oczyszczonych polifenoli, ze
względu na złożoną matrycę żywności oraz mniejsze stężenia związków w medium. Poszczególne
rośliny i preparaty wywierały różnorodny wpływ – od stymulującego, przez neutralny,
bakteriostatyczny, aż po bakteriobójczy – w zależności od gatunku bakterii oraz zastosowanego
stężenia. Najmniej wrażliwy na działanie badanych ekstraktów okazał się R. gauvreauii (RUMI).
Jedynie po zastosowaniu Citroseptu oraz ekstraktu z cytryńca chińskiego uzyskano zahamowanie
wzrostu tej bakterii. W przypadku RUMI zwiększenie liczebności można uzyskać poprzez dodatek
bioaktywnych składników zawartych w spirulinie, czerwonej cebuli, jagodach goji, czarnym bzie
oraz soku z noni. Z kolei wobec E. caccae wszystkie badane ekstrakty, z wyjątkiem spiruliny w
stężeniu 1–2,5%, wykazywały działanie bakteriostatyczne. Dość wrażliwym gatunkiem był także
E. cylindroides, którego wzrost hamowała większość badanych ekstraktów, z wyjątkiem wyciągów
z derenia i pokrzywy w stężeniu 5% (stymulacja wzrostu).
Uzyskane wyniki mają wartość aplikacyjną, gdyż wiele firm farmaceutycznych czyni
starania, by w niedalekiej przyszłości wprowadzić na rynek preparaty zaprojektowane tak, aby
docelowo zmniejszyć lub zwiększyć liczebność konkretnej grupy drobnoustrojów wchodzących w
skład naszej mikrobioty. Dzięki temu można będzie skuteczniej prowadzić profilaktykę otyłości,
cukrzycy i niektórych nowotworów czy leczyć choroby metaboliczne lub przewlekłe w obrębie
przewodu pokarmowego (nietolerancje pokarmowe, IBD, chorobę Crohna). Zgodnie z wynikami
uzyskanymi w przeprowadzonych badaniach, w celu wzbogacenia mikrobioty jelitowej w populację
B. galacturonicus można wykorzystać bioaktywne składniki pokrzywy, maliny, żurawiny, derenia,
czerwonej cebuli oraz jagód goji. Liczebność B. catenulatum natomiast można zwiększyć poprzez
suplementację diety sokiem z noni, zaś do stymulacji wzrostu Lactobacillus sp. można wykorzystać
składniki bioaktywne z pigwowca, czosnku niedźwiedziego, pokrzywy, brusznicy, soi, zielonej
herbaty, Citroseptu, jagód goji, czarnego bzu lub noni. Surowce te mogą być zatem z powodzeniem
stosowane do jogurtów jako dodatki smakowe, a zarazem wzbogacające te artykuły w naturalne
związki przeciwutleniające. Do produktów zawierających żywe kultury bakterii z rodzaju
8
Lactobacillus nie zaleca się natomiast dodawania ekstraktów z owoców żurawiny, cytryńca
chińskiego i z cebuli ani też tych materiałów roślinnych w postaci liofilizowanej czy suszonej.
Cytryniec chiński (CCH) jako jedyny spośród ocenianych surowców hamował wzrost
wszystkich badanych drobnoustrojów jelitowych, a wyznaczona wartość MIC była równa lub
większa od 5%, co stwarza możliwość jego zastosowania do eliminacji niepożądanych gatunków
mikrobioty jelitowej, przed suplementacją gatunkami pożądanymi. Drugim skutecznym
inhibitorem okazał się Citrosept. Co prawda, suplement ten nie wykazywał istotnego wpływu na
wzrost B. catenulatum, a w sposób dawkozależny stymulował wzrost Lactobacillus sp., jednak
wobec pozostałych badanych gatunków działał bakteriostatycznie (EN, RUMI, EC, BAC) lub
bakteriobójczo (EUB), powodując ograniczenie liczebności bakterii (do poziomu stanowiącego od
2% kontroli w przypadku EUB do 85% kontroli dla RUMI), a wartość MIC wyniosła ≥ 5%. Silne
działanie inhibitorowe wykazano także dla ekstraktu z owoców pigwowca japońskiego wobec EUB
i BAC, z wartościami MIC odpowiednio 2,5 i 5%. Brak negatywnego wpływu na LCB oraz
bakteriostatyczny wpływ na EC i EN czyni ten surowiec bardzo interesującym dla przetwórstwa i
przemysłu farmaceutycznego.
Analiza uzyskanych wyników potencjału antyoksydacyjnego podłoży wzbogacanych
związkami polifenolowymi lub ekstraktami roślinnymi po inkubacji z/bez bakterii pozwoliła na
rozpoznanie kilku typów przemian, które dokładnie przedyskutowano w rozprawie. Wykazano
między innymi, że w prostym podłożu, o niskim bazowym AOX (jak bulion odżywczy dla
Escherichia coli) w zależności od rodzaju dodanego czystego polifenolu i jego stężenia, następował
wzrost potencjału, a zanotowane wartości końcowe AOX kształtowały się w zakresie od ok. 108%
do nieco ponad 553% wartości wyjściowej. W przypadku wzbogacania ekstraktami lub
preparatami zwiększenie AOX było znacznie wyższe, uzyskano wartości od ok. 117% do prawie
1431% wyjściowego potencjału antyoksydacyjnego oznaczonego dla tego medium. W chwili, gdy
do doświadczeń stosowano bardziej złożone media, o wyższym bazowym AOX, różnice wywołane
dodatkiem polifenolu lub ekstraktu nie były już tak spektakularne. Nadal, co prawda, następował
wzrost potencjału o kilkanaście do kilkudziesięciu procent, ale wartości końcowe nie przekraczały
więcej niż 2,5- i 3,5-krotnie (odpowiednio dla pojedynczych polifenoli i ekstraktów) wartości
bazowej. W wielu przypadkach zaobserwowano, że przy niskich stężeniach dodatków polifenoli
(w postaci roztworu czystego związku lub ekstraktu/preparatu) potencjał antyoksydacyjny
medium wzbogacanego był niższy niż kontrolnego. Oznacza to, że doszło do reakcji pomiędzy
polifenolami a składnikami medium, co doprowadziło do zablokowania grup uczestniczących w
zmiataniu rodnika ABTS. Tego typu zmiany obserwowano między innymi w przypadku
doświadczeń z E. caccae, B. catenulatum oraz E. cylindroides. W miarę wzrostu stężenia polifenolu
lub ekstraktu, potencjał AOX zwykle się zwiększał, co odpowiada reakcjom wiązania polifenoli z
proteinami opisanym przez Le Bourvellec i Renard [2012]. Reakcje te mogą być odwracalne lub
9
nieodwracalne. Do połączeń nieodwracalnych należą m.in. wiązania kowalencyjne między
polifenolem a makrocząsteczką. Połączenia odwracalne to przede wszystkim niekowalencyjne
oddziaływania, międzycząsteczkowe, które – mimo swojej słabej siły – mogą prowadzić do
wytrącania białek przez polifenole i zaburzenia aktywności enzymów (co z kolei może prowadzić
do zahamowania wzrostu bakterii). Skutki interakcji polifenol-makrocząsteczka zależą od proporcji
między tymi składnikami. Przy niskiej zawartości polifenoli w stosunku do cząsteczek białek
powstają kompleksy rozpuszczalne. Wraz ze wzrostem zawartości polifenolu zmniejsza się
rozpuszczalność kompleksów i początkowo zwiększa się ich rozmiar i złożoność, by ostatecznie z
roztworu wytrąciły się białka niejako opłaszczone polifenolami [Le Bourvellec i Renard 2012].
Wydaje się, że właśnie początkowe etapy tych interakcji miały miejsce w doświadczeniach
wykonywanych w tej pracy. Kolejny typ zmian to obniżenie się potencjału antyoksydacyjnego
podłoża na skutek zbyt wysokiego stężenia dodanych związków. Obserwowano, że po
początkowym wzroście potencjału AOX następowało – mimo dalszego zwiększania dawki związku
– zatrzymanie wzrostu lub wręcz zmniejszenie aktywności przeciwrodnikowe medium.
Prawdopodobnie w tej sytuacji, oprócz interakcji ze składnikami podłoża (matrycą) dochodzi
również do polimeryzacji flawonoidów, ich autoutleniania lub reakcji enzymatycznych
powodujących degradację polifenoli (np. pod wpływem obecnej w surowcach roślinnych
polifenolooksydazy). Takie sytuacje zaobserwowano dla kilku różnych podłoży wzbogacanych
hesperydyną i hesperetyną oraz po dodaniu ekstraktów z derenia i brusznicy.
Potencjał antyoksydacyjny mediów wzbogaconych związkami polifenolowymi może pod
wpływem bakterii zwiększać się lub zmniejszać bądź też pozostawać bez zmian. Wzrost i spadek
potencjału AOX może wynikać zarówno z przemian związków polifenolowych pod wpływem
bakterii
do
pochodnych
o
odpowiednio
większych
lub
mniejszych
właściwościach
antyoksydacyjnych, jak również z uwalniania polifenoli (bez ich przemian) z wiązań z matrycą
podłoża, powodującego zwiększenie się liczby wolnych cząsteczek lub grup mogących wchodzić w
reakcje z rodnikiem. Ponadto, podczas swoich procesów metabolicznych, bakterie wytwarzają
różne związki, np. kwasy organiczne, które obniżają pH badanego roztworu i wpływają na
strukturę cząsteczki przeciwutleniacza. Przy niższym pH roztworu wiele polifenoli jest bardziej
stabilnych i przyjmuje postać uprotonowaną, dzięki czemu mają większy potencjał zmiatania
wolnych rodników [Materska 2008]. Wytworzone metabolity mogą także powodować zmianę
polarności środowiska i poprzez wpływ na lipofilowość/hydrofilowość polifenoli modyfikować ich
potencjał antyoksydacyjny.
Szczególnie wysoki przyrost aktywności antyoksydacyjnej nastąpił pod wpływem E. coli dla
podłoży z dodatkiem ekstraktu z czarnego bzu (wartość WI 2,75-4,88, w zależności od stężenia
ekstraktu), żurawiny (WI 1,6-3,83), czosnku niedźwiedziego (WI 1,99-3,29) oraz zielonej herbaty
(WI 1,32-1,95). Przy czym, poza ostatnim przykładem, wartość WI malała wraz ze wzrostem
10
stężeniem ekstraktu, co może wynikać z bakteriostatycznego wpływu tych ekstraktów na EC.
W przypadku ekstraktu z zielonej herbaty, przypuszczalnie zbyt duże stężenie katechin
spowodowało, że część z nich znajdowała się w podłożu w formie niedostępnej, tj. związanej z
białkami czy polisacharydami obecnymi w pożywkach.
Wykazano wzrost AOX podłoży z dodatkiem hesperydyny pod wpływem EN, BF
i EUB, a z dodatkiem Citroseptu – pod wpływem EC (WI 2,32-3,10) i RUMI (1,28-1,51). Znaczący
wzrost AOX pod wpływem bakterii wykazano też dla innych flawanonów zidentyfikowanych w
ekstrakcie z grejpfruta, tj. hesperetyny (pod wpływem EC), naringeniny (EC, w mniejszym stopniu
EN, BF i LCB) oraz naringiny (EC, EN). Znaczący wzrost potencjału antyoksydacyjnego w mediach z
dodatkiem (+)-katechiny zaobserwowano pod wpływem EN, BF, LCB i EUB (z maksymalną
wartością współczynnika interakcji WI wynoszącą 1,67). Przypuszczalnie do przemian
metabolicznych kwercetyny były zdolne Lactobacillus (WI 1,6-2,18) oraz Enterococcus (WI
1,08-1,41), podczas gdy rutynozyd kwercetyny mógł być przekształcany do aglikonu lub
pochodnych o większym potencjale AOX przez EC (WI 1,7-2,0), EN (1,5-1,95) i EUB (1,23-1,48).
Właściwości przeciwrodnikowe podłoży z dodatkiem florydzyny i rezweratrolu zwiększały się pod
wpływem EN, BF, EC i LCB (maksymalne wartości WI odpowiednio 2,13 i 1,79), zaś podłoża z
kemferolem – pod wpływem wszystkich bakterii oprócz BAC (max. WI wyniosło 2,18).
W doświadczeniach z ekstraktami roślinnymi i suplementami diety wzrost potencjału
antyoksydacyjnego w obecności E. coli zanotowano praktycznie we wszystkich próbach.
Współczynnik interakcji wahał się od 1,01 do 4,88 (czarny bez), co oznacza prawie 5-krotne
zwiększenie potencjału antyoksydacyjnego składników medium z dodatkiem ekstraktu z czarnego
bzu pod wpływem tej bakterii. Wyjątkiem były podłoża z dodatkiem ekstraktu z czerwonej cebuli
(WI=0,43; 1,72 i 0,80 dla rosnących stężeń) oraz 5% ekstraktu z cytryńca chińskiego (0,74),
co mogło być spowodowane bardzo silnym zahamowaniem wzrostu E. coli wywołanym przez te
ekstrakty. W przypadku pozostałych gatunków bakterii, wyniki były bardziej zróżnicowane.
Do najciekawszych można zaliczyć przypuszczalne przekształcenie związków bioaktywnych
zawartych w ekstrakcie z soi do pochodnych o wyższym potencjale przeciwrodnikowym przez LCB
i RUMI, zaś do pochodnych o niższym AOX przez BAC. Znaczący wzrost AOX zanotowano także w
przypadku pożywek z dodatkiem ekstraktu z derenia pod wpływem RUMI (WI 1,44-2,01)
i ekstraktu z brusznicy pod wpływem LCB (WI 1,08-1,63). Z kolei spadek aktywności AOX
wykazano dla wszystkich stężeń Citroseptu i ekstraktów z czarnego bzu, pokrzywy, soi, oraz soku z
noni w obecności Bacteroides galacturonicus oraz dla Citroseptu i ekstraktów z malin, czosnku
niedźwiedziego i jagód goji pod wpływem Enterococcus caccae. Możliwe, że za ten spadek
odpowiada tu wykorzystanie przez bakterie na swoje potrzeby związków przeciwutleniających
obecnych w pożywce.
