POLMICRO 2008 - Diagnostyka Laboratoryjna

diagnostyka laboratoryjna Journal of Laboratory Diagnostics
2009 • Volume 45 • Number 1 • 27-34
Kontrola jakości • Quality control
Ogólnopolski Sprawdzian Wiarygodności Badań
Mikrobiologicznych – POLMICRO 2008
Elżbieta Stefaniuk1,2, Patrycja Ronkiewicz1, Ewa Młodzińska1, Beata Chmylak1,
Janusz Fiett1,2, Waleria Hryniewicz1,2
1
Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej, Warszawa, Poland
2
Narodowy Instytut Leków, Warszawa, Poland
Streszczenie
Praca niniejsza stanowi przedstawienie i omówienie wyników XV edycji Ogólnopolskiego Sprawdzianu Wiarygodności Badań
Mikrobiologicznych – POLMICRO 2008. W roku 2008 Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej
(COBJDM) zorganizował dwa typy sprawdzianów: jeden – przeznaczony dla laboratoriów świadczących diagnostykę w szerokim zakresie oraz drugi – oddzielny sprawdzian, przeznaczony dla pracowni schorzeń jelitowych stacji sanitarno-epidemiologicznych. W ramach sprawdzianu COBJDM przygotował i rozesłał do laboratoriów następujące izolaty bakteryjne: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus lugdunensis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus oralis,
Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Yersinia kristensenii, Shigella boydi, Salmonella
enterica ser. Typhimurium, Salmonella enterica ser. Enteritidis, Morganella morgannii. Izolaty charakteryzowały się różnymi
fenotypami wrażliwości na leki oraz różnymi mechanizmami oporności. Zadaniem laboratoriów była identyfikacja badanych
izolatów do poziomu gatunku oraz określenie lekowrażliwości na wszystkie wymienione w ankiecie antybiotyki i chemioterapeutyki oraz podanie informacji o wykrytych mechanizmach oporności.
Polish National External Quality Assesment Scheme in Microbiological Diagnostics – POLMICRO 2008
Summary
The objective of this study was to analyse and discuss the results of 15th edition of Polish National External Quality Assessment Scheme in Microbiological Diagnostics – POLMICRO 2008. In 2008 two different types of proficiency programme were
organised. The first one was aimed at laboratories providing a broad spectrum of microbiological diagnostics. The second,
was prepared for enteric diseases laboratories in sanitary inspection. In 2008 edition the following strains were distributed by
the Centre of Quality Control in Microbiology (CQCM): Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus
lugdunensis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus oralis, Acinetobacter baumannii, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Yersinia kristensenii, Shigella boydii Salmonella enterica ser. Typhimurium, Salmonella enterica ser. Enteritidis,
Morganella morgannii. The distributed isolates present different susceptibility patterns and different mechanisms of resistance.
The task of the laboratory was to identify to the species level every strain and to determine their susceptibility to all antibiotics
listed in the questionnaire. The laboratories were also obliged to interpret and comment detected resistance mechanisms.
Słowa kluczowe:zewnątrzlaboratoryjny sprawdzian wiarygodności, identyfikacja, lekowrażliwość, mechanizmy oporności
Key words:external quality assessment scheme, identification, susceptibility to antimicrobial agents, resistance’s mechanisms
Wstęp
W Polsce sprawdzian wiarygodności badań w mikrobiologii
mający na celu ocenę kompetencji laboratoriów mikrobiologicznych, zwłaszcza w obszarze oznaczania lekowrażliwości i wykrywania mechanizmów oporności na leki drobnoustrojów wywołujących zakażenia szpitalne, ale także
nabyte poza szpitalem, po raz pierwszy został zorganizowany w roku 1994. Program ten otrzymał nazwę „POLMICRO”,
a zainicjowany został w grudniu 1993 roku przez Komisję
Standaryzacji i Kontroli Jakości Badań Laboratoryjnych
i Mikrobiologicznych przy Departamencie Polityki Zdrowotnej Ministerstwa Zdrowia i Opieki Społecznej przy współpracy z Krajowym Zespołem Konsultanta Medycznego ds.
Mikrobiologii. Od roku 1997 organizację badań międzylaboratoryjnych przejął, powołany przez Ministra Zdrowia i Opieki
Społecznej, Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej.
Kontrole zewnątrzlaboratoryjne są organizowane na całym
świecie i obejmują różne dziedziny medycyny laboratoryjnej.
Sprawdziany międzylaboratoryjne mają zasięg lokalny (kra27
Ogólnopolski Sprawdzian Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych – POLMICRO 2008
jowe), kontynentalny, jak również ogólnoświatowy. Zadaniem
sprawdzianów jest poprawa poziomu diagnostyki, standaryzacja stosowanych metod diagnostycznych, a tym samym zwiększenie liczby laboratoriów wiarygodnych. Program POLMICRO
ma zasięg ogólnopolski, a jego formuły, odbywające się w kolejnych latach i są różnorodne. W poszczególnych edycjach
programu poruszane są aktualne problemy z zakresu klinicznej
diagnostyki mikrobiologicznej.
