Ewa Grucka-Mamczar, Ewa Birkner, Jolanta Zalejska

BROMAT. CHEM. TOKSYKOL. – XL, 2007, 4, str. 389 – 393
Ewa Grucka-Mamczar, Ewa Birkner, Jolanta Zalejska-Fiolka,
Tatianna Jamróz-Szłapa
WPŁYW FLUORKU SODU I KOFEINY
NA AKTYWNOŚĆ WYBRANYCH ENZYMÓW
WA˛TROBOWYCH SZCZURA
Zakład Biochemii Ogólnej Katedry Biochemii w Zabrzu
Śla˛skiej Akademii Medycznej w Katowicach
Kierownik: dr hab. n. med. E. Birkner
Celem pracy było zbadanie aktywności enzymów oceniaja˛cych stan wa˛troby: cholinesterazy (CHE), fosfatazay alkalicznej (FA) i γ -glutamylotranspeptydazy (γ -GT). Doświadczenie prowadzono na 18 szczurach (samcach) rasy Spraque-Dawley. Wykazano wzrost
aktywności FA i γ -GT (pod wpływem NaF) charakterystyczny dla ostrej fazy wewna˛trzwa˛trobowej. Kofeina niwelowała działanie NaF na wa˛troby szczurów.
Hasła kluczowe: enzymy wa˛trobowe, NaF, kofeina, szczury.
Key words: liver enzymes, NaF, caffeine, rats.
Badania doświadczalne przeprowadzone in vivo na szczurach wykazały, że
fluorek (w postaci NaF) jest szybko absorbowany z żoła˛dka i światła jelit. Szybkość
absorbowania jest zwia˛zana z pH żoła˛dka.
Fluorek jest rozprowadzany z osocza do wszystkich tkanek i narza˛dów. Szybkość
„dostarczania” fluorku jest generalnie wyznaczana przez przepływ krwi do tkanek.
W konsekwencji stan równowagi ste˛żeń fluorku mie˛dzy osoczem a takimi tkankami
jak serce, płuca, wa˛troba jest osia˛gany znacznie szybciej niż odnośnie mie˛śni
szkieletowych, skóry i tkanki tłuszczowej (1).
Szczególnie wrażliwymi tkankami na oddziaływanie fluorku sa˛ wa˛troba i nerki
(2, 3). Z kolei kofeina jest zwia˛zkiem silnie pobudzaja˛cym układ nerwowy. Usuwa
objawy zme˛czenia i senności. Poprawia również koncentracje˛ i sprawność myślenia
(4, 5). Kofeina szybko sie˛ wchłania z przewodu pokarmowego. W wa˛trobie ulega
całkowitej biotransformacji przy udziale cytochromu P 450 1A (6, 7, 8).
Po przewlekłym narażeniu na duże dawki, kofeina prowadzi do zaburzeń
gospodarki wapniowo-fosforanowej. W ostatnich latach zaobserwowano, że kofeina może zmniejszać toksyczność fluorku przez tworzenie zwia˛zków kompleksowych. Hamuje to wchłanianie fluorku i ogranicza objawy zatrucia (9).
Celem pracy było zbadanie wpływu skojarzonego podawania szczurom fluorku
sodu i kofeiny na aktywność enzymów oceniaja˛cych stan wa˛troby takich jak:
cholinesteraza (CHE), fosfataza alkaliczna (FA) i γ -glutamylotranspeptydaza
(γ -GT) oznaczane w tym narza˛dzie.
390
Nr 4
E. Grucka-Mamczar i inni
CZE˛ŚĆ DOŚWIADCZALNA
Doświadczenie prowadzono na 18 szczurach (samcach) rasy Spraque-Dawley. Zwierze˛ta podzielono
na 3 grupy po 6 zwierza˛t każda. Zwierze˛ta miały zachowany naturalny cykl dzienno-nocny i swobodny
doste˛p do standardowej paszy. Pierwsza grupa szczurów otrzymywała do picia wode˛ destylowana˛
i stanowiła grupe˛ kontrolna˛. Druga grupa zwierza˛t otrzymywała fluorek sodu w dawce 4,9 mg F–/kg
m.c./dobe˛. Trzecia grupa szczurów otrzymywała taka˛ sama˛ dawke˛ F– oraz kofeine˛ w dawce 3 mg
kofeiny/kg m.c./dobe˛.