11
Aby zweryfikować, czy za wykazany wzrost bądź spadek potencjału antyoksydacyjnego
odpowiada biotransformacja poszczególnych flawonoidów do aglikonu i/lub innych pochodnych
wykonano analizę HPLC. Stwierdzono, że wykorzystane w doświadczeniach gatunki bakterii, poza
kilkoma wyjątkami, nie przejawiały zdolności metabolizowania większości badanych związków
polifenolowych. Istotne zmiany zanotowano dla rutyny, która częściowo ulegała reakcjom
biotransformacji. Pod wpływem Escherichia coli w medium z dodatkiem rutyny nieznacznie malała
zawartość rutynozydu, pojawił się też w wykrywalnym stężeniu kwercetyno-3-O-glukozyd (do
8,61±2,10 µg/ml). Zwiększała się również aktywność antyoksydacyjna medium, co mogłoby
stanowić poparcie tezy o degradacji rutyny pod wpływem enzymów E. coli. W obecności E. caccae
rutyna była degradowana do kwercetyny oraz innego, niezidentyfikowanego związku.
B. galacturonicus i E. cylindroides przekształcały rutynę do pochodnych, które nie zostały
zidentyfikowane, nie były to jednak ani kwercetyna ani jej glukozyd. Potencjał antyoksydacyjny
medium z dodatkiem rutyny istotnie wzrastał pod wpływem EUB, co potwierdzałoby powstanie
metabolitów o wyższym AOX. Wzrost stężenia rutyny w obecności bakterii (wyraźny szczególnie
dla niższych dawek) świadczy o uwalnianiu tego glikozydu z połączeń z matrycą pożywki.
Metabolity powstałe w reakcjach zachodzących z udziałem BAC natomiast miały niższy potencjał
antyoksydacyjny od wyjściowego (bez bakterii). Ponieważ rozerwanie pierścienia aromatycznego
przez enzymy bakteryjne powoduje spadek potencjału antyoksydacyjnego związku, można
przypuszczać, że BAC dokonał właśnie tego typu przemiany w obrębie cząsteczek rutyny.
Na podstawie tych wyników można wnioskować, że bakterie jelitowe mają zdolność do
metabolizowania tego samego związku poprzez odmienne szlaki metaboliczne i z wytworzeniem
odmiennych pochodnych, także takich o niższym potencjale antyoksydacyjnym.
Wzrost potencjału antyoksydacyjnego medium pod wpływem Ruminococcus gauvreauii dla
najniższej dawki naringiny wynikał prawdopodobnie z przemian tego flawanonu do pochodnych
o wyższym potencjale antyoksydacyjnym. Spadkowi zawartości naringiny pod wpływem RUMI nie
towarzyszyło jednak pojawienie się aglikonu – naringeniny, a zatem przemiany metaboliczne
musiały prowadzić do powstania innych pochodnych, np. kwasów fenolowych. Taki szlak
biotransformacji znany jest dla bakterii Clostridium orbiscindens, która przekształca naringeninę aż
do
floroglucyny,
poprzez
stadium
dihydrochalkonu
oraz
kwasu
3-(4-hydroksyfenylo)-
propionowego [Schoefer i in. 2003]. Co ciekawe, bakteria ta nie ma zdolności metabolizowania
naringiny (glikozydu). Podobnie Eubacterium ramulus nie działa na naringinę, podczas gdy
naringeninę przekształca do kwasów fenolowych [Schneider i Blaut 2000]. Zanotowany spadek
potencjału antyoksydacyjnego w podłożach z naringiną w wyniku działania Bacteroides
galacturonicus nie wynikał z przemian tego związku do aglikonu. Nie wykryto naringeniny, a
zmiany w stężeniu naringiny pod wpływem BAC w większości przypadków nie były istotne
12
statystycznie. Także w pozostałych podłożach nie stwierdzono istotnych zmian stężenia tego
glikozydu pod wpływem innych badanych bakterii.
W przypadku hesperydyny zmiany potencjału antyoksydacyjnego medium nie znalazły
uzasadnienia w przemianach tego związku pod wpływem bakterii – dla żadnej z nich, z wyjątkiem
Ruminococcus gauvreauii, nie zaobserwowano istotnych statystycznie zmian ani stężenia HR, ani
czasu retencji odpowiadającego jej piku na chromatogramach. W tym przypadku na uwagę
zasługuje znacznie mniejsze (niż wynikałoby to z dodanej dawki) stężenie HR w medium
wzbogaconym najwyższą dawką tego glikozydu, co znalazło odzwierciedlenie w niskim potencjale
antyoksydacyjnym tej próby. W obecności bakterii doszło do dalszego obniżenia AOX, czemu
towarzyszył znaczny spadek zawartości hesperydyny, ale nie przełożyło się to na pojawienie się
wykrywalnych stężeń aglikonu – hesperetyny. Jeśli zatem miałby to być rozpad hesperydyny pod
wpływem RUMI, to należałoby przypuszczać, że proces zachodzi dalej niż tylko do aglikonu
i prowadzi do powstania związków o niższym potencjale antyoksydacyjnym niż potencjał
wyjściowego glikozydu.
W podłożach z dodatkiem ekstraktów końcowe stężenia wykrywanych i identyfikowanych
polifenoli były znacznie niższe niż w przypadku czystych związków i w większości przypadków
poniżej progu detekcji metody. Dla tych związków, które udało się zidentyfikować wykazano tylko
kilka istotnych statystycznie zmian stężenia pod wpływem badanych gatunków bakterii.
W podłożach wzbogacanych ekstraktem z soi (w stężeniu 5%) nastąpił pod wpływem Eubacterium
cylindroides całkowity zanik daidzyny (z wyjściowej wartości 4,12±0,49 µg/ml do 0)
z jednoczesnym pojawieniem się jej aglikonu - daidzeiny (wzrost z 0 do 4,22±2,03 µg/ml)
i brakiem zmian w poziomie genisteiny. Należy zaznaczyć, że w stężeniu 5% ekstrakt z soi bardzo
silnie hamował wzrost EUB; być może te śladowe ilości bakterii, które pozostały, to właśnie te,
które zyskały zdolność do degradacji daidzyny do daidzeiny. Pozostałe testowane gatunki bakterii
nie wpływały na poziom izoflawonoidów w medium lub związki te występowały w stężeniu
niewykrywalnym.
W doświadczeniach z dodatkiem ekstraktów wykazano także zachodzenie, pod wpływem
bakterii, nieznacznych zmian stężenia rutyny, stanowiącej składnik niektórych surowców.
W podłożu wzbogacanym najwyższą dawką ekstraktu czosnku niedźwiedziego stężenie rutyny
malało pod wpływem E. caccae z 0,16±0,02 do 0,08±0,01 µg/ml. Jednocześnie w medium pojawiała
się kwercetyna, której stężenie wzrastało z poziomu niewykrywalnego do 0,20±0,00 µg/ml. Wyniki
te potwierdzają rezultaty doświadczeń z czystymi polifenolami, wskazujące na zdolność degradacji
rutyny do kwercetyny przez EN. Z kolei podczas przemian tego samego ekstraktu, ale pod
wpływem Ruminococcus gauvreauii, stężenie rutyny malało z 2,32±0,26 do 1,86±0,02 µg/ml. Nie
pojawiły się w wykrywalnych ilościach ani kwercetyna ani kwercetyno-3-O-glukozyd, zatem ubytek
rutyny polegał na czymś więcej niż odszczepieniu cząsteczki monocukru lub dwucukru od aglikonu,
13
tym
bardziej,
że
podczas
rozdziału
chromatograficznego
zaobserwowano
nowy,
niezidentyfikowany związek. Nie zanotowano zmian pod wpływem EUB, zaś w próbach z EC
polifenole miały stężenia poniżej progu detekcji.
Stężenie rutyny w podłożach wzbogaconych ekstraktem z jagód goji (w stężeniu
5%), będących bogatym źródłem tego związku, malało pod wpływem EUB z 0,43±0,05 do
0,23±0,32 µg/ml, ale nie towarzyszyły temu zmiany stężeń kwercetyno-3-O-glukozydu
i kwercetyny. Nie zanotowano żadnych zmian stężenia rutyny pod wpływem RUMI, a w próbach z
EC i EN jej poziom był poniżej możliwości detekcji aparatu. Co ciekawe, w medium z 5% dodatkiem
ekstraktu z czarnego bzu stężenie rutyny nie ulegało zmianie pod wpływem EN, podczas gdy
stężenie kwercetyny się zwiększało (z 0,18±0,03 do 2,00±0,01 μg/ml). W przypadku pozostałych
bakterii nie wykazano zmian stężenia tych związków lub stwierdzono, że ich poziom mieści się
poniżej progu wykrywalności.
Nie stwierdzono także istotnych zmian stężenia hesperydyny i naringiny pod wpływem
większości badanych gatunków bakterii (w tym RUMI) w podłożach z dodatkiem Citroseptu.
Wyjątek stanowiły próby inkubowane z EUB, w których poziom naringiny malał z 37,19±2,23 do
21,49±4,33 µg/ml, zaś hesperydyny pozostawał bez zmian. Potwierdza to wyniki doświadczeń z
czystymi polifenolami, w których wykazano, że badane bakterie nie metabolizują flawanonów
obecnych w grejpfrucie. Brak zmian ilości hesperydyny pod wpływem RUMI może być
konsekwencją znacznego błędu wynikającego z faktu, że stężenie tego związku w medium było na
progu wykrywalności.
Wykazano, że niektóre badane gatunki bakterii powodują spadek zawartości kwasów
fenolowych w podłożu, co może świadczyć zarówno o procesach degradacji tych związków przez
bakterie, jak i o ich wykorzystaniu jako źródła węgla i energii w procesach metabolicznych
mikroorganizmów. W podłożach z 5% dodatkiem ekstraktu z czosnku niedźwiedziego stwierdzono
spadek stężenia kwasu protokatechowego (PCA) pod wpływem Enterococcus caccae. Bakteryjny
metabolizm
PCA
prowadzi
do
wytworzenia
kwasów
pirogronowego,
bursztynowego,
szczawiowego, acetaldehydu i acetyloCoA, które są włączane w cykl kwasów trójkarboksylowych
[Karegoudar i Kim 2000]. W mediach wzbogacanych 5% ekstraktem z cytryńca chińskiego
wykazano z kolei spadek stężenia kwasu galusowego (GA) pod wpływem E. coli i E. caccae,
odpowiednio z 6,51±0,86 do 0,33±0,47 µg/ml oraz z 23,24±3,78 do 13,84±6,59 µg/ml.
Także w podłożach z najwyższą dawką ekstraktu z jagód goji poziom kwasu galusowego malał z
1,44±0,19 do 0,17±0,24 µg/ml pod wpływem EC. Z kolei w przypadku dodatku do pożywki 5%
ekstraktu z zielonej herbaty zanotowano wzrost stężenia kwasu galusowego (z niewykrywalnego
do 6,11±4,38 µg/ml) z całkowitym rozkładem (-)-epigalokatechiny (z 5,87±0,65 µg/ml do 0) pod
wpływem E. caccae, co może wskazywać na zdolność tej bakterii do odszczepiania reszty kwasu
galusowego
od
cząsteczki
(-)-epigalokatechiny.
14
Odmienne
prawidłowości
wykazano
w
doświadczeniach z zieloną herbatą – pod wpływem Eubacterium cylindroides oraz Lactobacillus sp.
zmniejszało się zarówno stężenie kwasu galusowego, jak i galusanu (-)-epigalokatechiny;
odpowiednio z 4,12±0,45 do 2,34±3,50 µg/ml i z 171,86±18,90 do 114,86±32,96 µg/ml dla EUB
oraz z 6,61±0,73 do 2,97±0,30 µg/ml i z 172,83±19,21 µg/ml do niewykrywalnego dla LCB.
Wykorzystanie kwasu galusowego przez LCB może tłumaczyć sugerowane wcześniej stymulowanie
wzrostu tej bakterii przez kwas galusowy. Stężenie, obecnego w ekstrakcie z malin kwasu
elagowego malało pod wpływem EC (z 0,08±0,01 do 0,03±0,05 µg/ml), EN (z 0,39±0,06 µg/ml do
niewykrywalnego) oraz LCB (z 0,32±0,02 do 0,17±0,24 µg/ml).
Uzyskane wyniki potwierdzają sugerowane wcześniej interakcje związków polifenolowych
ze składnikami pożywek. W niektórych przypadkach, pod wpływem bakterii dochodziło do
uwalniania
tych
związków
z
wytworzonych
połączeń,
prawdopodobnie
na
skutek
wykorzystywania przez bakterie do swojego metabolizmu aminokwasów czy cukrów albo na
skutek zmiany pH medium pod wpływem metabolitów bakterii. Większość badanych gatunków w
warunkach beztlenowych wytwarza kwasy organiczne, które powodują spadek odczynu podłoża
i zmianę siły oddziaływań między cząsteczkami. Wywołana przez bakterie zmiana pH podłoża
powoduje też zmiany struktury cząsteczek polifenoli. Wiadomo, że kwercetyna w bardziej
kwaśnym środowisku staje się mniej lipofilna, co wynika z przyjęcia formy uprotonowanej
i prowadzi do zwiększenia zdolności oddawania protonu [Materska 2008].