W roku 2008 w XV edycji ogólnopolskiego sprawdzianu wiarygodności badań mikrobiologicznych POLMICRO udział
wzięło 530 laboratoriów mikrobiologicznych. Zdecydowaną
większość stanowiły laboratoria medyczne, szpitalne i pozaszpitalne, publiczne i niepubliczne, ale również laboratoria
inspekcji sanitarnej i inspekcji weterynaryjnej. Ze względu na
zróżnicowany profil laboratoriów i zakres prowadzonej diagnostyki mikrobiologicznej, a tym samym różne oczekiwania
laboratoriów odnośnie do zewnętrznej kontroli jakości, Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej, podobnie jak w latach poprzednich, zorganizował dwa
rodzaje sprawdzianów: sprawdzian POLMICRO 2008 przeznaczony dla laboratoriów klinicznych i innych świadczących
szeroką diagnostykę mikrobiologiczną oraz sprawdzian POLMICRO 2008/SSE przeznaczony dla pracowni/laboratoriów
schorzeń jelitowych. Sprawdzian POLMICRO 2008 (ogólny) obejmował trzy tury porównań międzylaboratoryjnych,
a sprawdzian POLMICRO 2008/SSE – dwie tury kontroli.
Tematem niniejszego opracowania jest omówienie specyfiki
i rezultatów XV edycji POLMICRO 2008, z uwzględnieniem
dwóch typów zorganizowanych sprawdzianów.
Materiał i metody
Laboratoria przystępujące do sprawdzianu XV edycji POLMICRO 2008, w ramach każdej tury sprawdzianu, otrzymywały ustalony komputerowo zestaw izolatów zakodowanych
wielkimi literami od A do D (tab. I).
Do szczepów dołączona była szczegółowa instrukcja postępowania z badanymi szczepami drobnoustrojów, a także
informacja dotycząca zasad udzielania odpowiedzi, wnoszenia i rozpatrywania reklamacji.
Zadaniem laboratoriów była identyfikacja badanych izolatów do poziomu gatunku oraz określenie lekowrażliwości
na wymienione w ankiecie antybiotyki i chemioterapeutyki
oraz podanie informacji o wykrytych mechanizmach oporności. Uzyskane wyniki należało przesłać drogą elektroniczną
do Centralnego Ośrodka, poprzez wypełnienie ankiety dostępnej dla każdego laboratorium na stronie internetowej
Ośrodka www.polmikro.edu.pl. W roku 2008 elektroniczna
forma ankiety dostępna była w obu typach zorganizowanego sprawdzianu.
Wyniki lekowrażliwości podlegały ocenie tylko w przypadku
prawidłowej identyfikacji badanego szczepu do poziomu gatunku. Ocena popełnianych błędów w oznaczaniu lekowraż-
Tabela I. Izolaty bakteryjne będące przedmiotem oceny w poszczególnych turach sprawdzianu z rozbiciem na dwa
typy programu POLMICRO 2008 (XV edycja).
Tura sprawdzianu
Gatunek drobnoustrojów
Numer kolekcji POLMICRO
Mechanizm oporności
POLMICRO 2008 (edycja ogólna)
I tura
Staphylococcus epidermidis
PM-130
MSSE
Staphylococcus epidermidis
PM-131
MSSE
Staphylococcus epidermidis
PM-132
MRSE, MLSB
MSSL
Staphylococcus lugdunensis
PM-133
II tura
Streptococcus pneumoniae
PM-137
Streptococcus oralis
PM-138
III tura
Acinetobacter baumannii
PM-141
MBL-ujemny
Acinetobacter baumannii
PM-142
MBL-dodatni
Pseudomonas aeruginosa
PM-143
MBL-ujemny
Pseudomonas aeruginosa
PM-144
MBL-dodatni
Pseudomonas putida
PM-145
MBL-dodatni
Salmonella enterica ser. Typhimurium
PM-134
ESBL-ujemny
Shigella boydii
PM-135
POLMICRO 2008/SSE
I tura
II tura
Yersinia kristensenii
PM-136
ESBL-ujemny
Salmonella enterica ser. Enteritidis
PM-139
ESBL-dodatni
Morganella morgannii
PM-140
ESBL-ujemny
Legenda:
MSSE – Staphylococcus epidermidis meticylinowrażliwy (ang. methicillin-sensitive S. epidermidis),
MRSE – Staphylococcus epidermidis meticylinooporny (ang. methicillin-resistant S. epidermidis),
MSSL – Staphylococcus lugdunensis meticylinowrażliwy (ang. methicillin-sensitive S. lugdunensis),
MLSB – oprność typu indukcyjnego na makrolity, streptograminy i linkozamidy),
MBL – metalo-β-laktamaza,
ESBL – β-laktamza o rozszerzonym spektrum substratowym (ang. extendend spectrum β-lactamase).