Doświadczenie trwało 50 dni. Po tym czasie szczury usypiano thiopentalem w dawce 30 mg/szczura.
Do badań pobrano wa˛trobe˛ i sporza˛dzono w/v homogentaty (1 g tkanki + 9 cm3 ozie˛bionego 0,9%
NaCl). Homogenat odwirowano i w supernatancie oznaczono aktywności naste˛puja˛cych enzymów:
1. cholinesterazy (CHE) (EC 3.1.1.8) zestawem Biochemtest (POCH Gliwice, Polska, nr kat. 178
140143).
2. fosfataze˛ alkaliczna˛ (FA) (EC 3.1.3.1) zestawem Biochemtest (POCH Gliwice, Polska, nr kat
178152149).
3. γ -glutamylotranspeptydazy (γ -GT) (EC 2.3.2.1) zestawem firmy Alpha Diagnostic Niemcy nr kat
G 6570-100).
Wyniki przedstawiono w jednostkach IU w przeliczeniu na białko, którego ste˛żenie oznaczono
metoda˛ Lowry’ego (10).
A n a l i z a s t a t y s t y c z n a. Baze˛ danych utworzono w programie MS Excel 2000. W celu analizy
statystycznej wykorzystano program Statistica PL. Jako wskaźniki statystyki opisowej użyto średniej (x)
i odchylenia standardowego (SD). W celu porównania różnic mie˛dzy grupami zastosowano test
U Manna-Whitney’a. Za znamienne statystycznie przyje˛to zmiany przy poziomie istotności p < 0.05.
WYNIKI
Wyniki przedstawiono w tab. I do III. Z tab. I widać, że aktywności CHE w homogenatach wa˛troby
szczurów grupy kontrolnej, otrzymuja˛cej NaF i otrzymuja˛cej NaF z kofeina˛ nie uległa statystycznie
znamiennym zmianom.
Tabela I
Aktywność cholinesterazy w homogenatach wa˛troby szczurów
Table I
Activity of cholinesterase activity
Aktywność CHE (IU/g białka)
Grupa
x
SD
p
Kontrola
0,018
± 0,003
–
NaF
0,019
± 0,003
0,631
NaF + kofeina
0,017
± 0,005
0,749
Aktywność FA u szczurów otrzymuja˛cych NaF w porównaniu z grupa˛ kontrolna˛ wzrosła znamiennie statystycznie, natomiast dodatek kofeiny spowodował spadek FA do jej wartości z grupy kontrolnej (tab. II).
Jak widać z tab. III aktywność γ -GT w grupie szczurów otrzymuja˛cych NaF wzrosła (wynik
nieznamienny statystycznie), a dodatek kofeiny spowodował obniżenie znamienne statystycznie aktywności badanego enzymu.