Wnioski
1) Wyniki uzyskane w prezentowanej pracy wskazują, że należy odrzucić pierwszą hipotezę
badawczą. Naturalne składniki przeciwutleniające oraz związki polifenolowe zawarte w
surowcach roślinnych mogą wywierać silne inhibitorowe działanie na bakterie będące
przedstawicielami fizjologicznej mikrobioty jelitowej.

Szczególnie silny wpływ hamujący na bakterie Lactobacillus sp., Enterococcus caccae
i Bacteroides galacturonicus wykazano dla rezweratrolu i naringeniny, a na Bifidobacterium
catenulatum – kwercetyny. Wzrost Ruminococcus gauvreauii był silnie hamowany przez
wszystkie wymienione polifenole i dodatkowo przez kemferol, który działał bakteriobójczo
także wobec Eubacterium cylindroides.

Spośród badanych ekstraktów roślinnych i suplementów diety ekstrakt z cytryńca
chińskiego, jako jedyny, znacząco hamował wzrost wszystkich badanych bakterii jelitowych
(MIC ≥ 5%). Ekstrakt z miąższu i pestek grejpfruta (Citrosept) hamował wzrost badanych
bakterii, oprócz LCB, zaś ekstrakt z owoców pigwowca działał silnie hamująco na B.
galacturonicus (MIC 5%) i E. cylindroides (MIC 2,5%). Pozostałe ekstrakty wykazywały
15
bardziej zróżnicowany wpływ: od hamującego, przez neutralny, do stymulującego, w
zależności od gatunku bakterii.

Stwierdzono, że dla właściwości antyoksydacyjnych i antybakteryjnych badanych związków
polifenolowych kluczowa była jednoczesna obecność wolnych grup hydroksylowych
przyłączonych do szkieletu cząsteczki w pozycji C5, C7 i C4’ oraz grupy ketonowej przy C4.
Wykazano, że glikozydy flawonoidów są słabszymi inhibitorami niż ich aglikony,
prawdopodobnie na skutek zawady sterycznej, jaka występuje po przyłączeniu cząsteczek
cukrów.
2) Na podstawie uzyskanych wyników należy odrzucić drugą hipotezę badawczą.

Wykazano, że bakterie będące przedstawicielami fizjologicznej mikrobioty jelitowej mogą
przekształcać
polifenole
z
wytworzeniem
pochodnych
o
niższym
potencjale
antyoksydacyjnym.

W przypadkach gdy w obecności bakterii rosła aktywność antyoksydacyjna badanych
roztworów, często przyczyną tego były nie przemiany metaboliczne polifenoli, ale
prawdopodobnie ich uwalnianie z powiązań z białkami czy innymi składnikami obecnymi w
środowisku reakcji.
Biorąc pod uwagę uzyskane wyniki stwierdzono, że możliwe jest takie dobranie składników
polifenolowych, by zwiększyć lub zmniejszyć liczebność wybranej grupy bakterii wchodzących w
skład mikrobioty jelitowej. Takie celowane terapie w przyszłości mogą zostać wykorzystane do
przywracania równowagi w przewodzie pokarmowym i wspomagania leczenia różnych chorób
wywołanych przez dysbiozę. Na zakończenie pracy sformułowano także kilka wskazówek dla
konsumentów oraz producentów żywności.
Piśmiennictwo
1. Boots A.W., Haenen G.R., Bast A. 2008. Health effects of quercetin: from antioxidant to nutraceutical.
Eur. J. Pharmacol. 585 (2-3), 325-37.
2. Cushnie T.P.T., Lamb A.J. 2005. Antimicrobial activity of flavonoids. Int J Antimicrob Agents 26, 343356.
3. Duda-Chodak A., Tarko T., Rus M. 2011. Antioxidant activity and total polyphenol content of selected
herbal medicinal products used in Poland. Herba Pol., 57 (1), 48–61.
4. Duda-Chodak A., Tarko T., Satora P., Sroka P., Tuszyński T. 2010. The profile of polyphenols and
antioxidant properties of selected apples cultivars grown in Poland, J. Fruit Ornament. Plant Res.,
18(2), 39-50.
5. Ho P.C., Saville D.J., Wanwimolruk S. 2001. Inhibition of human CYP3A4 activity by grapefruit
flavonoids, furanocoumarins and related compounds. J Pharm Pharm Sci. 4 (3), 217-227.
6. Karegoudar T.B., Kim C.K. 2000. Microbial degradation of monohydroxybenzoic acids. J. Microbiol., 38
(2), 53–61.
7. Le Bourvellec C., Renard C.M.G.C. 2012. Interactions between polyphenols and macromolecules:
quantification methods and mechanisms. Crit. Rev. Food Sci. Nutr., 52 (3), 213–248.
8. Materska M. 2008. Quercetin and its derivatives: chemical structure and bioactivity – a review. Pol. J.
Food Nutr. Sci., 58 (4), 407–413.
16
9. Schneider H., Blaut M. 2000. Anaerobic degradation of flavonoids by Eubacterium ramulus. Arch.
Microbiol., 173 (1), 71–75.
10. Schoefer L., Mohan R., Schwiertz A., Braune A., Blaut M. 2003. Anaerobic degradation of flavonoids by
Clostridium orbiscindens. Appl. Environ. Microbiol., 69 (10), 5849–5854.
5.
Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo – badawczych
Moje zainteresowania naukowo-badawcze zmieniały się w czasie, przede wszystkim ze względu na
zmianę miejsca pracy. Mimo że od wielu lat pracuję i prowadzę badania naukowe na Wydziale
Technologii Żywności to moje podstawowe wykształcenie biologa, a następnie praca i doktorat na
Wydziale Lekarskim Collegium Medicum UJ nie dają o sobie zapomnieć. Patrząc z perspektywy tych
kilkunastu lat na projekty i tematy badawcze, w których uczestniczyłam, mogę z radością zauważyć,
że mają one wspólny mianownik, jakim jest poznanie mechanizmów oddziaływania świata
zewnętrznego na zdrowie człowieka, choć oczywiście na bardzo wielu poziomach i płaszczyznach.
Generalnie obszary badawcze, jakimi się zajmowałam lub nadal zajmuję można zebrać w pięć 5
głównych nurtów:
1.
Badanie
mechanizmów
odpowiedzialnych
za
kontrolowanie
procesów
apoptozy
i nekrozy w komórkach.
2.
Mechanizmy powstawania, zapobiegania i leczenia wrzodów i nowotworów przewodu
pokarmowego.
3.
Aspekty technologiczne, analityczne i zdrowotne przeciwutleniaczy.
4.
Interakcje związków antyoksydacyjnych z mikroorganizmami.
5.
Możliwości wykorzystania mikroorganizmów na szeroko rozumiane potrzeby człowieka.
Ad. 1. Jeszcze w trakcie studiów oraz podczas I roku studiów doktoranckich w UJ zajmowałam się
tematyką związaną z badaniem mechanizmów odpowiedzialnych za kontrolowanie procesów
apoptozy i nekrozy w komórkach. Celem badań była między innymi ocena stopnia apoptozy w
leukocytach izolowanych od pacjentów z różnymi chorobami zakaźnymi. Dostępne w tamtym
czasie metody okazały się mało przydatne, gdyż komórki eksponujące na swej powierzchni resztę
fosfatydyloseryny są w organizmie rozpoznawane i usuwane przez krążące we krwi fagocyty. To
powoduje, że w organizmie komórki są usuwane już we wczesnym stadium apoptozy i ich analiza w
oparciu o wiązanie aneksyny-V nie jest możliwa. Ponieważ aktywność kaspaz jest jednym z
najwcześniejszych markerów procesu apoptozy opracowano metodę bezpośredniego oznaczania
aktywności kaspaz, która może być przydatna w ocenie apoptozy ex vivo. W tym celu zastosowano
zmodyfikowaną formę rodaminy: (Asp)2-rodamina 110. Po katalitycznym odłączeniu grup
17
aspartylowych przez aktywne kaspazy fluorescencja barwnika silnie wzrastała, co oznaczano z
użyciem cytometru przepływowego. Wykazano, że w chorobach bakteryjnych aktywacja kaspaz
przeważała w monocytach i granulocytach, podczas gdy w chorobach o etiologii wirusowej - w
limfocytach T. Wykazano też, że w limfocytach izolowanych od pacjentów zakażonych wirusem HIV
aktywność kaspaz była wyższa w limfocytach T CD4+ niż w limfocytach T CD8+. Aktywność kaspaz
nie korelowała ze stopniem zaawansowania choroby, korelowała natomiast ze stopniem replikacji
wirusa w wirusowych chorobach zakaźnych. W ramach tych badań wykazano także, że apoptoza
zmniejszała zdolność monocytów do prezentacji antygenu i pełnienia funkcji wspomagających.
Ponadto stwierdzono, że pod wpływem cytokin w monocytach dochodziło do zmian fenotypowych
i funkcjonalnych.
Wyniki uzyskane w trakcie omówionych doświadczeń zaprezentowano w postaci pracy
przeglądowej oraz komunikatów na konferencjach naukowych (załącznik IV, pkt. D1, załącznik VI,
pkt. B21-B24).
Ad. 2. Z uwagi na podjęcie pracy na Wydziale Lekarskim, zdecydowałam się na rezygnację ze
studiów doktoranckich na Wydziale Biologii i Nauk o Ziemi UJ i rozpoczęcie nowych studiów
doktoranckich na Wydziale Lekarskim Collegium Medicum UJ, co spowodowało zmianę moich
zainteresowań badawczych. Zespół, do którego dołączyłam, a także ośrodek naukowy w Erlangen,
gdzie odbyłam w sumie 9-miesięczny staż naukowo-badawczy, zajmowały się szeroko pojętą
tematyką patomechanizmów kancerogenezy i powstawania wrzodów. W ramach tego rozległego
obszaru można wyróżnić kilka głównych tematów badawczych: (1) badanie patomechanizmu
kancerogenezy i powstawania wrzodów żołądka i dwunastnicy, ze szczególnym uwzględnieniem
roli apoptozy oraz wpływu toksyn Helicobacter pylori, czynników wzrostu i hormonów;
(2) doskonalenie różnych modeli doświadczalnych oraz porównanie mechanizmu powstawania
wywołanych w ten sposób uszkodzeń błony śluzowej żołądka i dwunastnicy; (3) rola Helicobacter
pylori w procesach powstawania wrzodów oraz nowotworów żołądka, dwunastnicy, trzustki
i innych narządów, (4) rola reaktywnych form tlenu (RFT) w patogenezie różnych chorób.
Początkowo zajmowałam się w szczególności mechanizmami regulującymi apoptozę oraz
rolą tego procesu w powstawaniu i gojeniu uszkodzeń błony śluzowej żołądka. Helicobacter pylori
(HP) jest znanym czynnikiem ryzyka powstawania wrzodów trawiennych w obrębie żołądka
i dwunastnicy. Ponieważ dokładny patomechanizm jego działania nie został do końca poznany
większość
działania
badań,
HP,
w
jakich
szczególnie
w
uczestniczyłam
kontekście
dotyczył
choroby
rozpoznania
wrzodowej
patomechanizmu
oraz
nowotworów.
W przeprowadzonych doświadczeniach wykorzystywano różne modele doświadczalne wrzodów
żołądka (m.in. z wykorzystaniem kwasu octowego, etanolu, aspiryny, stresu, ischemii i reperfuzji)
18
z udziałem zwierząt laboratoryjnych, ale też badanie wycinków pobranych bezpośrednio od
pacjentów z tymi chorobami.
Wyniki przeprowadzonych badań potwierdziły między innymi, że proces apoptozy odgrywa
kluczową rolę w opóźnianiu gojenia wrzodów. Wykazano, że wodne ekstrakty H. pylori (WE-HP)
szczepów CagA+;VacA+ (typ I) znacząco opóźniały gojenie wrzodów, czemu towarzyszył znaczący
spadek żołądkowego przepływu krwi (GBF) na obrzeżu wrzodów, około 3-krotne nasilenie
apoptozy w epitelium oraz zwiększony poziom cytokin prozapalnych inteleukiny-1β (IL-1β)
i czynnika martwicy nowotworów α (TNFα) w osoczu. Poziom tych cytokin był także znacznie
podwyższony w samej śluzówce żołądka eksponowanej na HP zarówno szczepy CagA+;VacA+ (typ
I), jak i CagA-;VacA- (typ II).
Ostra infekcja Helicobacter pylori jest powiązana ze znacznie zmniejszonym wydzielaniem
kwasu żołądkowego, co ułatwia kolonizację śluzówki żołądka przez tę bakterię. Dokładny
mechanizm hipochlorhydrii nie został do końca rozpoznany, dlatego w części doświadczeń
postanowiono zbadać czy dekarboksylaza histydynowa – HDC (enzym konwertujący histydynę do
histaminy, końcowego chemostymulatora komórek okładzinowych) odgrywa jakąś rolę tym
zjawisku. W przeprowadzonych badaniach wykazano, że WE-HP ze szczepów CagA+;VacA+ (typ I)
indukowały silny spadek GBF (o 65%) oraz zmniejszenie ilości mRNA dla HDC (o 50%).
U szczurów eksponowanych na typ I i II WE-HP zaobserwowano znaczący wzrost ekspresji mRNA
dla cytokin prozapalnych IL-1β i TNFα, spadek stężenia somatostatyny w soku żołądkowym oraz
podwyższony poziom gastryny. Uzyskane wyniki wskazują, że hipochlorhydria obserwowana
podczas ostrej infekcji HP wynikała ze zmniejszonej ekspresji genów dla HDC mimo zwiększonego
uwalniania gastryny, a zmianom tym towarzyszyły upośledzone mikrokrążenie żołądkowe i wzrost
ekspresji cytokin prozapalnych.