28
E. Stefaniuk i inni
liwości oparta była na wcześniej ustalonych kryteriach, które
zostaną omówione poniżej. Zastosowana kwalifikacja błędów oparta jest na zaleceniach Centers for Disease Control
and Prevention (CDC) w Atlancie. Błędy oznaczania lekowrażliwości dzielimy na trzy kategorie: małe błędy, duże błędy
i bardzo duże błędy. Małe błędy polegają na zaliczeniu szczepu średniowrażliwego jako wrażliwy lub oporny, do tego rodzaju błędów zaliczamy też uznanie szczepu wrażliwego lub
opornego za średniowrażliwy. Błędy duże polegają na podaniu, że szczep wrażliwy jest oporny. Najpoważniejszy rodzaj
stanowią bardzo duże błędy, czyli uznanie szczepu opornego za wrażliwy. Laboratorium powinno położyć szczególny
nacisk na eliminację bardzo dużych i dużych błędów.
Oprócz zwyczajowej oceny poprawności otrzymanych przez
każde z laboratoriów wyników, w ramach I tury POLMICRO
2008 przeprowadzono analizę powtarzalności zgodnie z zaleceniami WHO CDC, wg których dopuszczalne jest uzyskanie w podwójnym oznaczeniu strefy zahamowania wzrostu
różnicy maksymalnie ±3 mm, w wartości MIC różnicy nie
większej niż ±1 podwójne rozcieńczenie, pod warunkiem
utrzymania kategorii wrażliwości. W wypełnianej przez laboratoria ankiecie znajdowały się też pytania na temat metodyki stosowanej wykonywanych w trakcie badania próbek
testowych.
Wyniki i omówienie
SPRAWDZIAN POLMICRO 2008 (edycja ogólna)
I tura
W I turze POLMICRO 2008 (edycja ogólna) każde laboratorium otrzymało do oznaczenia zestaw trzech izolatów bakteryjnych spośród przedstawionych w tabeli I, z zaznaczeniem,
że wszystkie laboratoria otrzymały szczep Staphylococcus
lugdunensis PM-135, zaś drugi i trzeci szczep w każdym
zestawie był tym samym szczepem Staphylococcus epidermidis. Do tej tury sprawdzianu przystąpiło 467 laboratoriów
mikrobiologicznych. Negatywny wynik końcowy niniejszej
edycji przyznano 17 laboratoriom, co stanowiło 3,6% ogółu
laboratoriów przystępujących do sprawdzianu. Błędy dotyczyły głównie identyfikacji gatunkowej przesłanych izolatów.
Wyniki w dużej mierze zależały od stosowanych w laboratoriach testów identyfikacyjnych, jednakże, ze względu na
trudną identyfikację gronkowców koagulazo-ujemnych, za
zdecydowanie złe odpowiedzi uznawano rozbieżne identyfikacje szczepów S. epidermidis przesłanych do każdego
laboratorium w postaci dwóch oddzielnych prób oraz identyfikacje do poziomu „gronkowiec koagulazo-ujemny”.
Wiele laboratoriów miało trudności w oznaczeniu produkcji
β-laktamaz, co w przypadku badanych izolatów stanowiło
problem złożony: trudności techniczne, ale także specyfika przesłanych do badania szczepów bakteryjnych. Wyniki oznaczeń nie były brane pod uwagę w końcowej ocenie,
natomiast powinny stanowić podstawę do przeanalizowania
sposobu postępowania w laboratorium.
Penicylina powinna być stosowana do oznaczania wrażliwości wszystkich gatunków gronkowców na wszystkie pe-
nicylinazo-wrażliwe penicyliny (ampicylinę, amoksycylinę,
piperacylinę, azlocylinę, mezlocylinę). MIC penicyliny ≤0,03
µg/ml zazwyczaj oznacza brak produkcji β-laktamazy. MIC
penicyliny ≥0,25 µg/ml traktujemy jako oporność. Gronkowce
o MIC pomiędzy 0,06 µg/ml do 0,12 µg/ml mogą, ale nie muszą wytwarzać β-laktamazy. W tym przypadku wynik testu
cefinazowego określa oporność na β-laktamy (amoksycylinę,
piperacylinę, azlocylinę, mezlocylinę). W przypadku gronkowców koagulazo-ujemnych odczyt testu cefinazowego
może nastąpić nawet po upływie 1 godz. (chyba, że producent zaleci inaczej); należy pamiętać o pobraniu dużej ilości
materiału oraz o utrzymaniu w odpowiednich warunkach wilgotności krążka podczas całego czasu trwania testu.
W przypadku szczepu S. lugdunensis PM-135 do oznaczenia oporności na meticylinę zalecany jest krążek z cefoksytyną (zgodnie z Rekomendacjami KORLD/COBJDM i CLSI).
Spośród 467 laboratoriów 443 (94,9%) zastosowały krążek
z cefoksytyną. Wynik ten wskazywał na fakt, że zdecydowana większość laboratoriów, stosując się do powyższych
Rekomendacji, wprowadziła zmiany w swoich procedurach
badawczych polegające na rutynowym stosowaniu krążka
z cefoksytyną do oznaczania oporności gronkowców na meticylinę.
W przypadku szczepów meticylinoopornych nie ma potrzeby
oznaczania MIC dla penicyliny ani wykonywania testu cefinazowego, ponieważ szczepy takie są z założenia klinicznie
oporne na wszystkie antybiotyki β-laktamowe wraz z inhibitorami β-laktamaz.
