Inne enzymy wykorzystywane w klonowaniu molekularnym
Transkrypt
Inne enzymy wykorzystywane w klonowaniu molekularnym
INNE ENZYMY I BIAŁKA NIEENZYMATYCZNE KLONOWANIU MOLEKULARNYM WYKORZYSTYWANE W Wiele różnych enzymów, nie tylko restryktazy, jest wykorzystywanych rutynowo w klonowaniu molekularnym: DNA POLIMERAZY (DNA- i RNA-ZALEŻNE) Wiele etapów klonowania molekularnego wymaga syntezy DNA in vitro – reakcje te katalizują polimerazy DNA. Są to enzymy, które wymagają matrycy (w większości) i syntetyzują produkt, którego sekwencja nukleotydów jest komplementarna do matrycy. Większość polimeraz preferuje matryce DNA, ale mogą również kopiować RNA (odwrotna transkryptaza). RNA POLIMERAZY (DNA-ZALEŻNE) Enzymy, które katalizują syntezę RNA na matrycy dsDNA. Polimerazy pochodzenia fagowego są wykorzystywane in vitro do generowania dużych ilości RNA komplementarnego do jednej z nici obcego DNA sklonowanego za fagowym promotorem w wektorze plazmidowym. LIGAZY Enzymy wykorzystywane do łączenia dwóch różnych cząsteczek DNA to ligazy DNA. Najczęściej wykorzystywaną jest ligaza kodowana w genomie faga T4. RNA ligaza to enzym zdolny do kowalencyjnego łączenia cząsteczek jednoniciowego RNA posiadających grupy 5’-fosforanową i 3’-hydroksylową. KINAZY Enzymy te wykorzystywane są do fosforylowania końców cząsteczek DNA pozbawionych reszt fosforanowych, np.: kinaza polinukleotydowa faga T4. FOSFATAZY Odwrotnie niż kinazy enzymy te wykorzystujemy do defosforylacji, czyli usuwania grup fosforanowych z 5’-końców łańcuchów polinukleotydowych, np.: fosfataza alkaliczna E. coli. NUKLEAZY Enzymy, które katalizują hydrolizę wiązania fosfodiestrowego. Egzonukleazy usuwają mononukleotydy z końców liniowego DNA. Endonukleazy atakują wiązania fosfodiestrowe wewnątrz cząsteczek dwu- lub jednoniciowych; np.: Dezoksyrybonukleaza I – endonkleaza, która hydrolizuje ds lub ssDNA preferencyjnie w miejscach przylegających do nukleotydów pirymidynowych; produkty takiej reakcji trawienia to złożona mieszanina 5’-fosfo mono- i oligonukleotydów; w obecności jonów Mg2+ każda nić jest atakowana niezależnie, a miejsca trawienia na obu niciach rozmieszczone w sposób przypadkowy; Rybonukleaza A – endorybonukleaza, przecinająca wiązanie 3’-fosfodiestrowe przy pirymidynach, niewykazująca żadnej aktywności w stosunku do DNA, stosowana do usuwania RNA z preparatów DNA BIAŁKA NIEENZYMATYCZNE W inżynierii genetycznej wykorzystywane są również nieenzymatyczne białka wiążące DNA, np.: białko SSB (ang. single-stranded DNA-binding protein), wiążące się w sposób kooperatywny z ssDNA (ich użyteczność wynika z faktu, że mogą destabilizować struktury drugorzędowe powstałe w obrębie jednej nici i zwiększać tym samym procesywność enzymów, usuwając „bariery” na ich drodze).