Rak żołądka (GC) jest jednym z najczęstszych nowotworów i wiodących przyczyn śmierci na
całym świecie. Odkrycie bakterii H. pylori jest uznawane za największe osiągnięcie
gastroenterologii na progu trzeciego tysiąclecia. W ostatnich dekadach, liczne badania
epidemiologiczne oraz badania na zwierzętach wykazały powiązanie pomiędzy rakiem żołądka
a chroniczną infekcją HP, jednak dokładne mechanizmy rozwoju tego nowotworu u pacjentów
zainfekowanych HP nie były do końca poznane. Istniały dowody sugerujące, że istotną rolę w
kancerogenezie
żołądka
odgrywa
zwiększony
poziom
niektórych
czynników
wzrostu.
W przeprowadzonych badaniach wykazano, że w procesach tych istotną rolę odgrywały
zwiększone uwalnianie gastryny, podobnie jak nadekspresja czynników wzrostu, takich jak HGF
(hepatocyte growth factor) i TGFα (transforming growth factor). W przeprowadzonych badaniach
wykazano, że pacjenci zakażeni HP, w szczególności szczepami CagA+, obciążeni są znacznie
wyższym ryzykiem rozwoju raka żołądka. Częstość występowania HP osiągała 80% u pacjentów z
GC i aż 90% u pacjentów z chłoniakiem MALT, znacząco przewyższając wartości u pacjentów bez
19
nowotworu
(60%).
Co
więcej,
częstość
występowania
szczepów
CagA+
była
o 70% wyższa u pacjentów z GC lub MALT niż w dobranych pod względem płci i wieku kontrolach.
We wpuście żołądka u wszystkich badanych pacjentów, ale także w 90% próbek tkanek GC i MALT
wykryto ekspresję gastryny. Z kolei czynniki wzrostu TGFα i HGF częściej ulegały ekspresji
w próbkach GC niż w prawidłowej śluzówce odźwiernika. Poziom ekspresji enzymu
cyklooksygenazy-1 (COX-1) był podobny w tkankach nowotworowych i nietkniętej śluzówce,
natomiast mRNA dla cyklooksygenazy-2 (COX-2) wykrywano jedynie w tkankach nowotworowych,
a jego poziom istotnie malał po eradykacji HP u pacjentów z GC i całkowicie zanikał po tej terapii w
chłoniaku MALT. Poziom alfa-amidowanej gastryny w osoczu pacjentów z nowotworami był
wielokrotnie wyższy niż u osób zdrowych. Ekspresję genów dla BCL-2 wykrywano we wszystkich
próbach, podczas gdy dla BAX jedynie w ok. 50% prób z GC, co potwierdza, że w raku żołądka
dochodzi do zaburzenia w regulacji procesu apoptozy na poziomie układu BAX/BCL-2 ze
znaczącym przechyleniem równowagi w stronę BCL-2. Uzyskane wyniki potwierdziły, że zakażenie
H. pylori, zwłaszcza szczepami CagA+, to primum movens w rozwoju raka żołądka i chłoniaka MALT.
Jednym z powodów częstszego występowania raka żołądka u pacjentów z HP jest
zwiększone wydzielanie gastryny (hipergastrynemia). Ponieważ gastryna jest efektywnym
mitogenem żołądka, może być zdolna do indukowania cyklooksygenazy-2, która jest silnym
czynnikiem angiogennym i promującym wzrost nowotworu. W przeprowadzonych badaniach
udowodniono, że w raku żołądka dochodzi do koekspresji gastryny, jej receptora (CCKB-R) oraz
COX-2. HP uczestniczy zatem w kancerogenezie żołądka poprzez zwiększenie poziomu gastryny
indukującej COX-2, co skutkuje stymulacją wzrostu nowotworu i angiogenezy oraz osłabieniem
apoptozy. Selektywne zahamowanie COX-2 powodowało stymulację ekspresji proapoptotycznego
genu BAX w raku żołądka. Warto zatem rozważyć u pacjentów z rozwijającym się rakiem
żołądka eradykację HP w celu zmniejszenia czynnika wywołującego hipergastrynemię
i nadekspresję COX-2.
Gastryna i prostaglandyny (PG) są znanymi czynnikami mającymi chronić śluzówkę żołądka
przed szkodliwymi czynnikami. W przeprowadzonych doświadczeniach badano zależność między
uwalnianiem gastryny a ekspresją i aktywnością cyklooksygenazy u pacjentów z infekcją HP.
W badaniach wykorzystano materiał badawczy pobrany od 100 chorych z rakiem żołądka (wiek
21-60 lat) oraz od 300 pacjentów kontrolnych dopasowanych pod względem płci i wieku, którzy
byli hospitalizowani z uwagi na niepowiązaną w wrzodami dyspepsję. Częstość występowania HP u
pacjentów z rakiem żołądka wynosiła 92% w porównaniu do 68% w kontroli, natomiast częstość
HP-CagA+ odpowiednio 58,5% i 32,4%. Wartość OR (odds ratio) dla raka żołądka u pacjentów z
infekcją HP wynosiła 5,0, podczas gdy dla pacjentów zainfekowanych szczepem CagA+ aż 8,0.
Mediany dla cytokin prozapalnych IL-1β i IL-8 osiągały wyższe wartości u pacjentów z GC
(9,31 i 30,8 pg/ml) niż u kontrolnych (odpowiednio, 0,21 i 3,12 pg/ml). Również mediany
20
osoczowego poziomu gastryny i stężenia gastryny w świetle żołądka były kilkukrotnie wyższe u
pacjentów z rakiem (odpowiednio 62,6 pM i 310 pM) niż u kontroli (odpowiednio 19,3 pM i 20 pM).
Badania te po raz pierwszy wykazały, że pacjenci z GC mogą uwalniać duże ilości gastryny do
światła żołądka, co prowadzi do osiągnięcia stężenia tego hormonu na poziomie uznawanym za
stymulujący wzrost HP. Nie wykazano żadnej korelacji między poziomem gastryny w osoczu a jej
poziomem w żołądku, co sugeruje, że: (1) gastryna w żołądku ma odmienne pochodzenie niż
osoczowa, i prawdopodobnie pochodzi z komórek rakowych, (2) komórki nowotworowe są zdolne
do uwalniania gastryny do soku żołądkowego, (3) komórki rakowe mają swoiste receptory dla
gastryny CCKB-R, dzięki czemu wykazują aktywność promującą własny wzrost na sposób
autokrynny. Ostatni wniosek poparty został poprzez bezpośrednie wykrycie mRNA dla gastryny
i CCKB-R w tkankach rakowych. Dzięki uzyskanym wynikom, po raz pierwszy wykazano, że
gastryna pełni rolę autostymulatora dla komórek rakowych u pacjentów zainfekowanych HP.
Zarówno podstawowy (wyjściowy), jak i stymulowany histaminą wyrzut kwasu był znacząco niższy
u pacjentów z GC niż w kontroli, mimo zwiększonego u nich uwalniania gastryny. Może to
odzwierciedlać zmiany zapalne w śluzówce, wyrażone przez zwiększony poziom prozapalnych
cytokin IL-1β i IL-8, które z kolei mogą zwiększać uwalnianie gastryny. Gastryna, jako silny
mitogen, aktywuje COX-2, co prowadzi do wzmożonego wydzielania prostaglandyn. Postanowiono
sprawdzić zależności pomiędzy tymi czynnikami a rodzajem szczepu infekującego badanych
pacjentów. Wykryto mRNA dla gastryny i jej receptora na obrzeżach wrzodu, a nadekspresję mRNA
dla gastryny znaleziono także w pozostałej śluzówce wpustu, podczas gdy mRNA dla CCK B-R
ulegało nadmiernej ekspresji w śluzówce odźwiernika u pacjentów HP-pozytywnych. Podobnie,
zarówno białko, jak i mRNA dla COX-2 znaleziono w obrzeżach wrzodów żołądka u pacjentów
z zainfekowaną śluzówką i wpustu i odźwiernika, ale nie znaleziono w śluzówce pacjentów
po eradykacji HP, u których wrzody uległy zagojeniu, gastryna ulegała ekspresji jedynie w okolicy
wpustu, CCKB-R w trzonie żołądka, a COX-1 była wykrywana w trzonie i wpuście. U pacjentów
z wrzodami żołądka zainfekowanych HP poziom gastryny w osoczu był wyższy 3-krotnie,
a w świetle żołądka o ok. 50% niż u pacjentów HP-negatywnych. Poziom ten ulegał normalizacji po
eradykacji HP: mRNA dla COX-2 całkowicie znikało, zaś znaczący spadek w ekspresji mRNA dla
gastryny i CCKB-R w śluzówce wpustu i odźwiernika obserwowano po 6 tygodniach od eradykacji.
Na podstawie przeprowadzonych badań wywnioskowano, że: (1) w obrzeżach wrzodów
u pacjentów zainfekowanych HP dochodzi do koekspresji gastryny, jej receptora oraz COX-2;
(2) infekcja HP może „uczestniczyć” w powstawaniu wrzodów poprzez zwiększone uwalnianie
gastryny, która odpowiada za nadekspresję COX-2, ta z kolei może pomagać w gojeniu wrzodów
poprzez stymulację wzrostu komórek śluzówki, przywrócenie struktury gruczołowej oraz
angiogenezy w obszarze wrzodu; (3) gastryna wytwarzana we wpuście zainfekowanym przez HP
wydaje się uczestniczyć w indukcji COX-2 oraz produkcji PG zależnej od tego enzymu a zatem brać
21
udział w gojeniu wrzodów. Udział cyklooksygenaz w naprawie uszkodzeń wywołanych przez stres
(indukowany poprzez długotrwałe zanurzenie w wodzie; WRS - water immersion and restraint
stress) potwierdzono w doświadczeniach na szczurach. Wykazano, że wzrost COX-2 aktywowany
jest prawdopodobnie przez TGFα i EGF (epidermal growth factor), a zwiększone uwalnianie PG
oraz NO współuczestniczy z czynnikami wzrostu w naprawianiu uszkodzeń wywołanych stresem.
Badano także wpływ interakcji neuropeptydów nerwów czuciowych a selektywnych inhibitorów
COX-2 (koksyby) i NO-ASA (aspiryny sprzężonej z NO) w gastroprotekcji po narażeniu na stres.
Przedstawione powyżej wyniki udowadniały, że: (1) pacjenci z HP, szczególnie CagA+, są bardziej
narażeni na rozwój raka żołądka; (2) pacjenci z HP wytwarzają więcej IL-1β i IL-8, co odzwierciedla
występujący u tych pacjentów chroniczny nieżyt żołądka wywołany infekcją HP; (3) bardzo wysoki
wyrzut gastryny do światła żołądka, tak jak i znaczna ekspresja genów dla gastryny i jej receptora
w tkankach nowotworowych stanowi dowód na istotną rolę gastryny w rozwoju raka żołądka u
pacjentów zainfekowanych HP; (4) gastryna w komórkach rakowych pochodzi nie z komórek G, ale
z komórek rakowych, które dzięki takiej autokrynnej stymulacji rosną w sposób niekontrolowany.
Dlatego też badanie uwalniania gastryny może być użytecznym markerem złośliwości nowotworu
u pacjentów zainfekowanych HP.
Ostra infekcja HP u ludzi wiąże się także ze znaczną redukcją wydzielania kwasu
żołądkowego, przy czym mechanizm tej hipochlorhydrii nie został wyjaśniony. Celem części badań
było rozpoznanie w doświadczeniach modelowych na szczurach, jak wodne ekstrakty HP
zastosowane bezpośrednio na śluzówkę żołądka wpływają na jego aktywność sekrecyjną oraz na
poziom histaminy, gastryny i somatostatyny. Zbadano także ekspresję genów dla HDC oraz
cytokiny prozapalnej IL-1β. Typ I HP (CagA+;VacA+) powodował silniejsze zahamowanie
wydzielania kwasu i pepsyny niż typ II HP. Obydwa typy HP znacząco hamowały ekspresję mRNA
dla HDC i znacząco zmniejszały zawartość histaminy w śluzówce żołądka w porównaniu do kontroli
traktowanych solą fizjologiczną. Pod wpływem HP zwiększeniu ulegała ekspresja mRNA dla IL-1β,
a stężenie somatostatyny w świetle żołądka spadało, zanotowano również nieistotne zwiększenie
poziomu gastryny w osoczu. Wyniki dowodzą, że szkodliwy wpływ HP na śluzówkę żołądka wynika
z obniżenia poziomu HDC, co skutkuje ostatecznie hipochlorhydrią, a także z indukcji cytokin
prozapalnych, które zaburzają relację gastryna-somatostatyna.
Naprawa uszkodzonej śluzówki żołądka jest złożonym procesem, w który zaangażowane są
prostaglandyny oraz śluzówkowe czynniki wzrostu, jak EGF czy TGFα. Jednym z modeli wywołania
uszkodzeń błony śluzowej żołądka u szczura jest stres (WRS). Ekspozycja na WRS powodowała
rozwój licznych ostrych uszkodzeń stresowych, które zwykle ulegały samoistnemu wygojeniu w
ciągu 24 h. Natychmiast po zakończeniu WRS, żołądkowy przepływ krwi (GBF) wynosił zaledwie
70% wartości dla prawidłowej śluzówki. Ekspresja mRNA dla IL-1β i TNFα rosła osiągając
maksimum po 12 h od ustania WRS. Nasiliła się także apoptoza z maksimum po 6h od WRS, czemu
22
towarzyszył podwyższony poziom kaspazy-3. U szczurów, którym przed WRS podano EGF lub
prostaglandynę E2 (PGE2), zaobserwowano znaczący spadek ekspresji mRNA dla kaspazy-3 oraz
zwiększenie mRNA dla BCL-2, w porównaniu do zwierząt, którym przed WRS podano sól
fizjologiczną. Zastosowanie ICE-I (inhibitora kaspazy-1) znacząco zmniejszało liczbę uszkodzeń.