W przypadku oznaczania wrażliwości na glikopeptydy przeważająca liczba laboratoriów stosowała metodę dyfuzji antybiotyku z krążka – tylko 132 (28,2%) oznaczyły MIC wankomycyny, pozostałe zastosowały krążek z wankomycyną
30μg. Jeszcze gorzej przedstawiała się sytuacja w przypadku oznaczania wrażliwości na teikoplaninę. Należy pamiętać,
że gronkowce szybciej i łatwiej nabywają oporność na teikoplaninę. Zgodnie z zaleceniami, w przypadku gronkowców
koagulazo-ujemnych oznaczanie wrażliwości na antybiotyki
glikopeptydowe (wankomycynę i teikoplaninę) powinno odbywać się z zastosowaniem metod rozcieńczeniowych lub
E-testu, a nie metody dyfuzji antybiotyku z krążka (tab. II).
W przypadku, kiedy wartość MIC wskazuje na wrażliwość
izolatu na glikopeptydy, a pacjent nie odpowiada na terapię
glikopeptydami, szczep należy przesłać do laboratorium referencyjnego w celu weryfikacji fenotypu oporności. Dla przypomnienia, szczepy Staphylococcus haemolyticus wykazują
naturalną oporność na teikoplaninę, na co nie zwróciły uwagi
laboratoria, które szczepy badane, głównie S. lugdunensis,
Tabela II. Interpretacja wartości MIC glikopeptydów dla
gronkowców koagulazo-ujemnych.
Antybiotyk
Wartości MIC (µg/ml)
wrażliwy
średniowrażliwy
oporny
Wankomycyna
≤4
8-16
≥32
Teikoplanina
≤8
16
≥32
29
Ogólnopolski Sprawdzian Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych – POLMICRO 2008
zidentyfikowały jako S. haemolyticus (wyniki lekowrażliwości
nie korelowały z wynikiem identyfikacji).
W przypadku znacznej grupy laboratoriów (ok. 20%) wyraźnie widoczny był brak powtarzalności głównie wielkości stref
zahamowania wzrostu w metodzie dyfuzyjno-krążkowej, ale
też, choć w mniejszym stopniu, wartości MIC dla szczepu
S. epidermidis. Najwięcej wyników niepowtarzalnych dotyczyło oznaczenia wrażliwości na oksacylinę (29 – 6,2%)
i cefoksytynę (36 – 7,7%), erytromycynę (18 – 3,9%), kwas
fusidowy (34 – 7,3%), gentamicynę (22 – 4,7%), klindamycynę (21 – 4,5%), linezolid (25 – 5,4%), rifampicynę (16 –
3,4%), trimetoprim/sulfametoksazol i tetracyklinę (po 15
– 3,2% laboratoriów). Odchylenie standardowe wielkości
strefy zahamowania wzrostu dla poszczególnych antybiotyków przedstawia tabela III.
Dla szczepów S. epidermidis PM-130 i S. epidermidis PM131 największa różnica między medianą a wartością referencyjną była dla rifampicyny i wynosiła odpowiednio 9 mm
i 6 mm. Dla szczepu S. epidermidis PM-132 największa
różnica między medianą a wielkością referencyjną była dla
cefoksytyny i wynosiła 10 mm.
Wprawdzie rozbieżne wartości nie pociągały w większości
przypadków zmiany kategorii wrażliwości, niemniej fakt ten
powinien zostać przez laboratoria przeanalizowany. Dwa
laboratoria nieprawidłowo wykryły mechanizm oporności
na meticylinę, co wyraźnie spowodowane zostało zaniżeniem wielkości strefy przy cefoksytynie, jak i oksacylinie,
we wszystkich badanych izolatach. Laboratoria te w ramach
prowadzonych działań naprawczych powinny upewnić się
odnośnie do jakości zastosowanych krążków, gęstości zawiesiny, sposobu pomiaru wielkości stref itd.
II tura
Po raz kolejny na przestrzeni kilku lat, kiedy wśród badaTabela III. Odchylenie standardowe wielkości strefy zahamowania wzrostu (mm) wokół krążków antybiogramowych antybiotyków dla izolatów I tury POLMICRO 2008.
Antybiotyk
Staphylococcus
epidermidis
PM-130
Staphylococcus
epidermidis
PM-131
Staphylococcus
epidermidis
PM-132
Ciprofloksacyna
2,70
2,22
2,47
Cefoksytyna
3,36
2,83
3,59
Erytromycyna
3,35
2,60
1,58
Kwas fusidowy
3,36
3,25
5,10
Gentamicyna
3,48
2,45
2,57
Klindamycyna
3,06
2,74
4,44
2,91
Linezolid
3,12
2,98
Oksacylina
2,84
2,96
3,05
Teikoplanina
2,17
1,78
1,87
Rifampicyna
2,94
2,66
2,20
Trimetoprim/
sulfametoksazol
2,98
2,66
2,62
Tetracyklina
3,19
2,10
2,51
Wankomycyna
1,88
1,56
1,57
30
nych izolatów znajdowały się drobnoustroje wymagające,
wielu laboratoriom nie udało się ożywić przesłanych do nich
szczepów bakteryjnych. W II turze POLMICRO 2008 uczestniczyły 474 laboratoria, z czego aż 171 laboratoriów nie odesłało wyników. Tylko osiemdziesiąt dwa laboratoria (17,3%
ogółu) prawidłowo zidentyfikowały obydwa przesłane do
badania szczepy bakteryjne. W przypadku szczepu Streptococcus oralis za prawidłową uznano również identyfikację
(Streptococcus oralis/mitis czy też Streptococcus mitis). Prawidłową identyfikację szczepu S. pneumoniae podały 234
(49,4%) laboratoria, szczepu S. oralis: 66 – S. oralis, 32 –
S. mitis (łącznie 20,7%). Niestety, aż 177 (37,3%) laboratoriów szczep S. oralis zidentyfikowało jako S. pneumoniae, co
świadczy o nieprawidłowo prowadzonej diagnostyce (brak
wykonania testu rozpuszczalności w solach żółci).
