Nr kat. IR616
Transkrypt
Nr kat. IR616
FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human p53 Protein Klon DO-7 Ready-to-Use (Link) Nr kat. IR616 Przeznaczenie Do stosowania w diagnostyce in vitro. Przeciwciało FLEX Monoclonal Mouse Anti-Human p53 Protein, Ready-to-Use, (Link), jest przeznaczone do stosowania w immunohistochemii w aparatach Autostainer Link. Przeciwciało barwi natywne i zmutowane białko p53 i jest uŜyteczne w identyfikacji akumulacji białka p53 w nowotworach ludzkich (1, 2, 3). Interpretacja kliniczna wystąpienia lub braku barwienia musi być uzupełniona przez badania morfologiczne z wykorzystaniem odpowiednich prób kontrolnych i powinna być przeprowadzana przez doświadczonego patologa z uwzględnieniem historii choroby pacjenta i innych badań diagnostycznych. Streszczenie i informacje ogólne p53 to fosfoproteina jądrowa o masie cząsteczkowej 53 kDa. Natywne białko p53 występuje w róŜnych komórkach prawidłowych, ale ma bardzo krótki okres połowicznego rozpadu, dlatego występuje tylko w niewielkich ilościach (1) poniŜej progu wykrywania metodami immunohistochemicznymi (4). Mutacja somatyczna genu p53 to zdarzenie bardzo częste w rozwoju nowotworów ludzkich, a poniewaŜ zmutowane formy p53 są duŜo bardziej stabilne niŜ formy natywne, zmutowane białko p53 gromadzi się w wysokich ilościach (1). Na przykład: akumulację p53 stwierdzono w 76% z 212 ludzkich zmian złośliwych, które obejmowały raki sutka, okręŜnicy i Ŝołądka, a takŜe czerniaka, raka zarodkowego jądra, raka z komórek nabłonka przejściowego pęcherza moczowego, raka macicy i mięsaki tkanek miękkich (5). Natywne białko p53 działa jako czynnik transkrypcyjny, tj. jako modulator, który moŜe powodować aktywację i dezaktywację istotnych genów. Białko stanowi równieŜ inhibitor replikacji DNA i jest molekułą kontrolną w postępie cyklu Ŝycia komórki. Ponadto białko p53 jest zaangaŜowane w regulację apoptozy (2). W próbach transfekcji natywne białko p53 wywiera na nowotwory działanie supresorowe, a zmutowane białko p53 działa jako dominujący onkogen transformujący (1). Zobacz dokument Ogólne instrukcje wykonywania odczynów immunohistochemicznych firmy Dako lub następujące części instrukcji do systemu detekcji IHC: 1) Zasady procedury, 2) Niezbędne materiały niedostarczone z zestawem, 3) Przechowywanie, 4) Przygotowanie preparatu, 5) Wykonanie odczynu, 6) Kontrola jakości, 7) Rozwiązywanie problemów, 8) Interpretacja wyniku odczynu, 9) Ograniczenia metody. Dostarczany odczynnik Gotowe do uŜycia mysie przeciwciała monoklonalne są dostarczane w postaci ciekłej w buforze zawierającym białko stabilizujące i azydek sodu o stęŜeniu 0,015 mol/L. Klon: DO-7 (1). Izotyp: IgG2b, kappa. Immunogen Rekombinowane ludzkie natywne białko p53 (1). Swoistość W teście Western blot lizatów linii komórkowej A431 ludzkiego raka sromu przeciwciało barwiło prąŜek 53 kDa, który odpowiada zmutowanej postaci p53 obecnej w komórkach z linii A431. Epitop rozpoznany przez przeciwciało znajduje się między aminokwasami 1 i 45 końca N, a takŜe prawdopodobnie między aminowaksami 37 i 45 ludzkiego białka p53 (1). Analiza SDS-PAGE immunoprecypitatów wytwarzanych w reakcji przeciwciał z lizatami komórek z linii BT474 raka sutka wykazuje reakcję z białkiem 53 kDa odpowiadającym p53 (1). W badaniach immunohistochemicznych przeciwciało barwi zmutowane białko p53 w linii komórek A431 i natywne białko p53 w linii komórek SVK14 (linia keratynocytów transformowanych SV40) (1). Środki ostroŜności 1. Odczynniki przeznaczone dla przeszkolonych UŜytkowników. 2. Opisywany produkt zawiera silnie toksyczny związek — azydek sodu (NaN3), w czystej postaci. StęŜenie NaN3 występujące w produkcie nie jest klasyfikowane jako niebezpieczne. Jednak w wyniku reakcji NaN3 z ołowiem lub miedzią, wchodzącymi w skład instalacji kanalizacyjnych, mogą powstawać silnie wybuchowe azydki metali. Przy usuwaniu resztek odczynnika uŜywać duŜych ilości wody do przepłukiwania, aby uniknąć gromadzenia się azydków w instalacji kanalizacyjnej. 