Wykazano zatem, że EGF i PGE2 przyspieszały gojenie wywołanych stresem uszkodzeń poprzez
osłabienie procesu apoptozy na drodze wzmocnienia działania BCL-2 w śluzówce. Inhibitory
apoptozy przyspieszały gojenie uszkodzeń stresowych co sugeruje, że mogą być wydajnymi
czynnikami w leczeniu uszkodzeń śluzówki żołądka. Jest to zgodne z wynikami innych
doświadczeń, w których wykazano, że gojeniu uszkodzeń towarzyszy spadek ekspresji kaspazy-1
(osłabienie apoptozy) oraz wzrost TGFα. Rolę EGF potwierdzał także fakt, że nadekspresja
receptora dla EGF w błonie śluzowej żołądka w okresie ciąży, przyśpieszała gojenie się
przewlekłych wrzodów.
Leptyna jest hormonem wytwarzanym głównie w tkance tłuszczowej, odpowiedzialnym za
regulację pobierania pokarmu i gospodarkę energetyczną organizmu. Hormon ten jest produktem
genu Ob (ang. obesity) uwalnianym przez cholecystokininę (CCK), a jego wiązanie z receptorem w
podwzgórzu powoduje zmniejszenie apetytu. Leptynę odkryto stosunkowo późno, bo dopiero w
1994 roku, jednak od tego czasu zdobywa coraz większe zainteresowanie, z uwagi na jej rolę m.in.
w patogenezie otyłości. Hormon ten został wykryty także w żołądku, jednak jego rola w tym
narządzie nie została określona. Przeprowadzone badania miały na celu wykazanie czy leptyna
pełni funkcję ochronną wobec śluzówki żołądka eksponowanego na szkodliwe związki.
W doświadczeniach z udziałem szczurów rasy Wistar, sprawdzono wpływ leptyny oraz
cholesyctokininy-8 (CCK-8) na uszkodzenia śluzówki wywołane przez powierzchniową ekspozycję
na 75% etanol lub kwaśną aspirynę. Wykazano, że zarówno CCK-8, jak i leptyna, w sposób
dawkozależny, zmniejszają uszkodzenia wywołane przez 75% etanol, ze stężeniem redukującym
uszkodzenia o 50% wynoszącym odpowiednio 10 µg/kg i 8 µg/kg (dootrzewnowo i.p.).
Ochronnemu wpływowi leptyny i CCK-8 towarzyszył istotny wzrost GBF oraz stężenia NO. Leptyna
była wydajna również w osłabianiu uszkodzeń wywołanych aspiryną i związanego z tym spadku
GBF, podczas gdy CCK-8 w sposób dawkozależny zwiększała te uszkodzenia, bez wpływu na GBF.
Pod wpływem rosnących dawek CCK-8 obserwowano rosnące stężenie leptyny w osoczu, z
maksimum przypadającym dla 100 µg CCK-8/kg. Podanie przed zabiegiem 10 µg/kg (i.p.) CCK-8 lub
8% peptonu (znany stymulator uwalniania CCK) również wywoływało znaczący wzrost stężenia
leptyny w osoczu, a także wzrost mRNA dla genu Ob. Powodowało także istotne zmniejszenie
uszkodzeń śluzówki pod wpływem 75% etanolu w takim samym zakresie jak to indukowane przez
egzogenną leptynę w dawce 10 µg/kg i.p. Indometacyna, która hamowała o 90% wytwarzanie
prostaglandyn, nie miała wpływu na ochronne działanie leptyny i CCK-8 wobec etanolu. Z kolei
podanie L-NAME (estru metylowego NG-nitro-L-argininy, inhibitora syntazy tlenku azotu /NOS/)
23
osłabiało znacząco ochronne działanie leptyny i CCK-8 oraz przekrwienie, podczas gdy dodanie do
L-NAME L-argininy, ale nie D-argininy, przywracało efekt ochronny i hiperemiczny obydwu
hormonów. W prawidłowej śluzówce oraz w śluzówce poddanej ekspozycji na sam etanol, mRNA
dla Ob wykrywano jako słaby sygnał, natomiast przy podaniu przed etanolem rosnących dawek
CCK-8 lub peptonu (posiłku) sygnał stopniowo rósł. Na podstawie uzyskanych wyników wysunięto
następujące wnioski: (1) egzogenna leptyna lub ta uwalniana endogennie pod wpływem CCK lub
posiłku wywiera silne gastroprotekcyjne działanie zależne od aktywności nerwu błędnego
i obejmujące hiperemię, wywołaną prawdopodobnie poprzez NO oraz nerwy czuciowe, ale
niepowiązane z endogennymi prostaglandynami; (2) leptyna naśladuje gastroprotekcyjną
aktywność CCK i prawdopodobnie pośredniczy w ochronnym i hiperemicznym działaniu CCK w
żołądku szczura.
W kolejnych badaniach dalej starano się wyjaśnić mechanizm ochronnego działania leptyny.
Wrzody żołądka indukowano w żołądku szczura metodą kwasu octowego. Zarówno leptyna, jak
i CCK znacząco zmniejszały powierzchnię wrzodów (o ok. 50%) w porównaniu z kontrolą, w której
zastosowano sól fizjologiczną. Podanie tyrfostiny (inhibitora kinazy tyrozynowej receptora EGF)
lub L-NNA (NG-nitro-L-argininy, blokera NOS) powodowało częściowe zahamowanie gojenia
wrzodów indukowanego leptyną i CCK. Ekspresja mRNA i białka leptyny były znacząco wyższe na
brzegu wrzodów. Przyspieszone leptyną gojenie wrzodów było powiązane ze wzrostem ekspresji
transkryptów dla TGFα oraz ze zwiększeniem ekspresji mRNA i białka dla konstytutywnej NOS
(cNOS) i indukowalnej NOS (iNOS) na brzegach owrzodzeń. Wyniki świadczą, że leptyna
przyspieszała gojenie wrzodów poprzez zwiększenie ekspresji czynników wzrostu, jak np. TGFα,
oraz zwiększenie produkcji NO na skutek aktywacji cNOS i iNOS na brzegach wrzodów.
Jednym z modeli doświadczalnych stosowanych w badaniach nad patomechanizmem
uszkodzeń błony śluzowej żołądka jest wywołanie ischemii z następującą po niej reperfuzją (I/R).
Ekspozycja na I/R powodowała ostre uszkodzenia śluzówki (erozje), z maksymalną ich
powierzchnią po 3 h od zakończenia I/R. Powstaniu erozji towarzyszył spadek GBF, znaczny wzrost
stężenia wolnych rodników we krwi oraz wzrost poziomu gastryny w osoczu, przy niemal
całkowitym zahamowaniu wydzielania żołądkowego. Począwszy od 24 h po I/R, powierzchowne
uszkodzenia przechodziły w głębokie wrzody, które ulegały gojeniu w ciągu 10 dni, czemu
towarzyszyło
przywrócenie
wydzielania
żołądkowego
i
GBF.
Zastosowanie
dysmutazy
ponadtlenkowej (SOD) lub allopurynolu (inhibitora oksydazy ksantynowej) znacząco przyspieszało
gojenie erozji wywołanych I/R, a efektowi temu towarzyszył znaczny wzrost GBF oraz zmniejszenie
poziomu wolnych rodników we krwi. Po 0, 3 i 12 h od zakończenia I/R obserwowano znaczący
spadek mRNA dla SOD, podczas gdy ekspresja TNFα, IL-1β i ICAM-1 (intercellular adhesion
molecule-1, która pośredniczy w infiltracji neutrofili do miejsca uszkodzenia) wykazywały
stopniowy wzrost zaczynający się natychmiast po zakończeniu I/R, a osiągający maksimum
24
w dniu 3. Poziom TNFα i IL-1β w osoczu zaczynał wzrastać począwszy od dnia 3., z maksimum
przypadającym na dzień 5. po I/R, przy czym jego poziom był istotnie wyższy niż w śluzówce
kontrolnej jeszcze w 10. dobie po I/R. W dniu 10. wrzody były praktycznie całkowicie zagojone,
poziom mRNA dla TNFα, Il-1β i ICAM zmalał, a mRNA dla SOD wzrósł. Uzyskane wyniki wskazują,
że ekspozycja na ischemię i następującą po niej reperfuzję powodowała powstawanie uszkodzeń
błony śluzowej żołądka pośredniczone przez nadmierne wytwarzanie wolnych rodników, co
skutkowało zmniejszeniem zarówno GBF, jak i aktywności wydzielniczej żołądka. SOD i allopurynol
przyspieszały gojenie uszkodzeń powstałych po I/R prawdopodobnie poprzez zmniejszenie
wytwarzania wolnych rodników i ich unieczynnienie, oraz wspomaganie mikrokrążenia.
Zwiększenie ekspresji mRNA dla SOD, z następującym po niej wzrostem wytwarzania SOD oraz
lokalne uwalnianie IL-1β i TNFα mogło aktywować ekspresję ICAM-1 i infiltrację neutrofili, które
pełniły istotną rolę w przekształcaniu się indukowanych przez I/R uszkodzeń śluzówki w
chroniczne wrzody. W patomechanizmie powstawania uszkodzeń po I/R oprócz wolnych rodników
istotną rolę odgrywają też prostaglandyny uwalniane przez COX-2. Należy jednak podkreślić, że
RFT mogą pełnić także rolę ochronną przed powstawaniem uszkodzeń śluzówki żołądka, dzięki
tzw. efektowi „preconditioningu”.
Niesterydowe leki przeciwzapalne (NSAID), takie jak aspiryna (ASA), znane są ze swoich
szkodliwych skutków ubocznych w postaci krwawień i uszkodzeń śluzówki żołądka, tworzenia
owrzodzeń czy perforacji ściany, co potwierdzono zarówno w zwierzęcych modelach
doświadczalnych, jak i in vivo u człowieka. Te uboczne efekty aspiryny początkowo wiązano z
zahamowaniem aktywności cyklooksygenazy oraz z wynikającym niedoborem endogennych
prostaglandyn. Nie badano natomiast roli RFT, peroksydacji lipidów czy mechanizmów
antyoksydacyjnych w patogenezie uszkodzeń wywołanych aspiryną. Nowa generacja NSAID
obejmuje między innymi leki uwalniające rodnik NO (NO-ASA), dzięki czemu hamują
cyklooksygenazę i uwalnianie prostaglandyn, ale nie wywierają szkodliwego działania na śluzówkę
żołądka.
W przeprowadzonych doświadczeniach wykazano, że tradycyjna aspiryna znacząco
spowalniała gojenie wrzodów, czemu towarzyszył wzrost chemiluminescencji (świadczący o
zwiększonej produkcji RFT) i peroksydacji lipidów oraz spadek GBF w obrzeżach wrzodów.
Zastosowanie witaminy C (przeciwutleniacza) istotnie zmniejszało zarówno uszkodzenia
wywołane przez ASA, jak i osłabiało towarzyszący mu spadek GBF i wytwarzanie reaktywnych
form tlenu, a także blokowało indukowaną przez ASA peroksydację lipidów. Natomiast NO-ASA nie
wpływała na gojenie wrzodów, nie zwiększała peroksydacji lipidów ani nie powodowała
podniesienia poziomu IL-1β, jak to obserwowano dla klasycznej aspiryny. Na podstawie
uzyskanych wyników wywnioskowano, że: (1) zwiększenie peroksydacji lipidów indukowane
przez RFT odgrywa kluczową rolę w patomechanizmie uszkodzeń wywołanych przez ASA;
(2) witamina C osłabia szkodliwe działanie aspiryny w gojeniu wrzodów dzięki swojej aktywności
25
antyoksydacyjnej, działając poprzez zachowanie właściwego GBF, osłabienie peroksydacji lipidów
oraz uwalniania cytokin; (3) sprzężenie NO z cząsteczką aspiryny powoduje, że jej szkodliwe
działanie znika, co sugeruje, że NO może kompensować niedobór prostaglandyn powodowany
przez NSAID.
Dlatego też prowadzono dalsze badania nad wyjaśnieniem roli cytokin i RFT w aktywności
ASA i NO-ASA w różnych modelach doświadczalnych wrzodów żołądka. Porównano ich wpływ na
uszkodzenia żołądka wywołane przez WRS, I/R oraz aplikację 100% etanolu. Podanie NO-ASA
przed wywołaniem wrzodów, w sposób dawkozależny zmniejszało uszkodzenia żołądka we
wszystkich modelach doświadczalnych (WRS, I/R i etanol). W przeciwieństwie do tego,
ASA pogarszała znacząco stopień zmian wywołanych przez WRS, czemu towarzyszył spadek GBF,
zahamowanie wytwarzania prostaglandyny E2 i znaczny wzrost chemiluminescencji (wytwarzanie
ROS) oraz zwiększenie stężenia TNFα i IL-1β w osoczu. ASA znacząco zwiększała również
zawartość malonylodialdehydu (MDA) w śluzówce (MDA jest markerem peroksydacji lipidów)
i obniżała ekspresję mRNA dla SOD i peroksydazy glutationowej. Efekty były niwelowane przez NO
uwolnione podczas zastosowania NO-ASA. Sprzęganie NO z ASA ograniczało uszkodzenia
wywołane stresem, I/R i etanolem dzięki wywołaniu przekrwienia śluzówki, w którym
pośredniczył NO, co kompensowało niedobór prostaglandyn indukowany przez ASA.
Śluzówka żołądka wykazuje zdolności adaptacji do szkodliwego działania aspiryny.