W 1994 r. Chen i Whitford (11) stwierdzili, że kofeina zwie˛ksza ste˛żenie jonu fluorkowego w osoczu
szczurów. Autorzy odkryli, że po 2 godz. od podania F– w roztworze kofeiny, ste˛żenie jonu fluorkowego
w osoczu było wyższe niż podawanego w wodzie. Fakt ten skłonił nas do przeprowadzenia niniejszego
doświadczenia, w którym podawaliśmy szczurom takie same dawki F– i kofeiny jak Chen i Whitford,
spodziewaja˛c sie˛, że wyższe ste˛żenie jonu fluorkowego w osoczu mogłoby spowodować wie˛ksza˛ jego
kumulacje˛ w wa˛trobie i w konsekwencji uszkodzenie tego narza˛du. Kontrola ste˛żenia jonów fluor-
Nr 4
Wpływ fluorku sodu i kofeiny na aktywność enzymów wa˛trobowych szczura
391
T a b e l a II
Aktywność fosfatazy alkalicznej w homogenatach wa˛troby szczurów
T a b l e II
Activity of alkaline phosphatase in rat liver homogenates
Aktywność FA (IU/g białka)
Grupa
x
SD
Kontrola
1,30
± 0,22
p
–
NaF
1,67
± 0,29
0,025
NaF + kofeina
1,40
± 0,17
0,522
b T a b e l a III
Aktywność γ -glutamylotranspeptydazy w homogenatach wa˛troby szczurów
T a b l e III
Activity of γ -gluthamylotranspeptydase in rat liver homogenates
Grupa
Aktywność γ -GT (IU/g białka)
x
SD
p
Kontrola
1,94
± 0,98
–
NaF
3,92
± 2,39
0,109
NaF + kofeina
0,74
± 0,47
0,037
kowych w naszym doświadczeniu przeprowadzona w surowicy krwi badanych zwierza˛t nie wykazała
jednak zależności odkrytej przez Chen’a i Whitford’a, ponieważ ste˛żenie jonów fluorkowych w obecności kofeiny w surowicy było nieznamienne (2). Obserwuja˛c natomiast zmiany FA i γ -GT oznaczane
w homogenatach wa˛troby szczurów można poczynić ciekawe obserwacje, dotycza˛ce zmian, które miały
miejsce w tym narza˛dzie. Jak wiadomo FA obecna w surowicy jest również pochodzenia wa˛trobowego
(ok. 20%) (12). Jest to enzym kontroluja˛cy hydrolize˛ fosforanów organicznych. Jego optimum pH
wynosi 10, a jego aktywatorami sa˛ Mg(II), Co(II) i Mn(II). Inhibitorami sa˛ natomiast aniony
fosforanowe, boranowe, szczawianowe i cyjanki (13). Wzrost jej aktywności charakterystyczny jest
m.in. dla cholestazy wewna˛trzwa˛trobowej, co wynika z upośledzonego wydalania FA przez drogi
żółciowe. Z kolei γ -GT jest enzymem zwia˛zanym z przemiana˛ aminokwasów. Katalizuje ona hydrolize˛
peptydów do aminokwasów lub drobnocza˛steczkowych peptydów. γ -GT wydalana jest z ustroju głównie
z żółcia˛. Enzym ten zwia˛zany jest z błonami komórkowymi, wyste˛puje głównie w wa˛trobie, nerkach
i trzustce. Wzrost aktywności tego enzymu jest najcze˛ściej wskaźnikiem cholestazy wewna˛trzwa˛trobowej, spowodowanej upośledzonym wydalaniem enzymu z żółcia˛. Wydaje sie˛, że w naszym
doświadczeniu (w którym oba enzymy FA i γ -GT zwie˛kszały swoja˛ aktywność w wa˛trobie pod
wpływem NaF) doszło do wytworzenia cholestazy wewna˛trzwa˛trobowej. Cholestaze˛ wewna˛trzwa˛trobowa˛ podzielić można na ostra˛, przewlekła˛ i nawracaja˛ca˛ sie˛. Do ostrej cholestazy wewna˛trzwa˛trobowej, dochodzi po podaniu niektórych leków, pod wpływem oddziaływania trucizn, czy też po
zakażeniu wirusem (14). Można przypuszczać, że NaF w zastosowanej dawce zadziałał jako trucizna
i wywołał ostra˛ cholestaze˛ wewna˛trzwa˛trobowa˛ (wzrost aktywności FA o 28%, a γ -GT o 102%).
O zmienionej czynności wa˛troby pod wpływem fluorku sodu donosza˛ Qujeg i współpr. (15). Autorzy
podawali szczurom 10, 20 i 30 mg NaF/kg m.c. dziennie przez 90 dni i stwierdzili statystycznie
znamienny wzrost transferazy w surowicy krwi.