3. Podobnie jak w przypadku kaŜdego produktu otrzymywanego z materiału biologicznego, naleŜy stosować odpowiednie procedury postępowania. 4. NaleŜy stosować właściwe wyposaŜenie ochronne, zabezpieczające przed kontaktem odczynnika ze skórą bądź oczami. 5. Niewykorzystany odczynnik naleŜy usuwać zgodnie ze stosownymi przepisami lokalnymi i krajowymi. (117354-002) Dako Denmark A/S IR616/PL/MNI/2009.12.04 s. 1/3 | Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17 Przechowywanie Przechowywać w temperaturze 2–8°C. Nie stosowa ć po upływie terminu waŜności podanego na opakowaniu. JeŜeli odczynniki są przechowywane w warunkach innych niŜ podane na ulotce dołączanej do opakowania, UŜytkownik powinien je zweryfikować. Nie ma jednoznacznych oznak świadczących o niestabilności tego produktu. Z tego względu jednocześnie z badaniem próbek pochodzących od pacjentów, naleŜy wykonywać dodatnie i ujemne próby kontrolne. W wypadku nieoczekiwanego wyniku odczynu, którego nie moŜna wyjaśnić róŜnicami w procedurach laboratoryjnych, gdy podejrzewa się problem z przeciwciałem, naleŜy się skontaktować z działem wsparcia technicznego firmy Dako. Przygotowanie próbek i materiały dodatkowe wymagane, ale niedostarczane Przeciwciała mogą być wykorzystane do znakowania utrwalonych formaliną skrawków zatapianych w parafinie. Preparaty tkankowe naleŜy pociąć na skrawki o wymiarach około 4 µm. Wymagane jest poddanie cieplnemu odmaskowaniu antygenu (HIER) z uŜyciem Dako PT Link (nr kat. PT100/PT101). Szczegółowe instrukcje zawiera Instrukcja uŜytkownika aparatu PT Link. Optymalne wyniki uzyskuje się w wyniku wstępnej obróbki tkanek przy uŜyciu roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) (nr kat. K8000/K8004). Skrawki zatapiane w parafinie: Do obróbki wstępnej utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków tkankowych, zalecana jest procedura 3 w 1 z uŜyciem odczynnika Dako PT Link. Postępować według procedury wstępnej obróbki tkanek, zamieszczonej w ulotce roztworu EnVision FLEX Target Retrieval Solution, High pH (50x) (nr kat. K8000/K8004). Uwaga: Po przeprowadzeniu barwienia skrawki muszą być odwodnione, oczyszczone zakryte za pomocą środka do trwałego zatapiania. Odparafinowane skrawki: Do obróbki wstępnej utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie skrawków tkankowych, zalecane jest uŜycie odczynnika Dako PT Link i przeprowadzenie procedury opisane dla skrawków parafinowych. Po zakończeniu barwienia szkiełka naleŜy zatopić w wodnym lub trwałym środku do zatapiania. W trakcie przygotowywania oraz podczas procedury znakowania immunohistochemicznego skrawki nie powinny wyschnąć. W celu uzyskania lepszego przylegania skrawków do szkiełek podstawowych, zaleca się stosowanie szkiełek FLEX IHC Microscope Slides (nr kat. K8020). Wykonanie odczynu oraz materiały wymagane, ale niedostarczane Zalecanym systemem wizualizacji jest EnVision FLEX, High pH (Link) (nr kat. K8000). W systemie Autostainer Link wstępnie zaprogramowano etapy odczynu i czasy inkubacji. Zalecana objętość uŜytego odczynika to 1 x 200 µL lub 2 x 150 µL na preparat. Szczegółowe informacje dotyczące wkładania szkiełek mikroskopowych i odczynników przedstawiono w Instrukcji uŜytkownika aparatu Autostainer Link. Jeśli protokoły nie są dostępne w uŜywanym urządzeniu Autostainer, naleŜy skontaktować się z działem wsparcia technicznego firmy Dako. Wszystkie procedury inkubacji naleŜy równieŜ przeprowadzać w temperaturze pokojowej. Optymalne warunki mogą się zmieniać w zaleŜności od rodzaju materiału oraz sposobów jego przygotowania i powinny być określone indywidualnie w kaŜdym laboratorium. JeŜeli patolog oceniający preparat Ŝyczy sobie wybarwienia innym natęŜeniu, czasy inkubacji oraz uŜycie szablonów wizualizacji EnVision FLEX/EnVision FLEX+ mogą zostać zmienione. W