Wykazano, że w procesie tym istotną rolę pełni wzmożona ekspresja białek szoku cieplnego
(HPS70) oraz zahamowanie apoptozy poprzez obniżenie ekspresji BAX, prawdopodobnie na skutek
nadekspresji
TGFα.
Wykazano
także,
że
ekspozycja
śluzówki
żołądka
na
aspirynę
u pacjentów z istniejącą infekcją HP powoduje mniejsze uszkodzenia, prawdopodobnie na skutek
istniejącego już stanu zapalnego wywołanego przez bakterię oraz indukcji uwalniania gastryny
i COX-2. Wykazano także, że również inne współistniejące infekcje (np. Candida albicans) mogą
mieć wpływ na proces gojenia wrzodów.
Przedstawione badania i uzyskane w nich wyniki stanowiły znaczący wkład w rozwój
gastroenterologii
i
zostały
opublikowane
w
renomowanych
czasopismach
o
zasięgu
międzynarodowym (załącznik IV, pkt. A1, A2, A4, A5, A7-A12, D2), a także zaprezentowane na
krajowych i zagranicznych konferencjach i sympozjach naukowo-badawczych (załącznik VI, pkt.
B1-B19, B25-B27, B29-B35). Ich wartość została także dostrzeżona i doceniona poprzez dwukrotne
przyznanie zespołowej nagrody Ministra Edukacji Narodowej za współautorstwo cyklu prac w
dziedzinie gastroenterologii (2001 r.) oraz za współautorstwo cyklu prac pt. „Mechanizmy
zapobiegania i gojenia wrzodów w doświadczalnych modelach uszkodzenia błony śluzowej
żołądka” (2002 r.). Badania dotyczące patomechanizmu ischemii-reperfuzji stanowiły część mojej
pracy doktorskiej pt. „Ekspresja cytokin i rola reaktywnych form tlenu w uszkodzeniu wywołanym
26
ischemią-reperfuzją w śluzówce żołądka szczura”. Publiczna obrona pracy doktorskiej miała
miejsce 8 kwietnia 2002 roku, a na prowadzenie doświadczeń uzyskałam wsparcie finansowe w
postaci grantu promotorskiego (załącznik IV, pkt. I1).
O ile rola H. pylori, jako głównego czynnika etiologicznego w nieżycie oraz wrzodach
żołądka wydaje się być niekwestionowana, to rola tej bakterii w innych jednostkach chorobowych
była słabo poznana, albo w ogóle nie badana. W przeprowadzonych badaniach wykazano, że
poziom immunoreaktywnej gastryny w osoczu oraz tkankach nowotworowych, tak samo ekspresja
mRNA dla gastryny i jej receptora CCKB-R w tkankach rakowych były znacząco wyższe u pacjentów
z rakiem płuc w porównaniu do kontroli. Uzyskane wyniki wskazują, że gastryna, jako silny
mitogen w przewodzie pokarmowym, może być uwikłana w kancerogenezę płuc, poprzez
stymulowanie proliferacji komórek i wzrostu nowotworu. Płuca embriologicznie pochodzą z tych
samych komórek endodermy (wewnętrznego listka zarodkowego) co komórki wyściełające
i gruczoły w przewodzie pokarmowym, dla których gastryna jest silnym stymulatorem proliferacji.
Częstość występowania HP, szczególnie szczepów CagA+, była znacznie wyższa u pacjentów
z rakiem płuc niż w zdrowej populacji kontrolnej (załącznik VI, pkt. B28). W tkankach pobranych
z raka płuc oraz z obrzeża tego nowotworu po resekcji wykryto mRNA dla gastryny i CCKB-R.
Również mRNA dla COX-2 było wykrywane w większości wycinków nowotworu i obrzeży,
natomiast nie wykrywano go w nietkniętej śluzówce oskrzeli, gdzie jedynie COX-1 było obecne.
Tkanki nowotworu płuc i ich obrzeża zawierały wielokrotnie wyższe stężenia immunoreaktywnej
gastryny niż zdrowa śluzówka oskrzeli (załącznik IV, pkt. A6).
Uszkodzenie śluzówki żołądka pod wpływem HP jest spowodowane przez różne szkodliwe
substancje pochodzenia zarówno bakteryjnego, jak i z tkanek gospodarza, a które wiąże się ze
zwiększonym ryzykiem choroby wieńcowej (CAD). W badaniach wykazano silną korelację między
przyrostem niektórych cytokin (IL-6, TNFα) a chorobami sercowo-naczyniowymi. Infekcja HP
indukowała aktywację płytek krwi i ich agregację, co może wyjaśniać patogenny związek infekcji
HP i CAD (załącznik IV, pkt. A3). W badaniach z udziałem 76 pacjentów z CAD oraz 81 zdrowych
osób (kontrola) wykazano, że infekcja HP znacząco zwiększa ryzyko CAD szczególnie, gdy
analizowano przeciwciała klasy IgG anty-HP i anty-CagA. Przeciwciała anty-HP wykryto u 81,5%
chorych w porównaniu do 51% u kontroli, natomiast przeciwciała anty-CagA u 47,3% pacjentów
z CAD i tylko 28% w kontroli. U pacjentów CAD zanotowano też wyższe stężenia białka CRP
i fibrynogenu osoczowego oraz podwyższony poziom całkowitego cholesterolu. Wyniki te sugerują,
że większa częstość występowania cytotoksycznych szczepów HP może wzmagać procesy
miażdżycowe poprzez indukowanie stałej, choć słabej odpowiedzi zapalnej w ścianach tętnic ze
wzmożoną syntezą czynników ostrej fazy.
27
Wykazanie, że w uszkodzeniu śluzówki żołądka, istotną rolę odgrywa zaburzenie
równowagi BAX/BCL-2 i nadmierna apoptoza spowodowały rozszerzenie zainteresowań także na
inne schorzenia w tym choroby neurodegeneracyjne, gdzie wielu naukowców także rozważało rolę
apoptozy w patogenezie schorzenia. W przeprowadzonych badaniach nie wykazano cech apoptozy
(cięcie DNA metodą TUNEL) w żadnej z próbek pobranych z centralnego układu nerwowego od
pacjentów ze stwardnieniem zanikowym bocznym ani od pacjentów kontrolnych. Doświadczenia te
prowadzono w ramach projektu badawczego (załącznik IV, pkt. I3), a uzyskane wyniki z
wykorzystaniem innych metod wykrywania apoptozy zostały opublikowane (załącznik IV, pkt. A13,
załącznik VI, pkt. B20, B36, B37).
Ad. 3. Po obronie pracy doktorskiej i zmianie miejsca pracy nie miałam możliwości kontynuowania
badań w powyższej tematyce, jednak nadal interesował mnie wpływ reaktywnych form tlenu na
organizm człowieka. Zbieg okoliczności sprawił, że do zespołu prof. Tuszyńskiego trafiłam w czasie,
gdy uzyskano grant mający na celu szeroko zakrojone badania nad przeciwutleniaczami (załącznik
IV, pkt. I4). Z uwagi na swoje doświadczenie w pracy z rodnikami zostałam członkiem zespołu
i przez kilka następnych lat przeciwutleniacze stanowiły najważniejszy trzon moich zainteresowań
naukowych.
W początkowym okresie skupiłam się na ocenie właściwości antyoksydacyjnych,
bioróżnorodności i biodostępności związków polifenolowych w różnych surowcach roślinnych,
produktach żywnościowych i suplementach diety. W ramach wspomnianego projektu naukowego
brałam udział w doświadczeniach związanych w oceną potencjału antyoksydacyjnego (AOX) oraz
zawartości polifenoli w różnych odmianach jabłek i wytworzonych z nich przetworów (susze,
chipsy, cydry, wina). W przeprowadzonych badaniach wykazano ogromne zróżnicowanie badanych
parametrów w zależności od odmiany owocu. Spośród przebadanych kilkunastu odmian jabłek
najwyższe wartości AOX i polifenoli ogółem wykazano dla odmiany Antonówka (4059,2 mg
troloksu/100 g s.s i 524,7 mg katechiny/100 g s.s.). Z kolei Gala Mast, Idared i Koksa
pomarańczowa charakteryzowały się najsłabszymi zdolnościami antyoksydacyjnymi. Wykazano, że
choć skład związków polifenolowych zależy od odmiany owocu, jednak we wszystkich badanych
jabłkach dominują 3 związki: (-)-epikatechina, procyjanidyna B2 i kwas chlorogenowy. Profil
polifenoli zależał także od części owocu. W nasionach dominującym związkiem okazała się
florydzyna, stanowiąca od 72-84% wszystkich oznaczanych polifenoli oraz kwas chlorogenowy. Nie
stwierdzono natomiast obecności glikozydów kwercetyny, które stanowiły istotną frakcję polifenoli
skórek. W skórach jabłek oprócz glikozydów kwercetyny znaczący udział miały (-)-epikatechina
i procyjanidyna B2, natomiast w miąższu dominowały: kwas chlorogenowy, (-)-epikatechina
i procyjanidyna B2. Nasiona jabłek odznaczały się większą aktywnością przeciwutleniającą w
porównaniu do skórek i miąższu.
28
Znaczne zróżnicowanie właściwości antyoksydacyjnych oraz zawartości polifenoli w
owocach jabłek zachęciło do poszukiwania innych bogatych źródeł tych związków. W
początkowych etapach skoncentrowano się na innych owocach, głównie na gatunkach rzadziej
wykorzystywanych w przetwórstwie, ale powszechnych w gospodarstwach domowych. Szczególnie
uwagę skupiono na roślinach o tradycyjnym zastosowaniu w medycynie ludowej, z uwagi na
właściwości lecznicze. W ramach przeprowadzonych badań wykazano, że owoce pigwowca
japońskiego, derenia jadalnego czy morwy czarnej odznaczają się silnymi właściwościami
antyoksydacyjnymi, związanymi głównie z dużą zawartością polifenoli. Owoce pigwowca
japońskiego i derenia jadalnego miały kilkukrotnie wyższy AOX (odpowiednio 2631 i 1782 mg
troloksu/100 g) w porównaniu z innymi owocami krajowymi (jabłka – około 500 mg
troloksu/100 g, gruszki – 324, śliwki – 448, melony – 38). Ich potencjał antyrodnikowy wynikał
głównie z dużego stężenia związków polifenolowych. Część z omówionych powyżej badań
stanowiła zadania badawcze w projekcie badawczym finansowanym przez Ministerstwo Nauki
i Szkolnictwa Wyższego (załącznik IV, pkt. I5), w którym byłam głównym wykonawcą.
Za cenne źródło związków polifenolowych o wysokim potencjale antyoksydacyjnym uważa
się zioła i herbaty. W badaniach przeprowadzonych na kilkunastu ziołach i preparatach
wykorzystywanych w ziołolecznictwie wykazano, że potencjał antyoksydacyjny i zawartość
polifenoli zależy od użytego ekstrahenta, a domowe sposoby przygotowania naparów z ziół mogą
powodować utratę cennych składników. Największą aktywność antyoksydacyjną (1753 mg
troloksu/g s.m.) i najwyższy poziom polifenoli (200 mg katechiny/g s.m.) wykazano dla ekstraktów
z borówki brusznicy. Cennym źródłem związków przeciwutleniających były także kora dębu,
dziurawiec oraz kwiaty głogu i bzu czarnego. Z kolei niskim AOX odznaczały się liście pokrzywy
oraz ziele skrzypu, jemioły i fiołka. Znacznie wyższym (ponad 5-krotnie) potencjałem
przeciwutleniającym niż zioła charakteryzują się herbaty. Wykazano, że AOX herbat zależy od kraju
pochodzenia liścia oraz sposobu jego obróbki. Herbaty zielone są silniejszymi przeciwutleniaczami
(786-2068 mg troloksu/100 ml naparu, w zależności od gatunku) niż herbaty czerwone (505-595) i
czarne (396-1160).
Część doświadczeń miała na celu zbadanie wpływu dojrzewania i warunków
przechowywania na stężenie i profil polifenoli w surowcach roślinnych i gotowych produktach.
W przypadku herbat (zielonych, czerwonych i czarnych) wykazano spadek AOX (do 35%) podczas
1-miesięcznego przechowywania otwartych opakowań w temperaturze pokojowej. Z kolei
w przypadku jabłek ich AOX rósł trakcie przechowywania (chłodnia), podobnie jak zwiększało się
stężenie procyjanidyny B1, C1 i (+)-katechiny. Jest to sytuacja odwrotna niż miała miejsce podczas
dojrzewania jabłek, gdy AOX owoców malał, czemu towarzyszyło zmniejszenie zawartości kwasu
chlorogenowego, (-)-epikatechiny i florydzyny.
29
Kolejnym etapem w mojej pracy było zbadanie jak na stężenie antyoksydantów w
produktach spożywczych wpływają różne procesy technologiczne, ze szczególnym uwzględnieniem
doboru optymalnych parametrów procesów technologicznych, aby zwiększyć zawartość związków
przeciwutleniających i kształtować profil polifenoli. Wytworzone z wybranych odmian jabłek
przetwory, takie jak susz jabłkowy i chipsy, charakteryzowały się niższym AOX niż wyjściowy
surowiec (1500-2500 wobec 2829 - 4140 mg troloksu/100 mg s.s.). Skład polifenolowy był bardzo
zbliżony do jabłek, a głównymi związkami były kwas chlorogenowy, (-)-epikatechina oraz
procyjanidyny B2 i C1. Dodatkowo stwierdzono obecność 5-hydroksymetylofurfuralu (HMF).