III tura
Do III tury sprawdzianu POLMICRO 2008 (edycja ogólna)
przystąpiły 472 laboratoria mikrobiologiczne, a 430 uczestników nadesłało ankiety z wynikami w wyznaczonym terminie. Pozostałe laboratoria – 42 (8,9%) – nie zdążyły odesłać
wyników na czas. Zgodnie z zasadami sprawdzianu wyniki
przesłane po terminie nie były klasyfikowane dla zachowania uczciwości względem wszystkich pozostałych uczestników. Negatywny wynik końcowy niniejszej edycji przyznano 96 laboratoriom, co stanowiło 22,3% ogółu laboratoriów
przystępujących do sprawdzianu. Identyfikacja pałeczek
rodzaju Acinetobacter przysporzyła laboratoriom najwięcej
problemów. Największe rozbieżności dotyczyły szczepu Acinetobacter baumannii PM-142. Rodzaj Acinetobacter liczy
ponad dwadzieścia genogatunków, z których tylko połowa
ma rangę gatunków. Metodami fenotypowymi stosowanymi rutynowo w laboratoriach, dla jednego szczepu, można
uzyskać wiele różnych określeń. Metodami referencyjnymi
identyfikacji Acinetobacter są metody biologii molekularnej,
dlatego też za prawidłową uznano identyfikację do rodzaju
Acinetobacter.
Błędy dotyczyły głównie identyfikacji gatunkowej szczepów
Acinetobacter baumannii PM-142 i Pseudomonas putida PM145. Izolat A. baumannii PM-142 otrzymało 287 laboratoriów
i tylko 149 (52%) podało poprawną identyfikację do gatunku. Siedemdziesiąt dziewięć laboratoriów (27,6%) określiło szczep jako A. lwoffii, 48 (16,7%) laboratoriów określiło
szczep jako inny niż wymienione – w tym 22 jako Acinetobacter junii/johnsonii, 20 – Acinetobacter junii, 4 jako Acinetobacter johnsonii, 2 jako Acinetobacter calcoaceticus oraz 1
jako Acinetobacter haemolyticus. Trzy laboratoria oznaczyły
szczep PM-142 tylko do rodzaju, a 2 określiły szczep jako Alcaligenes faecalis i jedno jako Alcaligenes spp. Pojedyncze
laboratoria oznaczyły szczep jako Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas oryzihabitans, Pseudomonas mendocina/
stutzeri oraz Stenotrophomonas maltophilia.
Szczep Pseudomonas putida PM-145 otrzymało 143 uczestników programu, poprawną identyfikację uzyskało 127
(88,8%) laboratoriów. Po trzy laboratoria oznaczyły szczep
jako Pseudomonas aeruginosa i Pseudomonas fluorescens.
E. Stefaniuk i inni
Dwa laboratoria określiły szczep jako Acinetobacter baumannii oraz pojedyncze jako Pseudomonas fluorescens/putida, P. pseudoalcaligenes, Stenotrophomonas maltophilia,
Burkholderia cepacia, Flavimonas oryzihabitans i Ralstonia
pickettii.
Identyfikacja pozostałych szczepów nie sprawiła laboratoriom większych trudności, szczep A. baumanii PM-141
oraz szczepy Pseudomonas aeruginosa PM-143 i PM-144
poprawnie zidentyfikowało odpowiednio (424) 98,6%, (427)
99,3% i (429) 99,7% laboratoriów.
Najwięcej błędów w oznaczaniu wytwarzania metalo-βlaktamaz (MBL) przysporzył szczep Pseudomonas aeruginosa PM-143 – 9,3% uczestników oznaczyło szczep jako
wytwarzający metalo-β-laktamazy – MBL – dodatni. Prawie
7% laboratoriów A. baumannii PM-142 i 5,5% laboratoriów
szczep Ps. aeruginosa PM-144 określiło jako MBL-ujemny.