celu uzyskania informacji dotyczącej zmiany programowania protokołu, naleŜy skontaktować się z działem obsługi/obsługą techniczną firmy Dako. NaleŜy upewnić się, Ŝe działanie zmodyfikowanego protokołu jest prawidłowe — w tym celu naleŜy ocenić, czy odczyn jest taki jak opisany w części „Charakterystyka wydajnościowa”. Zalecane jest barwienie kontrastowe hematoksyliną przy uŜyciu EnVision FLEX Hematoxylin, (Link) (nr kat. K8008). Zaleca się stosowanie niewodnego, trwałego środka do zatapiania. Równolegle z odczynami na materiale pochodzącym od pacjentów naleŜy wykonywać dodatnie i ujemne próby kontrolne z uŜyciem identycznego protokołu. Dodatnia kontrola tkankowa powinna obejmować okręŜnicę i gruczolakoraka okręŜnicy, natomiast we wszystkich dodatnich preparatach komórki/struktury powinny wskazywać odczyn reakcji taki jak opisany dla tej tkanki w części „Charakterystyka wydajnościowa”. Zalecana kontrola ujemna to FLEX Negative Control, Mouse (Link) (nr kat. IR750). Interpretacja odczynu Komórki barwione przeciwciałem zwykle wykazują odczyn jądrowy, ale w niektórych przypadkach zgłaszano równieŜ odczyn cytoplazmatyczny (6). Charakterystyka wydajnościowa Tkanki prawidłowe: W przypadku międzybłonka prawidłowego i reaktywnego przeciwciało zabarwiło 0/40 przypadków, a 27 międzybłoniakach komórki prawidłowe np. fibroblasty i komórki śródbłonka nie dały odczynu (3). W okręŜnicy tylko pojedyncze komórki łagodnie zmienionego nabłonka podstawnego wykazywały słaby lub umiarkowany odczyn jądrowy. Tkanki nieprawidłowe: W chłoniakach typu grudkowego wzrost akumulacji p53 zaobserwowano w centroblastach, w których odczyn dodatni wykazywały następujące klasy zmian morfologicznych: klasa I (1/16), klasa ll (10/21) i klasa III (6/6) (4). W międzybłoniakach przeciwciało barwiło 7/26 przypadków typu nabłonkowego (1 do 25% komórek zabarwionych), 1/7 przypadków mieszanych (25 do 50% komórek zabarwionych) i 1/3 przypadków mesenchymalnych (więcej niŜ 75% zabarwionych komórek) (3). W chłoniaku Hodgkina przeciwciało barwi 65% lub więcej komórek (co oznacza obecność p53), a w chłoniakach innych niŜ Hodgkina przeciwciało barwi około 50% komórek (2). Komórki nowotworowe raka gruczołowego okręŜnicy wykazują odczyn jądrowy w zakresie od umiarkowanego do silnego. Piśmiennictwo 1. Vojtĕšek B, Bártek J, Midgley CA, Lane DP. An immunochemical analysis of the human nuclear phosphoprotein p53. New monoclonal antibodies and epitope mapping using recombinant p53. J Immunol Methods 1992; 151:237–44. 2. Nieder C, Petersen S, Petersen C, Thames HD. The challenge of p53 as prognostic and predictive factor in Hodgkin’s or non-Hodgkin’s lymphoma (review). Ann Hematol 2001;80:2–8. 3. Ramael M, Lemmens G, Eerdekens C, Buysse C, Deblier I, Jacobs W, et al. Immunoreactivity for p53 protein in malignant mesothelioma and non-neoplastic mesothelium. J Pathol 1992; 168:371–5. 4. Cooper K, Haffajee Z. bcl-2 and p53 protein expression in follicular lymphoma. J Pathol 1997; 182:307–10. 5. Bártek J, Bártková J, Vojtĕšek B, Stašková Z, Lukáš J , Rejthar A, et al. Aberrant expression of the p53 oncoprotein is a common feature of a wide spectrum of human malignancies. Oncogene 1991; 6:1699–703. 6. Kontogeorgos G, Kapranos N, Thodou E, Sambaziotis D, Tsagarakis S. Immunocytochemical accumulation of (117354-002) Dako Denmark A/S IR616/PL/MNI/2009.12.04 s. 2/3 | Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17 p53 in corticotroph adenomas: Relationship with heat shock proteins and apoptosis. Pituitary 1999; 1:207–12. Objaśnienie symboli Numer katalogowy Temperatura przechowywania ZuŜyć przed Wyrób medyczny do diagnostyki in vitro Zawartość wystarcza na <n> testów Producent Sprawdzić w instrukcji stosowania Numer serii (117354-002) Dako Denmark A/S IR616/PL/MNI/2009.12.04 s. 3/3 | Produktionsvej 42 | DK-2600 Glostrup | Denmark | Tel. +45 44 85 95 00 | Fax +45 44 85 95 95 | CVR No. 33 21 13 17