Wykazano, że w odbiorze produktu przez konsumenta istotne znacznie ma wybór właściwej
odmiany oraz dobór parametrów procesu produkcji. Spośród ocenianych odmian, za najbardziej
przydatną do produkcji chipsów uznano jabłka Golden Delicious. Stwierdzono także, że grubość
plastrów jabłek w zakresie od 3,0 do 3,5 mm oraz temperatura suszenia wynosząca 90°C były
optymalne w celu zapewnienia zarówno wysokiej atrakcyjności sensorycznej produktu, jak
i wysokiej zawartości polifenoli i aktywności przeciwutleniającej. Zastosowanie wstępnej obróbki
mikrofalowej (300 W, 5 min) pozwoliło na znaczne skrócenie czasu suszenia i przyczyniło się do
znacznego wzrostu zawartości polifenoli (o około 60%) i aktywności przeciwutleniającej (80%),
nie wpływając jednak negatywnie na ocenę organoleptyczną chipsów. Wyniki zgromadzone w
ramach tych badań pozwoliły na otrzymanie patentu „Sposób wytwarzania chipsów jabłkowych”
(załącznik IV, pkt. B2).
Innymi przetworami wytworzonymi z jabłek w ramach projektu badawczego były wina
i cydry. Oceniano wpływ warunków fermentacji na zawartość związków polifenolowych
i potencjał antyoksydacyjny win. Najkorzystniejszymi właściwościami antyoksydacyjnymi wśród
badanych napojów, odznaczały się wina z jabłek odmiany Šampion (466,1 mg troloksu/100 ml),
natomiast w przypadku odmiany Gloster aktywność ta była ponad 7-krotnie niższa. AOX był
bezpośrednio związany z ilością polifenoli oraz ich profilem. Wykazano, że dominującym
związkiem we wszystkich winach był kwas chlorogenowy, którego zawartość mieściła się w
zakresie od 12,7 mg/l (Gloster) do 25,8 mg/l (Šampion). Cechą wspólną była też zbliżona zawartość
pochodnych kwasu cynamonowego i (-)-epikatechiny oraz mała ilość pochodnych glikozydowych
kwercetyny. Stężenie pozostałych związków było silnie uzależnione od odmiany jabłek użytej do
fermentacji. Wykazano również, że pasteryzacja moszczu przed fermentacją spowodowała istotny
wzrost stężenia procyjanidyn, w odniesieniu do prób bez obróbki termicznej. Z kolei fermentacja w
miazdze zwiększała AOX otrzymywanych win jabłkowych, co było bezpośrednio związane z
zawartością polifenoli. Wykazano również, że AOX win można poprawić poprzez zastosowanie
komórek drożdży immobilizowanych w alginianie wapnia, co powodowało znaczący wzrost
stężenia kwasu chlorogenowego oraz (+)-katechiny i (-)-epikatechiny.
30
Wpływ różnych parametrów suszenia i obróbki mikrofalowej badano także na owocach
śliwy. Wykazano, że temperatura suszenia powyżej 90°C istotnie zwiększała aktywność
antyoksydacyjną uzyskanych suszów. Zastosowanie podsuszania mikrofalowego znacznie
(o ok. 5O%) zmniejszało straty polifenoli ogółem w procesie otrzymywania suszu. Wysoka
temperatura wpływa korzystnie na tworzenie się nowych, nieobecnych w surowcu związków
(produkty reakcji Maillarda), powstających w wyniku reakcji nieenzymatycznego brunatnienia.
Jednym z takich związków jest hydroksymetylofurfural (HMF), wykazujący aktywność
przeciwrodnikową. Związki Maillarda działają również hamująco na oksydazę polifenolową,
ograniczając spadek AOX w wyniku rozkładu polifenoli.
W przeprowadzonych badaniach wykazano, że w wyniku procesów technologicznych
znaczna część składników bioaktywnych ulega degradacji lub usunięciu z produktu, stąd pojawił się
pomysł by wzbogacać żywność w te związki. Dlatego też kolejnym obszarem badawczym była
ocena możliwości odzysku przeciwutleniaczy, szczególnie związków polifenolowych z surowców
roślinnych i odpadów przemysłu owocowo-warzywnego oraz próba ich zastosowania w przemyśle
do wzbogacania żywności i wytworzenia produktów funkcjonalnych. Ponieważ odpady z
przemysłu owocowo-warzywnego wytwarzane są w ogromnych ilościach i stanowią poważny
problem, postanowiono sprawdzić właściwości antyoksydacyjne oraz zawartość tanin i polifenoli w
skórkach i pestkach różnych owoców, zarówno krajowych i importowanych. Wykazano, że odpady
te stanowią bogate źródło przeciwutleniaczy. Wśród analizowanych części owoców najwyższy AOX
oznaczono w skórkach z jabłek odmiany Šampion (7925 mg troloksu/100 g s.s.) i z białych
winogron (6944) oraz w nasionach jabłek odmiany Idared i pomarańczy (odpowiednio, 7230
i 3423 mg troloksu/100 g s.s.). Najbogatszym źródłem polifenoli były nasiona i skórki winogron,
zawierające odpowiednio 9207 mg katechiny/100 g s.s. w nasionach winogron czerwonych i 8220
w nasionach z winogron białych oraz odpowiednio 5129 and 3794 w ich skórkach. Taniny
odgrywały istotną rolę w potencjale antyoksydacyjnym winogron, jabłek i agrestu. W innych
badaniach wykazano, że wytłoki z winogron i jabłek charakteryzowały się stosunkowo wysokim
AOX (odpowiednio 1452 i 415 mg troloksu/100 g ś.m.) i zawartością związków polifenolowych
(130 i 142 mg katechiny/100 g ś.m.) i stanowiły dobre źródło błonnika pokarmowego. Wytłoki
marchwiowe, mimo małej zawartości suchej masy, były również cennym źródłem β-karotenu.
Możliwości wykorzystania odpadów z przetwórstwa owocowo-warzywnego wymagają, aby
odzysk tych bioaktywnych związków był wydajny i opłacalny. Dlatego też zbadano wpływ różnych
rozpuszczalników oraz różnych metod na odzysk związków aktywnych z wytłoków owocowowarzywnych. Wykazano, że ekstrakcja metodą Soxhleta jest wydajniejsza niż maceracja
i perkolacja. Ponadto, rozpuszczalniki organiczne (np. aceton) stanowiły najlepsze ekstrahenty.
Niestety większość z nich jest toksycznych dla człowieka. Dlatego też, z uwagi na stosunkowo niską
31
toksyczność przy wysokiej wydajności ekstrakcji, jaką wykazano w badaniach, zaleca się
wykorzystywać do tego procesu wodny roztwór etanolu w stężeniu 60-80%.
Podczas przeprowadzanych doświadczeń coraz częściej uświadamiałam sobie, że to nie
ilość związków polifenolowych w produkcie jest najważniejsza, ale ich biodostępność, gdyż nie
każdy związek obecny w żywności czy suplemencie diety może być przez organizm konsumenta
wykorzystany. Wraz z zespołem zbadaliśmy, jak poszczególne etapy trawienia wpływają na
polifenole (i ich potencjał antyoksydacyjny) zarówno w postaci czystych związków, jak i w
powiązaniu z matrycą żywności (ekstrakty, owoce). Doświadczenia dotyczące tych zagadnień były
prowadzone w ramach grantu finansowanego przez Narodowe Centrum Nauki (załącznik IV, pkt.
I6), w którym byłam głównym wykonawcą. W trakcie badań opracowano model in vitro
uwzględniający symulację wszystkich etapów trawienia, tj. etap żołądka i jelita cienkiego, z
odpowiednią regulacją pH i symulacją wydzielania enzymów trawiennych, etap wchłaniania z
użyciem membran dializacyjnych oraz jelita grubego z rezydującą w nim mikrobiotą jelitową.
Wykazano, że w wyniku działania enzymów trawiennych aktywność antyoksydacyjna owoców
(jabłka i śliwki) wzrastała, co było związane ze zwiększeniem ilości polifenoli i z lepszą ich
przyswajalnością, wywołaną głównie przemianami do związków prostszych (monomery, aglikony).
Udowodniono także dobrą przyswajalność katechiny, zarówno naturalnie obecnej w badanych
owocach, jak i tej pochodzącej z trawienia procyjanidyn. W symulacji trawienia owoców aronii,
gruszek i bananów - odwrotnie niż w przypadku jabłek i śliwek - wykazano spadek aktywności
antyoksydacyjnej. Wszystkie dializaty uzyskane po symulowanym trawieniu charakteryzowały się
mniejszą zawartością polifenoli ogółem w porównaniu do surowca wyjściowego. Fenolokwasy oraz
procyjanidyny odznaczały się mniejszym stopniem wchłaniania. Podczas symulowanego trawienia
rozkładowi ulegały głównie glikozydy kwercetyny i cyjanidyny. Wykazano zróżnicowany wpływ
mikrobioty jelitowej na związki polifenolowe obecne w badanych owocach. Metabolizm bakteryjny
odegrał szczególnie istotną rolę w przypadku trawienia polifenoli obecnych w jabłkach oraz
truskawkach. Uzyskane wyniki potwierdziły, że prawidłowe funkcjonowanie mikrobioty jelitowej
jest kluczowe dla metabolizmu licznych substancji chemicznych dostarczanych wraz z
pożywieniem.
Przedstawione badania i uzyskane w nich wyniki stanowiły znaczący wkład w rozwój technologii
żywności i zostały opublikowane w renomowanych czasopismach o zasięgu międzynarodowym
(załącznik IV, pkt. A16, A19, A21, A22, A24, A25, A28, A29) i krajowym (załącznik IV, pkt. D8, D11,
D13, D15-D19, D24-D28, D32, D36, D39, D44), a także zaprezentowane na krajowych i
zagranicznych konferencjach i sympozjach naukowo-badawczych (załącznik VI, pkt. B38-B45, B48B56, B59, B69, B71, B73, B77, B79). Zwieńczeniem grantu zamawianego nr 094/P06/2003/28
(załącznik IV, pkt. I4) było również współautorstwo monografii pt. „Przeciwutleniacze w żywności.
32
Aspekty zdrowotne, technologiczne, molekularne i analityczne”, pod redakcją prof. Włodzimierza
Grajka (załącznik IV, pkt. D3-D7).
Ad. 4. Pamiętając o roli reaktywnych form tlenu w rozwoju różnych chorób, ale także o ich udziale
w psuciu się żywności, postanowiłam zbadać możliwości wykorzystania polifenoli i innych
przeciwutleniaczy do zwiększenia stabilności produktów żywnościowych. Tym bardziej, że podczas
badań nad możliwościami wzbogacania żywności w związki polifenolowe i antyoksydanty
zaobserwowano, że często substancje te mają negatywny wpływ na mikroorganizmy. Polifenole,
jako składniki naturalne, zdawały się być idealnym kandydatem na tańszą i zdrowszą alternatywę
sztucznych konserwantów. Co więcej, oprócz korzystnego działania na składniki żywności,
powinny wywierać także pozytywne działanie na organizm człowieka i stanowić skuteczne
narzędzie w profilaktyce chorób, w których rozwoju uczestniczą RFT.
Wstępne badania nad wpływem ekstraktów z 13 różnych roślin na różne bakterie jelitowe
wykazały, że bakterie Escherichia coli były wrażliwe na ekstrakt z nasion grejpfruta, podczas gdy
ekstrakty z owoców kolcowoju chińskiego i bzu czarnego hamowały wzrost Enterococcus caccae.
Z kolei Lactobacillus sp. był wrażliwy tylko na ekstrakt z borówki brusznicy. W innych badaniach
wykazano, że Citrosept wykazywał silne inhibitorowe działanie wobec beztlenowych gatunków
mikrobioty jelitowej, najsilniej działając na Bacteroides galacturonicus, którego wzrost hamował już
w stężeniu 1%. Sok z noni powodował zmniejszenie liczebności populacji B. galacturonicus
o ok. 30%, podczas gdy na Ruminococcus gauvreauii działał lekko stymulująco. Ani sok z noni ani
Citrosept nie wywierały wpływu na Bifidobacterium catenulatum.
Spirulina, to biomasa sinic, będących bogatym źródłem składników bioaktywnych, w tym
związków o charakterze przeciwutleniającym, o pozytywnym wpływie na organizm człowieka.
Wykazano, że synteza bioaktywnych związków i właściwości antyoksydacyjne tych cyjanobakterii
zależą od składu medium hodowlanego. Wodne ekstrakty ze Spiruliny (WES) hamowały wzrost
pleśni Penicillium, drożdży Rhodotorula oraz bakterii Bacillus subtilis i Micrococcus luteus, co
sugerowałoby potencjalne zastosowanie w zapobieganiu psucia się żywności. Jednakże wobec
Alicyclobacillus acidoterrestris oraz Geotrichum sp. wykazywały aktywność stymulującą. Wysokie
stężenia WES stymulowały także rozwój grzybni i produkcję konidioforów u Cladosporium
i Aspergillus niger.
A. acidoterrestris stanowi poważny problem w produkcji soków, szczególnie cytrusowych, z
uwagi na jego odporność na proces pasteryzacji. Przebadano 15 ziół i wykazano, że większość z
nich stymuluje wzrost tej bakterii. Jedynymi skutecznymi inhibitorami wzrostu A. acidoterrestris
były ekstrakty z dzikiej róży, kwiatów kocanki piaskowej, liści pokrzywy oraz korzeni lukrecji
i arcydzięgla.