Ponad 5% uczestników nie wykonało tego oznaczenia dla
szczepu A. baumannii PM-141, a dwa laboratoria oznaczyły
ten szczep jako MBL-dodatni. Fenotypowo szczep ten wykazuje wrażliwość na wszystkie antybiotyki i chemioterapeutyki zawarte w ankiecie z wyjątkiem gentamicyny. W takiej
sytuacji laboratorium nie ma obowiązku wykrywać mechanizmu MBL. W ramach sprawdzianu każde z uczestniczących
w POLMICRO laboratoriów otrzymało 1ml EDTA (możliwość wykonania ok. 100 testów), co jest ewenementem,
gdyż żaden inny organizator programów kontroli międzylaboratoryjnej nie dostarcza uczestnikom odczynników/testów
niezbędnych do wykonania badań. Niemniej jednak, aż
w 41 przypadkach zanotowano brak oznaczenia wytwarzania
metalo-β-laktamaz. EDTA jest inhibitorem MBL, w związku
z czym, o produkcji tych enzymów świadczy pojawienie się
i wyraźne powiększenie strefy wokół krążka z ceftazydymem
i/lub imipenemem od strony krążka zawierającego inhibitor.
MBL są β-laktamazami o aktywności karbapenemaz, zaliczane są w systemach klasyfikacyjnych laktamaz do klasy
B, wykorzystują jony Zn2+ w reakcji hydrolizy β-laktamów.
Szczepy wytwarzające β-laktamazy typu MBL, ze względu
na współwystępowanie innych mechanizmów, często są
oporne na wszystkie β-laktamy – szczególnie widoczne jest
to w przypadku szczepów P. aeruginosa.
Analiza uzyskanych wyników wykazała, że 119 laboratoriów
dla szczepu A. baumannii PM-142 po wykryciu MBL zmieniło interpretację kliniczną dla ampicyliny z sulbaktamem
(szczep wrażliwy, strefa 22 mm i MIC 4µg/ml) oraz dla cefepimu (szczep wrażliwy, strefa 22 mm i MIC ≤8µg/ml). Nie
istnieją rekomendacje zalecające zmianę interpretacji innych niż karbapenemy leków β-laktamowych w obecności
mechanizmu MBL (tak jak jest w przypadku mechanizmu
ESBL), dlatego też zmiany takiej nie należało wykonywać.
Obowiązuje zamieszczenie interpretacji zgodnej z uzyskaną strefą i/lub wartością MIC. Laboratoria jednakże powinny
zachować czujność i powinny poddawać oznaczaniu w kierunku MBL szczepy P. aeruginosa oporne lub o obniżonej
wrażliwości na karbapenemy i wysoce oporne na tikarcylinę i
tikarcylinę z kwasem klawulanowym, szczepy Acinetobacter
spp. i inne Pseudomonas spp. o obniżonej wrażliwości na
karbapenemy.
Najwięcej bardzo dużych błędów (VME) odnotowano dla tikarcyliny i tikarcyliny z kwasem klawulanowym u P. aeruginosa PM-143; Pięćdziesiąt trzy (12,3%) laboratoria (n=430)
określiły szczep jako wrażliwy na tikarcylinę z klawulanianem, a trzydzieści dziewięć (9%) na tikarcylinę. Jak podano wcześniej bardzo duży błąd oznacza określenie szczepu
opornego jako wrażliwy na dany antybiotyk/chemioterapeutyk, w wyniku takiego błędu w rutynowej pracy laboratorium lek może zostać włączony do terapii. Należy bardzo
poważnie potraktować pojawienie się bardzo dużego błędu,
laboratorium powinno zastanowić się nad kontrolą jakości
wykonywanych rutynowo oznaczeń lekowrażliwości. Wystąpienie VME jest najpoważniejszym błędem i za taki błąd
przyznawana jest ocena negatywna w sprawdzianie. Pozostałe błędy w oznaczaniu lekowrażliwości dotyczyły głównie
cefepimu (szczepy A. baumannii PM-141 oraz P. aeruginosa PM-143) – obydwa szczepy były średniowrażliwe: strefa
16 mm i MIC =16µg/ml, gentamicyny (szczep A. baumannii PM-141) i aztreonamu (P. aeruginosa PM-144). Szczep
A. baumannii PM-141 wykazywał dla gentamicyny strefę 14
mm – średniowrażliwy i MIC 8µg/ml – oporny. P. aeruginosa PM-144 wykazywał dla aztreonamu strefę 16 mm – średniowrażliwy i MIC ≥32µg/ml – oporny. Ze względu na fakt,
że metoda pozwalająca wykryć MIC jest metodą referencyjną w przypadku takich rozbieżności, w szczególności dla
pałeczek niefermentujących, jako właściwy wynik należało
uznać wartość MIC i odpowiednią dla niej interpretację. Mając na uwadze fakt, iż nie wszystkie laboratoria mają możliwość oznaczania wartości MIC, za poprawną uznawano
zarówno interpretację uzyskaną metodą dyfuzyjno-krążkową, jak i rozcieńczeniową. Wykresy 1-9 obrazują rozrzuty
stref zahamowania wzrostu dla wybranych antybiotyków
i dla wybranych izolatów uzyskanych przez uczestniczące
w sprawdzianie laboratoria.