Obserwuja˛c jednocześnie wyniki aktywności FA i γ -GT po dodaniu do NaF kofeiny można
stwierdzić, że powyższy stan (ostra cholestaza wewna˛trzwa˛trobowa) jest „znoszona” przez ten zwia˛zek.
Jak wiadomo, kofeina działa hamuja˛co na fosfodiesteraze˛ rozkładaja˛ca˛ cykliczny AMP (cAMP).
Powoduje to nagromadzenie cAMP w komórce, co aktywuje procesy metaboliczne (4). Warto
podkreślić, że w naszym doświadczeniu zastosowaliśmy dawke˛ „optymalna˛” kofeiny dla człowieka
(3 – 6 mg kofeiny/kg m.c./dzień) (16). Wydaje sie˛ jednak, że dodatek kofeiny wpływa nie tylko
korzystnie na organizm szczura, ponieważ w poprzedniej naszej pracy (17) doszliśmy do wniosku, że
zarówno pod wpływem F– jak i F– z kofeina˛ dochodzi u szczurów do ogólnych zaburzeń funkcji wa˛troby.
Przejawia sie˛ to wyższymi średnimi wartościami aktywności AspAT i AlAT (F– bez kofeiny) oraz
392
E. Grucka-Mamczar i inni
Nr 4
zahamowaniem syntezy cholesterolu i triacylogliceroli (F– i F– z kofeina˛). Ciekawe wyniki uzyskaliśmy
w badaniu aktywności CHE w surowicy krwi szczura (17). O ile NaF nie spowodował wie˛kszych zmian
aktywności CHE to dodatek kofeiny spowodował statystycznie znamienny spadek jej aktywności
w surowicy. Pamie˛tać należy, że na ogół spadek aktywności CHE w surowicy wia˛że sie˛ m.in.
z uszkodzeniem hepatocytów, czego nie należy w tym przypadku wykluczyć.
Chen i Whitford (18) badali wpływ różnych dawek kofeiny (3, 25 i 100 mg/kg m.c./dobe˛) przez okres
6 tyg. na równowage˛ metaboliczna˛ i ste˛żenie F–, wapnia i fosforu w tkankach szczurów. Autorzy
wykazali, że kofeina nie wpływa na wchłanianie, wydzielanie z moczem i równowage˛ fluorkowa˛ oraz
jego ste˛żenie w osoczu, szkliwie i kościach.
Reasumuja˛c wyniki naszego eksperymentu należy podkreślić, że aczkolwiek kofeina działa prewencyjnie wobec przypuszczalnie ostrej cholestazy wewna˛trzwa˛trobowej, to biora˛c pod uwage˛ jej aktywność metaboliczna˛ należałoby z pewnościa˛ ograniczyć spożycie kofeiny.
WNIOSKI
1. NaF w zastosowanej dawce powoduje przypuszczalnie ostra˛ cholestaze˛
wewna˛trzwa˛trobowa˛.
2. Kofeina znosi powyższe działanie NaF.
E. G r u c k a-M a m c z a r, E. B i r k n e r, J. Z a l e j s k a-F i o l k a, T. J a m r ó z - S z ł a p a
THE INFLUENCE OF SODIUM FLUORIDE AND CAFFEINE
ON THE ACTIVITY CHOSEN LIVER ENZYMES IN RATS
Summary
The aim of the study was to investigate the effect of sodium fluoride (NaF) on the activity of liver
enzymes, such as: cholinesterase (CHE), alkaline phosphatase (FA) and γ -glutamyltranspeptidase
(γ -GT). Eighteen Spraque-Dawley male rats were used in the experiment. The results indicate an
increase of FA and γ -GT (during NaF supplementation), which is characteristic of acute intrahepatic
phase. Caffeine neutralized the effect that NaF had on rat livers.