33
Zaskakujące wyniki uzyskano w doświadczeniach z udziałem Lactobacillus casei,
reprezentującego bakterie probiotyczne. Wykazano, że katechina w stężeniu 100-400 μM oraz
kwas chlorogenowy (400 μM) wywierają efekt stymulujący na wzrost L. casei. Natomiast
kwercetyna w stężeniach 25-50 μM hamowała wzrost tej bakterii, jeśli czas inkubacji był dłuższy
niż 6 h. Ekstrakt z liści borówki brusznicy powodował nieznaczny wzrost liczebności bakterii,
podczas gdy ekstrakty z kawy, aronii i dzikiej róży istotnie hamowały L. casei. Uzyskane wyniki po
raz pierwszy wyraźnie wskazały na konieczność prawidłowego doboru dodatków do żywności
probiotycznej, gdyż wiele surowców roślinnych użytych w celu wzbogacenia smaku i wartości
odżywczych oraz zdrowotnych produktów, może spowodować utratę właściwości probiotycznych,
na skutek zahamowania wzrostu zastosowanych szczepów. Ponieważ badane ekstrakty
i suplementy diety były bogatym źródłem polifenoli, dlatego też sprawdzono wpływ czystych
związków na przedstawicieli mikrobioty jelitowej. Wykazano, że kemferol silnie hamował wzrost
badanych bakterii jelitowych, działając najmocniej wobec R. gauvreauii (minimalne stężenie
hamujące – MIC 20 µg/ml) oraz Eubacterium cylindroides (MIC 50 µg/ml). Słabszymi inhibitorami
były rezweratrol i florydzyna. Rezweratrol silnie hamował wzrost Lactobacillus sp. i R. gauvreauii
(MIC 100 µg/ml) oraz E. caccae (MIC 250), a florydzyna słabo hamowała E. caccae i R. gauvreauii
(MIC>250). Wykazano także, że związki polifenolowe chronią komórki nabłonkowe jelita przed
stresem oksydacyjnym i proliferacją, przy czym kwas chlorogenowy i kwercetyna wykazują
silniejsze działanie ochronne niż epigalokatechina.
Podsumowując wyniki kilkunastu lat pracy naukowej mogłam uznać, że związki
o właściwościach antyoksydacyjnych pełnią pozytywną rolę dla zdrowia człowieka, hamują psucie
się żywności, zapobiegają niektórym chorobom i stresowi oksydacyjnemu. Z drugiej strony,
uzyskane wyniki wskazują, że niektóre suplementy diety i farmaceutyki mogą wywierać negatywny
efekt na zdrowie człowieka, zamiast je wspomagać. Związki polifenolowe wchodzące w ich skład,
stosowane w nadmiarze mogą negatywnie wpłynąć na funkcjonowanie fizjologicznej mikrobioty
jelitowej i całego organizmu. Jednocześnie, analiza wyników przeprowadzonych doświadczeń z
trawienia in vitro, wykazała, że aktywność biologiczna wielu polifenoli zależy od ich
biotransformacji przez mikroorganizmy jelitowe. Zagadnienia interakcji polifenoli i mikrobioty
jelitowej stały się tematem grantu badawczego pt. Interakcje pomiędzy mikroflorą przewodu
pokarmowego
człowieka
a
składnikami
żywności
funkcjonalnej
o
właściwościach
antyoksydacyjnych, finansowanego przez NCN, a którego byłam kierownikiem (załącznik IV, pkt.
I7). Wyniki uzyskane w ramach tego projektu oraz innych badaniach były podstawą do
przygotowania mojej monografii habilitacyjnej. W ostatnim czasie kontynuuję tę tematykę, a moje
zainteresowania koncentrują się na dalszym badaniu wpływu suplementów diety oraz różnych
preparatów ziołowych i farmaceutycznych na bakterie jelitowe, w szczególności na szczepy
probiotyczne.
34
Wyniki wymienionych badań były opublikowane w postaci kilku oryginalnych prac twórczych w
czasopismach z zasięgu międzynarodowym (załącznik IV, pkt. A13, A23, A26, A27, A31) i krajowym
(załącznik IV, pkt. D12, D14, D34, D35) oraz były prezentowane na licznych konferencjach
międzynarodowych i krajowych (załącznik VI, pkt. B57, B60, B61, B65-B68, B75, B76, B81, B87,
B89).
Ad. 5. W pewnym sensie pobocznym tematem badawczym, jednak ściśle związanym z moimi
zainteresowaniami i wykształceniem biologa, są doświadczenia nad możliwościami wykorzystania
różnych mikroorganizmów. Z uwagi na zatrudnienie na Wydziale Technologii Żywności badania te
koncentrowały się przede wszystkim na zastosowaniu drobnoustrojów w przemyśle spożywczym.
Z kolei ze względu na specyfikę katedry, większość badań, w których uczestniczyłam dotyczyła
napojów alkoholowych, w szczególności optymalizacji parametrów prowadzonych procesów
technologicznych oraz doskonalenia metod analitycznych. Głównym celem tych doświadczeń było
zwiększenie wydajności wytwarzania, poprawienie stabilności zarówno chemiczno-fizycznej,
jak i mikrobiologicznej oraz zwiększenie trwałości przechowalniczej i atrakcyjności sensorycznej
dla konsumenta.
Ponieważ Polska jest zaliczana jest do najchłodniejszej strefy uprawy winorośli w Europie,
jeden z obszarów badawczych dotyczył win i win owocowych wytwarzanych w Polsce. Wykazano,
że wina chłodnego klimatu wytwarzane z winorośli z południowych regionów naszego kraju
spełniają wymagania normatywne Unii Europejskiej i mogą stanowić konkurencję dla win
uzyskiwanych w tradycyjnych krajach winiarskich. Odmiany winorośli szczególnie przydatne do
tego celu to m.in. Marechal Foch, Leon Millot, Aurora, Rondo, Regent, Bianca, Perła Zali. Odmiany te
charakteryzowały się zawartością ekstraktu w zakresie 12,85-21,85 g/100 g oraz zbliżoną
kwasowością ogólną. Uzyskane z nich wina miały niewielką zawartość ekstraktu ogółem (poniżej
4%), stężenie alkoholu w zakresie 9,9-14,5% obj. oraz kwasowość od 4,0-8,7 g/l. Dominującymi
związkami lotnymi tych win były alkohole wyższe, głównie alkohole izoamylowe oraz izobutanol.
Polskie wina gronowe, ze względu na wysoką kwasowość, były również bogate w octan etylu.
Badania win i cydrów wytworzonych z jabłek w ramach projektu badawczego (załącznik IV,
pkt. I4) spowodowały wzrost zainteresowania tą tematyką, szczególnie że jabłka stanowią bardzo
dobry surowiec do produkcji win. Temat ten w ostatnich latach nabrał też uzasadnienia
ekonomicznego z uwagi na warunki geo-polityczne, które sprzyjają, a raczej wymuszają
przeznaczanie sporej części plonów z sadów jabłkowych do przetwórstwa. W przeprowadzonych
badaniach wykazano, że wytworzone z polskich jabłek moszcze charakteryzowały się stosunkowo
niską kwasowością (1,5-4,7 g/l) i zawartością ekstraktu na poziomie 11°Blg. W wyniku fermentacji
otrzymano wina o niskim stężeniu cukru resztkowego, zawierające bardzo bogaty profil związków
35
lotnych, z dominującymi alkoholami fuzlowymi, aldehydem octowym, octanem etylu, butanole
i kwasem octowym.
Moje doświadczenia z tematyką win zimnego klimatu i win jabłkowych spowodowały, że
zainteresowania rozciągnęły się także na inne napoje alkoholowe. Wykonane badania
i doświadczenia miały na celu wykonanie wstępnej analizy rynku krajowego oraz poznanie wiedzy
i potrzeb konsumentów, a następnie optymalizację procesów wytwarzania różnych napojów
alkoholowych, w tym miodów pitnych czy piw bezcukrowych.
Jak już wspomniałam moje zainteresowania obejmują możliwości wykorzystania
drobnoustrojów na szeroko rozumiane potrzeby człowieka, co jest dużym obszarem, obejmującym
także procesy biosorpcji i biodegradacji. Badano wpływ immobilizacji (w alginianie sodu, żelu
krzemionkowym i agarozowym) biomasy sinic Arthrospira platensis na wydajność biosorpcji
ołowiu. Najskuteczniejszym biosorbentem okazały się komórki im mobilizowane w alginianie, z
wydajnością wynoszącą 425 mg ołowiu/g s.s. biosorbenta. Sinice immobilizowane w żelu
agarozowym i krzemionkowym były znacznie mniej wydajne (odpowiednio 273 i 2 mg Pb/g s.s.).
Na wydajność biosorpcji ołowiu przez bakterie wpływało pH i stężenie wyjściowe ołowiu,
największą wydajność bakterii immobilizowanych w żelu alginianowym i agarozowym
obserwowano w pH 5,0 i przy początkowym stężeniu ołowiu 500 mg/l, podczas gdy
dla żelu krzemionkowego korzystniejsze wyniki osiągano przy pH 4,0 i stężeniu ołowiu na
poziomie 100 mg/l.
Do usuwania ołowiu wykorzystywano także biomasę odpadową drożdży piekarskich,
paszowych i browarniczych, wykazując największą wydajność usuwania Pb przy zastosowaniu
drożdży piekarskich i wyjściowego stężenia ołowiu 500 mg/l. Udowodniono, że wszystkie
testowane drożdże usuwały z roztworu ponad 90% ołowiu w ciągu 20 min procesu, przy czym
jedynie zastosowanie drożdży piekarskich umożliwiało obniżenie poziomu Pb poniżej 1 mg/l
z roztworów o wyjściowym stężeniu 200 i 500 mg Pb/l.
Biomasa drożdży może również znaleźć zastosowanie w technologii żywności, jako
zamiennik mięsa w produktach spożywczych. Przeprowadzone doświadczenia potwierdziły, że
drożdże piekarnicze i ich hydrolizaty nadawały wytworzonym pasztetom „mięsny” posmak,
zastępując całkowicie użycie mięsa i wątroby wieprzowej do wyrobu. Stanowiły także cenne źródło
białek i mikroelementów w tych produktach, dzięki czemu mogą stanowić ciekawą alternatywę dla
wegetarian.
Wyniki uzyskane z badań powyżej omówionych zostały opublikowane w postaci kilku oryginalnych
publikacji w czasopismach o zasięgu krajowym i międzynarodowym (załącznik IV, pkt. A14, A18,
A20, A24, A28, A30, D10, D20-D22, D29, D31, D33, D37-D38, D41, D43), były prezentowane w
postaci doniesień podczas konferencji naukowe (załącznik VI, pkt. B47, B58, B72, B83, B85, B86,
36
B88), pozwoliły też na przygotowanie skryptu dla studentów Wydziałów Technologii Żywności, pt.
„Procesy Fermentacyjne. Przewodnik do ćwiczeń” (załącznik IV, pkt. D23) oraz uzyskanie patentu
(załącznik IV, pkt. B2).
Kraków 27.03.2015
37
Tabelaryczne zestawienie dorobku
L.p.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
Nazwa czasopisma
Liczba
publikacji
Punktacja wg roku
Punktacja aktualna b
publikacji a
KBN
IF
KBN
IF
Publikacje naukowe w czasopismach znajdujących się w bazie Journal Citation Reports
Eur J Pharmacol
2
22
4,211
60
5,368
J Physiol Pharmacol
3
43
5,016
75
8,160
Digestion
1
10
1,780
20
2,032
Scan J Gastroenterol
1
10
1,842
20
2,329
Med Sci Monitor
3
15
0,000
45
3,648
Prostag Oth Lip Med.
1
9
1,469
20
2,391
J Physiol-Paris
1
8
0,862
30
2,345
Int J Colorectal Dis
1
10
1,848
30
2,499
Folia Neuropathol
1
10
0,346
20
1,667
Food Chem
1
24
2,696
40
3,259
J Elementol
2
21
0,281
30
1,286
Food Sci Technol Int
1
20
0,467
25
0,981
J Food Process Pres
2
26
0,944
40
1,876
J Agr Food Chem
1
24
2,469
45
3,107
Food Technol Biotech
1
15
0,976
25
0,977
J Food Comp Anal
1
32
1,948
35
2,259
Zywn-Nauk Technol Ja
2
24
0,347
30
0,622
Post Mikrobiol
1
13
0,145
15
0,271
Czech J Food Sci
1
15
0,685
20
0,741
J Environ Sci Heal A
1
20
1,252
20
1,135
J Food Sci Tech – Mys
1
20
1,123
20
2,024
Fruits
1
25
0,800
25
0,800
Eur J Nutr
1
35
3,840
35
3,840
suma
31
451
35,347
725
53,617
Publikacje w czasopismach spoza listy JCR
Post Biol Kom
1
4
15
Przem Ferm Owoc-Warz.
8
41
40
Acta Sci Pol Technol Aliment
6
35
60
Pol J Food Nutr Sci
1
10
10
EJPAU
2
8
14
Herba Pol
2
15
16
J Int Sci Public – MMT
2
4
J Fruit Ornam Plant Res
1
6
Przem Spoż
1
6
5
Żyw Człow Metab
1
1
4
Roczniki PZH
2
12
14
Potravinárstvo
4
20
20
suma
31
162
198
Inne
Rozdziały w monografii
12
Udzielone patenty
2
Doniesienia opublikowane w
89
materiałach konferencyjnych
suma
613
35,347
923
53,617
a – punkty obowiązujące w roku opublikowania Punkty za publikację w czasopiśmie naukowym określono według ministerialnej listy czasopism punktowanych
obowiązującej na koniec roku, w którym ukazała się publikacja. Dla publikacji z lat 1999-2005 punktację KBN ustalono na podstawie danych bibliograficznych
Biblioteki Medycznej Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego (Baza Expertus)
b – punkty zgodnie z aktualną ministerialną listą czasopism punktowanych z 31 grudnia 2014 oraz na podstawie listy JCR opublikowanej w roku 2014.
38

Autoreferat - Wydział Technologii Żywności

Transkrypt

Podobne dokumenty