SPRAWDZIAN POLMICRO 2008/SSE (edycja dla laboratoriów Państwowej Inspekcji Sanitarnej)
I tura/SSE
Do I tury sprawdzianu POLMICRO 2008/SSE przystąpiły
54 laboratoria mikrobiologiczne stacji sanitarno-epidemiologicznych. Spośród czterech laboratoriów, które otrzymały
jeden izolat bakteryjny Salmonella enterica ser. Typhimurium, dwa poddały kontroli samą identyfikację. Dwa izolaty
bakteryjne: Salmonella enterica ser. Typhimurium i Shigella
boydii otrzymało 12 laboratoriów mikrobiologicznych stacji
sanitarno-epidemiologicznych, a siedem z nich poddało kontroli wyłącznie identyfikację obu izolatów. Trzydzieści osiem
laboratoriów poddało się kontroli trzema wymienionymi
w tabeli I szczepami. Negatywny wynik końcowy niniejszej
edycji przyznano tylko jednemu laboratorium, które niepoprawnie zidentyfikowało dwa szczepy. Zamiast Shigella
boydii określono Serratia marcescens, zamiast Yersinia kristensenii laboratorium podało wynik – inny niż wymienione,
31
Ogólnopolski Sprawdzian Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych – POLMICRO 2008
Wykresy 1-9. Rozrzuty stref zahamowania wzrostu (mm) dla wybranych antybiotyków i dla wybranych izolatów uzyskane przez uczestniczące w sprawdzianie laboratoria.
Legenda: W wykresach 1-9 strzałką
oznaczono wartości referencyjne. Aba – Acinetobacter baumannii; Pae – Pseudomonas aeruginosa. Pionowe kreski obrazują punkty odcięcia tzw. beakpoints, będące podstawą kategorii wrażliwości. O – oporny, Ś – średniowrażliwy,
W – wrażliwy.
32
E. Stefaniuk i inni
bez żadnych dodatkowych informacji. Pozostałym laboratoriom identyfikacja nie sprawiła problemu. Natomiast wiele
laboratoriów miało trudności w oznaczeniu gatunku szczepu
Yersinia kristensenii. Odpowiedzi przesłane do Centralnego
Ośrodka to: Y. krisensenii – 23 laboratoria, Y. enterocolitica
– 11 , Yersinia spp. – 3 i jedna odpowiedź – gatunek inny niż
wymienione w liście gatunków zamieszczonej w ankiecie.
Do rodzaju Yersinia zaliczamy obecnie 12 gatunków: Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, Y. fredreksenii, Y. intermedia, Y. kristensenii, Y. bercovieri, Y. mollaterii,
Y. rohdel, Y. ruckeri, Y. aldovae i sklasyfikowany w 2005 roku
Y. aleksiciae. Rodzaj Yersinia został wyodrębniony w ramach
rodziny Enterobacteriaceae w 1964 roku i liczył trzy gatunki:
Y. pestis, Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, wcześniej
klasyfikowane do rodzaju Pasteurella. Zmiany w taksonomii spowodowane zostały wprowadzeniem do identyfikacji
metod taksonomii numerycznej oraz metod molekularnych.
W stosunku do dziewięciu gatunków: Y. fredreksenii, Y. kristensenii, Y. bercovieri, Y. mollaterii, Y. rohdel, Y. ruckeri,
Y. aldovae, Y. intermedia i Y. aleksiciae używa się określenia
„podobne do Y. enterocolitica”, czyli „Y. enterocolitica-like”.
Większość z tych gatunków wcześniej należała do biotypów
Y. enterocolitica. Gatunki te opisuje się czasami jako niepatogenne, gdyż pozbawione są czynników wirulencji charakterystycznych dla wysoce zjadliwych szczepów Yersinia.
Pałeczki Yersinia są wewnątrzkomórkowymi pasożytami,
których chorobotwórczość związana jest z właściwościami
inwazyjnymi, zdolnością do rozmnażania się w organizmie
gospodarza oraz wytwarzaniem toksyn. Y. enterocolitica-like
są patogenne dla ssaków, ptaków, gadów, płazów i ryb oraz
szeroko rozpowszechnione w środowisku naturalnym. Jednakże istnieją doniesienia o wywoływaniu przez te szczepy
u ludzi biegunek i innych objawów chorobowych, za które
odpowiadają odmienne czynniki zjadliwości. Ponieważ gatunki te występują u zwierząt, istnieje możliwość zakażeń
odzwierzęcych. Nie można również wykluczyć możliwości
przeniesienia szczepu z człowieka na człowieka. Diagnostyka mikrobiologiczna pałeczek z rodzaju Yersinia wymaga
zastosowania odpowiednich warunków temperaturowych,
podłoży bakteriologicznych, surowic, testów serologicznych
itp. Wyniki w dużej mierze zależały od stosowanych w laboratoriach testów identyfikacyjnych i tak, jak to ma miejsce
w szerokospektralnej diagnostyce mikrobiologicznej (nie
tylko diagnostyka schorzeń przewodu pokarmowego) być
może zaistnieje konieczność poszerzenia możliwości diagnostycznych o „nowe” czynniki etiologiczne zakażeń. Ze
względu na edukacyjny charakter programu POLMICRO
poprawna identyfikacja wyłącznie do rodzaju Yersinia, nie
wpływała na końcową ocenę I tury. Oznaczenie lekowrażliwości przesłanych szczepów nie przysporzyło uczestnikom
większych trudności, mimo że laboratoria wykonujące wyłącznie diagnostykę zakażeń przewodu pokarmowego rzadko wykonują testy wrażliwości.