PIŚMIENNICTWO
1. Enviromental Health Criteria 227 Fluorides. World Health Organization geneva 2002. – 2. Birkner
E., Grucka-Mamczar E., Zalejska-Fiolka J., Chlubek D., Kasperczyk S., Stawiarska-Pie˛ta B., Błaszczyk
U.: Influence of sodium fluoride and caf eine on the concentration offluoride ions, glucose and urea of
blood serum and activity of protein metabolism enzymes in rat liver. Biol. Trace Elem. Res., 2006; 113:
1-6. – 3. Birkner E., Grucka-Mamczar E., Żwirska-Korczala K., Zalejska-Fiolka J., Stawiarska-Pie˛ta B.,
Kasperczyk S., Kasperczyk A.: Influence of sodium fluoride and caffeine on the kidney function and
free-radical process in that organ in adult rats. Biol. Trace Elem. Res., 2006; 109: 35-47. – 4. Danysz A.,
Kleinrok Z.: Podstawy farmakologii dla lekarzy, farmaceutów i studentów medycyny. (red.) Danysz A.,
Klienrok Z.; Wrocław, Wyd. Volumed 1996; 404-405. – 5. Kolanowski W.: Kawa – charakterystyka
i znaczenie zdrowotne. Żywność i żywienie a zdrowie., 1998; 3: 305-309. – 6. Seńczuk W.:
Toksykologia. Wyd. Lek. PZWL, Warszawa, 1994; 241-242 i 379-381. – 7. Janus K.: Kofeina jako
substancja modelowa służa˛ca do oceny metabolicznej wydolności wa˛troby. Problemy Terapii Monitorowanej, 1993; 4(1): 27-31. – 8. Daniel W.A., Syrek M., Ryłko Z., Wójcik J.: Effects of antidepressant drugs
on the activity of cytochrome P-450 measured by caffeine oxidation in rat liver microsomes. Pol. J.
Pharmacol., 2001; 53: 351-357. – 9. Cirksena W., Mitchell G., Samaras G., Wax C.: Fluoride
metabolism. Vien: Verlag Wilheln Mandrich., 1980; 145-180. – 10. Lowry O.M., Rosenbrough N.J.,
Forr A.R., Randal R.L.: Protein measurement with Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., 1951; 193:
265-275.
Nr 4
Wpływ fluorku sodu i kofeiny na aktywność enzymów wa˛trobowych szczura
393
11. Chen X., Whitford G.M.: Lack of significant effect of coffee and caffeine on fluoride metabolism
in rats. J. Dent. Res., 1994; 73: 1173-1179. – 12. Kokot F., Kokot S.: Badania laboratoryjne. Wyd. Lek.
PZWL, Warszawa 2002; 151-152. – 13. Jakubowski Z., Kabata J., Kalinowski L., Szczepańska-Konkel
M., Anglieski S.: Badania laboratoryjne w codziennej praktyce. Wyd. V., Gdańsk 1998; Wyd. Med.
MAK med., 112-113. – 14. Brzozowski R. (red.): Choroby wa˛troby i dróg żółciowych. Wyd. Lek. PZWL,
Warszawa 1998; 110-111. – 15. Qujeg D., Laghale B., Ghalipour A., Solimani N., Hassenzadeh S.:
Effect of sodium fluoride on total serum protein levels and transaminase activity. Biomed. Pharmacother., 2002; 56: 169-172. – 16. Magkos F., Kavouras S.A.: Caffeine and ephedrine. Physiological
metaboilc and performance – enhancing effects. Sports. Med., 2004; 34: 871-889. – 17. GruckaMamczar E., Birkner E., Zalejska-Fiolka J., Kasperczyk S., Kasperczyk A., Stawiarska-Pie˛ta B., Birkner
B., Polaniak R.: Wpływ NaF i kofeiny na aktywność wybranych enzymów i parametrów biochemicznych surowicy szczurów. Ann. Acad. Med. Siles., 2006; 60: 26-30. – 18. Chen X., Whitford G.M.: Effect
of caffeine on fluoride, calcium, and phosphorus metabolism and calcited tissues in the rat. Arch. Oral
Biol., 1999; 44: 33-39.
Adres: 41-808 Zabrze, ul. Jordana 19.