II tura/SSE
Do sprawdzianu przystąpiło 55 laboratoriów mikrobiologicznych stacji sanitarno-epidemiologicznych. Poprawną identyfikację szczepów wykonały wszystkie laboratoria, przy czym
jedenaście laboratoriów poddało kontroli wyłącznie identyfikację. W oznaczaniu lekowrażliwości jedynie dla szczepu
Morganella morgannii jedno laboratorium zrobiło 2 małe błędy dla ampicyliny i 1 mały błąd dla ceftriaksonu.
Podsumowanie
Wyniki badań międzylaboratoryjnych odzwierciedlają słabe
strony kontroli wewnętrznej w medycznych laboratoriach
mikrobiologicznych. Wykazany brak powtarzalności w wynikach I tury POLMICRO 2008 powinien nakłonić laboratoria
do analizy poprawności stosowanych procedur diagnostycznych, jakości stosowanych krążków antybiogramowych, gęstości zawiesiny, sposobu pomiaru wielkości stref, umiejętności odczytu wartości MIC itd.
Tabele IV i V przedstawiają końcowe zestawienie liczby laboratoriów, które w roku 2008 wzięły udział w ogólnej edycji
programu POLMICRO oraz edycji dla laboratoriów PIS i liczby laboratoriów, których odpowiedzi uznano za pozytywne.
Świadectwa uczestnictwa i uzyskania bardzo dobrych wyników w Zewnątrzlaboratoryjnym Ogólnopolskim Sprawdzianie Wiarygodności Badań w Mikrobiologii POLMICRO 2008
Tabela IV. Zestawienie laboratoriów uczestniczących w edycji ogólnej POLMICRO 2008.
Tura sprawdzianu
POLMICRO 2008
(edycja ogólna)
Liczba laboratoriów,
które otrzymały badane izolaty
Liczba laboratoriów,
które odesłały odpowiedzi
Liczba i % laboratoriów,
które uzyskały ocenę pozytywną
I tura
476
467
450 - 96,4 %
II tura
474
304
82 - 27,0 %
III tura
472
430
334 - 77,7 %
Tabela V. Zestawienie laboratoriów uczestniczących w edycji ogólnej POLMICRO 2008/SSE.
Tura sprawdzianu
POLMICRO 2008/SSE
Liczba laboratoriów,
które otrzymały badane izolaty
Liczba laboratoriów,
które odesłały odpowiedzi
Liczba laboratoriów,
które uzyskały ocenę pozytywną
I tura
54
54
53
II tura
55
55
54
33
Ogólnopolski Sprawdzian Wiarygodności Badań Mikrobiologicznych – POLMICRO 2008
(edycja ogólna) otrzymały 343 laboratoria (73%) i były to
tylko te laboratoria, które uzyskały dobre wyniki co najmniej
w dwóch turach sprawdzianu POLMICRO 2008.
Świadectwa uczestnictwa i uzyskania bardzo dobrych wyników w Programie POLMICRO dla laboratoriów Państwowej
Inspekcji Sanitarnej w 2008 roku otrzymały 52 laboratoria
i były to tylko te laboratoria, które uzyskały dobre wyniki
w dwóch turach sprawdzianu POLMICRO 2008/SSE.
Z wieloletniej obserwacji wyników uzyskiwanych przez laboratoria mikrobiologiczne w Ogólnopolskim Sprawdzianie
Wiarygodności Badań w Mikrobiologii POLMICRO wynika,
że systematyczne poddawanie się laboratoriów zewnętrznej
kontroli jakości znajduje odbicie w poprawie jakości diagnostyki w tych laboratoriach, co z kolei potwierdza edukacyjną
rolę sprawdzianów organizowanych przez Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej.
Piśmiennictwo
1. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; Eighteenth informational supplement: M100-S18. CLSI, Villanova PA. 2008.
2. Hryniewicz W, Sulikowska A, Szczypa K i wsp. M. Rekomendacje doboru testów do oznaczania wrażliwości bakterii na anty-
34
biotyki i chemioterapeutyki – 2006. Narodowy Instytut Zdrowia
Publicznego 2006.
3. Hryniewicz W, Gniadkowski M, Łuczak-Kadłubowska A i wsp.
Zmiany do tekstu: Rekomendacje doboru testów do oznaczania
wrażliwości bakterii na antybiotyki i chemioterapeutyki – 2006
wprowadzone w roku 2008. Narodowy Instytut Leków 2008.
4. Clinical and Laboratory Standards Institute. Methods for Dilution
Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved standard – Seventh Edition: M7-A7. CLSI, Villanova, PA. 2006.
5. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests; Approved Standard – Ninth Edition M2-A9. CLSI, Villanova, PA. 2006.
Adres Autorów:
Centralny Ośrodek Badań Jakości w Diagnostyce Mikrobiologicznej
ul. Chełmska 30/34,
00-725 Warszawa,
tel. (022) 841 58 34,
faks: (022) 841 29 49
e-mail: [email protected]
(Praca wpłynęła do Redakcji: 2009-04-15)
(Praca przekazana do opublikowania: 2009-04-27)